KR19980024611A - 아카르보스 제조를 위한 삼투 조절된 발효 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 당뇨병 약제로서 사용되는 효능있는 α-글루코시다제 억제제인 아카르보스의 제조를 위한 신규한 발효 방법에 관한 것이다. 이는 통상적으로, 공정이 최적화되지 않으면 비경제적이므로 활성 화합물의 발효성 제조의 개선을 위한 수요가 있어왔다. 따라서, 본 발명으로 발효 용액에서의 오스몰 농도를 추적 및 조절함으로써, 발효로부터인 실질적 수율 증진을 달성하게 된다.
Description
아카르보스는 당뇨병의 치료용으로 상품명 글루코베이(GlucobayR)로 경구 투여된 당뇨병 약제로서 사용되는 효능있는 α-글루코시다제 억제제이다. 활성 화합물은 발효에 의해 수득되고; 생산자 유기체는 토양 박테리아 악티노플라네스(Actinoplanes) 종 SE 50/110, 또는 그로부터 유도된 돌연변이체이다.
통상적으로, 아카르보스와 같은 활성 화합물의 발효성 제조는 공정을 최적화하지 않고는 비경제적이다. 따라서 통상적으로, 달성할 수 있는 공간-시간 수율에 관해서는 발효를 상당히 개선할 필요가 있다. 수율 증진은 당업자들에게 공지된 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 이들로는 예를 들면, 생산자 유기체의 돌연변이원 처리, 및 생존 세포로부터 보다 높게 생산하는 돌연변이체의 선택이 포함되고; 이들 향상된 생산 균주를 본 방법으로 다시 처리할 수 있다. 유사하게는 종종, 분자 생물학의 혼입 기술로 균주를 개선할 수 있다. 추가의 중요한 접근 방법은 그의 성분 및 정량적 조성이 최대 생성물 수율을 달성하도록 되어야 하는 생산 배지를 최적화시키는 것이다. 최종적으로는 또한, 생산자 유기체를 산소 공급, 온도, pH, 전단 응력 등에 관한 생장 및 생성물 형성을 위한 최적 조건에 노출시킴으로써 발효 방법이 수율 증진에 기여할 수 있다.
본 발명은 상기에서 마지막으로 언급한 최적화 전략, 즉 발효 조건의 향상에 관한 것이다. 놀랍게도 본 발명에 이르러서야, 발효 용액의 오스몰 농도 -보통은 미생물 발효에 고려되지 않는 매개 변수임- 가 아카르보스 발효의 최종 수율에 꽤 상당한 효과를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 이는 모두, 결정적인 오스몰 농도 범위가 전혀 극한 범위 내에 있지 않지만, 예를 들면 200 내지 600 밀리오스몰/㎏의 중등 오스몰 농도로, 즉 종종 미생물 배양용 영양액 중에서 달성되는 범위로 존재하기 때문에 더욱 놀랍다. 상기 범위의 오스몰 농도는 통상, 예를 들면 인간 혈액의 값이 약 400 밀리오스몰/㎏이기 때문에, 완전히 생리적으로 정의될 수 있다. 놀랍게도, 낮은 영양액 오스몰 농도, 예를 들면 200 밀리오스몰/㎏ 뿐만 아니라, 보다 높은 영양액 오스몰 농도, 예를 들면 600 밀리오스몰/㎏도 보다 유의하게 낮은 생산성을 초래하고, 종종은 아카르보스 배양물이 그러한 조건 하에서조차 전혀 생성물을 형성하지 않는다는 것이 밝혀졌다.
아카르보스 형성 유기체 생산성의 현저한 오스몰 농도 의존성을 근거로 하여, 2차 대사산물 아카르보스의 발효에 대한 신규한 조절 전략이 개발되었고, 이 조절 전략은 현재까지 비교가능한 미생물 발효에서, 특히 산업 분야에서 이용되지 않았다. 상기 조절 전략의 원리는 적합한 방식으로 수행하려는 삼투적 활성 물질을 첨가함으로써 목적하는 최적 범위의 오스몰 농도를 유지하는 것이다. 상기 물질을 분획상으로 한꺼번에 또는 연속적으로, 공급-배치(fed-batch) 방법으로서 수행된 발효에 첨가할 수 있다. 그러나 놀랍게도 또한, 2차 대사산물 발효를 완전한 연속 공정으로 수행함으로써, 즉 하나 이상의 물질을 함유하는 영양액을 첨가함으로써 오스몰 농도를 일정하게 유지할 수 있고; 이러한 타입의 연속 발효에서, 정상 상태의 오스몰 농도는 배양물 중에 발생한다. 문제의 삼투적 활성 물질은 바람직하게는, 배양된 생산자 유기체의 생장을 촉진시키는 물질이다. 이들은 특히 C원, N원 및 염이 포함된다. 물질 각각 또는 이들 물질의 혼합물을 오스몰 농도 안정화용 배양물에 공급할 수 있다.
도 1은 아카르보스 발효시 생산성에 대한 오스몰 농도를 도시한 그래프.
도 2는 아카르보스 발효시 생산성에 대한 오스몰 농도를 도시한 그래프.
도 3은 중간 시험 규모로 수행한 아카르보스 배치 발효시의 오스몰 농도를 도시한 그래프.
도 4는 실험실 규모로 수행한 단일 분획의 신선한 영양액 배치상 첨가에 의한 오스몰 농도를 도시한 그래프.
도 5는 중간 시험 규모로 수행한 삼투 조절한 아카르보스 발효시의 오스몰 농도를 도시한 그래프.
도 6은 아카르보스 연속 발효 공정에 의해 바람직한 범위로 유지될 수 있는 배양물 브로스 중의 오스몰 농도를 도시한 그래프.
도 7은 중간 시험 규모로 수행한 아카르보스 연속 발효 공정에 의해, 배치 발효를 위한 최대치가 되도록 성공적으로 유지된 생산성을 도시한 그래프.
따라서, 본 발명은 2가지 필수 국면으로 이루어진다:
1. 그의 목적이 아카르보스 발효의 배양액 중의 오스몰 농도에 대해 한정된 범위 유지에 있는 조절 전략.
2. 기질을 공급-배치 발효 하에서 단일 분획으로서 한꺼번에 또는 연속적으로 첨가하거나, 또는 완전한 영양액을 완전한 연속 발효 하에서 첨가하는 것을 특징으로 하는 목적하는 오스몰 농도 범위의 유지 방법.
아카르보스 발효를 최적화하려는 노력 중에, 다양한 공정 변수를 생산성에 대한 그들의 영향에 관하여 실험하였다. 본 발명에 이르러서야, 영양액 조성, 및 발효의 수행 방식 둘다가 생성물 수율에 영향을 준다는 것이 밝혀졌다. 이들 결과는 야생 타입 균주 및 보다 높게 생산하는 고성능 돌연변이체 둘다에서 동일하게 또는 유사하게 관찰되었다.
배지에 관해서는, 아카르보스 발효를 위해 상이한 영양액 조성을 성공적으로 사용할 수 있다(Frommer 등, DE 26 14 393). 통상적으로는, 탄소원, 비타민 및 미량 원소, 염 및 완충 물질을 포함하는 영양액을 사용하는 것이 편리하다. 적합한 탄소원의 일례는 아카르보스 분자의 구조 원소를 형성하는 맥아당이다. 경제적 이유 때문에, 포도당, 맥아당 및 보다 고급 포도당 올리고머를 포함하는 전분 가수분해물과 같은 보다 저렴함 탄소원을 사용하는 것은 유리하다. 적합한 질소원은 개별적 아미노산, 예를 들면, 글루타민 또는 아스파라긴, 단백질 가수분해물 또는 단백질 추출물, 또는 대두 밀(meal), 감자 가루, 글루텐 또는 기타 복합 단백질- 또는 펩티드- 함유 기질과 같은 고단백질 개시 물질이다. 인산염 및 철염을 영양액에 혼입하고, 완충물질, 예를 들면 탄산칼슘을 사용하여 pH를 조절하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 미량 원소는 복합 영양액 기질에 의해 및(또는) 수돗물에 의해 영양액에 공급된다. 탈염수를 사용한 경우, 미량 원소 농축물을 첨가하는 것이 편리하였다.
발효 방법에 관해서는, pH를 생리적 범위, 즉 pH 5 내지 8로 유지하고, 배양물에 충분한 산소를 공급하여 상기 한계를 배제하는 것이 편리하다. 최적의 생산성은 약 30 ℃에서 달성되었다. 아카르보스 생산자가 섬유상 박테리아이기 때문에, 교반된 탱크 발효에서 극도로 높은 교반기 속도를 제거하고, 따라서 더 이상 묵인할 수 없는 전단력을 제거하는 것은 추가로 유리하다.
발효를 최적화하는 동안 놀랍게도, 영양액 조성물에 의해 발생된 오스몰 농도가 아카르보스 생산성에 상당히 현저한 영향을 가졌다는 것이 밝혀졌다. 이러한 영향은 바로 극한치까지 제한하지 않지만, 오히려 완전히 생리적 범위에 존재한다. 또한 놀랍게도, 높은 오스몰 농도 뿐만 아니라, 낮은 오스몰 농도도 상당한 생산성 저하를 초래한다. 이러한 관계는 도 1 및 2에서 명확해진다. 오스몰 농도는 약 400 밀리오스몰/㎏에서 최적이다. 값 500 밀리오스몰/㎏ 또는 300 밀리오스몰/㎏은 검출가능한 생산성 하강을 초래하고, 값 600 밀리오스몰/㎏ 또는 200 밀리오스몰/㎏은 상당히 현저한 생산성 하강을 초래하고; 일부의 경우에서는, 특히 상기 오스몰 농도 범위의 한계 또는 외계에서는 아카르보스 생성을 전혀 측정할 수 없었다. 미생물에 대한 이러한 관계는 통상적으로 낮은 오스몰 농도가 미생물 신진대사 활성에 대해 부작용을 나타내지 않고 상당히 보다 높은 오스몰 농도가 통상적으로 묵인되기 때문에 놀랍다.
아카르보스 생산성에 대한 오스몰 농도의 영향의 결과에 의하면, 발효 동안의 오스몰 농도를 바람직한 범위로 유지할 수 있는 경우, 발효를 성공적으로 최적화할 수 있다는 것이 제안된다. 미생물 배양 동안의 오스몰 농도 과정은 한편으로는 영양액으로부터인 삼투적 활성 기질의 소모에 의해, 및 또다른 한편으로는 생장 동안에 영양액으로 방출되는 삼투적 활성 생성물의 형성에 의해 결정된다. 아카르보스 배치 발효의 경우, 도 3에서 도시한 과정은 하기를 결과한다: 발효 개시의 오스몰 농도는 약 500 밀리오스몰/㎏, 즉 이미 약간의 생산성 억제를 초래하는 값이다. 발효 동안 오스몰 농도는 저하되고, 최적 범위를 통해 통과한 다음, 다시 생산성 하강을 초래하는 값에 도달한다.
이제 본 발명에 이르러서야, 작동 양태를 삼투 조절할 수 있는 조절 전략을 개발하려고 시도하였다. 통상, 영양액 기질을 미생물 배양물에 첨가하는 목적은 기질 농도에 의해 발생되는 한정된 신진대사 상태를 발생시키려는 것이다. 종종, 상기 동안 기질 한계를 배제하거나 한정된 기질 한계를 발생시키려고 시도한다. 그러나, 본 경우에서는 조절의 목적이 삼투적 활성 영양액 성분을 첨가함으로써 한정된 바람직한 오스몰 농도 범위를 유지하는 것이지만; 동시에, 우연히 초래된 과도한 또는 과도하게 불안정한 기질 농도가 기질의 첨가에 의해 발생되었기 때문에, 불리하게 작용하지 않도록 주의할 필요가 있었다.
삼투 조절된 3가지의 작동 방법 변형을 시험하였다:
1. 신선한 영양액을 발효 동안에 일회분씩 한꺼번에 첨가하고; 이로써 오스몰 농도를 단계에서 수요가 많은(sought-after) 최적치까지 유도할 수 있다.
2. 공급-배치 공정에서 발효 동안에 하나 이상의 기질을 연속 첨가하고; 이 방법에 의해 오스몰 농도를 전체 발효 기간 동안에 바람직한 범위로 유지할 수 있다.
3. 신선한 영양액을 연속 첨가하고 생성물 함유 배양물 브로스(broth)를 연속 제거하는 완전한 연속 발효; 이 경우, 오스몰 농도를 유사하게는 전체 발효 기간 동안에 바람직한 범위로 유지할 수 있고, 동시에 아카르보스 형성을 위해 최적인 정상 상태를 배양물에서 달성할 수 있다.
일회분씩 한꺼번의 신선한 영양액 첨가는 수행하기에 기술적으로 간단한 방법이다. 그러나, 상기 방법의 단점은 오스몰 농도를 단계에서 적용하기만 하고, 일부의 환경에서는 비교적 다량의 신선한 기질 첨가가 생합성 조절에 관하여 바람직하지 않게 작용할 수 있다는 것이다. 후자의 국면은 특히, 2차 물질대사와 관련있는 생합성 경로의 경우에서 중요한 것이다. 일회분씩 한꺼번의 신선한 영양액 첨가는 진탕된 플래스크에서 실험실 규모로 수행하였다. 놀랍게도, 단일 분획의 신선한 영양액 배치상 첨가에 의해 배양물 브로스의 오스몰 농도가 최적 조건으로 인지되는 350 내지 450 밀리오스몰/㎏으로 성공적으로 유지되었고, 따라서 유의한 생성물 수율 증진이 달성되었다(도 4: 오스몰 농도 과정 및 표 1: 최종 아카르보스 수율). 이 경우에서는 비교적 대부분의 영양액을 때맞춰 소수 시점에(예를 들면, 48시 및 96시 후에) 첨가할 수 있거나, 또는 비교적 적은 부분의 영양액을 보다 짧은 시간 간격으로 첨가할 수 있고, 연속 첨가와 비슷하다.
발효 동안에 영양액의 연속 첨가를 수행하였고 중간 시험 규모로 시험하였2다. 상기 공정을 실시예 2에 기술한다. 사용된 영양 기질은 예시할 목적으로, 영양액 중에서 통상적으로 사용된 탄소원(전분 가수분해물)이었다. 기타 영양액 성분(질소원, 염) 또는 다수의 영양액 성분의 혼합물을 또한 동일한 방식으로 사용할 수 있었다. 배양물 브로스의 오스몰 농도를 약 350 내지 약 450 밀리오스몰/㎏의 바람직한 범위로 유지할 수 있었다(도 5). 약 40시에 발효로의 연속 공급을 개시함으로써 발효 처음에 오스몰 농도 저하를 억제할 수 있었다는 것을 명확하게 알 수 있다. 대조적으로는, 삼투 조절 하에 있지 않은 대조군 발효 방법의 오스몰 농도는 이미 도 3에서 도시한 바와 같이, 전체 발효 기간에 걸쳐 저하된다. 표 2는 공급-배치 방법에서 영양액 성분의 연속 공급에 의해 달성된 삼투 조절된 발효 방법이 수율을 유의하게 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
| 발효 방법 | 최종 수율(%) |
| 삼투 조절하지 않은 아카르보스 발효 | 100 |
| 오스몰 농도 조절한 아카르보스 발효48시 및 72시 후의 신선한 영양액 첨가 | 109 |
| 오스몰 농도 조절한 아카르보스 발효48시 및 96시 후의 신선한 영양액 첨가 | 122 |
| 발효 방법 | 최종 수율(%) |
| 삼투 조절하지 않은 아카르보스 발효 | 100 |
| 오스몰 농도 조절한 아카르보스 발효 | 131 |
실시예 3은 삼투 조절을 위해 완전한 연속 발효 방법을 기술한다. 2차 대사산물의 완전한 연속 발효는 원칙적으로 다수의 경우에 불가능한데, 그 이유는 생장이 실질적으로 또는 완전히 중지된 후까지 신진대사의 조절 현상으로 인한 최대 생산성이 달성되지 않기 때문이다. 그러나, 생장과 생성물 형성 사이의 유사는 가능해질 연속 배양을 위한 강제적 예비 조건이다. 따라서, 아카르보스 발효의 경우, 완전한 연속 작동 양태를 성공적으로 수행할 수 있었다는 것이 절대적으로 놀랄만한 것으로서 간주해야 한다. 도 6은 배양물 브로스 중의 오스몰 농도가 연속 방법 공정에 의해 바람직한 범위로 유지될 수 있었다는 것을 도시한다. 도 7에서 도시한 바와 같이 결과적으로, 생산성은 수회의 부피 변화에 걸쳐 배치 발효를 위한 최대치로 성공적으로 유지되었다.
본 발명에 대해서는, 오스몰 농도 최적 조건이 균주-특이 매개변수라고 지적하는 것이 중요하다. 균주 개선 기술에 의해 생성된 상이한 고성능 균주는 그들의 오스몰 농도 최적 조건이 상이할 수 있다. 오스몰 농도 최적 조건이 변화되는 고성능 돌연변이체를 생성하는 것이 균주 개선의 목적이기조차 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 명세서에서 언급한 오스몰 농도 값은 예시적인 것이며 이 값은 사용한 생성 균주에 적용된다. 오스몰 농도 최적 조건은 신선하게 생성된 고성능 돌연변이체 각각에 관하여 새로이 결정해야 하고, 최적 오스몰 농도를 기술된 방식으로 유지하려고 시도하도록 삼투 조절된 발효를 수행하여야 한다.
실시예
실시예 1
신선한 영양액을 일회분씩 한꺼번에 아카르보스 발효에 첨가함에 의한 오스몰 농도 조절
아카르보스 생산자 균주를 1ℓ 들이 진탕된 플래스크에서 하기 영양액 90 ㎖ 중에 배양하였다: 전분 가수분해물 100 g/ℓ, 효모 추출물 7 g/ℓ, 카제인 가수분해물 3 g/ℓ, CaCO33g/ℓ, K2HPO43 g/ℓ, 수돗물, pH 6.9. 영양액을 오토클레이브에서 121 ℃에서 10분 동안 살균시킨 다음, 시드 배양물로 접종하였고 30 ℃ 및 250 rpm의 진탕기 횟수로 가온하였다. 상기에서 구체화한 조성의 1.5배 농축된 영양액 20 ㎖를 매번 48시 및 72시 후에, 또는 48시 및 96시 후에 첨가하였다. 공급액은 오토클레이브에서 121 ℃에서 10분 동안 살균시켰다. 오스몰 농도는 동결점 하강을 측정함으로써 1일 1회 결정하였고; 아카르보스 함량은 HPLC로 1일 1회 결정하였다.
실시예 2
영양액 기질을 아카르보스 발효에 연속 첨가함에 의한 오스몰 농도 조절
아카르보스 생산자 균주를 3,000ℓ 들이 발효조에서 하기 영양액 1,600ℓ 중에서 배양하였다: 전분 가수분해물 100 g/ℓ, 효모 추출물 7 g/ℓ, 카제인 가수분해물 3 g/ℓ, CaCO33g/ℓ, K2HPO43 g/ℓ, 수돗물, pH 6.9. 영양액을 연속 방법으로 살균(150 ℃, 52초)시켰고, 이전에 살균된 발효조로 충전시켰고, 300ℓ 들이 발효조에서 생성된 시드 배양물로 접종하였고 하기 조건 하에서 발효시켰다: 온도: 31 ℃, 헤드 공간 압력: 1.0 내지 1.8 바, 교반: 150 내지 220 rpm, 폭기(曝氣) 속도: 500 내지 1,000ℓ/분. 48시로부터, 전분 가수분해물 용액을 약 3.2ℓ/시의 공급 속도로 연속 공급하였고; 용액은 수돗물 중에 163 ㎏의 전분 가수분해물을 포함하였고(최종 부피: 233ℓ) 121 내지 125 ℃에서 20분 동안 살균시켰다. 오스몰 농도는 동결점 하강을 측정함으로써 1일 1회 결정하였다. 아카르보스는 HPLC로 결정하였다.
실시예 3
연속적 아카르보스 발효에 의한 오스몰 농도 조절
아카르보스 생산자 균주를 3,000ℓ 들이 발효조에서 하기 영양액 1,600ℓ 중에서 배양하였다: 전분 가수분해물 100 g/ℓ, L-아스파라긴·2H2O 20 g/ℓ, K2HPO43 g/ℓ, MgSO4·7H2O 2 g/ℓ, FeCl3·6H2O 1 g/ℓ, Mg3(PO4)2·8H2O 2 g/ℓ, MnCl2·4H2O 0.1 g/ℓ, CoCl2·6H2O 0.1 g/ℓ, ZnCl20.1 g/ℓ, 수돗물, pH 6.8. 영양액을 연속 방법으로 살균(150 ℃, 52초)시켰고, 이전에 살균된 발효조로 충전시켰고, 300ℓ 들이 발효조에서 생성된 시드 배양물로 접종하였고 하기 조건 하에서 발효시켰다: 온도: 31 ℃, 헤드 공간 압력: 1.0 내지 1.8 바, 교반: 150 내지 220 rpm, 폭기 속도: 500 내지 1,000ℓ/분. 48시로부터, 전분 가수분해물 용액을 약 3.2ℓ/시의 공급 속도로 연속 공급하였고; 용액은 수돗물 중에 163 ㎏의 전분 가수분해물을 포함하였고(최종 부피: 233ℓ) 121 내지 125 ℃에서 20분 동안 살균시켰다. 96시 이후에, 200ℓ의 배양물 브로스 일부를 진행 중인 발효로부터 제거시켰고 무균 조건 하에서 이전에 살균된 300ℓ 들이의 발효조로 이송시켰다. 이어서, 신선한 영양액을 0.33 발효조 부피/일의 유속으로 상기 배양물로 연속 공급하였고; 생성물 함유 배양물 브로스를 동속으로 발효조로부터 연속적으로 제거시켰다. 오스몰 농도 및 아카르보스는 실시예 2에서와 같이 결정하였다.
하기는 본 발명의 삼투 조절된 3가지의 작동 방법 변형을 시험한 결과이다:
1. 신선한 영양액을 발효 동안에 일회분씩 한꺼번에 첨가한 결과, 오스몰 농도를 단계에서 수요가 많은(sought-after) 최적치까지 유도할 수 있었다.
2. 공급-배치 공정에서 발효 동안에 하나 이상의 기질을 연속 첨가한 결과, 오스몰 농도를 전체 발효 기간 동안에 바람직한 범위로 유지할 수 있었다.
3. 신선한 영양액을 연속 첨가하고 생성물 함유 배양물 브로스(broth)를 연속 제거하는 완전한 연속 발효한 결과, 오스몰 농도를 유사하게는 전체 발효 기간 동안에 바람직한 범위로 유지할 수 있었고, 동시에 아카르보스 형성을 위해 최적인 정상 상태를 배양물에서 달성할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따라서는 당뇨병 약제로서 사용되는 효능있는 α-글루코시다제 억제제인 아카르보스의 발효성 제조가 개선된다.
Claims (11)
- 오스몰 농도가 200 내지 600 밀리오스몰/㎏으로 고정되고 유지되는 것을 특징으로 하는 아카르보스 제조를 위한 발효 방법.
- 제1항에 있어서, 오스몰 농도가 300 내지 500 밀리오스몰/㎏으로 고정되고 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 하나 이상의 영양액 성분(들)이 발효 동안 아카르보스 형성 배양물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 아카르보스 제조를 위한 발효 방법.
- 제3항에 있어서, 하나 이상의 영양액 성분의 첨가를 수행하여, 배양물 중의 오스몰 농도가 200 내지 600 밀리오스몰/㎏ 이내로 유지되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 하나 이상의 영양액 성분의 첨가를 수행하여, 배양물 중의 오스몰 농도가 300 내지 500 밀리오스몰/㎏ 이내로 유지되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 영양액 성분(들)이 한꺼번에 개별적 분획으로서 배양물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 영양액 성분(들)이 연속적으로 배양물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 영양액 성분(들)이 연속적으로 배양물에 첨가되고, 생성물 함유 배양물 브로스가 배양물로부터 연속적으로 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 생성물 함유 배양액이 배양물로부터 일회분씩 한꺼번에 제거되거나, 또는 신선한 영양액이 일회분씩 한꺼번에 배양물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 아카르보스 제조를 위한 발효 방법.
- 발효가 공급-배치 방법으로 수행되고, 공급 기질액이 분획상으로 한꺼번에 또는 연속적으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 아카르보스 제조를 위한 발효 방법.
- 발효가 연속 방법으로서 수행되는 것을 특징으로 하는 아카르보스 제조를 위한 발효 방법.
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