ES2328751T3 - Liberacion de polipeptidos biologicamente activos. - Google Patents

Liberacion de polipeptidos biologicamente activos. Download PDF

Info

Publication number
ES2328751T3
ES2328751T3 ES96935054T ES96935054T ES2328751T3 ES 2328751 T3 ES2328751 T3 ES 2328751T3 ES 96935054 T ES96935054 T ES 96935054T ES 96935054 T ES96935054 T ES 96935054T ES 2328751 T3 ES2328751 T3 ES 2328751T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gram
invasive
bacterium
biologically active
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES96935054T
Other languages
English (en)
Inventor
Lothar Steidler
Erik Remaut
Jeremy Mark Wells
Richard William Falla Le Page
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intrexon Actobiotics NV
Original Assignee
Actogenix NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Actogenix NV filed Critical Actogenix NV
Application granted granted Critical
Publication of ES2328751T3 publication Critical patent/ES2328751T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA TRANSPORTAR POLIPEPTIDOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS Y/O ANTIGENOS, JUNTO CON MEDIOS DE TRANSPORTE Y FORMULADOS FARMACEUTICOS QUE INCLUYEN ESTOS MEDIOS DE TRANSPORTE.

Description

Liberación de polipéptidos biológicamente activos.
La presente invención se refiere a la administración de polipéptidos biológicamente activos in vivo. En particular, se refiere al uso de bacterias no invasivas, generalmente bacterias Gram-positivas tales como Lactococcus, que proporcionan polipéptidos biológicamente activos para el cuerpo, especialmente en la mucosa. En un aspecto, esta invención se refiere a la provisión de un efecto adyuvante por medio del cual se aumenta una respuesta inmune inducida contra un antígeno. También se proporcionan construcciones de ácido nucleico y organismos hospedadores para estas aplicaciones.
El número limitado de adyuvantes aprobados para uso en vacunas humanas (debido a la toxicidad o patogenicidad de los agentes más activos tales como el adyuvante completo de Freund) y el descubrimiento durante los últimos 20 o más años de numerosos polipéptidos implicados en la proliferación, diferenciación y activación de células B y células T ha dirigido la atención a la posibilidad de usar estos factores (citoquinas) para aumentar las respuestas a las vacunas, y para dirigir la respuesta inmune a una vacuna particular a lo largo de rutas deseadas. La necesidad de esta estrategia se ha vuelto incluso más evidente ya que ciertos descubrimientos inmunológicos recientes han subrayado que las respuestas inmunes mediadas por células y mediadas por anticuerpos son en gran medida respuestas mutuamente excluyentes. Si se activa la formación de anticuerpos o las células T efectoras y macrófagos se determina por la serie particular de citoquinas que se induce por cualquier antígeno, patógeno o vacuna dada. Lo más importante es la actividad funcional de los tipos de células T auxiliares, TH1 o TH2, que están implicadas en la respuesta a cualquier antígeno o patógeno invasor particular.
Como la inmunidad protectora frente a un agente patógeno normalmente surge como consecuencia de la formación de anticuerpos (patógenos extracelulares, toxinas solubles o patógenos intracelulares después de su liberación en fluidos tisulares procedentes de células muertas, moribundas o productoras) o de respuestas mediadas por células (patógenos intracelulares), en principio es muy ventajoso poder dirigir las respuestas inmunes a una vacuna hacia la formación de anticuerpos o la activación de macrófagos y células T. Para que los efectos protectores de la vacunación persistan durante el máximo tiempo posible, también es importante poder aumentar la amplitud, duración y componentes de memoria de la respuesta inmune.
Por estas razones, numerosos investigadores han centrado su atención en la posibilidad de utilizar uno o más de los miembros de la red de citoquinas de las proteínas de señalización como adyuvantes de vacuna. Esta estrategia puede ser incluso más significativa cuando se considera que la pérdida de células T auxiliares - y por lo tanto de su producción de citoquinas - puede estar asociada con la incapacidad de individuos que padecen ciertos tipos de inmunodeficiencias hereditarias o adquiridas de responder a vacunas particulares.
Aunque se ha prestado mucha atención al uso de citoquinas para estos fines, solo se ha notificado un éxito limitado en la utilización de citoquinas como adyuvantes. Se han encontrado dificultades considerables en la administración de citoquinas adyuvantes por métodos que serían apropiados para la inclusión en un régimen de vacuna. Esta dificultad puede ejemplificarse haciendo referencia a estudios del uso de IL-2 como adyuvante.
La IL-2 ha suscitado una atención particular como posible adyuvante porque, aunque se considera que su fuente principal son las células T auxiliares 1, se cree que sus actividades principales incluyen la implicación en una amplia serie de aspectos de las repuestas inmunes, tales como la proliferación de células T, la síntesis de otras citoquinas, el crecimiento de células B y la síntesis de inmunoglobulinas. De esta manera, la IL-2 es una citoquina derivada de células T que se describió por primera vez como un factor de crecimiento de células T. Ahora se sabe estimular el crecimiento y la diferenciación de células T, células B, células NK, monocitos, macrófagos y oligodendrocitos. En general, se ha descubierto que la actividad adyuvante de la parte de IL-2 que se ha notificado por muchos trabajadores, depende del uso de múltiples inyecciones de la citoquina o su incorporación en liposomas o emulsiones oleosas. Para evitar esta necesidad, otros trabajadores han co-expresado IL-2 con antígenos de vacuna en vectores bacterianos y virales recombinantes, o han obtenido por ingeniería genética proteínas de fusión IL-2:antígeno; se ha afirmado que estas últimas
proporcionan una notable mejora de la inmunogenicidad del componente antigénico del compañero de fusión.
Otras características deseables de las vacunas incluyen la necesidad de ser tan inocuas como sea posible, de actuar eficazmente después de la administración del menor número posible de dosis y de ser adecuadas para la administración a través de las superficies mucosas (por ejemplo, por vía oral, intranasal o intravaginal) evitando de esta manera la necesidad de agujas hipodérmicas y activando respuestas inmunes locales mucosas además de respuestas inmunes sistémicas. La capacidad de una proliferación continuada de patógenos vivos atenuados ha dado como resultado numerosos estudios del uso de cepas de vacunas recombinantes de virus y bacterias (tales como cepas de vacuna de poxvirus o
de bacterias de salmonela y de bacterias tuberculosas) como agentes para la administración de antígenos heterólogos.
Previamente se han desarrollado sistemas para la expresión de antígenos heterólogos en las bacterias no patógenas, no colonizadoras, no invasivas y de calidad alimentaria Lactococcus lactis (véase la patente del Reino Unido GB-2278358B). Previamente se ha demostrado que Lactococcus lactis puede producir y secretar IL-2 murina biológicamente activa cuando se cultiva in vitro (Steidler et al. Applied and Environmental Microbiology, abril de 1995, Vol. 61, Nº 4, páginas 1627-1629). Sin embargo, debido al hecho de que Lactococcus lactis es no invasiva - de hecho no es una bacteria comensal ni está asociada normalmente de otra manera con la colonización de superficies mucosas en animales - no era evidente que esta bacteria pudiera emplearse satisfactoriamente en una estrategia de vacunación que requería la formación de una citoquina adyuvante in vivo. Previamente se ha demostrado (documento GB-2278358B) que un antígeno heterólogo puede ser completamente antigénico cuando se acumula dentro del citoplasma de Lactococcus lactis (del cual se supone que sale in vivo cuando las células se digieren por células fagocíticas).
Por medio de la manipulación de los elementos genéticos apropiados, se han proporcionado construcciones de ácido nucleico (aquí operones artificiales - unidades multigénicas transcritas de forma coordinada) para la co-expresión en Lactococcus lactis de un polipéptido antigénico (ejemplificado en este documento usando el fragmento C de la toxina tetánica - TTFC) y un polipéptido de citoquina biológicamente activo (ejemplificado en este documento usando interleuquina-2 y también interleuquina-6).
Otros trabajadores han demostrado que la citoquina IL-6 tiene la capacidad de aumentar respuestas de anticuerpo con especificidad de antígeno murinas in vivo e in vitro, y también se ha podido preparar unidades de expresión para IL-6 en L. lactis. La IL-6 es una citoquina multifuncional secretada tanto por células linfoides como por células no linfoides que se sabe que posee actividades pleiotrópicas que juegan un papel fundamental en la defensa del hospedador. La IL-6 puede ejercer actividades inductoras del crecimiento, inhibidoras del crecimiento e inductoras de la diferenciación, dependiendo de las células diana. Estas actividades incluyen la diferenciación y/o la activación de células T y macrófagos, la promoción del crecimiento de células B (visto como crecimiento - promoción de líneas tumorales de células B in vitro), la diferenciación terminal (secreción de inmunoglobulinas) en células B, y - actuando sistémicamente - la inducción de la respuesta de proteínas de fase aguda hepática. Es muy importante para la inmunización de la mucosa el hecho de que se haya demostrado que la IL-6 induce un alto porcentaje de secreción de IgA en células B comprometidas con IgA.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva que contiene al menos una secuencia de ácido nucleico que se expresa bajo el control de un promotor constitutivo y codifica un polipéptido biológicamente activo heterólogo, donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido biológicamente activo comprende una secuencia señal de secreción que permite la secreción del polipéptido biológicamente activo, donde la expresión de dicho polipéptido biológicamente activo se produce independientemente de cualquier inductor u otra señal reguladora, para uso como un medicamento.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, que es una bacteria no colonizadora.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, donde dicha bacteria Gram-positiva se elige entre el grupo consistente en Listeria innocua, Staphylococcus xylosus y una especie de Lactococcus.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, donde dicha bacteria Gram-positiva es Lactococcus lactis.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, donde dicho polipéptido biológicamente activo es una citoquina.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, donde dicha citoquina es una interleuquina.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, donde dicha interleuquina es IL-2 o IL-6.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, donde la bacteria comprende además al menos una secuencia de ácido nucleico que se expresa bajo el control de un promotor y codifica un antígeno.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, donde dicho antígeno es heterólogo para dicha bacteria.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, donde dicho antígeno se acumula intracelularmente.
La presente invención proporciona una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, para la fabricación de un adyuvante.
La presente invención proporciona el uso de una bacteria Gram-positiva no invasiva como se ha indicado anteriormente, para la fabricación de una vacuna.
Para ejemplificar la presente invención, se construyeron por separado operones para la co-expresión de IL-2 e IL-6 en un vector de expresión constitutivo (pTREX1, también conocido como pEX1) de forma que la transcripción del gen de TTFC y del gen de interleuquina pudieran controlarse por la actividad de un elemento promotor de lactococos de actividad previamente definida (denominado P1). Las construcciones se prepararon de forma que, después de la traducción del ARNm transcrito a partir de los operones artificiales, el antígeno TTFC se acumulara intracelularmente.
Cuando se administraron preparaciones de estas bacterias por vía intranasal a ratones, las bacterias modificadas por ingeniería genética para expresar Interleuquina-2 o Interleuquina-6 indujeron aproximadamente 10 veces más anticuerpo anti-TTFC que las construcciones que expresaban el TTFC solo. De esta manera, cualquiera de estas interleuquinas poseía una actividad adyuvante inconfundible en el sistema experimental.
No era evidente por la capacidad de Lactococcus lactis de administrar un antígeno heterólogo o por su capacidad de producir IL-2 in vitro que fuera un vehículo apropiado para administrar una citoquina in vivo de tal forma que se proporcionara suficiente citoquina activa para proporcionar un efecto adyuvante. Lactococcus lactis es una bacteria no invasiva y no colonizadora, lo que significa que cuando estas bacterias se usan para administrar un antígeno al sistema inmune, por ejemplo a través de una superficie mucosa, lo más probable es que entren en el tejido linfoide como consecuencia de la fagocitosis por las células M (o con micropliegues (microfold)) que prueban el contenido de las secreciones mucosas adyacentes al tejido linfoide mucoso. Los antígenos en forma de micropartículas (por ejemplo, el toxoide tetánico incorporado en micropartículas de poli L-lactida) entran en el tejido linfoide pasivamente de esta manera, mientras que las bacterias patógenas (o vacunas atenuadas) tales como especies de Listeria, Salmonella y Shigella pueden invadir las células y tejidos por medio de la estimulación activa de su captación en células epiteliales mucosas, además de conseguir la entrada a través de células M. Como previamente se ha descubierto que la actividad de las citoquinas como adyuvantes requiere múltiples inyecciones o una administración de liberación sostenida (Heath and Playfair (1992) Vaccine 7: 427-434) y como las citoquinas sólo se protegerán de la digestión proteolítica dentro de células fagocíticas mientras que las células de Lactococcus lactis permanecen intactas o viables, es inesperado que las células de Lactococcus que expresan citoquinas presenten una actividad adyuvante notable como se demuestra en este documento. Tal vez esto se comprenda si se entiende que la muerte y disolución de las partículas bacterianas favorecerá la liberación de antígenos, pero impedirá más que una producción muy transitoria de citoquinas. Sin embargo, los descubrimientos de los presentes inventores indican que la expresión de IL-2 o IL-6 por Lactococcus lactis tiene un efecto adyuvante notable. Aunque las bacterias expresadas se administraran por vía parenteral en lugar de por vía mucosa se aplicarían las mismas consideraciones.
De esta manera, como Lactococcus lactis no es invasivo - de hecho no es una bacteria comensal y también depende para su nutrición del suministro de aminoácidos y péptidos que es poco probable que estén disponibles in vivo - la demostración de que las cepas secretoras de citoquinas de L . lactis, sin embargo, pueden aumentar la producción de anticuerpos es sorprendente. Por lo tanto, estos resultados demuestran por primera vez que pueden usarse cepas recombinantes de Lactococcus lactis para sintetizar y administrar moléculas biológicamente activas in vivo. Es de un interés particular el hecho de que estos resultados demuestren la posibilidad de aumentar la respuesta inmune mucosa así como la respuesta inmune sistémica, ya que se ha demostrado que la IL-6 es una citoquina que puede inducir un alto porcentaje de secreción de IgA en células B comprometidas con IgA.
El descubrimiento de que Lactococcus lactis puede mantener su actividad biológica en una membrana mucosa durante un período de tiempo suficiente para administrar una dosis biológicamente activa de dos citoquinas recombinantes diferentes cualesquiera y de esta forma aumentar una respuesta inmune a un antígeno heterólogo, demuestra una amplia aplicabilidad para la administración de polipéptidos para fines distintos de una actividad adyuvante sola.
La capacidad de L. lactis de producir y secretar polipéptidos demuestra que es posible utilizar estas bacterias para la producción y administración in vivo de polipéptidos que se sabe que son activos a concentraciones micromolares, nanomolares o picomolares. Como la dosificación precisa de estos polipéptidos y la necesidad de la introducción simultánea de células bacterianas es motivo de menor preocupación para aplicaciones veterinarias que para las aplicaciones humanas, es probable que este método para administrar polipéptidos recombinantes sea especialmente valioso en aplicaciones veterinarias. Sin embargo, incluso dentro de la medicina humana, el hecho de que la producción de citoquinas pueda limitarse a los sitios de deposición de células bacterianas inocuas y esté disponible cerca del antígeno durante las primeras fases de la respuesta inmune puede favorecer su uso en circunstancias, tales como la actividad adyuvante, en las que el polipéptido biológicamente activo se localiza mejor para evitar efectos secundarios sistémicos tóxicos. La presente memoria descriptiva también describe:
(i)
un método para administrar uno o más polipéptidos biológicamente activos, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena que expresa dicho uno o más polipéptidos;
(ii)
un método para administrar uno o más antígenos, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena que expresa dicho uno o más antígenos; y
(iii)
un método para administrar uno o más antígenos y/o uno o más polipéptidos biológicamente activos que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena que expresa dicho uno o más antígenos y dicho uno o más polipéptidos biológicamente activos heterólogos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos biológicamente activos son heterólogos para la bacteria procedente de fuentes eucariotas o fuentes procariotas, o sus virus.
La presente memoria descriptiva también describe una bacteria no invasiva o no patógena que expresa (i) uno o más polipéptidos heterólogos biológicamente activos y (ii) uno o más antígenos.
"Actividad biológica" se refiere a la capacidad de realizar una función biológica y con referencia a un polipéptido implica que el polipéptido adopta una conformación estable ("forma plegada") que es la misma o muy parecida a su configuración nativa. Cuando se pliega correctamente o de una forma sustancialmente correcta, por ejemplo con la formación de unidades plegadas apropiadas, \alpha-hélices, láminas \beta, dominios, puentes disulfuro etc., un polipéptido debe tener la capacidad de realizar su función natural. Generalmente, la unidad de función en un polipéptido es un dominio.
La simple capacidad de unirse a un anticuerpo o a otro receptor, con o sin inducción de una respuesta inmune, es pasiva y no constituye "actividad biológica". Cualquier antígeno tiene la capacidad de unirse a un anticuerpo pero no es necesariamente biológicamente activo.
Un polipéptido "heterólogo" es uno que no es nativo para la bacteria, es decir, no se expresa por la bacteria de manera natural o antes de la introducción en la bacteria, o un antepasado de la misma, de un ácido nucleico codificante del polipéptido.
Una bacteria de acuerdo con la presente invención es Gram-positiva y, en principio, puede ser una bacteria inocua, por ejemplo, Listeria innocua, Staphylococcus xylosus o un lactococo. Los lactococos, en particular Lactococcus lactis, representan una realización preferida de la presente invención. Estas bacterias no son colonizadoras.
El especialista en la técnica apreciará que los métodos de la presente invención podrían usarse para administrar una serie de polipéptidos biológicamente activos. Los ejemplos de polipéptidos adecuados incluyen los que pueden funcionar local o sistémicamente, por ejemplo, un polipéptido capaz de ejercer actividades endocrinas que afecten al metabolismo local o de todo el cuerpo y/o el o los polipéptidos biológicamente activos son los que pueden regular las actividades de las células que pertenecen al sistema inmunohemopoyético y/o dicho uno o más polipéptidos biológicamente activos son los que pueden afectar a la viabilidad, crecimiento y diferenciación de una diversidad de células normales o neoplásicas en el cuerpo o afectar a la regulación inmune o inducción de respuestas inflamatorias de fase aguda a lesiones e infecciones, y/o dicho uno o más polipéptidos biológicamente activos son los que pueden aumentar o inducir resistencia a la infección de células y tejidos mediada por quimioquinas que actúan sobre sus receptores de células diana, o la proliferación de células epiteliales o la promoción de la curación de heridas, y/o dicho uno o más polipéptidos biológicamente activos modulan la expresión o la producción de sustancias por las células en el cuerpo.
Los ejemplos específicos de dichos polipéptidos incluyen insulina, hormona de crecimiento, prolactina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona paratiroidea, somatostatina, hormona estimuladora del tiroides, polipéptido intestinal vasoactivo, una citoquina estructural del grupo 1 que adopta una estructura en haces helicoidal 4\alpha antiparalela tal como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-\gamma, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL o IFN\alpha/\beta, una citoquina estructural del grupo 2, que a menudo están asociadas con la superficie celular, forman homotrímeros simétricos y las subunidades adoptan la conformación "\beta-jelly roll" descrita para ciertas proteínas de la cubierta viral tales como la familia TNF de citoquinas, por ejemplo TNF\alpha, TNF\beta, CD40, CD27 o ligandos FAS, la familia IL-1 de citoquinas, la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, los factores de crecimiento derivados de plaquetas, el factor de crecimiento de transformación \beta y factores de crecimiento nerviosos, una citoquina estructural del grupo 3 que comprende moléculas de cadena corta \alpha/\beta, que se producen como moléculas precursoras transmembrana grandes que contienen al menos un dominio EGF en la región extracelular, por ejemplo, la familia de citoquinas del factor de crecimiento epidérmico, las quimioquinas caracterizadas por su posesión de secuencias de aminoácidos agrupadas alrededor de restos de cisteína conservados (los subgrupos de quimioquinas C-C o C-X-C) o las citoquinas relacionadas con insulina, una citoquina estructural del grupo 4 que presenta estructuras en mosaico tales como las heregulinas o neuregulinas compuestas de diferentes dominios, por ejemplo, EFG, dominios de tipo inmunoglobulina y kringle.
Como alternativa, el polipéptido biológicamente activo puede ser un receptor o antagonista de polipéptidos biológicamente activos como se ha definido anteriormente.
La bacteria expresa el polipéptido biológicamente activo y el antígeno a partir del ácido nucleico contenido dentro de ella. El ácido nucleico puede comprender uno o más construcciones de ácido nucleico donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido biológicamente activo y de ácido nucleico que codifica el antígeno están el bajo control de secuencias reguladoras apropiadas para la expresión en la bacteria.
Pueden elegirse o construirse vectores adecuados que comprenden ácidos nucleicos para la introducción en bacterias, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias cuando sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virus, por ejemplo fagos o fagémidos, según sea apropiado. Si se desean más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992, se describen con detalle muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión
de genes. Las descripciones de Sambrook et al. y Ausubel et al. se incorporan en este documento como referencia.
En una realización preferida, las secuencias codificantes del polipéptido biológicamente activo y el antígeno están contenidas en un operón, es decir, una construcción de ácido nucleico para la expresión multicistrónica. En un operón, la transcripción a partir del promotor produce un ARNm que comprende más de una secuencia codificante, cada una con su propio sitio de unión a ribosomas colocado de manera adecuada cadena arriba. De esta manera, A partir de un solo ARNm puede traducirse más de un polipéptido. El uso de un operón permite que la expresión del polipéptido biológicamente activo y el antígeno estén coordinadas.
En una realización alternativa, las secuencias codificantes del polipéptido biológicamente activo y el antígeno forman parte del mismo vector de ácido nucleico, o están en vectores separados, y están individualmente bajo el control regulador de promotores separados. Los promotores pueden ser iguales o diferentes.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una construcción de ácido nucleico o vector que comprende una secuencia codificante de un polipéptido biológicamente activo y una secuencia codificante de un antígeno, donde cada secuencia codificante está bajo el control de un promotor para expresión en una bacteria no invasiva (como se describe, especialmente una bacteria no comensal y/o no colonizadora, por ejemplo un lactococo), ya sea un operón o no lo sea.
Un promotor empleado de acuerdo con la presente invención se expresa constitutivamente en la bacteria. El uso de un promotor constitutivo evita la necesidad de suministrar un inductor u otra señal reguladora para que tenga lugar la expresión. El promotor dirige la expresión a un nivel al cual la célula hospedadora bacteriana se mantiene viable, es decir, conserva alguna actividad metabólica, aunque no se mantenga el crecimiento. Ventajosamente, entonces dicha expresión puede estar a un bajo nivel. Por ejemplo, cuando el producto de expresión se acumula intracelularmente, el nivel de expresión puede conducir a la acumulación del producto de expresión a menos de aproximadamente un 10% de la proteína celular, preferiblemente aproximadamente o menos de aproximadamente un 5%, por ejemplo aproximadamente un 1-3%. El promotor puede ser homólogo para la bacteria empleada, es decir, uno encontrado en esa bacteria de forma natural. Por ejemplo, puede usarse un promotor de Lactococcus en un Lactococcus. Un promotor preferido para uso en Lactococcus lactis (u otro lactococo) es "P1" procedente del cromosoma de Lactococcus lactis (Waterfield N. R., Le Page, R.W.F.; Wilson P.W. and Wells J.M., Gene (en prensa)), cuya secuencia se muestra a continuación (SEC ID Nº 1):
1
La construcción o construcciones de ácido nucleico pueden comprender una secuencia señal de secreción. El ácido nucleico que codifica el polipéptido biológicamente activo permite la secreción del polipéptido biológicamente activo (mediante el acoplamiento apropiado de una secuencia de ácido nucleico que codifica una sola secuencia a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido). La capacidad de una bacteria que lleva el ácido nucleico de secretar el polipéptido puede ensayarse in vitro en condiciones de cultivo que mantienen la viabilidad del organismo.
Las secuencia señal secretoras adecuadas incluyen cualquiera de las que tienen actividad en organismos Gram positivos tales como Bacillus, Clostridium y Lactobacillus. Estas secuencias pueden incluir el líder de secreción de \alpha-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens o el líder de secreción de la enzima estafiloquinasa secretada por algunas cepas de Staphylococcus, que se sabe que actúa en hospedadores Gram-positivos y Gram-negativos (véase "Gene Expression Using Bacillus", Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnology 1: 21-27), o secuencias líder de otras numerosas enzimas del género Bacillus o proteínas de la capa S (véanse las páginas 341-344 de Harwood and Cutting, "Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley & Co. 1990). En el caso de Lactococcus puede preferirse la secuencia líder de la proteína denominada Usp45 (SEC ID Nº 2):
2
Sin embargo, puede ser preferible que el antígeno se acumule intracelularmente. Como se ha descrito, el nivel de acumulación debe permitir a la bacteria permanecer viable, es decir, conservar alguna actividad metabólica, y puede ser menor de aproximadamente un 10% de la proteína celular, preferiblemente de aproximadamente o menos de aproximadamente un 5% de la proteína celular.
En principio, el antígeno puede ser cualquier péptido o polipéptido al que se puede unir un receptor del sistema inmune, tal como un anticuerpo. En una realización preferida, el antígeno es una forma de toxoide bacteriano de una toxina o un fragmento antigénico de la misma. Para una buena compatibilidad de expresión en Lactococcus, que tiene una desviación hacia el uso de A/T con respecto a G/C en sus secuencias codificantes (60% de A/T), el antígeno puede ser uno cuya secuencia codificante sea rica en A/T (tenga un mayor contenido de A/T que de G/C). Por ejemplo, el antígeno puede ser un toxoide (o un fragmento antigénico del mismo) u otro componente inmunogénico de Clostridium o Pneumococcus u otra especie de Streptococcus. Las secuencias codificantes de Clostridium, por ejemplo, a menudo tienen un contenido de pares de bases A/T > 70%, como también lo tienen genes de parásitos de malaria humanos importantes que pertenecen al género Plasmodium.
En el uso para aumentar una respuesta inmune al antígeno, es decir un péptido o polipéptido antigénico como se describe en este documento, el polipéptido biológicamente activo preferiblemente tiene actividad citoquina. Se describen citoquinas en "The Cytokine Facts Book", Callard and Gearing (1994), Academic Press. Son polipéptidos preferidos con actividad citoquina las interleuquinas, incluyendo la Interleuquina-2 (IL-2) y la Interleuquina 6 (IL-6). Muchas citoquinas contienen un puente disulfuro y todas se secretan a partir de las células que las producen de forma natural. Sería de esperar que la naturaleza reductora del citoplasma de las células bacterianas impidiera la formación de puentes disulfuro. No sería evidente que un polipéptido que se secreta de forma natural, especialmente que contiene de forma natural un puente disulfuro, fuera biológicamente activo cuando estuviera retenido en una célula bacteriana.
De esta manera, en una realización, el polipéptido biológicamente activo es uno que se secreta a partir de células que lo producen de forma natural.
El uso de una citoquina para aumentar una respuesta inmune al antígeno de acuerdo con la presente invención es particularmente apropiada para antígenos de baja inmunogenicidad. Además, la aplicación de un inmunógeno a una membrana mucosa generalmente induce una respuesta de IgA. La capacidad de una vacuna de inducir una buena respuesta inmune mucosa (de nivel protector) es una característica muy deseable, ya que se sabe que los anticuerpos slgA juegan un papel vital en la protección de las superficies mucosas contra infecciones. Por ejemplo, se ha demostrado que slgA, que se une a la superficie del bacilo colérico, es capaz de prevenir el cólera experimental en ratones. El anticuerpo slgA que neutralizaba eficazmente VIH-1 puede jugar un papel importante en la protección contra la infección por este virus, ya que una vez que el virus ha accedido al cuerpo se establece una infección que dura toda la vida. Por lo tanto, se buscan métodos para la inducción fiable y de larga duración de respuestas de slgA en la mucosa, ya que la inmensa
mayoría de los virus y patógenos bacterianos humanos inician las infecciones colonizando las superficies mucosas.
De esta manera, en la presente invención pueden emplearse de una forma particularmente ventajosa antígenos de baja inmunogenicidad de un parásito contra el cual es beneficiosa una respuesta de IgA aumentada, por ejemplo el inmunógeno P28 (glutatión-S-transferasa) de Schistosoma mansoni.
Para generar una bacteria de acuerdo con la presente invención, se introduce un ácido nucleico en una célula hospedadora bacteriana. De esta manera, la presente memoria descriptiva también describe un método que comprende introducir un ácido nucleico como se describe en una bacteria no invasiva, una bacteria Gram-positiva y aún más preferiblemente una bacteria no comensal y no colonizadora (tal como Lactococcus). La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. En el caso de las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro cálcico, electroporación y transfección usando bacteriófagos.
Después de la introducción, puede provocarse o permitirse la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, por cultivo de las células hospedadoras en condiciones para la expresión del gen. Puede emplearse el crecimiento de las células en cultivo en condiciones para la expresión del polipéptido biológicamente activo y el antígeno para verificar que las bacterias contienen el ácido nucleico codificante y pueden producir el material codificado.
La presente memoria descriptiva también describe un método para administrar una dosis biológicamente activa de un polipéptido in vivo, comprendiendo el método administrar a un individuo una bacteria no invasiva que contiene ácido nucleico para la expresión de un polipéptido biológicamente activo heterólogo a la bacteria. Como se ha descrito anteriormente, las bacterias preferidas incluyen lactococos tales como Lactococcus lactis y una vía de administración preferida puede ser la aplicación en la mucosa.
Aunque previamente se ha demostrado que es posible expresar en dichas bacterias un polipéptido heterólogo en una forma biológicamente activa, esto sólo se ha hecho en condiciones de cultivo in vitro que están optimizadas para la viabilidad y el crecimiento bacteriano. In vivo, por ejemplo en la membrana mucosa, las bacterias están en un medio que no sería de esperar que soportara su crecimiento o viabilidad. De esta manera, es sorprendente que estas bacterias puedan liberar un polipéptido en una dosis (cantidad) que sea suficiente para que la actividad biológica del polipéptido tenga como resultado un efecto biológico detectable.
En una realización preferida, el polipéptido biológicamente activo tiene actividad citoquina y la bacteria también puede expresar un antígeno. Ventajosamente pueden administrarse interleuquinas tales como IL-2 e IL-6.
Se apreciará que los métodos y el uso de una bacteria no invasiva o no patógena como se ha descrito en este documento proporciona una amplia serie de métodos terapéuticos que permitirían al especialista en la técnica manipular, por ejemplo, la respuesta inmune de un sujeto. De esta manera, la presente memoria descriptiva también describe:
(i)
un método para regular la supervivencia, crecimiento, diferenciación, funciones efectoras o susceptibilidad a la infección de células o tejidos, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena como se define en este documento;
\global\parskip0.900000\baselineskip
(ii)
un método para reforzar una respuesta inmune contra células tumorales o una infección que coloniza una superficie mucosa o tejido adyacente o distante, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena como se define en este documento;
(iii)
un método para modular el tipo de respuesta inmune (anticuerpos frente a respuesta mediada por células) contra un agente infeccioso patógeno, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena como se define en este documento;
(iv)
un método para modular la infiltración de células inflamatorias o tumorales en tejidos normales, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena como se define en este documento;
(v)
un método para controlar la velocidad de crecimiento, la velocidad de invasión o la supervivencia de células tumorales, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena como se define en este documento;
(vi)
un método para inducir la apoptosis en células tumorales, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena como se define en este documento;
(vii)
un método para regular negativamente una respuesta inmune que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena que expresa un polipéptido biológicamente activo; y
(viii)
un método para tratar una patología alérgica autoinmune u otra patología de desregulación inmune, que comprende administrar a un sujeto una bacteria no invasiva o no patógena que expresa un polipéptido biológicamente activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Alternativamente, cuando una bacteria expresa tanto una citoquina como un antígeno, la presente memoria descriptiva también describe un método para aumentar la respuesta inmune a un antígeno, comprendiendo el método administrar a un individuo una bacteria no invasiva que contiene un ácido nucleico para la expresión de un polipéptido con actividad citoquina y un antígeno.
El aumento de una respuesta inmune, tal como una respuesta de anticuerpos, preferiblemente proporciona un nivel de respuesta inmune que es protectora del individuo contra la exposición posterior con el antígeno en un contexto patogénico. Por ejemplo, si el antígeno es un toxoide bacteriano o un fragmento de una toxina, el nivel de una respuesta de anticuerpo a la administración de una bacteria de acuerdo con la presente invención puede proteger posteriormente al individuo contra las consecuencias patógenas de la exposición con la toxina bacteriana, por ejemplo, tras la infección con bacterias que producen la toxina.
La administración de la bacteria por aplicación a una superficie mucosa puede ser ventajosa en ciertos contextos gracias a la generación de una respuesta inmune amentada en la membrana mucosa (por ejemplo, respuesta de IgA) además de una respuesta sistémica.
La bacteria puede aplicarse en un medio nutriente, es decir, un medio que contiene una sustancia o sustancias que mantienen (al menos in vitro) la actividad metabólica en la bacteria. Estas sustancias pueden mantener la viabilidad si no el crecimiento de la bacteria. Estas sustancias pueden incluir una fuente de energía tal como glucosa, aminoácidos y similares.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El individuo al que se le administra la bacteria puede ser un ser humano o un animal, es decir un mamífero no humano. La administración puede ser convenientemente nasal, y puede ser oral, vaginal o anal. En contextos en los que no se prefiere la administración mucosa, la bacteria puede administrarse por cualquier otro medio adecuado dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, por ejemplo, por vías parenterales (i/v, i/p, s/c, i/m).
En un contexto terapéutico, es decir, cuando el efecto biológico de la administración del polipéptido a un individuo es beneficioso para ese individuo, administración preferiblemente se realiza en una "cantidad terapéuticamente eficaz", siendo ésta suficiente para mostrar un efecto beneficioso en un paciente. Este efecto beneficioso puede ser al menos una mejoría de al menos un síntoma. En un contexto profiláctico, la cantidad puede ser suficiente para reducir el efecto perjudicial sobre el individuo de una exposición patogénica posterior, por ejemplo, mediante el aumento de la respuesta inmune. La cantidad real administrada y la velocidad y evolución en el tiempo de la administración dependerán del objetivo de la administración, por ejemplo, el efecto biológico que se pretende conseguir en vista de la naturaleza y gravedad de la exposición, y es el objeto de una optimización rutinaria. La prescripción del tratamiento, incluyendo la vacunación profiláctica, por ejemplo las decisiones sobre la dosificación etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos.
Una composición que comprende bacterias puede administrarse de acuerdo con la presente invención sola o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o secuencial.
La presente memoria descriptiva también describe una composición farmacéutica que comprende una bacteria como se describe. Esta composición farmacéutica es, en una realización, preferiblemente adecuada para la aplicación en una membrana mucosa.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento y para uso de acuerdo con la presente invención pueden comprender, además de la bacteria, un excipiente farmacéuticamente aceptable, vehículo, tampón, estabilizante u otros materiales bien conocidos para los especialistas en la técnica. Estos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración. Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de una afección, puede emplearse una solución acuosa aceptable por vía parenteral que carece de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Las personas de experiencia relevante en la técnica son capaces de preparar soluciones adecuadas. Si es necesario, pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos. Como se ha descrito, un agente farmacéutico que comprende una bacteria para administración de acuerdo con la presente invención puede comprender una o más sustancias nutrientes, por ejemplo una fuente de energía tal como glucosa, aminoácidos y similares.
La presente memoria descriptiva también describe un método de fabricación de un agente farmacéutico que comprende formular bacterias como se ha descrito con un medio de vehículo adecuado para la administración a un individuo. En una realización, el agente farmacéutico es adecuado para la aplicación en una membrana mucosa de un individuo.
La presente memoria descriptiva también describe una bacteria no invasiva que expresa un polipéptido biológicamente activo heterólogo, y posiblemente también un antígeno, para uso farmacéutico, es decir, uso en un método de tratamiento del cuerpo de un ser humano o un animal por cirugía o terapia, incluyendo profilaxis ("vacunación"). Como se describe, la bacteria puede ser Gram-positiva, preferiblemente es no comensal y/o no colonizadora y los ejemplos adecuados incluyen Lactococcus. El método comprende preferiblemente la administración a una membrana mucosa de un individuo, por ejemplo, para aumentar una respuesta inmune en el individuo.
La presente memoria descriptiva también describe el uso de cualquier bacteria como se describe en la fabricación de una composición, es decir una composición farmacéutica o medicamento, para la administración a un individuo. Esta administración preferiblemente es en una membrana mucosa del individuo y puede ser para aumentar la respuesta inmune del individuo, por ejemplo, contra un antígeno expresado por la bacteria.
A modo de ejemplo experimental y no de limitación, a continuación se describe con detalle el uso de una realización de la presente invención para conseguir un nivel protector de respuesta inmune a un antígeno haciendo referencia a las figuras.
La Figura 1 muestra un organigrama de construcciones de plásmidos. El plásmido resultante pTTI2 puede usarse para expresar TTFC e IL-2, y el plásmido pTTI6 resultante puede usarse para expresar TTFC e IL-6 en un organismo tal como Lactococcus lactis.
La Figura 2a muestra el vector pEX1 (también denominado pTREX1) en el que puede insertarse un gen, tal como una construcción de operón que comprende secuencias codificantes para un antígeno (por ejemplo, TTFC) y un polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, una citoquina tal como IL-2 o IL-6) en el sitio de clonación múltiple (MCS).
La Figura 2b muestra una vista ampliada de una región de pEXl (pTREXl) que muestra el promotor P1, la secuencia Shine-Dalgarno (SD) y la secuencia terminadora de la transcripción colocada operativamente para la expresión de un gen (incluyendo una secuencia codificante multi-(di-)cistrónica) cuando se inserta en el MCS (sitio de clonación múltiple) del gen.
La Figura 3 muestra la unión entre TTFC y cistrones de interleuquina en el operón empleado para la expresión.
La Figura 4 muestra títulos de IgG de suero específica para TTFC de grupos de seis ratones vacunados por vía intranasal con Lactococcus lactis recombinante que expresa el fragmento C de la toxina tetánica (TTFC) con las citoquinas murinas IL-2 o IL-6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Para conseguir la expresión simultánea de TTFC y mIL2 o mIL6, se han elegido para la construcción operones que dirigen los dos cistrones bajo investigación. Se han usado vectores para la expresión constitutiva. En general, se intenta flanquear los cistrones con un sitio XbaI inmediatamente antes de la secuencia Shine-Dalgarno (SD) y un sitio SpeI inmediatamente después del codón de terminación. De esta manera, pueden cambiarse fácilmente múltiples cistrones y ponerse en diversas combinaciones en cualquier serie deseada, ya que XbaI y SpeI producen los mismos extremos cohesivos. Previamente se ha conseguido la expresión de mIL2 y mIL6 por medio del promotor de T7 - sitio de unión a ribosomas del gen 10 de T7, de forma que se eligió usar el sitio XbaI presente en el sitio de unión a ribosomas de g10. Para esta disposición, se sabía que la secuencia SD estaba bien colocada. Se eligió poner el cistrón de TTFC delante de las interleuquinas.
\newpage
Construcción de plásmidos
La construcción de los plásmidos se representa en la Figura 1. Se sometieron plásmidos que llevaban mIL2 y mXL6 a mutagénesis dirigida para proporcionar sitios SpeI extra inmediatamente después de los codones de terminación. Los plásmidos resultantes se denominaron pL2MIL2A y pL2MIL6A, respectivamente. Se usó un plásmido que contenía una fusión del líder de secreción de USP45 y TTFC como plantilla para la amplificación por PCR de las diversas secuencias de TTFC necesarias.
Para los operones que dirigen la producción de TTFC intracelular, el gen se amplificó como un fragmento SpeI/BamHI de extremos romos y se clonó en el vector pTREX1, que se cortó con SphI, se hizo romo y se volvió a cortar con BamHI. El plásmido resultante se denominó pT1TT. A partir de este plásmido se aisló el fragmento de TTFC SpeI de 150 pb 3' terminal y se clonó en el sitio XbaI de pL2MIL2A y pL2MIL6A. Los plásmidos resultantes se denominaron p3TTIL2 y p3TTIL6. Se usó un sitio de restricción KpnI presente en el extremo 3' de TTFC para reconstruir TTFC, y de esta forma obtener los operones deseados, por ligamiento del fragmento KpnI-SpeI de p3TTIL2 y p3TTIL6 con los fragmentos KpnI-PvuII y SpeI-PvuII apropiados de pTITT. Los plásmidos resultantes se denominaron pTT12 y pTT16.
Expresión de proteínas
La expresión de proteínas se ensayó por detección con anticuerpos. Para esto, se aplicaron puntualmente colonias de las diferentes cepas bajo investigación sobre membranas de nitrocelulosa y se pusieron en placas de agar sólido GM17 (difco) que contenían antibióticos apropiados. Las placas se incubaron durante una noche y se bloquearon en PBS que contenía leche desnatada en polvo al 2,5%. Los filtros se revelaron con anti-TTFC de conejo o anti MIL2 de conejo. El experimento mostró una clara expresión de TTFC en todas las construcciones que contenían el gen de TTFC. Además de pTTI2 y pTTAI2 se detectó la coexpresión de IL2 y TTFC. Como las uniones entre las unidades de TTFC y mil6 son idénticas a las existentes entre TTFC y mil2 puede suponerse que la IL6 se coexpresaba con TTFC igualmente bien.
Preparación de células para inmunizaciones
Se desarrollaron cepas bacterianas para inmunizaciones a partir de cultivos de una noche recientes que se diluyeron en una proporción de 1 ml de cultivo de una noche en 15 ml de medio GM17 reciente que contenía eritromicina a 5 \mug/ml y se dejaron crecer a 30ºC. Las células se recogieron a una densidad óptica a 600 nm comprendida entre 0,5 y 1,0. Las células se lavaron en 1/10 del volumen de cultivo original de casaminoácidos al 0,5%, bicarbonato sódico 0,2 M y glucosa al 0,5% antes de la resuspensión en 1/200 del volumen de cultivo original y la determinación de la concentración de células bacterianas. Después, las células se diluyeron en la solución anterior para dar el número necesario de células por inmunización.
Inmunización
Los ratones se anestesiaron ligeramente por inhalación usando "Metofane". Se aplicaron 10 \mul de la suspensión bacteriana en una solución de hidrolizado de caseína al 0,5%, bicarbonato sódico 0,2 M y glucosa al 0,5%, en cada orificio nasal sucesivamente usando una pipeta automática. Los animales se observaron minuciosamente para determinar cualquier dificultad respiratoria hasta que se recuperaron completamente de la anestesia.
Resultados
Los resultados se muestran en la Tabla 1 y en la Figura 4. Las bacterias capaces de expresar Interleuquina-2 o Interleuquina-6 inducían más anticuerpo anti-TTFC IOx que las bacterias que expresan TTFC solo.
En el caso de las toxinas bacterianas, la norma es que se consigue un efecto protector una vez que el título de anticuerpos supera un valor umbral. Los niveles de título de anticuerpo encontrados en los ratones en los que se habían inoculado bacterias que contenían pEX-TTFC/IL-2 y pEX-TTFC/IL-6 excedían con mucho del valor umbral para la protección posterior contra la exposición a la toxina tetánica (véase la Figura 4, títulos 35 días después de la vacunación).
Resumen de los ejemplos experimentales
Se construyeron por separado operones artificiales para la co-expresión de un polipéptido antigénico (fragmento de toxina tetánica C-TTFC) y polipéptidos biológicamente activos (Interleuquina-2; Interleuquina-6) en un vector de expresión constitutivo (pTREX1) de forma que la transcripción del gen de TTFC y el gen de interleuquina pudieran controlarse por la actividad de un elemento promotor de lactococos de actividad definida previamente. Las construcciones se prepararon de forma que, después de la traducción del ARNm transcrito a partir de los operones artificiales, el antígeno de TTFC se acumulara intracelularmente. Se unió operativamente a la interleuquina una secuencia señal de secreción. Cuando se administraron preparaciones de estas bacterias por vía intranasal a ratones, las bacterias modificadas por ingeniería genética para expresar Interleuquina-2 o Interleuquina-6 indujeron aproximadamente más anticuerpo anti-TTFC IOx que las construcciones que expresaban el TTFC solo. De esta manera, cualquiera de estas interleuquinas poseía una actividad adyuvante característica en el sistema experimental.
Lactococcus lactis no es una bacteria comensal (a diferencia de las especies relacionadas de lactobacilos, que viven en los cultivos de pollos y están presentes en tractos entéricos de muchos mamíferos), y su nutrición también depende del suministro de aminoácidos y péptidos que es poco probable que estén disponibles in vivo, de forma que la demostración de que las cepas que expresan citoquinas de L. lactis pueden aumentar la producción de anticuerpos es sorprendente. Estos resultados demuestran por primera vez que pueden usarse cepas recombinantes de una bacteria no coloniza-
dora y no invasiva tal como Lactococcus lactis para sintetizar y administrar moléculas biológicamente activas in vivo.
Tabla 1
En la Tabla, "TT/9" se usa para indicar la inoculación con bacterias que expresan TTFC a una dosis de 1 x 10^{9} bacterias, "TT/8" a una dosis de 1 x 10^{8} bacterias y así sucesivamente. "TT IL-2/9" y "TT IL-6/9" indican la inoculación con bacterias que expresan TTFC e IL-2 y TTFC e IL-6, respectivamente, a una dosis de 1 x 10^{9} bacterias, "TT IL-2/8" a una dosis de 1 x 10^{8} bacterias y así sucesivamente. Las figuras proporcionadas son títulos ELISA para ratones individuales.
TABLA 1 Datos de respuesta inmune - día 35 Datos de Títulos de Punto Final en Sangre de 3 Vacunaciones Nasales
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.
Documentos de patentes citados en la descripción
\bullet GB 2278358 B [0008][0008]
Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción
\bulletSteidler et al. Applied and Environmental Microbiology, April 1995, vol. 61 (4), 1627-1629 [0008]
\bulletHeath; Playfair. Vaccine, 1992, vol. 7, 427-434 [0025]
\bullet Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0039]
\bullet Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1992 [0039]
\bulletWaterfield N.R.; Le Page, R.W.F.; Wilson P.W.; Wells J.M. Gene [0043]
\bulletRapoport. Gene Expression Using Bacillus. Current Opinion in Biotechnology, 1990, vol. 1, 21-27 [0045]
\bulletHarwood; Cutting. Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley & Co, 1990, 341-344 [0045]
\bulletCallard; Gearing. The Cytokine Facts Book. Academic Press, 1994 [0048]

Claims (12)

1. Bacteria Gram-positiva no invasiva que contiene al menos una secuencia de ácido nucleico que se expresa bajo el control de un promotor constitutivo y codifica un polipéptido heterólogo biológicamente activo, donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido biológicamente activo comprende una secuencia señal de secreción que proporciona la secreción del polipéptido biológicamente activo, donde la expresión de dicho polipéptido biológicamente activo tiene lugar independientemente de cualquier inductor u otra señal reguladora, para usar como un medicamento.
2. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo con la reivindicación 1, que es una bacteria no colonizadora.
3. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde dicha bacteria Gram-positiva se elige del grupo que consiste en Listeria innocus, Staphylococcus xylosus y una especie de Lactococcus.
4. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha bacteria Gram-positiva es Lactococcus lactis.
5. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho polipéptido biológicamente activo es una citoquina.
6. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo con la reivindicación 5, donde dicha citoquina es una interleuquina.
7. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha interleuquina es IL-2 o IL-6.
8. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la bacteria comprende además al menos una secuencia de ácido nucleico que se expresa bajo el control de un promotor y codifica un antígeno.
9. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho antígeno es heterólogo para dicha bacteria.
10. Bacteria Gram-positiva no invasiva de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, donde dicho antígeno se acumula intracelularmente.
11. Uso de una bacteria Gram-positiva no invasiva según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un adyuvante.
12. Uso de una bacteria Gram-positiva no invasiva según se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para la fabricación de una vacuna.
ES96935054T 1995-10-20 1996-10-21 Liberacion de polipeptidos biologicamente activos. Expired - Lifetime ES2328751T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9521568 1995-10-20
GBGB9521568.7A GB9521568D0 (en) 1995-10-20 1995-10-20 Delivery of biologically active polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2328751T3 true ES2328751T3 (es) 2009-11-17

Family

ID=10782670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES96935054T Expired - Lifetime ES2328751T3 (es) 1995-10-20 1996-10-21 Liberacion de polipeptidos biologicamente activos.

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6605286B2 (es)
EP (1) EP0871748B1 (es)
JP (2) JP2000508162A (es)
KR (1) KR19990064308A (es)
CN (1) CN1195860C (es)
AT (1) ATE435294T1 (es)
AU (1) AU7315496A (es)
BR (1) BR9610929A (es)
CA (1) CA2234941C (es)
DE (1) DE69637961D1 (es)
DK (1) DK0871748T3 (es)
ES (1) ES2328751T3 (es)
GB (1) GB9521568D0 (es)
NO (1) NO328224B1 (es)
NZ (1) NZ320418A (es)
WO (1) WO1997014806A2 (es)
ZA (1) ZA968806B (es)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9521568D0 (en) * 1995-10-20 1995-12-20 Lynxvale Ltd Delivery of biologically active polypeptides
ES2255181T3 (es) * 1997-08-05 2006-06-16 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Antigeno inmunoprotector contra la gripe y su uso en vacunacion.
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
BR9812079A (pt) 1997-09-10 2000-09-26 Vion Pharmaceuticals Inc Salmonella sp. mutante, lipopolissacarìdeo, processo para inibir o crescimento ou reduzir o volume de um câncer de tumor sólido, composição farmacêutica, e, processo aperfeiçoado para selecionar alterações genéticas em uma bactéria.
WO2000023471A2 (en) * 1998-10-20 2000-04-27 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Use of a cytokine-producing lactococcus strain to treat colitis
FR2791998B1 (fr) * 1999-04-07 2001-06-08 Agronomique Inst Nat Rech Lactocoques modifies exprimant une catalase et leurs utilisations
CA2377107C (en) 1999-07-05 2013-04-23 Wolfgang Christian Hans Delivery of trefoil peptides
US6962696B1 (en) * 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
AU2002255851B2 (en) 2001-03-23 2008-03-06 Advanced Bionutrition Microbial feeds for aquaculture and agriculture
US7780961B2 (en) 2001-05-03 2010-08-24 Actogenix N.V. Self-containing Lactococcus strain
AU2003250250B2 (en) 2002-06-19 2008-02-14 Intrexon Actobiotics Nv Methods and means to promote gut absorption
EP1514183A2 (en) * 2002-06-20 2005-03-16 BRITISH TELECOMMUNICATIONS public limited company Distributed computer
US20050129711A1 (en) * 2002-11-14 2005-06-16 Janakiraman Ramachandran Incapacitated whole-cell immunogenic bacterial compositions produced by recombinant expression
CA2506031A1 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Vib Vzw Self-containing lactobacillus strain comprising a thya mutation and therapeutic applications thereof
GB0230331D0 (en) * 2002-12-31 2003-02-05 British Telecomm Method and apparatus for operating a computer network
US7833775B2 (en) * 2003-02-06 2010-11-16 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
US7695725B2 (en) * 2003-02-06 2010-04-13 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
AU2004246999B2 (en) * 2003-02-06 2010-06-10 Aduro Biotech, Inc., Listeria attenuated for entry into non-phagocytic cells, vaccines comprising the listeria, and methods of use thereof
WO2005009397A2 (en) * 2003-02-21 2005-02-03 Hasumi Llc (Dba Shukokai International) Human lymphocyte vaccine adjuvant
US20070298012A1 (en) * 2003-12-16 2007-12-27 Ivan King Compositions and Methods for Tumor-Targeted Delivery of Effector Molecules
GB0412655D0 (en) * 2004-06-07 2004-07-07 British Telecomm Distributed storage network
EP1789529B1 (en) 2004-08-20 2013-10-02 Actogenix N.V. Method to improve lactococcus preservation
WO2006036406A2 (en) 2004-08-25 2006-04-06 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Live microbial microbicides
KR20070057864A (ko) 2004-08-26 2007-06-07 더 유니버시티 오브 웨스턴 온타리오 철 운반의 억제제를 포함하는 약제 조성물, 및 철 운반억제제를 동정하는 방법
BRPI0610609A2 (pt) 2005-04-15 2010-07-06 Univ North Carolina State métodos e composições para modular a adesão e toleráncia ao estresse em bactérias
WO2007025333A1 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Bacterial delivery of biologically active polypeptides
CA2925307C (en) 2005-08-30 2019-12-03 Intrexon Actobiotics Nv Novel treatment of chronic enterocolitis
RU2420569C2 (ru) 2005-11-29 2011-06-10 Актогеникс Нв Индукция толерантности к антигенам через слизистую
US20110182859A1 (en) * 2010-01-22 2011-07-28 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Compositions and methods for therapeutic delivery with microorganisms
US20110172826A1 (en) * 2005-12-14 2011-07-14 Amodei Dario G Device including altered microorganisms, and methods and systems of use
US8734823B2 (en) * 2005-12-14 2014-05-27 The Invention Science Fund I, Llc Device including altered microorganisms, and methods and systems of use
US8278094B2 (en) 2005-12-14 2012-10-02 The Invention Science Fund I, Llc Bone semi-permeable device
US8682619B2 (en) * 2005-12-14 2014-03-25 The Invention Science Fund I, Llc Device including altered microorganisms, and methods and systems of use
BRPI0711119A2 (pt) * 2006-05-02 2011-08-30 Actogenix Nv administração microbiana de peptìdeos intestinais associados à obesidade
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
CA2672229A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Actogenix N.V. Delivery of binding molecules to induce immunomodulation
EP2115146B1 (en) 2007-01-12 2016-07-06 Intrexon Actobiotics NV Lactococcus promoters and uses thereof
BRPI0807857A2 (pt) * 2007-01-25 2014-05-27 Actogenix Nv Tratamento de doença imune por meio de distribuição através da mucosa de antígenos.
EP3181682B1 (en) 2008-09-29 2021-04-21 Intrexon Actobiotics NV Reduced colonization of microbes at the mucosa
US8241623B1 (en) 2009-02-09 2012-08-14 David Bermudes Protease sensitivity expression system
WO2010124855A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Actogenix Nv Cryoprotectants for freeze drying of lactic acid bacteria
EP2275527A1 (en) 2009-07-17 2011-01-19 ActoGeniX NV Animal component-free culture medium for bacterial fermentation
US20120183503A1 (en) 2009-09-29 2012-07-19 Actogenix N.V. Lactobacillus and streptococcus promoters and uses thereof
EP2343319A1 (en) 2010-01-07 2011-07-13 University of Ljubljana Genetically modified food grade microorganism for treatment of inflammatory bowel disease
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
CA2802994A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 The United States Of America As Represented By The Secretary, National I Nstitutes Of Health Compositions and methods for treating inflammatory conditions
CN101921725B (zh) * 2010-07-27 2013-06-05 浙江大学 一种口服免疫阻断鸡生长抑素作用的转化子及其应用
JP5991650B2 (ja) * 2010-08-10 2016-09-14 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 サイトカインを発現する豚丹毒菌及び豚丹毒菌を用いたサイトカインのデリバリー方法
RU2644346C2 (ru) 2011-06-01 2018-02-08 Интрексон Актобиотикс Н.В. Система полицистронной экспрессии для бактерий
DK2758512T3 (en) 2011-09-23 2018-07-23 Intrexon Actobiotics Nv MODIFIED GRAM POSITIVE BACTERIES AND APPLICATIONS THEREOF
KR102028771B1 (ko) 2011-09-23 2019-10-04 인트랙슨 액토바이오틱스 엔.브이. 변형된 그람 양성 박테리아 및 그 사용 방법
KR20150065170A (ko) 2012-08-07 2015-06-12 탑제닉스, 인크. 관심있는 화합물을 발현하는 형질전환된 박테리아를 포함하는 국소 조성물
US9593339B1 (en) 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
JP6088648B2 (ja) * 2013-06-11 2017-03-01 ハウスウェルネスフーズ株式会社 貪食細胞へ物質を送達する担体
WO2015195546A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 TopGeniX, Inc. Topical formulations for uv protection
EP3020816A1 (en) * 2014-11-11 2016-05-18 University College Cork Bacterial mediated gene therapy
CN104476458B (zh) * 2014-11-14 2016-08-17 中黔电气集团股份有限公司 一种带自动夹紧机构的低压柜骨架组装台
JP6581208B2 (ja) 2014-12-23 2019-09-25 イリヤ ファーマ エービー 創傷治癒の方法
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CA3011331A1 (en) 2016-01-14 2017-07-20 Intrexon Actobiotics N.V. Compositions and methods for the treatment of type 1 diabetes
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
KR102553825B1 (ko) * 2018-05-04 2023-07-13 (주)메디톡스 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도
KR102015116B1 (ko) * 2018-05-04 2019-10-21 (주)메디톡스 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도
US20220127629A1 (en) * 2019-03-04 2022-04-28 Celloryx AG Chloride-Inducible Prokaryotic Expression System

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4874702A (en) * 1980-09-08 1989-10-17 Biogen, Inc. Vectors and methods for making such vectors and for expressive cloned genes
US5417986A (en) * 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
US5032510A (en) * 1984-09-26 1991-07-16 Eli Lilly And Company Method for expression and secretion in bacillus
EP0176320B1 (en) * 1984-09-26 1990-07-25 Eli Lilly And Company A method for expression and secretion in bacillus
US5591632A (en) * 1987-03-02 1997-01-07 Beth Israel Hospital Recombinant BCG
US5504005A (en) * 1987-03-02 1996-04-02 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Recombinant mycobacterial vaccine
US5330753A (en) * 1987-04-29 1994-07-19 President And Fellows Of Harvard College Cholera vaccines
US6130082A (en) * 1988-05-05 2000-10-10 American Cyanamid Company Recombinant flagellin vaccines
US5149532A (en) * 1989-11-01 1992-09-22 Cedars Sinai Medical Center Method of vaccine or toxoid preparation and immunization by colonization with recombinant microorganisms
GB9006400D0 (en) * 1990-03-22 1990-05-23 Ciba Geigy Ag Bacterial vectors
IL99097A0 (en) * 1990-09-05 1992-07-15 Akzo Nv Haemophilus paragallinarum vaccine
WO1992015689A1 (en) * 1991-03-05 1992-09-17 The Wellcome Foundation Limited Expression of recombinant proteins in attenuated bacteria
IL103530A0 (en) * 1991-10-25 1993-03-15 Duphar Int Res Treponema hyodysenteriae vaccine
CA2130453A1 (en) 1992-02-27 1993-09-02 Richard W. F. Le Page Heterologous gene expression in lactococcus, and the expression products threrefrom
US5455034A (en) * 1992-06-26 1995-10-03 Kansas State University Research Foundation Fusobacterium necrophorum leukotoxoid vaccine
US5837509A (en) * 1992-12-30 1998-11-17 Bioteknologisk Institut Recombinant lactic acid bacterium containing an inserted promoter and method of constructing same
IT1270123B (it) * 1994-10-05 1997-04-28 Dompe Spa Composizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati e loro uso per terapia
US5733540A (en) * 1995-03-08 1998-03-31 Lee; Peter Poon-Hang Protection from viral infection via colonization of mucosal membranes with genetically modified bacteria
US5824538A (en) * 1995-09-06 1998-10-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Shigella vector for delivering DNA to a mammalian cell
GB9518323D0 (en) * 1995-09-07 1995-11-08 Steidler Lothar Materials and methods relating to the attachment and display of substances on cell surfaces
GB9521568D0 (en) * 1995-10-20 1995-12-20 Lynxvale Ltd Delivery of biologically active polypeptides
DE69736226T2 (de) * 1996-04-19 2006-11-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Verfahren zur anregung einer immunantwort durch verabreichung von nutzorganismen, die intimin allein oder als fusionsprotein mit einem oder mehreren anderen antigenen exprimieren
US6685943B1 (en) * 1997-01-21 2004-02-03 The Texas A&M University System Fibronectin binding protein compositions and methods of use
PT892054E (pt) * 1997-06-20 2007-02-28 Intervet Int Bv Vacina de clostridium perfringens
US6100388A (en) * 1998-03-16 2000-08-08 Biogaia Biologies Ab Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccine delivery vehicle
US6190669B1 (en) * 1998-05-13 2001-02-20 University Of Maryland, Baltimore Attenuated mutants of salmonella which constitutively express the Vi antigen
WO2000023471A2 (en) * 1998-10-20 2000-04-27 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Use of a cytokine-producing lactococcus strain to treat colitis
WO2002033109A2 (en) * 2000-10-20 2002-04-25 Bioteknologisk Institut Fermentation method for production of heterologous gene products in lactic acid bacteria
US7425449B2 (en) * 2002-04-30 2008-09-16 The Regents Of The University Of California Site specific Listeria integration vectors and methods for using the same

Also Published As

Publication number Publication date
AU7315496A (en) 1997-05-07
MX9803093A (es) 1998-11-29
BR9610929A (pt) 1999-12-21
ZA968806B (en) 1998-04-20
EP0871748A2 (en) 1998-10-21
CA2234941C (en) 2010-09-21
JP2000508162A (ja) 2000-07-04
US6605286B2 (en) 2003-08-12
NZ320418A (en) 2000-03-27
US20010006642A1 (en) 2001-07-05
NO981746D0 (no) 1998-04-17
US20030202991A1 (en) 2003-10-30
WO1997014806A2 (en) 1997-04-24
WO1997014806A3 (en) 1997-08-21
GB9521568D0 (en) 1995-12-20
ATE435294T1 (de) 2009-07-15
EP0871748B1 (en) 2009-07-01
KR19990064308A (ko) 1999-07-26
CN1202934A (zh) 1998-12-23
NO328224B1 (no) 2010-01-11
DE69637961D1 (de) 2009-08-13
JP2008067708A (ja) 2008-03-27
NO981746L (no) 1998-06-22
DK0871748T3 (da) 2009-10-19
CN1195860C (zh) 2005-04-06
CA2234941A1 (en) 1997-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2328751T3 (es) Liberacion de polipeptidos biologicamente activos.
Bermúdez-Humarán Lactococcus lactis as a live vector for mucosal delivery of therapeutic proteins
Sáez et al. Oral immunization of mice with recombinant Lactococcus lactis expressing Cu, Zn superoxide dismutase of Brucella abortus triggers protective immunity
Bahey-El-Din et al. Lactococcus lactis as a cell factory for delivery of therapeutic proteins
JP4583607B2 (ja) 感染症の治療のための弱毒化微生物
Mielcarek et al. Nasal vaccination using live bacterial vectors
ES2199932T3 (es) Poxvirus recombinante y vacuna estreptococica que contiene proteina m.
Carrier et al. Expression of human IL-1 beta in Salmonella typhimurium. A model system for the delivery of recombinant therapeutic proteins in vivo.
JP2019073554A (ja) アイメリアに対する免疫応答を強化するか又はアイメリア感染症を制限する組成物及び方法
Maurice et al. Oral immunization of Carassius auratus with modified recombinant A-layer proteins entrapped in alginate beads
AU655556B2 (en) Interleukin-2-leukotoxin gene fusions and uses thereof
ES2256514T3 (es) Vacuna bacterial.
Liu et al. Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium expressing Helicobacter pylori urease B subunit
RU2701733C1 (ru) Живая вакцина на основе штамма пробиотиков ENTEROCOCCUS FAECIUM L3 для профилактики инфекции, вызванной STREPTOCOCCUS PNEUMONIE
AU774535B2 (en) Delivery of biologically active polypeptides
EP1210445B1 (en) Recombinant microorganisms
MXPA98003093A (es) Suministro de polipeptidos biologicamente activos
JP2003518933A (ja) 感染症の治療のための弱毒化微生物
US9409956B2 (en) Salmonella typhi Ty21a expressing Yersinia pestis F1-V fusion protein and uses thereof
Silva et al. Cholera vaccine candidate 638: intranasal immunogenicity and expression of a foreign antigen from the pulmonary pathogen Coccidioides immitis
Galan et al. Expression and localization of the Streptococcus equi M protein in Escherichia coli and Salmonella typhimurium
KR100392916B1 (ko) htrA-프로모터를 사용하여 약독된 박테리아 내에서 이종단백질을 발현시키는 방법
AU2022382621A1 (en) Pharmaceutical composition comprising salmonella strain and immune checkpoint inhibitor as active ingredient for prevention or treatment of cancer
Cárdenas et al. Stability, immunogenicity, and expression of foreign antigens in bacterial vaccine vectors
Loomis et al. Utility of the PhoP virulence regulon in live salmonella vaccines and heterologous antigen delivery systems