CN116262937A - 一种提高阿卡波糖生物发酵水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，通过控制发酵过程中不同梯度的温度及溶氧水平，加速了阿卡波糖产物的积累，提升了效价水平，同时也降低了发酵的耗能。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种提高阿卡波糖生物发酵水平的方法。
背景技术
阿卡波糖(Acarbose)，是德国Bayer公司于上世纪70年代中期研制开发的一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，它是一种生物合成的假性四糖，其分子式由氨基环醇、4-氨基-4,6-二脱氧葡萄糖和1分子麦芽糖三部分组成。因其能够有效抑制小肠壁细胞α糖苷酶活性，延缓肠道对寡糖、双糖或多糖的降解和吸收，且具有良好的药动学性质和低毒性质。临床被广泛用于II型糖尿病治疗。
由于阿卡波糖的化学结构比较复杂，其化学合成步骤相对繁琐且成本高昂，目前工业规模的生产主要是通过微生物发酵获得的。阿卡波糖可从游动放线菌的发酵液中提取得到，其在微生物体内的合成代谢路径以及发酵工艺研究一直是阿卡波糖的研究热点之一。
阿卡波糖发酵目前主要通过诱变处理筛选高产菌种、调整培养基中物料的种类和含量以及优化补料来提高发酵产量，提高后的阿卡波糖产量水平在3-4g/L左右。
比如CN112522174A公开了一种敲除负调控蛋白基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法，通过在游动放线菌中，分别敲除负调控蛋白基因ACPL_5445和ACPL_3989，得到阿卡波糖高产突变菌株，最终明显提高阿卡波糖产量。
CN110541017B公开了一种提高阿卡波糖生产量的方法，采取补料发酵的同时严格控制葡萄糖和麦芽糖质量比为1：4可大大提高阿卡波糖的产量。
CN112646850A公开了一种提高阿卡波糖发酵产量的方法，通过连续补入营养物质和放出料液的方法，稳定维持料液在一定液位，配合通气和搅拌，使料液中的溶解氧和营养物质维持在一个较优的范围，促进阿卡波糖菌的生长和发酵单位的产生，进而提高阿卡波糖发酵产量。
目前大多数产品在发酵过程中均采用恒温、恒定溶氧水平培养，即在发酵过程中始终保持恒定温度值、发酵液中相同浓度氧分压值培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效提高阿卡波糖生物发酵水平的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，在发酵过程中梯度调节培养温度和/或溶氧浓度。
具体地，作为本发明的一些优选实施方案，所述发酵培养温度调节为，将培养好的种子接入发酵罐后，发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.6～7.2时，发酵培养温度调节至28±0.5℃，直至发酵结束。
优选地，将培养好的种子接入发酵罐后，发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.8～7.0时，发酵培养温度调节至28±0.5℃，直至发酵结束。
具体地，作为本发明的一些优选实施方案，所述溶氧浓度调节为，将培养好的种子接入发酵罐后，发酵培养起始阶段，溶氧浓度控制在50％～60％，培养至48～72h时将溶氧浓度调节至30～40％，直至发酵结束。
优选地，梯度调节溶氧浓度为，将培养好的种子接入发酵罐后，发酵培养起始阶段，溶氧浓度控制在50％～60％，培养至56～64h时+将溶氧浓度调节至30～40％，直至发酵结束。
进一步地，作为本发明的一些优选实施方案，在发酵过程中调节温度的同时还可以调节溶氧，具体包括如下步骤：
将培养好的种子接入发酵罐后，发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，溶氧浓度控制在50％～60％；当发酵液的pH值上升至6.6～7.2时，则降低培养温度至28±0.5℃，培养至48～72h时将溶氧浓度调节至30～40％，直至发酵结束。
优选地，将培养好的种子接入发酵罐后，发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，溶氧浓度控制在50％～60％；当发酵液的pH值上升至6.8～7.0时，则降低培养温度至28±0.5℃，培养至56～64h时将溶氧浓度调节至30～40％，直至发酵结束。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明通过控制不同梯度的温度及溶氧水平，加速了阿卡波糖产物的积累，降低了发酵的耗能，阿卡波糖生物发酵水平获得显著提升，效价水平稳定在8000～9000μg/mL，远高于现有技术公开的3000～4000μg/mL。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种提高阿卡波糖生物发酵水平的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下具体实施例中，如无具体说明，使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；所使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例内容可以知道如何具体实现所述方法，并实现相应的结果。
实施例采用的阿卡波糖产生菌株为犹他游动放线菌MYIH97，于2016年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016237。
实施例获取种子液的方法如下：
(1)将甘油管冷冻保存的菌液直接接种到摇瓶种子培养基中，温度26～30℃、转速250rpm振荡培养44-48h；
其中摇瓶种子培养基配方为：黄豆粉30g/L、甘油10g/L、玉米淀粉20g/L、碳酸钙5g/L，其余为水，培养基灭菌前pH值调至6.8-7.0，装量为100mL/500mL。
(2)将培养好的摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.5％的接种量接种至种子罐。通气量1:1～1:1.5，罐压0.05Mpa，搅拌50rpm～200rpm，26～30℃培养44-48h。
其中种子罐培养基配方为：黄豆粉30g/L、甘油10g/L、玉米淀粉20g/L、碳酸钙5g/L和泡敌0.6g/L，其余为水，培养基灭菌前pH值调至6.8-7.0。种子罐体积为1m3，培养基配制体积为300L。
将培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气搅拌，不同培养温度和溶氧量下，发酵培养一定时间得到效价不同的阿卡波糖发酵液。
其中发酵罐培养基配方为：葡萄糖40g/L，麦芽糖40g/L，黄豆粉30g/L，谷氨酸钠5g/L，碳酸钙5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，氯化铁0.8g/L，氯化钙5g/L和泡敌0.6g/L，其余为水，培养基灭菌前pH值调至6.8-7.0。发酵罐体积为2.5m3，培养基配制体积为1500L。
实施例中阿卡波糖发酵液含量检测用HPLC法进行测定，检测条件为：
色谱柱：氨基键合硅胶为填充剂，4.6mm×250mm
流动相：乙腈：磷酸缓冲液＝70：30
流速：1.5mL/min
柱温：40℃
检测波长：210nm
进样体积：10μL
具体实施例如下：
实施例1-10，一定溶氧条件下发酵温度的考察
实施例1
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为32±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为3471μg/mL。
实施例2
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为30±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为7015μg/mL。
实施例3
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，全程溶氧控制在30％～40％，发酵培养168h，测得阿卡波糖效价水平为7536μg/mL。
实施例4
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为26±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为5640μg/mL。
实施例5
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.6时，发酵培养温度调节至28±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为8131μg/mL。
实施例6
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.8时，发酵培养温度调节至28±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为8337μg/mL。
实施例7
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至7.0时，发酵培养温度调节至28±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为8401μg/mL。
实施例8
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至7.2时，发酵培养温度调节至28±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为8219μg/mL。
实施例9
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为32±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.6时，发酵培养温度调节至30±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为6652μg/mL。
实施例10
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为28±0.5℃，当发酵液的pH值上升至7.2时，发酵培养温度调节至26±0.5℃，发酵溶氧全程控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为5935μg/mL。
实施例1-10通过一定溶氧条件下，不同培养温度的实施例证明了“发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.6～7.2时，调节发酵培养温度至28±0.5℃”的技术方案可显著提高阿卡波糖生物发酵水平。
实施例11-18，一定溶氧条件下发酵温度的考察
实施例11
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积15％的接种量接入发酵罐，罐压控制在0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，全程溶氧控制在70％～80％，发酵培养168h，测定阿卡波糖效价水平为6581μg/mL。
实施例12
将罐种子液按发酵培养基体积15％的接种量接入发酵罐，罐压控制在0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，全程溶氧控制在50％～60％，发酵培养168h，测得阿卡波糖效价水平为6889μg/mL。
实施例13
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，发酵培养0～48h溶氧控制在50％～60％，发酵培养48h后溶氧控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为7820μg/mL。
实施例14
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，发酵培养0～56h溶氧控制在50％～60％，发酵培养56h后溶氧控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为8035μg/mL。
实施例15
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，发酵培养0～64h溶氧控制在50％～60％，发酵培养64h后溶氧控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为8117μg/mL。
实施例16
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，发酵培养0～72h溶氧控制在50％～60％，发酵培养72h后溶氧控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为7912μg/mL。
实施例17
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，发酵培养0～48h溶氧控制在70％～80％，发酵培养48h后溶氧控制在50％～60％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为6715μg/mL。
实施例18
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵培养温度为28±0.5℃，发酵培养0～72h溶氧控制在70％～80％，发酵培养72h后溶氧控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为6942μg/mL。
实施例11-18通过一定培养温度下，不同溶氧条件的实施例证明了“发酵培养起始阶段，溶氧浓度控制在50％～60％，培养至48～72h时将溶氧浓度调节至30～40％，直至发酵结束”的技术方案可显著提高阿卡波糖生物发酵水平。
实施例19-23，阶段调节培养温度以及溶氧量
实施例19
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始阶段，控制培养温度为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至7.2时，发酵培养温度调节至28±0.5℃；发酵培养0～72h溶氧控制在50％～60％，发酵培养72h后溶氧控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为8624μg/mL。
实施例20
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至7.0时，发酵培养温度调节至28±0.5℃；发酵培养0～60h溶氧控制在50％～60％，发酵培养60h后溶氧控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为8871μg/mL。
实施例21
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为28±0.5℃，当发酵液的pH值上升至7.2时，发酵培养温度调节至26±0.5℃；发酵培养0～72h溶氧控制在50％～60％，发酵培养72h后溶氧控制在30％～40％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为6031μg/mL。
实施例22
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为32±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.6时，发酵培养温度调节至30±0.5℃；发酵培养0～48h溶氧控制在70％～80％，发酵培养48h后溶氧控制在50％～60％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为6119μg/mL。
实施例23
将上述培养好的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，罐压0.05Mpa，通气1:1～1:1.5，搅拌50rpm～200rpm，发酵起始培养温度为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.6时，发酵培养温度调节至28±0.5℃；发酵培养0～48h溶氧控制在70％～80％，发酵培养48h后溶氧控制在50％～60％，发酵培养共计168h，测得阿卡波糖效价水平为7336μg/mL。
实施例19-23对比说明，“发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，溶氧浓度控制在50％～60％；当发酵液的pH值上升至6.6～7.2时，则降低培养温度至28±0.5℃，培养至48～72h时将溶氧浓度调节至30～40％，直至发酵结束”的技术方案可显著提升阿卡波糖发酵水平。
Claims (10)
1.一种提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，根据发酵培养过程的pH值变化分两个阶段调节发酵培养温度。
2.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，发酵培养阶段，起始温度控制为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.6～7.2时，发酵培养温度调节至28±0.5℃，直至发酵结束。
3.根据权利要求2所述的提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，发酵培养阶段，发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，当发酵液的pH值上升至6.8～7.0时，发酵培养温度调节至28±0.5℃，直至发酵结束。
4.一种提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，根据发酵培养时间分两个阶段梯度调节溶氧量。
5.根据权利要求4所述的提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，所述梯度调节溶氧量为，发酵培养起始阶段，溶氧浓度控制在50％～60％，培养至48～72h时，将溶氧浓度改为控制在30～40％，直至发酵结束。
6.根据权利要求5所述的提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，所述梯度调节溶氧量为，发酵培养起始阶段，溶氧浓度控制在50％～60％，培养至56～64h时将溶氧浓度调节至30～40％，直至发酵结束。
7.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，在发酵过程中梯度调节培养温度的同时梯度调节溶氧量。
8.根据权利要求7所述的提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，溶氧浓度控制在50％～60％；当发酵液的pH值上升至6.6～7.2时，降低培养温度至28±0.5℃，培养至48～72h时将溶氧浓度控制在30～40％，直至发酵结束。
9.根据权利要求8所述的提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，发酵培养起始温度控制为30±0.5℃，溶氧浓度控制在50％～60％；当发酵液的pH值上升至6.8～7.0时，降低培养温度至28±0.5℃，培养至56～64h时将溶氧浓度控制在30～40％，直至发酵结束。
10.根据权利要求1～9任一项所述的提高阿卡波糖生物发酵水平的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
a.将菌液直接接种到摇瓶种子培养基中，26～30℃振荡培养44-48h；
其中摇瓶种子培养基配方为：黄豆粉30g/L、甘油10g/L、玉米淀粉20g/L、碳酸钙5g/L，其余为水，培养基灭菌前pH值调至6.8-7.0；
b.将步骤a得到的种子液按种子罐培养基体积0.5％的接种量接种至种子罐，26～30℃培养44-48h；
种子罐培养基配方为：黄豆粉30g/L、甘油10g/L、玉米淀粉20g/L、碳酸钙5g/L和泡敌0.6g/L，其余为水，培养基灭菌前pH值调至6.8-7.0；
c.将步骤b得到的罐种子液按发酵培养基体积的15％的接种量接入发酵罐，发酵培养168h；
其中发酵罐培养基配方为：葡萄糖40g/L，麦芽糖30g/L，黄豆粉30g/L，谷氨酸钠5g/L，碳酸钙5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，氯化铁0.8g/L，氯化钙5g/L和泡敌0.6g/L，其余为水，培养基灭菌前pH值调至6.8-7.0；
步骤b、c中通气量为1:1～1:1.5，罐压为0.05Mpa，
步骤b、c搅拌转速为50rpm～200rpm。
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