KR19990064308A - 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 전달 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 항원을 전달 수단과 함께 전달하는 방법 및 이 전달 수단을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
제한된 수의 보조제만이 인체 백신에 사용되었으며(프로인트 완전 보조제와 같은 최대 활성 제제의 독성 또는 병원성 때문), B세포 및 T 세포의 증식, 분화 및 활성화와 관련된 지난 20년 이상 동안의 수많은 폴리펩티드의 발견으로 인하여 백신에 대한 응답을 증대시키고, 원하는 경로를 따라 특정 백신에 대한 면역 응답을 유도하는 이들 인자(시토킨)의 사용 가능성에 주목하게 되었다. 이 용도에 대한 필요성은 세포-매개되고 항체-매개된 면역 응답이 상당히 상호 배제적인 응답이라는 것에 역점을 두고 있는 최근 면역학적 발견에 따라 더욱 명백해지고 있다. 항체 형성 또는 작동인자 T-세포 및 대식세포가 활성화되는지의 여부는 제공된 모든 항원, 병원체 또는 백신에 의해 유도된 시토킨의 특정 배열에 따라 결정된다. 가장 중요한 것은 헬터 T 세포의 형태 TH1, 또는 TH2의 기능적인 활성이며, 이는 임의의 특정 항원 또는 침입 병원체에 대한 응답과 관련이 있다.
일반적으로 병원성 인자에 대한 예방 면역이 항체 형성(사세포, 죽어가는 세포 또는 생산성 세포로부터 조직액내로 방출되는 세포외 병원체, 가용성 독소 또는 세포내 병원체) 이나 세포-매개된 응답(세포내 병원체)의 결과로 발생하기 때문에, 원칙적으로 항체 형성 또는 T-세포와 대식세포 활성화 방향으로 백신에 대한 면역 응답을 유도할 수 있는 것이 상당히 유리하다. 백신 접종에 의한 예방 효과가 가능한 한 오래 지속될 수 있도록, 면역 응답의 범위, 지속성 및 기억 성분을 강화시킬 수 있는 것이 중요하다.
이러한 이유에서, 수 많은 연구자들은 백신 보조제로서 시그널링 단백질의 시토킨 망(network)중 1종 이상의 성분을 이용할 수 있는 가능성에 주목하였다. 헬퍼 T세포의 손실 및 이로 인한 시토킨의 생산 손실이 특정 형태의 선천적 또는 후천적 면역 결핍증이 있는 환자가 특정 백신에 응답할 수 없는 것과 관련이 있을 수 있다고 생각할 때 이 접근법은 더욱 중요할 수 있다.
이 목적을 위한 시토킨의 사용에 많은 주의를 기울였지만, 보조제로서 시토킨을 사용한 경우는 보고된 성공사례가 제한되어 있다. 백신 섭생법과 관련하여 적절한 방법으로 보조제 시토킨을 투여하는 것은 상당히 어렵다. 보조제로서 IL-2의 사용에 대한 연구를 참조하면 이 난점을 알 수 있다.
IL-2는 그 주요 기본적인 공급원이 T 헬퍼 1 세포라고 생각되지만 주 활성은 T-세포 증식, 다른 시토킨의 합성, B-세포 증식 및 면역글로블린 합성과 같은 다양한 형태의 면역 응답과 관련이 있다고 생각되기 때문에, 특히 가능한 보조제로서 주목을 받아왔다. 따라서 IL-2는 T 세포 증식 인자로서 처음 개시된 T-세포 유래의 시토킨이다. 지금은 IL-2가 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 대식세포 및 희돌기교세포의 증식 및 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 많은 연구진들에 의해 보고된 일부 IL-2의 보조제 활성은 리포좀 또는 오일성 에멀션내로 병입시킨 IL-2 이용 또는 복수 주입액으로의 시토킨 이용에 따라 달라진다는 것이 밝혀졌다. 이러한 문제점을 제거하기 위해서, 다른 연구진들은 재조합 박테리아 및 비루스 벡터내에서 백신 항원과 IL-2를 동시발현시키거나, 또는 IL-2:항원 융합 단백질을 유전자 조작하였다; 후자의 경우 융합 파트너의 항원성 성분의 면역원성이 현저히 강화된다.
백신의 기타 바람직한 특성은 가능한 무해하고, 가능한 최소한의 투여횟수로 투여후에도 효과적으로 작용하며, 점막 표면을 통한 투여에 적절해야 하며(경구, 비강내 또는 초내), 따라서 피하 주사할 필요가 없으며 전신 면역 응답외에 국부, 점막 면역 응답을 활성화시킨다. 감쇠 생병원체의 계속적인 증식 능력으로 이종 항원의 전달 인자로서 비루스 및 박테리아의 재조합 백신 균주(예, 폭스 비루스 백신 균주, 또는 살모넬라 및 결핵 박테리아 백신 균주)의 용도를 다각도로 연구할 수 있었다.
본 발명자들은 비-병원성, 비-집락성, 비-침입성 식품용 박테리아 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)중 이종 항원의 발현을 위한 시스템을 이미 개발하였다(참고, 영국 특허 GB-2278358B). 또한, 본 발명자들은 락토코커스 락티스가 생체외에서 배양시 생물학적으로 활성인 쥐 IL-2를 생성 및 분비할 수 있다는 것을 이미 밝힌바 있다(Steidler 등, Applied and Environmental Microbiology, 1995년 4월, 제 61권, No. 4, p1627-1629). 그러나, 락토코커스 락티스가 비-침입성(락토코커스 락티스는 공생 박테리아가 아니며, 정상적으로 동물의 점막 표면의 집락화와 관련이 없음)이기 때문에, 이 박테리아는 생체내에서 보조 시토킨의 형성을 요하는 백신화 계획에 성공적으로 사용될 수 있을지가 분명하지 않다. 본 발명자들은 이종 항원이 락토코커스 락티스(세포가 식세포에 의해 분해될 때 생체내에서 누출된다고 추정)의 세포질내에 축적되는 경우 완전히 항원성일 수 있다는 것을 이미 밝힌바 있다(GB-2278358B).
적절한 유전 인자를 조작하여 항원성 폴리펩티드(예를 들어, 파상풍 독소 단편 C- TTFC를 사용) 및 생물학적으로 활성인 시토킨 폴리펩티드(예를 들어, 인터루킨 2 및 인터루킨-6 사용)를 락토코커스 락티스에서 동시발현시키기 위한 핵산 작제물(인조 오페론-대등하게 전사되는 다중유전자 단위체)을 제공한다.
IL-6 시토킨은 생체내 및 생체외에서 쥐 항원-특이적 항체 응답을 증대시키는 능력을 갖는다는 것이 다른 연구진들에 의해서 밝혀졌으며, 또한 본 발명자들은 엘. 락티스에서 IL-6를 위한 발현 단위체를 제조할 수 있었다. IL-6은 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 다면발현 활성을 갖는 것으로 알려진 림프구 및 비-림프구 세포에 의해서 분비되는 다기능 시토킨이다. IL-6은 표적 세포에 따라서, 증식-유도, 증식-억제 및 분화-유도 활성을 나타낼 수 있다. 이들 활성은 T 세포 및 대식 세포의 분화 및/또는 활성화, B세포의 증식 촉진(생체외에서 B 세포 종양주의 증식 촉진으로서 관찰), B세포에서의 말기 증식(면역글로블린의 분비), 및 간의 급성상태 단백질 응답의 유도(전신 작용성)를 포함한다. IL-6의 점막 면역화의 가장 중요한 목적은 IgA-감작된 B세포에서 고 비율의 IgA 분비를 유도하기 위한 것으로 보여진다.
본 발명은 생체내에서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 전달에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신체, 특히 점막에 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 제공하기 위하여 비-침입성 박테리아, 일반적으로 락토코커스(Lactococcus)와 같은 그람-양성 박테리아를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항원에 대하여 상승된 면역 응답을 증대시키는 보조제 효과의 제공에 관한 것이다. 핵산 구조물 및 이를 적용하기 위한 숙주 유기체를 또한 제공한다.
도 1은 플라스미드 구조물의 플로우 개략도이다. 락토코커스 락티스와 같은 유기체에서, 생성 플라스미드 pTTI2는 TTFC 및 IL-2를 발현하는데 사용할 수 있으며, 생성 플라스미드 pTTI6는 TTFC 및 IL-6를 발현하는데 사용할 수 있다.
도 2a는 항원(예, TTFC) 및 생물학적으로 활성인 폴리펩티드(예, IL-2 또는 IL-6와 같은 시토킨)에 대한 암호 서열을 포함하는 오페론 구조물과 같은 유전자를 다중 클로닝 부위(MCS)에 삽입할 수 있는 벡터 pEX1(소위 말하는 pTREX1)을 도시한 것이다.
도 2b는 유전자 MCS(다중 클로닝 부위)에 삽입된 경우, 유전자(다중-(이중)시스트론을 암호하는 서열)의 발현을 위해 실시가능하게 배치된 P1 프로모터, 샤인-달가르노 서열(SD) 및 전사 터미네이터 서열을 보여주는 pEX1(pTREX1)의 영역의 확장도를 도시한 것이다.
도 3은 발현을 위해 사용된 오페론중 TTFC 및 인터루킨 시스트론 사이의 접합 부분을 도시한 것이다.
도 4는 쥐 시토킨 IL-2 또는 IL-6과 함께 파상풍 독소 단편 C(TTFC)를 발현하는 재조합 락토코커스 락티스로 비강내 백신화한 6마리의 마우스 그룹에 TTFC-특이 혈청 IgG의 역가를 도시한 것이다.
본원에서 언급한 모든 문헌은 참고로 인용하였다.
본 발명을 예시하기 위해서, IL-2 및 IL-6의 동시 발현을 위한 오페론은 구성 발현벡터(pTREX1, 또한 pEX1으로도 알려짐)에서 별도로 구조화되어 TTFC 유전자 및 인터루킨 유전자의 전사가 소정의 활성을 갖는 락토코커스의 프로모터 성분의 활성(P1으로 알려짐)에 의해서 조절될 수 있다. 구조물을 제조하여, 인조 오페론으로부터 전사된 mRNA의 해독후에 TTFC 항원을 세포내에서 축적시킨다.
이들 박테리아의 제제를 마우스에게 비강내로 투여하는 경우, 인터루킨-2 또는 인터루킨-6을 발현하도록 유전자 조작된 박테리아는 TTFC를 단독으로 발현하는 구조물보다 약 10배 이상의 항-TTFC 항체를 유도였다. 따라서, 이들중 어느 하나의 인터루킨은 실험계에서 뚜렷한 보조 활성을 소유하는 것이다.
이종 항원을 전달하는 락토코커스 락티스의 능력 또는 생체외 IL-2를 생성하는 능력으로부터 상기 박테리아가 보조 효과를 제공하기 위해서 충분히 활성인 시토킨을 제공할 정도로 생체내 시토킨의 전달을 위한 적절한 매개체인지는 분명하지 않았다. 락토코커스 락티스는 비-침투성이고 비-집락형성성이므로, 이들 박테리아가 예를 들어 점막 표면을 통해 항원을 면역계로 전달하는데 사용되는 경우에는, 점막 림프양 조직에 이웃한 점막 분비물의 함유를 표본으로 M[또는 마이크로폴드(microfold)] 세포에 의한 식작용의 결과로서 박테리아가 림프양 조직에 유입될 것 같다. 극미립자 항원(예, 폴리 엘-락타이드 미세입자내로 혼입된 파상풍 유독소)은 이와 같은 방식으로 수동적으로 림프양 조직내로 유입시키는 반면, 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella) 및 쉬겔라(Shigella) 종과 같은 병원성 박테리아(또는 감쇠된 백신)는 M 세포를 경유한 유입외에 점막 상피 세포내로 유입되도록 활성적으로 자극하므로써 세포 및 조직에 침입할 수 있다. 보조제로서 시토킨의 활성은 복수 주입 또는 지속된 방출 전달을 미리 필요로 한다는 것으로 이미 밝혀졌고(Heath and Playfair (1992 Vaccine 7: 427-434), 락토코커스 락티스 세포가 손상되지 않거나 또는 살아있는 동안 대식세포 내에서의 단백질 분해로부터 시토킨만이 보호되기 때문에, 시토킨을 발현하는 락토코커스 세포가 본원에서 기재한 바와 같이 현저한 보조 활성을 나타낼 것이라는 것은 예상하지 못했다. 하지만, 박테리아 입자의 사멸 및 용해가 항원을 방출시키나 시토킨의 일시적인 생성을 방해하는 것을 이해한다면, 아마도 이를 알 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 락토코커스 락티스에 의한 IL-2 또는 IL-6의 발현이 현저한 보조 효과를 갖는다는 것을 연구 결과 알 수 있었다. 발현인자 박테리아가 점막 경로보다는 비경구 투여에 의해 투여되는 경우에도, 동일한 사항이 적용된다.
따라서, 락토코커스 락티스가 침입성이 아니기 때문에 실제로 이 박테리아는 공생 박테리아가 아니며 또한 그의 영양이 생체내에서 이용할 수 있을 것 같지 않은 아미노산 및 펩티드의 제공에 달려있다. 엘. 락티스의 시토킨 분비 균주가 항체 생성을 증진시킨다는 것은 놀라운 사실이다. 따라서 이들 결과는 무엇보다도 락토코커스 락티스의 재조합 균주가 생체내에서 생물학적으로 활성인 분자의 합성 및 전달에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 특히, IL-6이 IgA 감작된 B 세포에서 고비율로 IgA 분비를 유도할 수 있는 시토킨이므로, 상기 결과가 점막 뿐만 아니라 전신 면역 응답을 증대시킬 가능성을 나타낸다는 사실은 특히 흥미롭다.
락토코커스 락티스가 2개의 다른 재조합 시토킨중 하나를 생물학적으로 활성인 용량으로 전달하고 따라서 이종 항원에 대한 면역 응답을 증대시킬 수 있도록 충분한 시간 동안 점액성 막상에 생물학적 활성을 유지할 수 있다는 사실은 보조 활성 용도외에 폴리펩티드의 전달에 광범위한 적용가능성을 보여준다.
폴리펩티드를 생성하고 분비하는 엘. 락티스 능력은, μM, nM 또는 pM 농도에서 활성으로 알려진 폴리펩티드의 생체내 생성 및 전달을 위해 이들 박테리아를 이용할 수 있는 가능성을 보여준다. 이들 폴리펩티드의 정확한 용량, 및 박테리아 세포의 동시 삽입에 대한 요구는 인체용에서보다 가축용일 때 그 문제점이 보다 적기 때문에, 재조합 폴리펩티드를 전달하기 위한 본 방법은 특히 수의용으로서 더 가치있다. 그러나, 인체 약제에서, 시토킨 생산이 무해한 박테리아 세포의 침착 부위에 제한될 수 있으며, 면역응답의 최초 단계 동안 거의 항원으로 이용가능하다는 사실은 같이 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 독성 전신 부작용을 피할 수 있도록 적소에 위치되는 조건에서 보조 활성과 같은 용도를 촉진시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 방법을 제공한다:
(i) 1종 이상의 폴리펩티드를 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 전달하는 방법;
(ii) 1종 이상의 항원을 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 1종 이상의 항원을 전달하는 방법; 및
(iii) 1종 이상의 항원과 1종 이상의 생물학적으로 활성인 이종 폴리펩티드를 모두 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 전달하는 방법.
생물학적으로 활성인 폴리펩티드는 박테리아에 동종이거나 또는 이종일 수 있으며, 진핵 공급원이나 원핵 공급원, 또는 이의 비루스로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 제 2의 목적은, (i) 1종 이상의 생물학적으로 활성인 이종 폴리펩티드 및 (ii) 1종 이상의 항원을 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 제공하는 것이다.
"생물학적 활성"은 생물학적 기능을 수행하는 능력이며, 폴리펩티드의 경우 본래 구조와 동일하거나 거의 유사한 안정한 구조("중첩된 형태")를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 적당하게 중첩된 단위체, α-나선형, β-시이트, 도메인, 디설파이드교 등의 형성에 의하여 정확하게 또는 거의 정확하게 중첩된 경우, 폴리펩티드는 자연적인 기능을 수행하는 능력을 갖고 있어야 한다. 일반적으로, 폴리펩티드의 기능 단위는 도메인이다.
면역 응답을 유도하거나 또는 유도하지 않고 단지 항체 또는 기타 수용체에 결합하는 능력은 수동적이며, "생물학적 활성"을 포함하지 않는다. 임의의 항원은 항체에 의해 결합될 능력을 갖고 있으나, 반드시 생물학적으로 활성인 것은 아니다.
"이종" 폴리펩티드는 박테리아 고유의 것이 아닌 것, 즉 본래의 박테리아, 또는 폴리펩티드를 암호하는 핵산을 박테리아 또는 이의 조상내로 도입하기 전의 박테리아에 의해서 발현되지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 박테리아는 일반적으로 그람-양성이며, 기본적으로 무해한 박테리아일 수 있다(예, 리스테리아 인노큐아(Listeria innocua), 스타필로코커스 크실로서스(Staphylococcus xylosus)또는 락토코커스). 락토코커스종, 특히 락토코커스 락티스는 본 발명의 바람직한 일양태이다. 이러한 박테리아는 비-집락형성성이다.
당업자라면 본 발명의 방법이 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 전달하는데 사용할 수 있다는 것을 명백히 알 것이다.
적절한 폴리펩티드의 예는 국부적으로 또는 전신적으로 작용할 수 있는 것, 예를 들면, 국부 또는 전신 대사에 영향을 주는 내분비 활성을 상승시킬 수 있는 폴리펩티드; 및/또는 면역조혈계에 속하는 세포의 활성을 조절할 수 있는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드(들); 및/또는 신체의 각종 정상 세포 또는 신생 세포의 생존도, 증식 및 분화에 영향을 주거나 또는 상처와 감염에 대한 급성 염증 응답의 유발 또는 면역 조절에 영향을 줄 수 있는 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드; 및/또는 표적 세포 수용체에 작용하는 케모킨에 의해 매개되는 세포와 조직의 감염에 대한 저항성, 또는 상피세포의 증식이나 상처 치유의 촉진을 증대시키거나 또는 유도할 수 있는 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드(들); 및/또는 신체에서 세포에 의한 물질의 발현 또는 생성을 조정하는 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함한다.
이러한 폴리펩티드의 특정 예는 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 성장 억제 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 혈관작용 장 폴리펩티드; IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL 또는 IFNα/β와 같이 역평행한 4α 나선형 다발을 포함하는 구조적 그룹 1 시토킨; 종종 세포-표면 관련되어 있고, 대칭적인 동종삼량체를 형성하며, 각 서브유니트는 특정 비루스 코트 단백질용으로 알려진 β-젤리 롤의 구조를 갖으며, 예를 들면 TNFα, TNFβ, CD40, CD27 또는 FAS 리간드와 같은 시토킨의 TNF계, 시토킨의 IL-1계, 섬유아세포 증식 인자계, 혈소판 유도된 증식 인자, 형질전환 증식 인자 β 및 신경 증식 인자를 포함하는 구조적 그룹 2 시토킨; 세포외 영역에 1종 이상의 EGF 도메인을 각각 포함하는 거대 경막 전구체 분자로서 생성되는 단쇄 α/β 분자, 예를 들면 시토킨의 상피 증식 인자계, 보존된 시스테인 잔기 주변에 그룹을 형성한 아미노산 서열을 갖는 것이 특징인 케모킨(C-C 또는 C-X-C 케모킨 아군) 또는 인슐린 관련 시토킨을 포함하는 구조적 그룹 3 시토킨; 여러 도메인, 예를 들어 EGF, 면역글루블린 유사 도메인 및 크링글 도메인으로 구성된 헤레귤린(heregulin) 또는 뉴레귤린(neuregulin)과 같은 모자이크 구조를 나타내는 구조적 그룹 4 시토킨을 포함한다.
대안적으로, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드는 전술한 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용체 또는 길항물질일 수 있다.
박테리아는 내부에 포함된 핵산으로부터 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 및 항원을 발현한다. 핵산은 1종 이상의 핵산 구조물을 포함하며, 이 구조물내에는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호하는 핵산 및 항원을 암호하는 핵산이 박테리아에서 발현하기 위해서 적절한 조절 서열의 통제하에 있다.
박테리아내로 삽입하기 위한 핵산을 포함하는 적절한 벡터는 프로모터 서열, 종결인자 단편, 증강 서열, 표식 서열 및 기타 적당한 서열을 비롯하여, 적절한 조절 서열을 포함하도록 선택되거나 구조화될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파아지와 같은 비루스, 또는 파아지미드일 수 있다. 더욱 상세한 설명은 예를 들어, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook 등, 1989, 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스를 참조. 예를 들어, 핵산 구조물의 제조, 변이, 서열화, 세포내로 DNA 삽입과 유전자 발현과 같은 핵산의 조작 및 단백질의 분석에 대한 다수의 공지된 기술 및 계획안은 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, 2판, Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 개시되어 있다. Sambrook 등 및 Ausubel 등의 문헌은 본원에서 참고로 인용하였다.
바람직한 일양태에서, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 및 항원을 암호하는 서열은 오페론, 즉 다수-시스트론 발현을 위한 핵산 구조물에 포함되어 있다. 오페론에서, 프로모터로부터의 전사는 1종 이상의 암호 서열을 포함하는 mRNA를 형성하며, 각각은 리보좀 결합 부위 상류에 적절하게 배치된다. 따라서, 1종 이상의 폴리펩티드는 단일 mRNA로부터 해독될 수 있다. 오페론의 사용은 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 및 항원의 발현을 조정할 수 있다.
또 다른 일양태에서, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 및 항원을 암호하는 서열은 동일한 핵산 벡터, 또는 별도의 벡터의 일부분이며, 각각은 분리된 프로모터의 조절 통제하에 존재한다. 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 제 3의 목적은 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호하는 서열 및 항원을 암호하는 서열을 포함하는 핵산 구조물 또는 벡터를 제공하는 것으로서, 각각의 암호 서열은 오페론으로서든 아니든 비-침입성 박테리아(개시된 바와 같이, 락토 코커스와 같은 비-공생 및/또는 비-전이증식성 박테리아)의 발현용 프로모터의 통제하에 존재한다.
본 발명에 따라 사용된 프로모터는 박테리아에서 구조적으로 발현되는 것이 바람직하다. 구조적 프로모터의 사용은 유발인자 또는 발현의 개시를 위한 기타의 조절 시그날에 대한 요구를 제거할 수 있다. 프로모터는 박테리아 숙주 세포가 생존할 수 있는 농도도, 즉 증식이 유지되지 않더라도 일부 대사 활성을 보유하는 농도로 발현을 유도하는 것이 바람직하다. 이어서, 이러한 발현은 낮은 농도로 발생하는 것이 유리하다. 예를 들어, 발현 생성물을 세포내 축적시킬 때, 발현 농도는 발현 생성물을 세포 단백질의 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만, 예를 들어 약 1-3%로 축적되도록 한다. 프로모터는 사용되는 박테리아에 동종인 것, 즉 자연적으로 박테리아에서 발견되는 것일 수 있다. 예를 들어, 락토코커스 프로모터는 락토코커스에 사용될 수 있다. 락토코커스 락티스(또는 기타 락토코커스들)에 사용되는 바람직한 프로모터는 락토코커스 락티스의 염색체로부터 유도된 "P1"이며(Waterfield N.R.; Le Page, R.W.F.; Wilson P.W. 및 Wells J.M., Gene(in press)), 서열은 하기 서열번호 1에 표시되어 있다:
핵산 구조물(들)은 분비성 시그널 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 바람직한 일양태에서, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호하는 핵산은 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 분비를 위해 제공될 수 있다(폴리펩티드를 암호하는 핵산 서열에 대해 단일 서열을 암호하는 핵산 서열을 적절하게 커플링하므로써). 핵산을 고정한 박테리아의 폴리펩티드를 분비하는 능력은 유기체의 생존도가 유지되는 배양 조건의 생체외에서 시험할 수 있다.
적절한 분비성 시그널 서열은 바실러스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium) 및 락토바실러스(Lactobacillus)와 같은 그람 양성 유기체에서 활성을 갖는 임의의 것들을 포함한다. 이러한 서열은 그람-양성 및 그람-음성 숙주에 모두 작용하는 것으로 알려진, 바실러스 아밀로리퀴페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)의 α-아밀라제 분비 리더서열 또는 스타필로코커스(Staphylococcus)의 일부 균주에 의해서 분비되는 스타필로키나아제 효소의 분비 리더서열[참고: "Gene Expression Using Bacillus", Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnology 1: 21-27], 또는 기타 수 많은 바실러스 효소나 S-층 단백질의 리더 서열[참고 Harwood 및 Cutting의 p341-344, "Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley & Co. 1990]을 포함할 수 있다. 락토코커스의 경우, Usp45로 표시되는 단백질의 리더서열이 바람직할 수 있다(서열 번호 2):
그러나, 세포내 항원을 축적하는 것도 바람직할 수 있다. 전술한 바와 같이, 박테리아가 생존할 수 있는, 즉 일부 대사 활성을 보유할 수 있는 축적 농도가 바람직하며, 세포 농도는 세포 단백질의 약 10% 미만, 바람직하게는 세포 단백질의 약 5% 미만이다.
항원은 기본적으로 항체와 같은 면역 시스템의 수용체가 결합할 수 있는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직한 일양태에서, 항원은 독소 또는 이의 항원성 단편의 박테리아성 유독소 형태이다. 암호하는 서열중 G/C에 비해 A/T가 편중되어 사용된(60% A/T) 락토코커스에서의 발현 적합성을 위해서, 항원은 이의 암호 서열에 A/T가 풍부하다(G/C 보다 A/T 함량이 높다). 예를 들어, 항원은 유독소(또는 이의 항원성 단편)이거나, 또는 클로스트리디움 또는 뉴모코커스(Pneumococcus)나 기타 스트렙토코커스종으로부터의 또 다른 면역원성 성분일 수 있다. 플라모디움(Plasmodium)속에 속하는 가장 중요한 인체 말라리아 기생충으로부터의 유전자와 같이, 클로스트리디움의 암호하는 서열은, 예를 들어, 종종 70% 이상의 A/T 염기쌍 함량을 갖는다.
본원에서 기술한 바와 같이, 항원, 즉 항원선 펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 면역 응답을 강화시키는데 사용하기 위해서, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드는 시토킨 활성을 갖는 것이 바람직하다. 시토킨은 문헌["The Cytokine Facts Book", Callard and Gearing (1994), 아카데믹 프레스]에 상세히 개시되어 있다. 시토킨 활성을 갖는 바람직한 폴리펩티드는 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨 6(IL-6)을 비롯한 인터루킨이다. 다수의 시토킨은 디설파이드가교를 포함하며, 이들 시토킨은 자연적으로 이를 생성하는 세포로부터 분비된다. 박테리아 세포의 세포질의 감수 특성은 디설파이드가교의 형성을 방지할 것으로 예상된다. 자연적으로 분비되는, 특히 자연적으로 디설파이드가교를 포함하는 폴리펩티드는 박테리아 세포에서 보유될 때 생물학적으로 활성인지는 분명하지 않다.
따라서, 일양태에서, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드는 자연적으로 폴리펩티드를 생성하는 세포로부터 분비되는 것이다.
본 발명에 따른 항원에 대한 면역 응답을 증대시키기 위한 시토킨의 사용은 특히 저 면역원성의 항원에 적절하다. 또한, 점막에 대한 면역의 응용은 일반적으로 IgA 응답을 유발한다. sIgA 항체가 감염에 대한 점막 표면을 보호하는데 중요한 역할을 하기 때문에, 우수한(보호성 농도) 점막 면역 응답을 유발하는 백신의 능력은 상당히 바람직한 특징이다. 예를 들어, 콜레라 바실러스의 표면에 결합하는 sIgA는 마우스에서 실험실용 콜레라를 방지할 수 있다는 것을 보여준다. 효과적으로 HIV-1을 중화시키는 sIgA는 이 비루스에 감염되는 것을 보호하는데 중요한 역할을 하며, 이는 상기 비루스가 장기간 감염된 신체에 접근할 수 있기 때문이다. 대다수의 인체 비루스 및 박테리아 병원체가 점막 표면에 전이증식하므로서 감염을 개시하기 때문에, 이 후 점막 sIgA 응답의 신뢰할 만하고 오래 지속되는 유도를 위한 방법이 요구된다.
따라서, 증가된 IgA 응답이 유리한 기생충으로부터의 저 면역원성의 항원은 본 발명에 사용하기 특히 유리하며, 예를 들어, 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni)의 P28 면역원(글루타치온-S-트랜스퍼라아제)이 있다.
본 발명에 따른 박테리아를 생성하기 위해서, 박테리아 숙주 세포내로 핵산을 삽입한다. 따라서, 본 발명의 제 4 목적은 개시된 바와 같이 비-침입성 박테리아, 바람직하게는 그람-양성 박테리아, 가장 바람직하게는 비-공생, 비-전이증식성 박테리아(예, 락토코커스)내로 핵산을 삽입하는 것을 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 삽입 기술은 임의의 이용가능한 기술을 사용할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적절한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기침투 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
예를 들어 유전자를 발현시킬 수 있는 조건하에서 숙주세포를 배양하므로써 핵산으로부터 발현을 유발하거나 또는 발현시키므로써 삽입될 수 있다. 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 및 항원을 발현하기 위한 조건하에서 배양액중 세포의 증식은 박테리아가 암호하는 핵산을 포함하고 암호된 물질을 생성한다는 것을 증명하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 제 5의 목적은 생체내에서 폴리펩티드의 활성 용량을 전달하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 박테리아와 이종인 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 발현을 위한 핵산을 포함하는 비-침입성 박테리아를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 전술한 바와 같이, 바람직한 박테리아는 락토코커스 락티스와 같은 락토코커스종을 포함하며, 바람직한 투여 경로는 점막 투여일 수 있다.
박테리아 생존도 및 증식을 최적화하는 배양 조건의 생체외에서만 행해진다고 하더라도, 이러한 박테리아에서 생물학적으로 활성인 형태의 이종 폴리펩티드를 발현할 수 있다는 것은 이미 알려져 있다. 생체내에서, 예를 들어 점액막에서, 박테리아는 증식 또는 생존도를 유지할 것으로 예상되지 않는 환경에 존재한다. 따라서, 이러한 박테리아가 확인가능한 생물학적 효과를 형성하는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 충분한 용량으로 폴리펩티드를 전달할 수 있다는 것은 놀라운 일이다.
바람직한 일양태에서, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 시토킨 활성을 갖으며, 박테리아는 항원을 또한 발현시킬 수 있다. IL-2 및 IL-6와 같은 인터루킨이 전달되는 것이 유리하다.
본원에 개시된 본 발명의 방법 및 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아의 용도는 당업자가 예를 들면 검체의 면역 응답을 조작할 수 있도록 하는 광범위한 치료 방법을 제공한다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기와 같은 여러 목적을 제공한다:
(i) 전술한 바와 같이 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 생존, 증식, 분화, 작동인자 기능 또는 세포나 조직의 감염에 대한 감수성을 조절하는 방법;
(ii) 전술한 바와 같이 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 점막 표면 또는 이웃한 조직이나 이격되어 있는 조직을 전이증식시키는 감염 또는 종양 세포에 대한 면역 응답을 추가 항원 자극하는 방법;
(iii) 전술한 바와 같이 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 병원성 감염 제제에 대한 면역 응답의 형태(항체 대 세포-매개된)를 조정하는 방법;
(iv) 전술한 바와 같이 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 염증이 있는 정상 조직 또는 종양 세포의 침윤을 조정하는 방법;
(v) 전술한 바와 같이 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 종양 세포의 증식율, 침입율 또는 생존율을 통제하는 방법;
(vi) 전술한 바와 같이 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 종양 세포의 괴사를 유도하는 방법;
(vii) 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 면역 응답을 억제조절하는 방법; 및
(viii) 검체에게 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 투여하는 것을 포함하여, 알러지성 자가면역 또는 기타 면역 조절장애 질환을 치료하는 방법.
대안적으로 설명하면, 시토킨 및 항원이 박테리아에 의해서 모두 발현되는 경우, 본 발명의 목적은 항원에 대한 면역 응답을 증대시키는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 시토킨 활성을 갖는 폴리펩티드 및 항원의 발현을 위한 핵산을 포함하는 비-침입성 박테리아를 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
항체 응답과 같은 면역 응답의 증대는 병원성 환경에서 항원을 이용한 연속적인 항원투여에 대해 개체를 보호하는 정도의 면역 응답을 제공하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항원이 박테리아 유독소 또는 독소 단편인 경우, 본 발명에 따른 박테리아의 투여에 대한 항체 응답 정도는 결과적으로 박테리아 독소, 예를 들면 독소를 생성하는 박테리아로 감염시 항원투여의 병원성 결과에 대하여 개체를 보호할 수 있어야 한다.
점막 표면에 적용되는 박테리아의 투여는 전신 응답외에 점액성 막에 대한 증가된 면역 응답(예, IgA 응답)을 형성시켜 특정 환경에서 유리할 수 있다.
박테리아를 영양 배지, 즉 박테리아에서 대사 활성(최소한 생체외)을 유지하는 물질(들)을 포함하는 배지에 적용할 수 있다. 이러한 물질들은 박테리아를 증식시키지는 않지만 생존도를 유지할 수 있다. 이러한 물질들은 글루코스, 아미노산 등과 같은 에너지 공급원을 포함할 수 있다.
박테리아가 투여되는 개체는 인체 또는 동물, 즉 비-인체 포유동물일 수 있다. 투여 경로는 통상적으로 비강이며, 경구, 질내 또는 항문일 수 있다. 점막 투여가 바람직하지 않은 환경에서, 박테리아는 당업자의 능력내에 있는 임의의 기타 적절한 수단, 예를 들어 비경구적 경로로(i/v, i/p, s/c, i/m) 투여될 수 있다.
개체에게 폴리펩티드를 전달하는 생물학적 효과가 그 개체에게 이로운 치료적 환경에서, "치료학적 유효량"으로 투여하는 것이 바람직하며, 이는 환자가 혜택을 받기에 충분한 양이다. 이러한 혜택은 하나 이상의 증상을 최소한 개선시킬 수 있다. 예방학적 측면에서, 예를 들면 면역 응답을 증가시키므로써 개체에게 연속적인 병원성 항원 투여의 해로운 효과를 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 투여되는 실제량, 투여속도 및 시간 경과는 예를 들면, 항원 투여의 특성 및 경중의 관점에서 추구되는 생물학적인 효과와 같이 투여의 목적에 따라 다르며, 일상적인 최적화의 대상이다. 예방 백신화를 비롯한 치료 처방, 예를 들면 복용량 등의 결정은 일반 의사 및 기타 의학 박사의 책임내에 있다.
박테리아를 포함하는 조성물은 단독으로 또는 기타 치료와 조합하여 동시에 또는 연속적으로 본 발명에 따라 투여할 수 있다.
본 발명은 개시된 바와 같이 박테리아를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일양태에서, 이러한 약학적 조성물은 점액성 막에 적용하기 적절한 것이 바람직하다.
본 발명 및 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 박테리아외에도, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충액, 안정화제 또는 당업자들에게 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이여야 하며, 활성 성분의 효능을 저해해서는 안된다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 따라 다를 수 있다. 정맥, 피부 또는 피하 주입, 또는 상처 부위에 주입하는 경우, 발열 인자가 없고 적절한 pH, 등장도 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용 가능한 수용액이 사용될 수 있다. 당업자들은 적절한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충액, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 따라 투여하기 위한 박테리아를 포함하는 약학적 조성물은 1종 이상의 영양 물질, 예를 들면, 글루코스, 아미노산 등과 같은 에너지 공급원을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체에게 투여하기 위한 적절한 담체 매체를 사용하여 개시된 바와 같이 박테리아를 배합하는 것을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 일양태에서, 약학적 조성물은 개체의 점액성 막에 적용하기 적절하다.
본 발명은 예방("백신화")을 비롯하여, 약학적 용도, 즉 수술 또는 치료에 의해 인체 또는 동물의 몸의 치료 방법에 사용하기 위한 생물학적으로 활성인 이종 폴리펩티드 및 가능하게는 항원을 발현하는 비-침입성 박테리아를 제공한다. 개시된 바와 같이, 박테리아는 그람-양성일 수 있으며, 바람직하게는 비-공생 및/또는 비-전이증식성이며, 적절한 예는 락토코커스를 포함한다. 상기 방법은 개체의 점액성 막, 예를 들어 개체의 면역 응답을 증진시키기 위해 투여하는 것을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적은 개시한 바와 같이 개체에게 투여하기 위한 조성물, 즉 약학적 조성물 또는 약제의 제조에 임의의 박테리아의 사용 방법을 제공하기 위한 것이다. 개체의 점액성 막으로 투여되는 것이 바람직하며, 개체의 면역 응답, 예를 들어 박테리아에 의해 발현되는 항원을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 각 목적의 양태들은 본원으로부터 분명해질 것이며, 당업자들은 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 추가의 목적 및 양태들도 분명해질 것이다. 비-제한적인 실험적 예증에 의해서, 항원에 대한 면역 응답의 보호성 농도를 획득하는데 본 발명의 양태의 사용 방법이 도면에 상세히 기술되어 있다.
실시예 1
TTFC와 mIL2 또는 mIL6을 동시 발현시키기 위해서, 연구시 2개의 시스트론을 유도하는 오페론의 구조를 선택하였다. 구조적 발현을 위한 백터를 이용하였다. 일반적으로, 샤인-달가르노(SD) 서열 바로 앞에 XbaI 부위와 정지 코돈 바로 뒤의 SpeI 부위를 갖는 시스트론을 측면에 위치시키고자 하였다. 이 방식에서, XbaI 및 SpeI가 동일한 점착성 말단을 형성하기 때문에 다중 시스트론은 용이하게 상호교환되며, 각종 조합을 임의의 원하는 배열로 할 수 있다. T7 프로모터 - T7 유전자 10 리보좀 결합 부위에 의한 mIL2 및 mIL6의 발현은 이미 달성되었고, 따라서, g10 리보좀 결합 부위에 존재하는 XbaI 부위를 사용하기 위해서 선택하였다. 이 배열의 경우, SD 서열이 잘 배치된다는 것을 알았다. 인터루킨 전면에 TTFC 시스트론을 위치시키도록 선택하였다.
플라스미드의 구조
플라스미드의 구조는 도 1에 도시되어 있다. mIL2 및 mIL6를 운반하는 플라스미드는 정지 코틴 바로 뒤의 외부 SpeI 부위를 제공하기 위해 변이가 유도된 부위를 필요로 한다. 생성 플라스미드를 각각 pL2MIL2A 및 pL2MIL6A라고 칭하였다. USP45 분비 리더서열 및 TTFC의 융합을 포함하는 플라스미드는 요구되는 각종 TTFC 서열의 PCR 증폭의 주형으로서 사용된다.
세포내 TTFC 생성을 유도하는 오페론의 경우, 유전자는 블론트-SpeI/BamHI 단편으로서 증폭시키고, SphI로 절단시키고 블론트시킨 후 BamHI로 재절단시킨 벡터 pTREX1내에 클론시켰다. 생성 플라스미드를 pT1TT라고 칭하였다. 이 플라스미드로부터, 3'말단 150bp, SpeI TTFC 단편을 분리하고 pL2MIL2A 및 pL2MIL6A의 XbaI 부위내에 클론시켰다. 생성 플라스미드를 p3TTIL2 및 p3TTIL6으로 칭하였다. 재구조물 TTFC에 대한 TTFC의 3' 말단에 존재하는 KpnI 제한 부위를 이용하고, pT1TT로부터 적절한 KpnI-PvuII 및 SpeI-PvuII 단편을 사용하여 p3TTIL2 및 p3TTIL6로부터 KpnI-SpeI 단편을 결찰시키므로써 원하는 오페론을 수득하였다. 생성 플라스미드를 pTT12 및 pTT16이라고 칭하였다.
단백질 발현
단백질의 발현은 항체 검출에 의해서 분석하였다. 이를 위해서, 조사중인 여러 균주의 콜로니를 니트로셀룰로스 막에 스폿하고, 적절한 항생제를 함유하는 GM17(difco) 고체 아가 플레이트상에 두었다. 상기 플레이트를 밤새 항온처리하고, 2.5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS에서 블록하였다. 여과물을 토끼-항-TTFC 또는 토끼 항 MIL2를 사용하여 나타내었다. 실험은 TTFC 유전자를 보유하는 모든 구조물에서 분명한 TTFC 발현을 나타내었다. 더구나 pTTI2 및 pTTAI2의 경우, IL2 및 TTFC의 동시 발현을 검출하였다. TTFC 단위체 및 mil6사이의 접합부위가 TTFC 및 mil2의 것과 동일하기 때문에, IL6는 동일하게 TTFC와 동시발현된다고 가정할 수 있다.
면역화를 위한 세포의 제조
면역화를 위한 박테리아 균주는 30℃에서, 5㎍/㎖의 에리트로마이신을 포함하는 15㎖의 신규 GM17 배지내에 밤새 배양물을 1㎖의 비율로 역희석한 새로운 밤새 배양물중 증식시켰다. 600nm에서 0.5 내지 1.0의 최적 밀도에서 세포를 회수하였다. 본래 배양액 부피의 1/200로 재현탁시키기 전에 0.5% 카스아미노산, 0.2M 중탄산 나트륨, 0.5% 글루코스의 본래 배양액 부피의 1/10로 세포를 세척하고 박테리아 세포 농도를 측정하였다. 이어서, 상기 용액에 세포를 희석하여 면역화에 대하여 필요한 수의 세포를 수득하였다.
면역법
"메토판"을 마우스에게 흡입하게 하여 약하게 마취시켰다. 0.5% 카제인 가수분해물, 0.2M 중탄산 나트륨 및 0.5% 글루코스중 10㎕의 박테리아 현탁액을 자동 피펫을 사용하여 차례로 각 비공에 적용하였다. 동물이 마취에서 완전히 회복될 때까지 호흡 곤란을 면밀히 관찰하였다.
결과
결과는 표 1 및 도 4에 나타나있다. 인터루킨-2 또는 인터루킨-6를 발현할 수 있는 박테리아는 TTFC를 단독으로 발현하는 박테리아보다 10배 더 많은 항-TTFC 항체를 유도하였다.
항체 적정량이 역치를 초과할 때만 보호효과가 달성되는 것은 박테리아 독소에 대해서도 같다. pEX-TTFC/IL-2 및 pEX-TTFC/IL-6를 함유하는 박테리아로 접종한 마우스에서 발견되는 항체 적정량의 농도는 파상풍 독소 항원투여에 대한 연속적인 보호를 위한 역치를 훨씬 초과하였다(도 4 참고, 백신화 35일 후에 적정량).
실험적 예증의 요약
항원성 폴리펩티드(파상풍 독소 단편 C-TTFC) 및 생물학적으로 활성인 폴리펩티드(인터루킨 2; 인터루킨-6)를 동시발현하기 위한 인공적인 오페론은 구조적 발현 벡터(pTREX1)내에서 별도로 구조화되어, 미리 규정된 활성을 갖는 락토코커스 프로모터 성분의 활성에 의해서 TTFC 유전자 및 인터루킨 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 구조물을 제조하여, 인공적인 오페론으로부터 전사된 mRNA의 해독후에, TTFC 항원을 세포내에 축적시켰다. 분비 시그널 서열은 인터루킨에 실시가능하게 결합시켰다. 이들 박테리아 제제가 마우스에게 비강내 투여되는 경우, 인터루킨-2 또는 인터루킨-6을 발현시키기 위해 유전자 조작한 박테리아는 TTFC 단독 발현하는 구조물보다 약 10배 이상의 항-TTFC 항체를 유발하였다. 따라서, 이들 인터루킨은 실험계에서 뚜렷한 보조 활성을 갖는다.
락토코커스 락티스는 공생 박테리아가 아니며(관련된 락토바실러스종과 다름, 닭 무리에 살며, 다수의 포유동물의 장에 존재한다), 그의 영양은 생체내에서 이용할 수 없을 것같은 아미노산 및 펩티드의 제공에 의존하며, 따라서 엘. 락티스의 시토킨-발현 균주가 항체 생성을 증대시킬 수 있다는 것은 놀라운 일이다. 무엇보다도, 이들 결과는 락토코커스 락티스와 같은 비-전이증식성, 비-침입성 박테리아가 생체내에서 생물학적으로 활성인 분자를 합성 및 전달하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
| 3가지 비측 백신화 자료-종말점 적정 | ||||
| TT/9 | TT/8 | TT/7 | TT/6 | |
| 10000 | 50 | 50 | 50 | |
| 11000 | 60 | 50 | 50 | |
| 10000 | 50 | 50 | 75 | |
| 9000 | 50 | 50 | 50 | |
| 4500 | 50 | 50 | 70 | |
| 600 | 110 | 55 | 250 | |
| 평균 | 7516.7 | 61.7 | 50.8 | 90.8 |
| 표준 편차 | 4089.2 | 24.0 | 2.0 | 78.8 |
| TT IL-2/9 | TT IL-2/8 | TT IL-2/7 | TT IL-2/6 | |
| 14000 | 50 | 50 | 50 | |
| 30000 | 50 | 50 | 150 | |
| 100000 | 50 | 50 | 50 | |
| 100000 | 105 | 150 | 50 | |
| 120000 | 50 | 80 | 50 | |
| 100000 | 100 | 50 | 50 | |
| 평균 | 77333.0 | 67.5 | 71.7 | 66.7 |
| 표준 편차 | 43848.0 | 27.2 | 40.2 | 40.8 |
| TT IL-6/9 | TT IL-6/8 | TT IL-6/7 | TT IL-6/6 | |
| 80000 | 200 | 50 | 50 | |
| 170000 | 300 | 50 | 50 | |
| 190000 | 200 | 100 | 50 | |
| 100000 | 10000 | 50 | 50 | |
| 50000 | 750 | 50 | 50 | |
| 80000 | 260 | 400 | 50 | |
| 평균 | 111670.0 | 1951.7 | 116.7 | 50.0 |
| 표준 편차 | 55648.0 | 3948.3 | 140.2 | 0.0 |
대조군
| pEX1/9 | pEX1/8 | pEX1/7 | pEX1/6 | 기본형 | |
| 75 | 75 | 55 | 75 | 60 | |
| 75 | 50 | 75 | 55 | 60 | |
| 50 | 55 | 75 | 75 | 55 | |
| 55 | 50 | 55 | 50 | 55 | |
| 75 | 55 | 75 | 50 | 60 | |
| 60 | 55 | 70 | 50 | 60 | |
| 평균 | 65.0 | 56.7 | 67.5 | 59.2 | 56.7 |
| 표준 편차 | 11.4 | 0.9 | 1.0 | 12.4 | 4.1 |
상기 표에서, "TT/9"는 1×109박테리아의 용량에서 TTFC를 발현하는 박테리아를 접종한 것을 나타내며, "TT/8"은 1×108박테리아의 용량에서 접종한 것을 나타낸다. "TT IL-2/9" 및 "TT IL-6/9"는 TTFC와 IL-2, 및 TTFC와 IL-6을 각각 발현하는 박테리아를 1×109박테리아의 용량으로 접종한 것을 나타내며, "TT IL-2/8"은 1×108박테리아의 용량으로 접종한 것을 나타낸다. 주어진 도면은 개개의 마우스의 경우 ELISA 적정량이다.
Claims (54)
1종 이상의 폴리펩티드를 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 전달하는 방법.
1종 이상의 항원을 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 1종 이상의 항원을 전달하는 방법.
1종 이상의 항원 및 1종 이상의 생물학적으로 활성인 이종 폴리펩티드를 모두 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 전달하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 1 종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 박테리아와 이종인 방법.
제4항에 있어서, 1종 이상의 이종 폴리펩티드가 진핵세포 또는 이의 비루스로부터 유도되는 방법.
제4항에 있어서, 1종 이상의 이종 폴리펩티드가 원핵세포 또는 이의 비루스나 박테리아종과 동종인 비루스로부터 유도되는 방법.
제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 그람-양성 박테리아인 방법.
제7항에 있어서, 그람 양성 박테리아가 리스테리아 인노큐아(Listeria innocua), 스타필로코커스 크실로서스(Staphylococcus xylosus), 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordoni), 락토코커스(Lactococcus)종 또는 락토바실러스(Lactobacillus)종인 방법.
제8항에 있어서, 그람-양성 박테리아가 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)인 방법.
제7항에 있어서, 박테리아가 그람-양성 병원성 박테리아의 감쇠된 균주인 방법.
제10항에 있어서, 박테리아가 리스테리아 모노시토겐즈(Listeria monocytogenes)인 방법.
제5항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 국부적으로 또는 전신적으로 작용할 수 있는 폴리펩티드(들), 예를 들면 국부 또는 전신 대사에 영향을 주는 내분비 활성을 상승시킬 수 있는 폴리펩티드인 방법.
제5항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 면역조혈계에 속하는 세포의 활성을 조절할 수 있는 폴리펩티드(들)인 방법.
제5항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 신체의 각종 정상 세포 또는 신생 세포의 생존도, 증식 및 분화에 영향을 주거나 또는 상처와 감염에 급성 염증 응답의 유발 또는 면역 조절에 영향을 줄 수 있는 폴리펩티드(들)인 방법.
제5항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 표적 세포 수용체에 작용하는 케모킨에 의해 매개되는 세포와 조직의 감염에 대한 저항성, 또는 상피세포의 증식이나 상처 치유의 촉진을 증대시키거나 또는 유도할 수 있는 폴리펩티드(들)인 방법.
제5항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 신체의 세포에 의해서 물질의 발현 또는 생성을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 성장 억제 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 또는 혈관작용 장 폴리펩티드인 방법.
제12항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL 또는 IFNα/β와 같이 역평행한 4α 나선형 다발 구조를 포함하는 구조적 그룹 1 시토킨인 방법.
제12항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가, 종종 세포-표면에 결합되어 있고, 대칭적인 동종삼량체를 형성하며, 각 서브유니트는 특정 비루스 코트 단백질용에서 알려진 β-젤리 롤의 구조를 갖으며, 예를 들면 TNFα, TNFβ, CD40, CD27 또는 FAS 리간드와 같은 시토킨의 TNF계, 시토킨의 IL-1계, 섬유아세포 증식 인자계, 혈소판 유래된 증식 인자, 형질전환 증식 인자 β 및 신경 증식 인자를 포함하는 구조적 그룹 2 시토킨인 방법.
제12항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 세포외 영역에서 1종 이상의 EGF 도메인을 각각 포함하는 거대 경막 전구체 분자로서 생성되는 단쇄 α/β 분자, 예를 들면 시토킨의 상피 증식 인자계, 보존된 시스테인 잔기 주변에 그룹을 형성한 아미노산 서열을 갖는 것이 특징인 케모킨(C-C 또는 C-X-C 케모킨 아군) 또는 인슐린 관련 시토킨을 포함하는 구조적 그룹 3 시토킨인 방법.
제12항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 여러 도메인, 예를 들어, EGF, 면역글로블린 유사 도메인 및 크링글 도메인으로 구성된 헤레귤린(heregulin) 또는 뉴레귤린(neuregulin)과 같은 모자이크 구조를 나타내는 구조적 그룹 4 시토킨인 방법.
제12항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 제10항 내지 제19항중 어느 한 항에 기재된 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 길항물질 또는 수용체인 방법.
제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 세포 또는 조직의 생존, 증식, 분화, 작동인자 기능 또는 감염에 대한 감수성을 조절하는 방법.
제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 점막 표면 또는 이웃한 조직이나 이격되어 있는 조직에서 집락형성하는 감염 또는 종양세포에 대한 면역 응답을 추가 항원 자극하는 방법.
제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 병원성 감염 인자에 대한 면역 응답의 형태(항체 대 세포-매개)를 조정하는 방법.
제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 염증이 있는 정상 조직 또는 종양 세포의 침윤을 조정하는 방법.
제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 종양 세포의 증식율, 침입율 또는 생존율을 통제하는 방법.
제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 종양 세포의 괴사를 유도하는 방법.
제23항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서, 제12항 내지 제22항중 어느 한 항에 기재된 하나 이상의 특징에 의해서 변형되는 방법.
생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 면역 응답을 억제조절하는 방법.
생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 알러지성 자가면역 또는 기타 면역장애 질병상태를 치료하는 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 제7항 내지 제22항중 어느 한 항에 기재된 특징에 의해 변형되는 방법.
제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를, 임의적으로 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 보조제, 담체 등과 함께 포함하는 약학적 조성물.
제33항에 있어서, 백신 조성물인 약학적 조성물.
제33항 또는 제34항에 있어서, 제12항 내지 제22항중 어느 한 항에 기재된 하나 이상의 특징에 의해 변형된 약학적 조성물.
1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 1종 이상의 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아를 혼합하는 단계를 포함하여, 제33항 내지 제35항중 어느 한 항에 기재된 약학적 조성물을 제조하는 방법.
1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호하는 1종 이상의 암호 서열 및 1종 이상의 항원을 암호하는 1종 이상의 암호 서열을 포함하고, 각 암호 서열이 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아에서 발현되기 위한 프로모터의 조절하에 존재하는 핵산.
제37항에 있어서, 제7항 내지 제22항중 어느 항에 기재된 하나 이상의 특징에 의해 변형된 핵산.
제37항 또는 제38항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호하는 핵산 및/또는 1종 이상의 항원을 암호하는 핵산이 적절한 조절 서열의 통제하에 있는 1종 이상의 핵산 구조물을 포함하는 핵산.
제39항에 있어서, 적절한 조절 서열이 프로모터 서열, 종결인자 단편, 증강 인자 및 표식 유전자 중에서 선택되는 핵산.
제39항 또는 제40항에 있어서, 1종 이상의 핵산 구조물이 폴리시스트론 RNA 전사를 형성할 수 있는 인조 오페론을 포함하는 핵산.
제37항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 락토코커스 락티스에 사용하기 위한 락토코커스의 프로모터인 핵산.
제37항 내지 제42항중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호하는 암호 서열(들)의 상류에 분비성 시그널 서열을 더 포함하는 핵산.
제43항에 있어서, 분비성 시그널 서열이 바실러스 아밀로리퀴페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)의 α-아밀라제 분비 리더서열, 스타필로키나아제 효소의 분비 리더서열, 기타 바실러스 효소 또는 S-층 단백질용 리더 서열 또는 락토코커스 단백질 Usp45의 리더서열인 핵산.
제37항 내지 제44항중 어느 한 항에 있어서, 항원(들)이 보호성 면역 응답을 유도할 수 있는 항원(들)인 핵산.
제37항 내지 제44항중 어느 한 항에 있어서, 항원(들)이 제12항 내지 제22항중 어느 한 항에 기재된 1종 이상의 동시발현된 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 존재하에 보호성 면역응답이 가속, 증폭 또는 더 오래 지속되는 항원(들)인 핵산.
비-침입성 또는 비-병원성 박테리아, 예를 들면 락토코커스 락티스의 형질변형에 사용되는 제37항 내지 제46항중 어느 한 항에 기재된 핵산의 용도.
제37항 내지 제46항중 어느 한 항에 기재된 핵산을 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아 숙주세포내로 삽입하는 단계를 포함하여, 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 박테리아를 제조하는 방법.
(i) 1종 이상의 생물학적으로 활성인 이종 폴리펩티드; 및
(ii) 1종 이상의 항원을 발현하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아.
제49항에 있어서, 제7항 내지 제22항중 어느 한 항에 기재된 하나 이상의 특징에 의해서 변형된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아.
제49항 또는 제50항에 있어서, 제37항 내지 제46항중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하는 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아.
제49항 내지 제51항중 어느 한 항에 있어서, 약제에 사용하기 위한 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아.
1종 이상의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 1종 이상의 항원의 전달을 위한 제제의 제조에 제37항 내지 제46항중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하는 박테리아 또는 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 기재된 비-침입성 또는 비-병원성 박테리아의 용도.
제53항에 있어서, 제23항 내지 제32항중 어느 한 항에 기재된 하나 이상의 특징에 의해 변형된 용도.
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