KR20010023185A - 히알루론산 겔, 그의 제조 방법 및 그를 함유하는 의학용재료 - Google Patents

히알루론산 겔, 그의 제조 방법 및 그를 함유하는 의학용재료 Download PDF

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Abstract

중성 수용액에서 난용성인 것을 특징으로 하는 히알루론산 단독의 겔 (1), 및 25 ℃ 의 온도에서 중성 수용액 중에 1 일 이상 동안 그 형태를 유지하는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 겔 (1) 을 포함하는 의학용 재료.

Description

히알루론산 겔, 그의 제조 방법 및 그를 함유하는 의학용 재료{HYALURONIC ACID GEL, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND MEDICAL MATERIAL CONTAINING THE SAME}
히알루론산은 교대로 결합한 β-D-N-아세틸글루코아민 및 β-D-글루쿠론산으로 이루어진 직쇄형 거대 분자 다당류이다. 히알루론산은 포유류의 결합 조직뿐만 아니라, 닭볏 및 연쇄 구균의 캡슐에서도 발견된다. 히알루론산은 닭볏 및 탯줄로부터 추출하여, 또한 연쇄 구균의 배양물로부터 정제물로서 수득할 수 있다.
천연 히알루론산은, 분자량에 있어서 다분산성이고, 종 및 장기 특이성이 없기 때문에, 신체에 이식 또는 주입할 경우에도 우수한 생체적합성을 나타낸다고 알려져 있다. 또한, 생체 적용시에 히알루론산의 용이한 수용성에 유래하는 단점, 예컨대 비교적 짧은 생체내 체류 시간 때문에, 히알루론산의 각종 화학 변성물이 제안되어 있다.
이 중 대표적인 것은, 디비닐 술폰, 비스에폭시드 또는 포름알데히드와 같은 이작용성 가교제를 사용하여 수득한 고팽윤성의 가교된 히알루론산 겔이다 (USP 4,582,865, JP-B-6-37575, JP-A-7-97401 및 JP-A-60-130601).
테트라부틸암모늄 히알루로네이트가 디메틸 술폭시드와 같은 유기 용매에 용해하는 특징을 이용한 히알루론산의 화학적 변성 방법도 기재되어 있다 (JP-A-3-105003). 테트라부틸암모늄 히알루로네이트를 디메틸 술폭시드 중에서, 트리에틸아민과 2-클로로-1-메틸피리디늄 요오드로 처리하여, 히알루론산의 카르복실기와 히드록실기 사이에서 에스테르 결합을 형성시키는 방법도 제안되어 있다 (EP-A-0341745A1).
또한, 공유 결합하는 화학 약품을 사용하지 않고, 히알루론산을 물에 불용화하는 접근으로서, 아미노기 또는 이미노기를 가지는 고분자와 히알루론산을, 히알루론산의 카르복실기와 고분자의 아미노기 또는 이미노기를 통해 이온 결합시켜 히알루론산-고분자 착물을 제조하는 방법이 기재되어 있다 (JP-A-6-73103).
히알루론산 수용액이 산성화, 예를 들어 pH 2.0 내지 2.7 의 범위로 되는 경우, 젤리화에 의해 이른바 퍼티겔(putty gel)을 형성하는 것은 알려져 있지만, pH 2.0 미만에서는 퍼티겔이 형성되지 않는다.
퍼티겔은 중성 수용액 중에 빠르게 용해하기 때문에, 본 발명에 따른 히알루론산 겔과는 차별화된다.
다른 접근으로서, pH 2.0-3.8 에서, 20-80 중량% 의 수혼화성 유기 용매의 존재하에, 히알루론산 수용액으로부터 히알루론산 겔을 제조하는 방법도 기재되어 있다 (JP-A-5-58881). 그러나, 수득한 히알루론산 겔이 코팅을 실시하지 않는 경우에는 수중에서 용해한다는 것 또한 기재되어 있다.
또한, 폴리비닐 알코올 및 글루코만난으로 대표되는 고분자 수용액을 반복적으로 동결 및 해동시켜 고분자 겔을 제조하는 몇 가지 일반적인 방법도 제안되어 있다 (JP-A-57-190072 및 JP-A-5-161459).
동결-해동 및 동결-건조는 히알루론산, 또는 히알루론산을 포함하는 생체 시료를 정제 또는 보존하기 위한 일반적 기술로서 널리 사용되고 있으나, 이들이 통상은 중성 조절하에 사용되기 때문에, 이와 같은 기술로 히알루론산 겔을 형성한 보고는 아직 없었다.
히알루론산은 극히 높은 점성과 우수한 보습성을 가지고, 본질적으로 항원성이 없고 생체적합성이 높다. 따라서, 골관절염증의 치료약과 안과 수술 보조재로서 사용되고 있다.
또한, 히알루론산 자체를 수술 후 유착 방지제로서 사용하는 것도 연구되어 왔다. 그러나 히알루론산은 생체내에서의 체류 시간이 비교적 짧기 때문에 효과가 약하고, 수용성이 높기 때문에 단시간에 상처의 표면으로부터 확산하며 흘러내린다 (Journal of Gynecologic Surgery, 제 7 권, 제 2 호, 97-101 (1991)).
JP-A-5-508161 및 JP-A-6-508169 를 기초로 한 카르보디이미드 가교제로 카르복실메틸 셀룰로스와 히알루론산 나트륨을 변성시키면 유착 방지 필름 "Seprafilm" (Genzyme) 이 제조된다.
히알루론산이 본래 가지고 있는 탁월한 생체적합성을 최대한 사용하기 위한 시도에도 불구하고, 양이온성 고분자와의 착물 형성 또는 화학적 가교제나 화학적 변성제 없이, 생체적합성 생체의학 재료로서 사용가능하며, 생체내 체류 시간이 긴 히알루론산 겔은 아직 개발되어 있지 않다.
본 발명자들이 히알루론산 자체의 물리화학적 특성에 대해 심도있는 연구를 수행한 결과, 특정 pH 로 조정된 히알루론산 수용액을 1 회 이상 동결 및 해동함으로써 히알루론산 겔을 수득할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 이와 같이 하여 수득한 히알루론산 겔은 수중에서의 용해 속도가 극히 느리다는 것도 발견하였다.
히알루론산의 통상적인 변성법은, 수많은 노력에도 불구하고, 화학적 반응 물질을 이용하기 때문에, 변성에 본질적인 독성 및 생체적합성 등의 피할 수 없는 추가 위험의 문제를 가진다.
예를 들어, 화학적 변성, 가교 또는 히알루론산의 금속염과의 이온적 처리는 생체내 존속성이 향상된 유착 방지제를 만들 것이다. 그러나 생성된 유착 방지제는 가교제나 히알루론산 분자 중에 공유 결합 또는 이온 결합된 금속으로 인해, 천연 히알루론산의 구조를 더이상 유지하지 못하고, 생리학적 효과, 생체적합성, 및 독성을 포함하는 안정성의 면에서 본질적으로 천연 히알루론산과 동등하지 않다. 또한 이들 가교제의 잔류 독성의 문제 및 가교제 분해 산물이 신체에 미치는 위험을 완전히 피하기가 어렵다.
본 발명은 신규한 히알루론산 겔과 그의 제조 방법, 및 생체적합성이 양호한 생체의학 재료에 관한 것이다.
도 1 은 실시예 8 과 비교예 6 에서 수득한 GPC 크로마토그램과 각 분획의 분자량간의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 2 는 비교예 6 의 히알루론산이 직쇄라는 근거로, 실시예 8 에서의 분지도와 분자량간의 관계를 나타내는 그래프이다.
[발명을 실시하기 위한 최량의 양태]
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서, 동물 조직으로부터 추출에 의해, 또는 발효에 의해 수득한 히알루론산은 기원에 제한되지 않고 사용될 수 있다.
발효에 사용되는 균주는, 연쇄 구균 속과 같은, 자연으로부터 분리되는 히알루론산 발생 미생물, 또는 JP-A-63-123392 에 기재된 스트렙토콕쿠스 에쿠이 FM-100 (National Institute of Bioscience and Human-Technology 제 9027 호) 또는 JP-A-2-234689 에 기재된 스트렙토콕쿠스 에쿠이 FM-300 (National Institute of Bioscience and Human-Technology 제 2319 호) 와 같은, 고수율로 안정하게 히알루론산을 발생하는 변이주가 바람직하다. 상기의 변이주를 배양하여 수득한 정제된 히알루론산을 사용할 수 있다.
겔은 고분자 사전(Kobunshi Jiten) 신판(Asakura Shoten 에 의해 1988 년 출판됨) 에 의해, "임의의 용매에 불용성인 삼차원 네트워크 구조를 가진 고분자 또는 그의 팽윤체" 로 정의되어 있다. 이화학 사전 (Rikagaku Jiten) 제 4 판 (Iwanami Shoten 에 의해 1987 년 출판됨) 에 의해서는, "졸(콜로이드 용액) 의 젤리화 생성물" 이라고도 정의되어 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 겔은 중성 수용액에 난용성인 것을 특징으로 하고, 상기 히알루론산 겔을 중성 수용액 중에 투입한 경우에는, 겔화되지 않은 히알루론산과 비교하여 상당한 난용성을 나타낸다. 난용성은 25 ℃ 의 중성 수용액 중에서의 겔의 형태의 유지성과 겔의 용해율, 및 37 ℃ 의 중성 수용액 중에서의 겔의 용해율로 정의한다. 중성 수용액은 pH 7 로 조정된 완충화된 생리 식염수를 의미한다.
본 발명에 따른 히알루론산 겔은 알칼리성 완충 수용액 중에, 예를 들어 pH 11 에서 빨리 용해하는 특징도 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 겔은 삼차원 네트워크 구조를 가지는 고분자 또는 그의 팽윤체이다. 삼차원 네트워크 구조는 가교된 히알루론산으로 형성된다.
본 발명에 따른 히알루론산 겔은, 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하의 처리에 의해 분해를 통해 가용화될 수 있다. 가용화된 히알루론산이 가교 구조를 유지하는 경우, 가용화된 히알루론산은 고분자 용액론에 따라 분지형 히알루론산으로서 직쇄형 히알루론산과 구별될 수 있다. 히알루론산 자체는 직쇄형 고분자이고, 분지를 가지지 않는 것으로 알려져 있다 [Kyoritsu Shuppan 에 의해 출판된 다당류 생화학 I 화학편 (Tato Seikagaku I Kagaku-hen)].
본 발명에 따른 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건은, 수용액의 pH 가 1.5 이고 온도 60 ℃ 인 것이 바람직하다. 글리코시드 결합의 가수분해를 통한 히알루론산 주사슬의 절단 반응이, 중성 수용액 중과 비교하여, 산성이나 알칼리성 수용액 중에서 현저히 촉진되는 것이 잘 알려져 있다 (Eur. Polym. J. 제 132 권, 제 8 호, 1011-1014 면, 1996). 또한, 산가수분해는 고온일수록 촉진된다.
본 발명에 따른 히알루론산 겔의 촉진 가수분해의 반응 시간은 히알루론산 겔의 구조, 예컨대 원료 히알루론산의 분자량 또는 분자량 분포, 및 겔의 가교도에 의해 크게 좌우된다.
반응 조건은 가용화되는 히알루론산의 비율과 분지도가 크게 되도록 선택한다. 반응 조건이 너무 약하거나 강하면 분지도 측정이 곤란한데, 이는 약한 조건에서는 가용화된 히알루론산의 비율이 너무 작고, 한편 강한 조건에서는 가용화된 히알루론산의 분자량이 너무 작기 때문이다. 또한 분지점이 분해하는 가능성도 증대한다.
반응 조건으로는, 육안으로 확인할 수 있는 히알루론산 겔이 거의 완전히 소실하는 반응 시간, 또는 가용화된 히알루론산의 비율이 50 % 이상이 되는 반응 시간이 바람직하다.
가용화된 히알루론산의 분자량과 분지도 측정용으로, 겔 침투 크로마토그램 (GPC) 용 검출기로서 시차 굴절율계와 다각도 레이저 광산란 검출기 (MALLS) 를 사용하는 GPC-MALLS 법, GPC 용 검출기로서 시차 굴절율계와 저각도 레이저 광산란 검출기를 사용하는 GPC-LALLS 법, 및 GPC 용 검출기로서 시차 굴절율계와 점도계를 사용하는 GPC-점도법을 들 수 있다.
본 발명에서는, 분자량에 따라 GPC 에 의해 분리된 분획의 분자량과 분지도를 GPC-MALLS 법에 의해 온라인에서 연속적으로 측정한다. GPC-MALLS 법은 GPC 에 의해 분리된 각 분획의 분자량과 회전 반경을 연속적으로 측정할 수 있게 한다. GPC-MALLS 법에서는, 분지도의 측정을 위해, 두 가지 방법이 가능하다: 가용화된 히알루론산 분획의 분자량과 회전 반경간의 관계를, 대조로서 직쇄형 히알루론산 분획의 분자량과 회전 반경간의 관계와 비교하는 회전 반경법, 및 가용화된 히알루론산 각 분획의 분자량을, 대조로서 직쇄형 히알루론산의 동일 용출 부피에서 분획의 분자량과 비교하는 용출 부피법이 있다.
본 발명에서는, 용출 부피법에 의해 분지도를 측정한다. 분지도는 가용화된 히알루론산의 고분자 사슬 하나에 존재하는 분지점의 수이고, 가용화된 히알루론산의 분자량에 대해 플롯화된다.
각 분획의 분자량과 회전 반경의 측정을 위해, 유한 농도에서 하기 수학식 1 의 짐(Zimm) 플롯을 사용한다. 분자량은 산란 각도 0 °로의 외삽값으로부터 계산하고, 회전 반경은 각도 의존적인 초기 구배로부터 하기의 식에 따라 계산한다.
[여기서 M 은 분자량이고, 〈S2〉 는 회전 반경 제곱의 평균이고, K 는 광학 상수이고, R(θ) 는 환산 초과 산란 강도이고, c 는 고분자 농도이고, P(θ)는 입자 산란 함수이고, λ는 용액 중에서 레이저광의 파장이고, A2는 제 2 비리얼 (virial) 계수이며 히알루론산에 대해 0.002 mlㆍmol/g2이다. c 는 시차 굴절율계의 출력으로부터, 히알루론산 수용액의 시차 굴절율의 증가량 (dn/dc: 0.153 ml/g) 을 기준으로 계산한다.]
GPC-MALLS 법에서는, 환산 초과 산란 강도로부터 분자량과 회전 반경 제곱의 평균을 계산하므로, 측정 정확도는 환산 초과 산란 강도에 의존한다. 수학식 1 은, 환산 초과 산란 강도를 농도와 분자량 양자와 관련시킨다. 따라서, 시료의 분자량에 따라 시료 농도와 주입 부피를 결정해야 한다. 분자량 분획을 위한 GPC 칼럼을 선택할 경우, 칼럼이 과부하되지 않도록 최대 시료 농도와 주입 부피를 결정한다.
용출 부피법에서, 각 분획의 분지도는 하기의 수학식 2 에 따라 계산한다. 동일 용출 부피의 분획에서, 분지형 고분자의 분자량 Mb및 직쇄형 고분자의 분자량 M1으로부터 수축 인자 g 를 결정할 수 있다.
g = (M1/Mb)(a+1)/e
[여기서, a 는 Mark-Houwink 상수로 히알루론산에 대해 0.78 이고, e 는 탈수 인자로 1 로 정의된다.]
임의로 분지화된 고분자(장쇄 분지형, 4 작용성)를 가정할 경우, 하나의 고분자 사슬상의 분지점의 수 B (분지도)는 하기의 수학식 3 으로부터 계산할 수 있다.
용출 부피법에 의한 분지도의 측정은 GPC-LALLS 법에 의한 분지도 측정과 동일하고, 그 상세한 설명은 Size Exclusion Chromatography (Kyoritsu Shuppan 1991) 에서 찾을 수 있다.
가용화된 히알루론산은 농도 조정을 위해 GPC 용출액으로 희석하여, 0.2 ㎛ 의 멤브레인 필터를 통해 여과한 후에 측정한다.
본 발명에 따른 히알루론산 겔이, 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하에서도 안정한 가교 구조를 가지는 경우, 분지 구조는 가용화된 히알루론산에서 고분자 용액론에 따라 확인된다.
본 발명에서, 히알루론산 단독이라는 것은, 히알루론산 이외에 화학적 가교제 또는 화학적 변성제를 사용하지 않는 것과, 히알루론산이 양이온성 고분자와 착물화 형태가 아닌 것을 의미한다.
히알루론산의 화학적 가교제는 히알루론산의 카르복실기, 히드록실기 또는 아세토아미도기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 다가 화합물을 의미한다. 예를 들어, 폴리글리시딜 에테르 등의 다가 에폭시 화합물, 디비닐 술폰, 포름알데히드, 옥시염화인, 카르보이미드 화합물과 아미노산 에스테르의 배합물, 및 카르보이미드 화합물과 디히드라지드 화합물의 배합물을 들 수 있다. 화학적 가교제는 히알루론산과 반응하여 3 차원 네트워크 구조를 형성한다.
히알루론산의 화학적 변성제는, 히알루론산의 카르복실기, 히드록실기 또는 아세토아미도기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 화합물을 의미한다. 예를 들어 무수 아세트산과 진한 황산의 배합물, 무수 트리플루오로아세트산과 유기산의 배합물 및 알킬 요오드 화합물을 들 수 있다. 이것은 히알루론산 중의 친수성기를 소수성화하고, 따라서 히알루론산의 용해율을 감소시킨다.
히알루론산과 착물을 형성하는 양이온성 고분자는, 히알루론산의 카르복실기와 고분자 화합물의 아미노기 또는 이미노기의 사이에서 이온 결합을 통해 착물을 형성하는 고분자를 의미하고, 예를 들어 키토산, 폴리라이신, 폴리비닐피리딘, 폴리에틸렌이민 및 폴리디메틸아미노에틸메타크릴레이트를 들 수 있다. 양이온성 고분자와 히알루론산은 착물화하여 물에 불용화된다.
한편, 히알루론산에 가교 구조의 도입을 직접 유도하지 않거나 히알루론산을 불용화 또는 난용화시키지 않는 물질을, 본 발명에 따른 히알루론산 겔을 제조하는 경우 첨가할 수 있다. 히알루론산만큼 생체적합성이 우수한 재료, 예컨대 콘드로이틴 술페이트 및 카르복시메틸 셀룰로스를 제한 없이 혼합 또는 혼입하여 히알루론산 겔을 수득할 수 있다.
또한, 히알루론산 겔의 제조시, 약학적 또는 생리학적 활성 물질을 첨가하여, 상기 물질을 함유하는 히알루론산 겔을 제한 없이 형성할 수도 있다.
본 발명에서 사용될 히알루론산의 분자량은 약 1 ×105내지 약 1 ×107Da 의 범위내가 바람직하다. 또한 더 큰 분자량을 가지는 히알루론산도, 가수분해 등의 처리에 의해 분자량이 상기 범위로 낮춰진 후에 사용할 수 있다.
본 발명에서, 히알루론산의 개념은 그의 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨, 칼륨 및 리튬염도 포함하는 것으로 사용된다.
본 발명에 사용되는 히알루론산 수용액은, 히알루론산 분말과 물의 혼합물을 교반하여 수득된다. 상기 히알루론산의 농도는 5.0 중량% 이하가 수용액 취급의 면에서 바람직하다.
분자량이 2 ×106Da 이상인 히알루론산을 사용하는 경우, 그 농도는 2.5 중량% 이하가 바람직하다.
히알루론산 수용액의 pH 를 조정하기 위해, pH 를 3.5 이하로 조정할 수 있는 임의의 산을 사용할 수 있다. 산의 사용량을 감소시키기 위해, 강산, 예컨대 염산, 질산 및 황산을 사용하는 것이 바람직하다.
히알루론산 수용액의 pH 는 히알루론산 중의 충분한 비율의 카르복실기가 양성자화하도록 조정한다. 산 형태의 히알루론산의 해리 상수는, 히알루론산이 무한 농도로 희석된 경우 logK0=4.25 이다 (Acta Chemica Hungarica-Models in Chemistry 129(5), 671-683, 1992). 최종 pH 는 히알루론산 염의 짝이온의 종류, 히알루론산의 분자량, 수용액의 농도, 동결 및 해동 조건, 및 생성된 겔의 강도 등의 특성에 따라 설정되지만, 본 발명에서는 pH 를 3.5 이하, 바람직하게는 2.5 이하로 조정하는 것이 필요하다.
동결-해동에 있어, 제조된 산성 히알루론산 수용액을 적합한 용기 내에서, 소정의 온도에서 동결시킨 후, 소정의 온도에서 해동시키는 것으로 이루어지는 과정을 1 회 이상 수행한다. 동결 및 해동 온도와 시간은 용기의 크기 및 수용액의 부피에 따라, 산성 히알루론산 수용액이 동결 및 해동하도록 적절하게 설정되지만, 동결 온도가 빙점 이하이고, 해동 온도가 빙점 이상인 것이 일반적으로 바람직하다.
동결 및 해동 시간을 단축시키기 위해, 동결 온도를 -5 ℃ 이하로, 그리고 해동 온도를 5 ℃ 이상으로 하는 것이 특히 바람직하다. 동결 및 해동 시간은 그 온도에서 동결 및 해동이 완결된다면 특별한 제한은 없다.
제조된 산성 히알루론산 수용액을 동결하고 이어서 해동하는 것으로 이루어지는 조작의 반복 회수는, 사용하는 히알루론산의 분자량, 수용액의 농도와 pH, 동결 및 해동 온도와 시간, 및 생성하는 겔의 강도 등의 각종 특성에 의존한다. 통상은 1 회 이상 반복하는 것이 바람직하다.
또한, 동결 및 해동 조작을 반복할 때마다, 동결 및 해동 온도와 시간을 변화시킬 수 있다.
제조된 산성 히알루론산 수용액의 동결 및 해동에 의해 수득한 히알루론산 겔로부터, 히알루론산의 가수분해를 방지하기 위해, 산성화를 위해 첨가된 산 성분을 제거해야 한다. 산 성분을 제거하기 위해, 통상은 겔을 수성 용매, 예를 들어 물, 생리 식염수 또는 인산염 완충액, 바람직하게는 생리 식염수 또는 인산염 완충액으로 세정한다. 히알루론산 겔의 기능을 손상시키지 않는 것이면 수성 용매에 대해 특별한 제한은 없다.
세정 방법에 특별한 제한은 없으나, 배취법, 여과법, 또는 충전된 칼럼을 통해 용매를 통과시키는 방법이 통상적으로 사용된다. 세정 조건은 세정 용매의 부피 및 세정 회수를 포함하여, 제거하려는 성분을 농도를 원하는 수준 이하로 낮출 수 있도록, 히알루론산 겔의 형태와 용도를 고려하여 선택할 수 있다.
세정된 히알루론산 겔은, 용도에 따라 용매 중에 침지한 상태, 용매로 습윤된 상태, 또는 공기-건조, 감압 건조 또는 동결-건조 후의 건조 상태에서, 생체의학 재료로서 사용된다.
히알루론산 겔의 성형에 있어서, 제조된 산성 히알루론산 수용액이 제조시에 동결될 경우 용기와 과정의 선택에 의해, 시이트상, 필름상, 플레이크상, 스폰지상, 덩어리상 또는 튜브상 등의 원하는 형태의 히알루론산 겔을 수득할 수 있다. 예를 들어 판상에 동결 캐스팅하여 필름상 또는 시이트상을 수득하고, 물과 혼화하지 않는 유기 용매 중에 격렬히 교반하면서 동결-해동하여 플레이크상을 수득한다.
히알루론산 겔의 제조 후에, 후가공, 예컨대 기계적 분쇄, 압연 또는 방사시켜 겔을 미세한 플레이크상, 필름 등으로 만든다. 그러나, 성형을 위한 특별한 처리를 행하지 않고도 적절한 제조 조건을 선택하여 목적하는 형태의 히알루론산 겔을 수득할 수도 있다. 예를 들어, 히알루론산 농도가 0.1 % 이하, 바람직하게는 0.05 % 이하인 제조된 산성 히알루론산 수용액은 동결-해동 후에 미세 섬유상의 히알루론산 겔을 형성시킨다.
본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔은 히알루론산이 사용되는 임의의 분야에서, 일반적인 생분해성 생체의학 재료로서 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어 유착 방지제, 약리 활성 물질용 담체, 상처용 붕대, 인공 피부, 치환형 생체 조직 회복제, 관절 주입제, 외과 수술용 봉합사, 지혈제, 인공 장기, 인공 세포외 매트릭스, 인공 기저막 또는 진단이나 치료에 사용되는 의료 기구 및 장비 등의 생체의학적 제품 또는 의약 조성물에 사용될 수 있다.
히알루론산 겔의 성형 가공품은 단일 형태뿐만 아니라, 다른 형태와 배합되어 사용될 수 있고, 겔화되지 않은 히알루론산과 혼합 또는 배합시에 효과의 증강이 기대된다.
예를 들어, 개복술 후의 유착 방지제로서 히알루론산 겔 시이트와 히알루론산 용액을 병용하면 국소 효과와 복강내 전체 효과를 기대할 수 있다.
또한, 관절 주입제로서 플레이크상 히알루론산 겔과 히알루론산 용액의 혼합물을 사용하면, 즉각적 효과와 지연 효과를 기대할 수 있다.
이제, 본 발명에 따라 수득되는 히알루론산 겔의 생체의학 재료로서의 유용성은 약리 활성 물질용 서방화 담체로서의 용도를 참고로 하여 기재될 것이다.
본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔은 그 구조 중에 포함된 약리 활성 물질을 서방화하는 담체로서 사용될 수 있다. 이 경우, 약리 활성 물질의 종류, 사용 형태, 사용 부위 및 필요 지속 시간에 따라 히알루론산 겔의 분해성으로 대표되는 특성과 형태를 조절하여, 겔을 다양한 약리 활성 물질에, 및 다양한 사용 형태에 적용할 수 있다.
적당하게 제제화되었을 경우, 목적하는 방식으로 약리 활성 물질을 방출시키는 약제를 수득할 수 있다. 서방화 약제는 경구적, 경피적, 경점막적으로, 주사 또는 이식에 의해 투여될 수 있다.
다음으로, 본 발명의 유착 방지제를 이하 설명한다.
본 발명에 따른 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제는 시이트상, 필름상, 덩어리상, 섬유상 또는 튜브상의 외과 수술용 물질이다. 사용 형태로서는, 필름상 또는 시이트상 물질을 외과 수술 부위에 직접 적용하는 것이 바람직하다. 미세 플레이크상 물질을 주사로 외과 수술 부위에 적용하는 것도 바람직하다. 겔 또는 필름상 물질을 복강내로 외과 수술 부위에 적용하는 것도 바람직하다.
또한, 생리 활성 물질을 포함하는 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제는, 제조된 산성 히알루론산 용액을 생리 활성 물질과 혼합한 후, 상기 혼합물을 동결 및 해동하여 수득할 수 있다.
히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제는 유착으로 고생할 수 있는 임의의 동물에 적용할 수 있고, 유리하게는 포유 동물, 특히 인간에 있어 수술 후의 유착을 방지할 수 있다.
신체내에 투여될 수 있는 어느 곳에서나, 예를 들어 개복술, 부인과 수술 및 개흉술에서 복강 및 흉강 내의 각종 장기, 건외막, 두개골, 신경 및 안구에, 정형 외과 수술에서 건과 인대에, 그리고 신경 외과 수술에서 경막에 유효하다.
본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제는 수술 후의 유착을 방지할 수 있다면 수술 중 또는 수술 후 어느 때라도 투여할 수 있으나, 수술 마지막에 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 히알루론산 겔이 생체의학 재료로서 이상적인 생체적합성 및 존속성, 특히 유착 방지제로서 이상적인 생체적합성 및 존속성을 가지고, 수술 후의 유착을 현저히 방지한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 상기 발견을 토대로 하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (1) 중성 수용액에 난용성인 히알루론산 단독으로 형성된 겔, (2) 25 ℃ 의 중성 수용액 중에 1 일 이상 형태를 유지하는, (1) 에 따른 히알루론산 겔, (3) 25 ℃ 의 중성 수용액 중에 1 일에 50 % 이하의 용해율로 용해하는, (1) 에 따른 히알루론산 겔, (4) 37 ℃ 의 중성 수용액 중에 12 시간에 50 % 이하의 용해율로 용해하는, (1) 에 따른 히알루론산 겔, (5) 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하에 처리한 경우, 용해되어, 분지 구조를 가지고 분지도가 0.5 이상인 분자량 분획을 부분적으로 포함하는 가용화된 히알루론산을 생성시키는 (1) 에 따른 히알루론산 겔, (6) pH 3.5 이하의 히알루론산 수용액을 동결하고, 이어서 해동하여 형성되는, (1) 에 따른 히알루론산 겔, (7) 히알루론산 수용액을 pH 3.5 이하로 조정하고, 상기 용액을 1 회 이상 동결 및 해동하는 것으로 이루어지는, (6) 에 따른 히알루론산 겔의 제조 방법, (8) 하기 (a) 및 (b) 의 요건을 만족하는 히알루론산 단독으로 형성된 겔을 함유하는 생체의학 재료: (a) 히알루론산 겔이 25 ℃ 의 중성 수용액 중에 1 일에 50 % 이하의 용해율로 용해함, 및 (b) 상기 겔을 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하에 처리한 경우, 상기 겔이 용해하여, 분지 구조를 가지고 분지도가 0.5 이상인 분자량 분획을 부분적으로 포함하는 가용화된 히알루론산을 생성시킴, (9) 히알루론산 겔 단독으로 형성된 겔이 시이트상, 필름상, 플레이크상, 스폰지상, 덩어리상, 섬유상 또는 튜브상인, (8) 에 따른 생체의학 재료, (10) 히알루론산 겔 및 겔화되지 않은 히알루론산을 함유하는 생체의학 재료로서, 히알루론산 겔이 중성 수용액 중에 50 % 이하로 용해하고, 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하에 처리한 경우, 히알루론산 겔이 용해하여, 분지 구조를 가지고 분지도가 0.5 이상인 분자량 분획을 부분적으로 포함하는 가용화된 히알루론산을 생성시키는 생체의학 재료, (11) 시이트상, 필름상, 스폰지상, 덩어리상, 섬유상 또는 튜브상인 히알루론산 단독으로 형성된 히알루론산 겔, 및 겔화되지 않은 히알루론산을 함유하는 생체의학 재료, 및 (12) 생체의학 재료가 유착 방지제인 (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 따른 생체의학 재료.
이제, 실시예를 참고로 본 발명을 다시 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 특정 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1
분자량이 2 ×106Da 인 히알루론산 나트륨을 증류수에 용해시켜, 1 중량% 의 히알루론산 수용액을 수득한다. 수득한 히알루론산 수용액의 pH 는 6.0 이다. 1 N 염산으로 수용액의 pH 를 1.5 로 조정한다. 산성 히알루론산 수용액 15 ml 를 30 ml 유리병에 넣고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 16 시간 방치한 후, 25 ℃ 에서 해동하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다.
실시예 2
실시예 1 에서, 히알루론산 수용액의 제조시에 히알루론산 농도를 0.1 중량% 로 변경하고, 이어서 실시예 1 에서와 동일한 조작을 수행하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다.
실시예 3
실시예 1 에서, 분자량이 6 ×105Da 인 히알루론산을 용해시켜 히알루론산 수용액을 수득한다. 실시예 1 에서와 동일한 조정 작업 후, 수득한 수용액을 -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣고, 6 시간 이상 동결하고 25 ℃ 에서 2 시간 이상 해동하는 것을 5 회 반복하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다.
실시예 4
실시예 1 에서, 동결 온도를 -10 ℃ 로 설정한다. -10 ℃ 에서 77 시간 동결하고, 이어서 25 ℃ 에서 해동하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다.
실시예 5
실시예 1 에서, 0.4 중량% 의 히알루론산 수용액으로부터 pH 2.5 의 산성 히알루론산 수용액을 제조한다. 산성 히알루론산 수용액 15 ml 를 30 ml 유리병에 넣고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣는다. 6 시간 이상 동결하고 25 ℃ 에서 2 시간 이상 해동하는 것을 8 회 반복하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다.
비교예 1
실시예 1 에서, 히알루론산 수용액을 pH 조정없이, 동결 및 해동을 8 회 반복한다. 히알루론산의 수용액에는 변화가 없다. 즉, 겔화가 일어나지 않는다.
비교예 2
실시예 1 에서 제조한 히알루론산 수용액을 60 ℃ 에서 공기-건조하여, 두께 약 100 ㎛ 의 캐스트 필름을 수득하고, 이것을 히알루론산 겔의 용해성 시험에 사용한다.
비교예 3
실시예 1 에서 제조한 히알루론산 수용액을 -20 ℃ 에서 동결하고 동결-건조하여, 히알루론산 스폰지를 수득하고, 이것을 히알루론산 겔의 용해성 시험에 사용한다.
실시예 6
히알루론산 겔의 용해성 시험
생리 식염수에 50 mM 농도로 인산염 완충액을 첨가하여, pH 7 의 인산염 완충액-생리 식염수를 제조한다. 상기 실시예에서 수득한 스폰지상의 히알루론산 겔을 증류수로 세척하고, 거름 종이위에서 탈수한다. 겔 중의 건조 히알루론산 150 mg 에 대하여 50 ml 의 인산염 완충액-생리 식염수에, 히알루론산 겔을 침지한다.
비교예에서 수득한 히알루론산 고형물을, 건조 중량으로 150 mg 에 대하여 50 ml 의 인산염 완충액-생리 식염수에 침지한다.
25 ℃ 의 인산염 완충액-생리 식염수에서 히알루론산의 용해율을, 인산염 완충액-생리 식염수 중의 히알루론산 농도로부터 수득한다.
즉, 25 ℃ 의 중성 수용액 중의 히알루론산 겔의 용해성은 상기 시험에 따라 정의된다.
히알루론산 농도 측정
인산염 완충액-생리 식염수 중의 히알루론산의 농도는 시차 굴절율계를 검출기로서 사용하여 GPC 피크의 면적으로부터 수득한다.
전술한 바와 같이, 실시예 1 내지 4 에서 수득한 히알루론산 겔 및 비교예 2 및 3 에서 수득한 히알루론산 고형물에 대해 용해성 시험을 실제로 수행한다. 그 결과를 히알루론산 겔의 형태를 육안으로 관찰한 결과와 함께 표 1 에 나타낸다.
예를 들어 시험 1 에서, 실시예 1 에서 수득한 히알루론산 겔의 용해율은 1 일 경과 후 3 %, 4 일 경과 후 5 % 및 7 일 경과 후 6 % 로 나타났다.
즉, 7 일 경과 후에도 94 % 의 히알루론산이 잔존하고 있다. 스폰지상의 형태도 유지되고 있다. 시험 5 에서, 비교예 2 에서 수득한 두께 약 100 ㎛ 의 캐스트 필름의 용해율은 1 일 경과 후 100 % 이고, 이는 완전 용해를 나타낸다.
4 일 경과 후 및 7 일 경과 후에도 완전히 용해된 상태를 지속하고 있다.
그러므로, 비교예에서 수득한 히알루론산 고형물은 수중에서 용해 속도가 극히 빠르지만 (시험 5 내지 6), 본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔은 용해 속도가 극히 느리다 (예를 들어, 시험 1 내지 4) 는 것이 발견되었다.
이 결과는 본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔이 생체내 체류 시간이 더 길다는 것을 시사한다.
시험 번호 히알루론산 겔의 용해율 (상계 %) 와 형태 (하계) 비고
1일 후 4일 후 7일 후 14일 후
1234 3스폰지상2스폰지상9스폰지상3스폰지상 5스폰지상4스폰지상14스폰지상5스폰지상 6스폰지상6스폰지상28스폰지상7스폰지상 10스폰지상15스폰지상38스폰지상11스폰지상 실시예 1실시예 2실시예 3실시예 4
56 100(완전 용해)100(완전 용해) 1일 후의 상태 유지1일 후의 상태 유지 1일 후의 상태 유지1일 후의 상태 유지 1일 후의 상태 유지1일 후의 상태 유지 비교예 2비교예 3
비교예 4
분자량이 2 ×106Da 인 히알루론산 나트륨 분말을 히알루론산 겔의 용해성 시험에 사용한다.
비교예 5
분자량이 2 ×106Da 인 히알루론산 나트륨 분말을 원반형 펠렛으로 가압 성형한다. 상기 펠렛을 히알루론산 겔의 용해성 시험에 사용한다.
실시예 7
히알루론산 겔의 용해성 시험
생리 식염수에 50 mM 농도로 인산염 완충액을 첨가하여, pH 7 의 인산염 완충액-생리 식염수를 제조한다. 상기의 실시예에서 수득한 스폰지상의 히알루론산 겔을 증류수로 세척하고, 거름 종이위에서 탈수한다. 겔 중의 건조 히알루론산 20 mg 에 대하여 50 ml 의 인산염 완충액-생리 식염수에, 히알루론산 겔을 침지한다.
비교예에서 수득한 히알루론산 고형물을, 건조 중량으로 20 mg 에 대하여 50 ml 의 인산염 완충액-생리 식염수에 침지한다.
37 ℃ 의 인산염 완충액-생리 식염수에서 히알루론산의 용해율을, 인산염 완충액-생리 식염수 중의 히알루론산 농도로부터 수득한다.
즉, 37 ℃ 의 중성 수용액 중의 히알루론산 겔의 용해성은 상기 시험에 따라 정의된다.
전술한 바와 같이, 실시예 1 내지 4 에서 수득한 히알루론산 겔 및 비교예 2 내지 5 에서 수득한 히알루론산 고형물에 대해 용해성 시험을 실제로 수행한다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.
시험 번호 히알루론산 겔의 용해율 (%) 비고
1일 후 4일 후 7일 후
78910 12121312 14162215 16192318 실시예 1실시예 2실시예 3실시예 4
11121314 100 (완전 용해)100 (완전 용해)100 (완전 용해)100 (완전 용해) 6시간 후의 상태 유지6시간 후의 상태 유지6시간 후의 상태 유지6시간 후의 상태 유지 6시간 후의 상태 유지6시간 후의 상태 유지6시간 후의 상태 유지6시간 후의 상태 유지 비교예 2비교예 3비교예 4비교예 5
예를 들어 시험 7 에서, 실시예 1 에서 수득한 히알루론산 겔의 용해율은 12 시간 경과 후 14 % 이고 24 시간 경과 후 16 % 로 나타났다.
즉, 24 시간 경과 후에도 84 % 의 히알루론산 겔이 잔존하고 있다. 반면 시험 11 에서, 비교예 2 에서 수득한 두께 약 100 ㎛ 의 캐스트 필름의 용해율은 6 시간 경과 후 100 % 이고, 이는 완전 용해를 나타낸다.
그러므로, 비교예에서 수득한 히알루론산 고형물은 수중에서 용해 속도가 극히 빠르지만 (시험 11 내지 14), 본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔은 용해 속도가 극히 느리다 (예를 들어, 시험 7 내지 10) 는 것이 발견되었다.
이 결과는 본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔이 생체내 체류 시간이 더 길다는 것을 시사한다.
실시예 8
히알루론산 겔의 가용화 시험
염산으로 증류수의 pH 를 1.5 로 조정한다. 실시예 1 에서 수득한 스폰지상의 히알루론산 겔을 증류수로 세정한 후, 실시예 6 에 기재된 인산염 완충액-생리 식염수에서 세정하고, 증류수로 세정한다. 세정한 히알루론산 겔을 동결-건조한다. 건조 히알루론산 15 mg 에 대해, pH 1.5 의 수용액 15 ml 에 상기의 히알루론산 겔을 침지한다. 이 용액을 60 ℃ 로 설정한 오븐 중에 방치한다. 2 시간 후, 6 시간 후 및 12 시간 후에 0.5 ml 의 시료를 빼낸다. 6 시간 후, 히알루론산 겔은 거의 소실해 있고, 육안으로 확인할 수 없다.
비교예 6
분자량이 2 ×106Da 인 히알루론산 나트륨을 증류수에 용해시켜, 0.1 중량% 의 히알루론산 수용액을 수득한다. 1 N 염산으로 수용액의 pH 를 1.5 로 조정한다. 직쇄형 히알루론산의 산가수분해를 위해, 산성 히알루론산 수용액 15 ml 를 60 ℃ 의 오븐 중에 4 시간 동안 방치한다.
실시예 9
가용화된 히알루론산의 분자량과 분지도 측정
GPC-MALLS 측정을 위해, 실시예 8 에서 수득한 가용화된 히알루론산, 및 비교예 6 에서 수득한 직쇄형 히알루론산의 산가수분해물을 GPC 용출액으로 2 배로 희석하여 0.05 중량% 로 만들고, 0.2 ㎛ 의 멤브레인 필터를 통해 여과하고, 이 중 0.1 ml 를 주입한다.
GPC 칼럼 SB806HQ (Showa Denko K.K.), 검출기로서 시차 굴절율계 830-RI (JASCO Corporation), MALLS DAWNDSP-F (Wyatt), 용출액으로서 질산 나트륨 0.2 M 수용액을 사용하여, 40 ℃, 0.3 ml/분의 유속에서, 1 데이타/2 초의 간격으로 측정한다. 산란 강도의 측정을 위해, 산란 각도 21.7 °내지 90 °인 8 개의 검출기를 사용한다. 데이터 처리를 위해, 소프트웨어인 ASTRA Version 4.10 (Wyatt) 를 사용한다.
전술한 바와 같이, 실시예 8 에서 수득한 가용화된 히알루론산, 및 비교예 6 에서 수득한 직쇄형 히알루론산의 산가수분해물을 검사한다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
시험 번호 반응 시간 (시간) 중량평균분자량 분자량 분포Mw/Mn 가용화율 (%) 비고
15 16 17 18 2 6 12 4 36.8 ×10437.8 ×10410.7 ×10424.7 ×104 1.8 2.4 1.8 1.6 28 86 97 - 실시예 8 실시예 8 실시예 8 비교예 6
예를 들어 시험 15 에서, 반응 시간 2 시간 경과 후에 꺼낸 경우 실시예 8 에서 수득한 히알루론산 겔의 가용화율이 작은 것으로 나타났다. 시험 17 에서, 반응 시간 12 시간 경과 후에 꺼낸 시료는, 분자량이 크게 저하되어 분지도 측정이 곤란하게 된다. 시험 16 에서, 반응 시간 6 시간 경과 후 꺼낸 경우, 히알루론산 겔의 가용화율이 크고, 큰 분자량 분포도인 2.4 는 분지형 히알루론산의 존재를 반영한다.
반응 시간 6 시간 경과 후, 실시예 8 에서 수득한 가용화된 히알루론산, 및 비교예 6 에서 수득한 직쇄형 히알루론산의 산가수분해물의 GPC 크로마토그램, 및 각각 시험 16 및 18 에서 수득한 이들의 분지도 계산 결과가 각각 도 1 및 도 2 에 각각 나타나 있다.
도 1 로부터 알 수 있듯이, 실시예 8 에 대한 GPC 크로마토그램 1 은 비교예 6 에 대한 GPC 크로마토크램 2 보다 고분자량 범위에 치우친다. 동일 용출 부피에서 분획의 분자량을 비교하면, 실시예 8 에 대한 분자량이, 분자량 약 200,000 이상의 영역에 해당하는 용출 부피 8.6 ml 이하에서 비교예 6 보다 명확하게 큰 분자량을 가지는 것을 알 수 있다.
실시예 8 에 대한 분획은 분지형 히알루론산이 존재하기 때문에, 동일 용출 부피에서 비교예 6 에 대한 분획보다 분자량이 더 크다.
도 2 는 비교예 6 의 직쇄형 히알루론산을 기준으로 계산한 실시예 8 에 대한 분지도와 분자량의 관계를 나타낸다. 분지도는 동일 용출 부피에서 수학식 2 및 3 을 사용하여 실시예 8 및 비교예 6 에 대한 분획의 분자량으로부터 계산한다.
도 2 는, 실시예 8 에 대해 분지도가, 분자량 200,000 이상의 영역에서 0.5 로부터 급속히 증대하여 가는 것을 보여주고 , 이것은 본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔이, 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하에서도 안정한 가교 구조를 포함하고 있다는 것을 보여준다.
실시예 10
히알루론산 겔의 알칼리성 완충 수용액 중에서의 침지 시험
실시예 1 에서 수득한 스폰지상의 히알루론산 겔을 증류수로 세정한 후, 실시예 6 에 기재된 인산염 완충액-생리 식염수에서 세정하고, 증류수로 세정한다. 세정한 히알루론산 겔을, 겔 중의 건조 히알루론산 150 mg 에 대해 25 ℃ 에서 50 ml 의 pH 11 의 인산수소 이나트륨-수산화 나트륨 25 mM 완충액에 침지하고 방치하며, 그 결과로 겔은 빨리 용해하고, 1 시간 후에 완전히 용해한다. 유사하게, 겔을 pH 10 의 탄산수소나트륨-수산화 나트륨 25 mM 완충액에 침지한 경우, 7 시간 후에는 형태가 붕괴되어 18 시간 후에 완전히 용해한다.
본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔은, 중성 수용액 중에는 난용성이지만, 알칼리성 수용액 중에는 빨리 용해하는 특징을 가지는 것을 알 수 있다.
실시예 11
히알루론산의 팽윤도 측정
실시예 1 에서 수득한 스폰지상 히알루론산 겔을 증류수로 세정한 후, 실시예 6 에 기재된 인산염 완충액-생리 식염수에서 세정하고, 증류수로 세정한다. 이어서 세정한 히알루론산 겔을 동결-건조한다.
건조 기준으로 100 mg 인 히알루론산 겔을 증류수 200 ml 에 침지하고, 25 ℃ 에서 24 시간 동안 방치한다. 팽윤한 히알루론산 겔을 꺼내고, 거름 종이위에서 탈수하고, 중량을 측정한다. 팽윤 비율은 117 이다.
본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔은 측정가능하고 안정한 팽윤 비율을 가지는 것을 알 수 있다.
실시예 12
히알루론산 겔의 세포독성 시험
본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔의 존재하에 비접촉시켜, 정상인 인간 피부 유래의 섬유아세포 배양의 증식 거동을 관찰하여, 본 발명에 따른 히알루론산 겔의 세포 독성을 평가한다. 실시예 1 에서 수득한 스폰지상 히알루론산 겔을 실시예 8 에서와 동일하게 동결-건조한다. 동결-건조된 겔을 기계적으로 분쇄하고, 분쇄된 겔 20 mg 을 세포 배양 삽입물(세공 크기:3 ㎛, Falcon) 에 놓고, 세포 배지에 침지한다. 대조군 실험을 위해, 히알루론산 부재하에 배양을 수행한다.
배양 조건 플레이트: 세포 배양용 12 웰 플레이트
배지: PDMEM 배지 + 10 % 소 태아 혈청, 2 ml/웰
온도: 37.5 ℃ (5 % CO2하)
세포수: 1 ×104세포/웰
배양 개시 후 2 일, 5 일 및 8 일 후에, 세포 배지를 도립 현미경하에 세포 밀도에 대해 관찰한다. 그 결과, 히알루론산 겔이 존재하여도 대조군 실험과 만족스럽게 세포 배지 증식하고, 이로써 본 발명에 따라 수득한 히알루론산 겔에는 세포 독성이 없는 것이 확인되었다.
실시예 13
분자량이 2 ×106인 히알루론산 나트륨을 증류수에 용해시켜, 1 중량% 의 히알루론산 수용액을 수득한다. 1 N 염산으로 수용액의 pH 를 1.5 로 조정하여, 산성 히알루론산 수용액을 수득한다. 산성 히알루론산 수용액 25 ml 를 플라스틱 페트리 접시에 놓고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣는다. 22 시간의 동결과 25 ℃ 에서 2 시간의 해동을 2 회 반복하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다. 이어서 겔을, 생리 식염수에 50 mM 농도로 인산염 완충액을 첨가하여 제조한 pH 7 의 인산염 완충액-생리 식염수 100 ml 에, 중화를 위해 5 ℃ 에서 24 시간 침지한 후, 증류수로 충분히 세정한다. 겔을 2 개의 판 사이에서 프레스하고, 동결-건조하여, 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지 시이트를 수득한다.
실시예 14
분자량이 6 ×105Da 인 히알루론산 나트륨을 사용하는 것 이외는 실시예 13 과 동일한 과정을 반복하여, 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지 시이트를 제조한다.
실시예 15
실시예 13 에서 제조한 분자량 2 ×106Da, pH 1.5 의 산성 히알루론산 수용액 25 ml 를 플라스틱 페트리 접시에 놓고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣는다. 22 시간의 동결과 25 ℃ 에서 2 시간의 해동을 2 회 반복하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다. 이어서 겔을 실시예 13 에서와 동일하게 인산염 완충액-생리 식염수에 침지하고, 세정하고, 2 장의 판 사이에서 프레스한다. 이어서 겔을 30 ℃ 에서 3 시간 동안 공기-건조하여 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지 필름을 수득한다.
실시예 16
실시예 13 에서 수득한 히알루론산 시이트 50 mg 를 무균적으로 10 ml 의 생리 식염수에서, 미세균질화기 (POLYTORON, KINIMATICA AG) 에서 분쇄하여, 히알루론산 겔로 형성된 플레이크상 유착 방지제를 수득한다.
실시예 17
실시예 13 에서 제조한 분자량 2 ×106Da, pH 1.5 의 산성 히알루론산 수용액 15 ml 를 30 ml 용기에 넣고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣는다. 22 시간의 동결과 25 ℃ 에서 2 시간의 해동을 2 회 반복하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다. 이어서 겔을, 생리 식염수에 50 mM 농도로 인산염 완충액을 첨가하여 제조한 pH 7 의 인산염 완충액-생리 식염수 100 ml 에, 중화를 위해 5 ℃ 에서 24 시간 침지한 후, 증류수로 충분히 세정한다. 겔을 직접 동결-건조하여, 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지 스폰지를 수득한다.
실시예 18
실시예 13 에서 제조한 분자량 2 ×106Da, pH 1.5 의 산성 히알루론산 수용액 15 ml 를 30 ml 용기에 넣고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣는다. 22 시간의 동결과 25 ℃ 에서 2 시간의 해동을 2 회 반복하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다. 겔을 실시예 13 에서와 동일하게 인산염 완충액-생리 식염수에 침지하고, 세정한 후, 원심 분리에 의해 탈수하고, 컴팩트 상태로 동결-건조하여, 히알루론산 겔로 형성된 생체의학용 덩어리를 수득한다.
실시예 19
분자량이 2 ×106Da 인 히알루론산 나트륨을 증류수에 용해시켜 0.05 % 농도로 하고, 1 N 염산으로 pH 를 1.5 로 조정한다. 산성 히알루론산 수용액 100 ml 를 200 ml 의 용기에 넣고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣는다.
22 시간의 동결과 25 ℃ 에서 2 시간의 해동을 2 회 반복하여, 섬유상의 히알루론산 겔을 수득한다. 겔을 여과에 의해 수집한 후, 실시예 13 에서와 동일하게 인산염 완충액-생리 식염수에 침지하고, 세정 및 동결-건조하여, 히알루론산 겔로 형성된 섬유상의 생체의학용 재료를 수득한다.
실시예 20
실시예 13 에서 제조한 분자량 2 ×106Da, pH 1.5 의 산성 히알루론산 수용액 5 ml 를 튜브형 주형에 붓고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣는다. 22 시간의 동결과 25 ℃ 에서 2 시간의 해동을 2 회 반복하여, 튜브상의 히알루론산 겔을 수득한다. 겔을 실시예 13 에서와 동일하게 인산염 완충액-생리 식염수에 침지하고, 세정 및 동결-건조하여, 히알루론산 겔로 형성된 생체의학용 튜브를 수득한다.
실시예 21
실시예 13 에서 제조한 분자량 2 ×106Da, pH 1.5 의 산성 히알루론산 수용액 25 ml 를 플라스틱 페트리 접시에 놓고, -20 ℃ 로 설정한 냉동고에 넣는다. 22 시간의 동결과 25 ℃ 에서 2 시간의 해동을 2 회 반복하여, 스폰지상의 히알루론산 겔을 수득한다. 겔을 실시예 13 에서와 동일하게 인산염 완충액-생리 식염수에 침지하고, 세정한다. 약하게 탈수한 후, 겔을 1 중량% 의 히알루론산 수용액 5 ml 로 함침하고, 2 개의 판 사이에서 프레스하고 동결-건조하여, 히알루론산과 연결된 히알루론산 겔의 유착 방지 시이트를 수득한다.
비교예 7
실시예 13 에서 제조한 히알루론산 수용액을 1 N 수산화 나트륨으로 pH 7.0 으로 조정하고, 수용액의 25 ml 를 플라스틱 페트리 접시상에서, -20 ℃ 에서 동결하고 동결-건조하여, 히알루론산 시이트를 수득한다.
비교예 8
실시예 13 에서 제조한 히알루론산 수용액을 1 N 수산화 나트륨으로 pH 7.0 으로 조정하고, 수용액의 25 ml 를 플라스틱 페트리 접시상에서, 60 ℃ 에서 공기-건조하여 히알루론산 시이트를 수득한다.
비교예 9
실시예 13 에서 제조한 히알루론산 수용액을 1 N 수산화 나트륨으로 pH 7.0 으로 조정하고, 수용액의 25 ml 를 비이커에서, -20 ℃ 에서 동결하고 동결-건조하여 히알루론산 스폰지를 수득한다.
비교예 10
2 % 의 수산화 나트륨으로 pH 10 으로 조정된, 1.1 g 의 인산수소 이나트륨 수화물의 30 g 의 물 중의 용액에, 분자량 6 ×105Da 의 히알루론산 나트륨 0.6 g 을 용해시킨다. 이어서 1.5 ml 의 디옥산 중의 염화 시아눌 0.05 g 을 상기 히알루론산 용액에 첨가하고, 3 시간 동안 실온에서 반응시킨다. 이어서, 반응 용액을 투석막에 넣고, 1 일간 물에 대하여 투석하고, 틀에 끼운 유리판에 붓고 건조하여, 필름을 수득한다.
실시예 22
히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료의 용해성 시험
생리 식염수에 인산염 완충액을 첨가하여, pH 7 의 인산염 완충액-생리 식염수 50 mM 를 제조한다. 건조 기준으로 150 mg 의 히알루론산을 함유하는 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료를 50 ml 의 인산염 완충액-생리 식염수에서 약하게 흔든다. 25 ℃ 에서 인산염 완충액-생리 식염수 중에서, 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료의 용해성을 그의 형태로부터 구한다.
전술한 바와 같이, 실시예 13 내지 21 및 비교예 7 내지 9 에서 수득한 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료에 대해 용해성 시험을 실제로 수행한다. 그 결과를 표 4 에 나타낸다.
시험 번호 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료의 형태 비고
1일 후 4일 후 7일 후
192021222324252627 불변불변불변불변불변불변불변불변불변 불변일부 용해불변일부 용해불변불변불변불변일부 용해 일부 용해일부 용해일부 용해일부 용해불변불변일부 용해일부 용해일부 용해 실시예 13실시예 14실시예 15실시예 16실시예 17실시예 18실시예 19실시예 20실시예 21
282930 완전 용해완전 용해완전 용해 1일 후의 상태 유지1일 후의 상태 유지1일 후의 상태 유지 1일 후의 상태 유지1일 후의 상태 유지1일 후의 상태 유지 비교예 7비교예 8비교예 9
표 4 로부터 알 수 있듯이, 실시예에서 수득한 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료 (시험 19 내지 27) 는 25 ℃ 의 중성수용액 중에 7 일 후에도 불변이거나 일부 용해되고, 1 일 이상 형태를 유지할 수 있는 반면, 비교예에서 수득한 히알루론산의 단순한 성형된 시이트 및 스폰지 (시험 28 내지 30) 는 1 일에 완전 용해한다.
실시예 23
히알루론산 겔의 유착 방지제 및 생체의학 재료의 용해성 시험
생리 식염수에 인산염 완충액을 첨가하여, pH 7 의 인산염 완충액-생리 식염수 50 mM 를 제조한다. 건조 기준으로 150 mg 의 히알루론산을 함유하는 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료를 50 ml 의 인산염 완충액-생리 식염수에서 약하게 흔든다. 37 ℃ 에서 인산염 완충액-생리 식염수 중에 용해된 히알루론산의 비율은 인산염 완충액-생리 식염수의 히알루론산 농도로부터 구한다.
히알루론산 농도의 측정
인산염 완충액-생리 식염수 중의 히알루론산의 농도는 시차 굴절율계를 검출기로서 사용하여 GPC 피크의 면적으로부터 수득한다.
전술한 바와 같이, 실시예 13 내지 21 및 비교예 7 내지 9 에서 수득한 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료에 대해 용해성 시험을 실제로 수행한다. 그 결과를 표 5 에 나타낸다.
시험 번호 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료의 용해율 (%) 비고
12 시간 후 1일 후 4일 후 7일 후
313233343536373839 61568868812 152118211615151421 243826292220262430 295535402826323036 실시예 13실시예 14실시예 15실시예 16실시예 17실시예 18실시예 19실시예 20실시예 21
404142 10010096 100100100 100100100 100100100 비교예 7비교예 8비교예 9
표 5 로부터 알 수 있듯이, 실시예에서 수득한 히알루론산 겔로 형성된 유착 방지제 및 생체의학 재료 (시험 31 내지 39) 는 25 ℃ 의 중성 수용액 중에 7 일에 26 내지 55 % 정도로 용해하고 난용성인 반면, 비교예에서 수득한 히알루론산의 단순한 성형된 시이트 및 스폰지 (시험 40 내지 42) 는 12 시간에 96 내지 100 % 정도로 용해한다.
실시예 24
히알루론산 겔 유착 방지제의 생체적합성 시험 및 생체내 존속성 시험
하기 시험을 위해, 실시예 13 및 14 에서 수득한 히알루론산 겔 시이트의 유착 방지제를 1 cm ×1 cm 의 정방형으로 절단하고, 대조군으로서 비교예 7 에서 수득한 히알루론산 시이트 및 비교예 10 에서 수득한, 염화 시아눌로 가교된 히알루론산을 1 cm ×1 cm 의 정방형으로 절단한다.
12 주된 수컷 DDY 마우스 (평균 체중 33 g) 20 마리 중 5 마리를 히알루론산 겔 (분자량 2 ×106Da) 의 이식에, 5 마리를 히알루론산 겔 (분자량 6 ×105Da) 의 이식에, 및 비교 시험으로서 5 마리를 동결-건조된 히알루론산의 이식에, 남은 5 마리를 염화 시아눌로 가교된 히알루론산의 이식에 사용한다.
이식 시에, 마우스를 넴뷰탈 마취하에 복벽정준선을 따라 약 1.5 cm 절개하고, 각종 히알루론산을 맹장에 놓고 봉합한다.
이식 후 3, 5, 7, 9 및 14 일 후, 각종 히알루론산 겔 및 냉동 건조된 히알루론산으로 이식된 마우스 각각 1 마리를 경부 탈구에 의해 치사시키고, 복부 절개한다. 이어서, 이식 부위의 상태를 관찰한다. 그 후, 복강내를 생리 식염수로 세정하여, 히알루론산 시이트의 잔여물을 포함하여 잔존 히알루론산을 회수한다.
회수된 세정액을 동일 양의 0.02 N 의 수산화 나트륨과 혼합한 후, 1 시간 동안 방치하고 염산으로 중화한다. 이어서, 원심분리하고, 필터(세공 크기 0.45 ㎛) 를 통해 여과한다. 수득한 시료를 GPC 로 분석하여, 시료 중의 히알루론산의 양을 측정한다. 이식한 시이트 중의 히알루론산 양을 기준으로 한 히알루론산 회수율을 계산하고, 이식 부위의 상태 관찰 결과와 함께 표 6 에 나타낸다.
(주): 이상없음 △: 경미한 염증
모든 마우스가 정상적으로 생육하지만, 비교예 10 에서 수득한 염화 시아눌로 가교된 히알루론산으로 이식된 조직에서 경미한 염증이 관찰되는 반면, 히알루론산 겔 및 동결-건조된 히알루론산으로 이식된 조직은 정상이다.
실시예 25
히알루론산 겔 유착 방지제의 마우스 자궁 모델을 사용한 유착 방지 효과에 대한 시험
하기 시험을 위해, 실시예 13 에서 수득한 히알루론산 겔 유착 방지제를 1 cm ×2 cm 의 정방형으로 절단하고, 유사하게 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 용액으로 함침시킨 실시예 13 에서 수득한 히알루론산 겔 유착 방지제, 및 대조군으로서 비교예 7 에서 수득한 히알루론산 시이트, 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 용액 및 비교예 10 에서 수득한 염화 시아눌로 가교된 히알루론산을 1 cm ×2 cm 의 정방형으로 절단한다.
7 주된 암컷 ICR 래트 (체중 25 내지 30 g) 를 복강내 펜토바르비탈 주사에 의해 마취하고, 복벽정준선을 따라 절개한다. 이어서, 각 마우스의 자궁각 (uterine horn) 상에서 요오드를 적용하여 약 10 mm 의 길이로 마모한다. 10 마리의 마우스를 각 처리군에 할당한다. 전술한 히알루론산 겔, 히알루론산 또는 염화 시아눌로 가교된 히알루론산 또는 대조 시험을 위한 무처리의 1 cm ×2 cm 의 장방형의 시이트로 마모 부위를 싼다. 히알루론산 용액의 경우, 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 용액 1 ml 를 각 마모 부위에 적용한다. 히알루론산 겔과 히알루론산 용액을 병용하는 경우, 우선 히알루론산 겔로 마모 부위를 싸고, 복강내에 히알루론산 용액을 첨가한다. 각각의 경우, 5-0 딕손(Dexon)으로 폐복한다.
10 일 후, 무처리하거나, 히알루론산 겔, 히알루론산 겔과 히알루론산 용액의 병용, 히알루론산 시이트, 히알루론산 용액 또는 염화 시아눌로 가교된 히알루론산으로 처리한 각 군의 마우스 10 마리를 경부 탈구에 의해 치사시킨다. 이어서 복벽정중선 절개를 다시 행하고, 유착 형성을 관찰한다. 유착 형성의 판단시에, 매우 얇은 막 유착은 제외하고, 섬유상이며 두껍고, 핀셋으로 당겨도 용이하게 박리되지 않을 정도로 충분히 강한 유착만을 고려한다. 그 결과를 표 7 에 나타낸다.
시험 번호 군 유착 형성 비율 비고
47 무처리 9/10 비교예
48 실시예 13 의 히알루론산 겔 1/10 실시예
49 실시예 13 의 히알루론산 겔 및 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 용액 0/10 실시예
50 비교예 7 의 히알루론산 시이트 5/10 비교예
51 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 용액 6/10 비교예
52 비교예 10 의 염화 시아눌로 가교된 히알루론산 3/10 비교예
표 7 로부터 알 수 있듯이, 유착 형성은 무처리 마우스 10 마리 중 9 마리에서, 단순 히알루론산 시이트로 처리한 10 마리 중 5 마리에서, 히알루론산 용액으로 처리한 10 마리 중 6 마리에서, 그리고 염화 시아눌로 가교된 히알루론산으로 처리된 10 마리 중 3 마리에서 나타났지만, 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 겔 유착 방지제, 및 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 겔 유착 방지제와 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 용액의 배합물은 처리된 10 마리 마우스 중 각각 1 마리 및 0 마리에서 유착을 발생시켰다. 그러므로, 이것은 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 겔 유착 방지제, 및 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 겔 유착 방지제와 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 용액의 배합물이 강한 유착 방지 효과를 가지는 것을 시사한다.
실시예 26
래트 맹장 모델에 대한 히알루론산 겔 유착 방지제의 유착 방지 시험
하기 시험을 위해, 실시예 13 에서 수득한 히알루론산 겔의 유착 방지제, 및 대조군으로서 비교예 7 에서 수득한 히알루론산 시이트와 염화 시아눌로 가교된 히알루론산을 2 cm ×2 cm 의 정방형으로 절단한다.
10 주된 수컷 Wister 래트 (체중 약 250 g) 를 복강내로 케타민 (60 mg/체중 1 kg) 과 실라진 (10 mg/체중 1 kg) 으로 마취하고, 복벽정준선을 따라 절개한다. 맹장을 약 10 ×10 mm 의 영역으로 (약 20 회) 점상의 출혈이 발생하도록 마모시킨다. 각 5 마리의 군에서, 마모 부위를 무처리 (대조군) 하거나, 상기의 히알루론산 겔, 히알루론산 또는 염화 시아눌로 가교된 히알루론산의 2 cm ×2 cm 의 장방형 시이트로 덮고, 이어서 3-0 딕손을 사용하여 폐복한다.
14 일 후, 무처리 및 히알루론산 겔, 히알루론산 시이트 또는 염화 시아눌로 가교된 히알루론산으로 처리한 각 군의 래트 5 마리를 치사시킨다. 이어서 복벽정중선 절개를 다시 행하고, 유착 형성을 관찰한다. 유착 형성의 판단시에, 매우 얇은 막 유착은 제외하고, 섬유상이며 두껍고, 핀셋으로 당겨도 용이하게 박리되지 않을 정도로 충분히 강한 유착만을 고려한다. 그 결과를 표 8 에 나타낸다.
시험 번호 군 유착의 형성 비율 비고
53 무처리 4/5 비교예
54 실시예 13 의 히알루론산 겔 1/5 실시예
55 비교예 7 의 히알루론산 시이트 3/5 비교예
56 비교예 10 의 염화 시아눌로 가교된 히알루론산 2/5 비교예
표 8 로부터 알 수 있듯이, 유착 형성은 무처리 래트 5 마리 중 4 마리에서, 단순 히알루론산 시이트로 처리한 5 마리 중 3 마리에서, 그리고 염화 시아눌로 가교된 히알루론산으로 처리된 5 마리 중 2 마리에서 나타났지만, 실시예 13 에서 제조한 히알루론산 겔의 유착 방지제는 처리된 5 마리 래트 중 1 마리에서 유착을 발생시켰다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 화학적 가교제 또는 화학적 변성제를 사용하지 않고, 난수용성의 히알루론산의 겔을 수득할 수 있다. 화학적 가교제 또는 화학적 변성제를 사용하는 것에 기인하는 생체적합성에 대한 악영향이 피해지고, 히알루론산 겔이 생체내 체류 시간이 길어서 생체적합성 재료 분야에 유용하다. 특히 난수용성인 히알루론산 겔은, (1) 유착 방지제로서 이상적인 생체내 존속성을 가지고, (2) 상처 표면에서의 체류 시간을 대폭 개선하여 수술 후 유착을 효과적으로 억제할 수 있고, 또한 (3) 종래의 화학 변성된 히알루론산의 문제점인 독성과 생체적합성을 완전히 해결할 수 있을 정도로 극히 안정성이 높은, 우수한 유착 방지제를 제공할 수 있다.

Claims (12)

  1. 중성 수용액에 난용성인 히알루론산 단독으로 형성된 겔.
  2. 제 1 항에 있어서, 25 ℃ 의 중성 수용액 중에 1 일 이상 형태를 유지하는 히알루론산 겔.
  3. 제 1 항에 있어서, 25 ℃ 의 중성 수용액 중에 1 일에 50 % 이하의 용해율로 용해하는 히알루론산 겔.
  4. 제 1 항에 있어서, 37 ℃ 의 중성 수용액 중에 12 시간에 50 % 이하의 용해율로 용해하는 히알루론산 겔.
  5. 제 1 항에 있어서, 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하에 처리한 경우, 용해되어, 분지 구조를 가지고 분지도가 0.5 이상인 분자량 분획을 부분적으로 포함하는 가용화된 히알루론산을 생성시키는 히알루론산 겔.
  6. 제 1 항에 있어서, pH 3.5 이하의 히알루론산 수용액을 동결하고, 이어서 해동하여 수득하는 히알루론산 겔.
  7. 히알루론산 수용액을 pH 3.5 이하로 조정하고, 상기 용액을 1 회 이상 동결 및 해동하는 것으로 이루어지는, 제 6 항에 기재된 히알루론산 겔의 제조 방법.
  8. 하기 (a) 및 (b) 의 요건을 만족하는 히알루론산 단독으로 형성된 겔을 함유하는 생체의학 재료:
    (a) 히알루론산 겔이 25 ℃ 의 중성 수용액 중에 1 일에 50 % 이하의 용해율로 용해함, 및
    (b) 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하에 처리한 경우, 겔이 용해하여, 분지 구조를 가지고 분지도가 0.5 이상인 분자량 분획을 부분적으로 포함하는 가용화된 히알루론산을 생성시킴.
  9. 제 8 항에 있어서, 히알루론산 겔 단독으로 형성된 겔이 시이트상, 필름상, 플레이크상, 스폰지상, 덩어리상, 섬유상 또는 튜브상인 생체의학 재료.
  10. 히알루론산 겔 및 겔화되지 않은 히알루론산을 함유하는 생체의학 재료로서, 히알루론산 겔이 중성 수용액 중에 50 % 이하로 용해하고, 히알루론산 산가수분해의 촉진 조건하에 처리한 경우, 히알루론산 겔이 용해하여, 분지 구조를 가지고 분지도가 0.5 이상인 분자량 분획을 부분적으로 포함하는 가용화된 히알루론산을 생성시키는 생체의학 재료.
  11. 히알루론산 단독으로 형성된 시이트상, 필름상, 스폰지상, 덩어리상, 섬유상 또는 튜브상 히알루론산 겔, 및 겔화되지 않은 히알루론산을 함유하는 생체의학 재료.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 유착 방지제인 생체의학 재료.
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