SU1713929A1 - Способ получени L-аспарагиназы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологии и касаетс  способа получени  ферментного препарата L-аспарагиназы, используемого в медицине в качестве анти- лейкозного препарата. Целью изобретени   вл етс  увеличение выхода и удельной активности фермента. L-аспарагиназуполуча-. ют путем культивировани  продуцентов - штаммов Erwinia carotovora - 268, 268М.268M12R, 268MV1 в аэробных глубинных услови х на среде, содержащей источник углерода, источник аминного азота, минеральные соли и воду, при этом посевной материал и инокул т выращивают на среде, содержащей D-галактозу в качестве источника углерода, а основную ферментацию ведут на среде, содержащей глюкоэ1у в качестве основногр источника углерода, и r^люкoзy ввод т в питательную среду после 1,5-2,0 ч после начала культивировани  в проточном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание остаточной ее концентрации,, близкой к нулю, в течение всего процесса культивировани . Посевной материал выращивают на среде, содержащей галактозу,в количестве 0,9-1,1%, а основную ферментацию ведут на среДе, содержащей глюкозу в суммарном количестве 0,8-1,1%. В результате получают биомассу штаммов Erwinja carotovora со средней активностью фермента 20,4 МЕ/мг сухого вещества и выходом фермента в среднем до 83,6» МЕ/мл среды.сл«ч.' Изобретение относитс  к микробир- логии и касаетс  способа получени  ферментного препарата L-аспарагиназы; используемого в медицине в качестве анти- лейкозного препарата.Цель изобретени  - увеличение выхода и удельной активности фермента.Изобретение заключаетс  в том, что продуценты - штаммы Erwlnia carotovora 268, 268М. 268M12R. 268MV1 культивируют в аэробных глубинных услови х на среДе,; содержащей источник углерода, источникаминного азота, минеральные соли и воду, при этом посевной материал и инокул т вы- ра.щива^т на среде, содержащей галактозу • В качестве источника углерода, а основную ферментацию ведут на среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода, и глюкозу ввод т в питательную среду после 1,5-2,Оч с начала культивировани  в притомном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание остаточной ее концентрации, близкой к нулю, в течениеыsQ hO <>&>&

Description

всего процесса культивировани . Посевной материал и инокул т выращивают на среде, содержащей галактозу в количестве 0,91 ,1%. Основную ферментацию ведут на среде , содержащей глюкозу в суммарном количестве 0,9-1,1 %.

Использование глюкозы в приточном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание ее остаточной концентрации , близкой к нулю, позвол ет избежать репрессирующее действие глюкозы на синтез L-аспарагиназы и обеспечить высокое суммарное количество используемой глюкозы (0,9-1,1) среды. Последующее введение глюкозы в основную ферментацию после 1,5-2.0 ч роста позвол ет полностью fиспользовать остаточную галактозу иноку л та . Одновременно происходит синхронизаци  культуры.

Способ осуществл ют следуюддим образом .

В качестве продуцента используют культуру Erwlnia carotovora 268 или фагоустойчивую KvnbTypy - Ervyinla carotovora 268М или фаго- и стрептомицинустойчивую культуру Erwinia carotovora 268M/12R, а также Erwlnia carotovora 268MV1.

Основной штамм Erwinla carotovora 268, а также его варианты - штаммы 268М, 268M12R хран тс  в коллекции культур микроорганизмов Института микробиологии им, А. Кирхенштейна АН Латв. CGP, а вариант - штамм 268MVI хранитс  в коллекции центрального музе  промышленных микроорганизмов Государственного НИИ стандартизации и контрол  медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича .

Культуры хран т на м со-пептонном агаре (2% агара) при комнатной температуре {18-20°С) и пересевают через каждые 3-4 мес. Дл  работы используют свежепересе нную 12- или 24-чаеовую культуру.

Посевной материал выращивают в колбах на среде, содержащей О-галактрзу в качестве источника углерода в количестве 0,9-1,1 мас.%, и глутамат натри  в качестве источника аминного азота в количестве 0,1%мас. Продолжительность выращивани  посевного материала 16-20 ч.

Инокул т выращивают в культиваторе емкостью 100 л с объемом культуральной жидкости 50 л. Дл  выращивани  инокул та используют среду, содержащую в качестве источника углерода D-галактозу в количестве 0,9-1,1%. Это дает возможность получить биомассу с преиндуцированными системами синтеза аспарашназы. При переходе к основной ферментации на глюкозе

это обеспечивает сохранение высокого уровн  синтеза фермента.

Услови  выращивани  инокул та: рН среды 6,,0, температура 37°С, аэраци  0,5 обьема воздуха на 1 объем среды. Пеногаситель-пропинол Б-400.

После 6ч роста культуральнуюжидкость в объеме 50 л из инокул тора передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с объемом культуралъной жидкости 500 л. Введение глюкозы в рабочий ферментер производ т через 1.5-2,0 ч после засева. За этот период происходит полное потребление галактозы, оставшейс  в культуральной 5 жидкости инокул та, и одновременно синхронизаци  культуры. При этом глюкозу ввод т в притфчном режиме в концентрации и со скоростью, обеспечивающей потреблениеее культурой, и поддержание ее остаточного содержани  в культуральной жидкости, близкое к нулю. Услови  культивировани  аналогичны таковым при выращивании инокул та .

В ходе ферментации контролируют зна5 чение рН. прирост биомассы, уделъиую активность L-аспарагиназы. потребление кислорода и содержание сахара. После 6-9 ч ферментации биомассу Enwinia carotovora отдел ют центрифугированием дл  последующего выделени  фермента. Получают биомассу со средней удельной активностью фермента 20,4 МЕ/мг сухого вещества и выходом фермента 83,6 ME/мл среды. Выделение фермента из клеток осуществл ют 5 одним из известных способов.

П р и м е р 1. Посевной материал Erwlnla carotovora 268 выращивают в колбах на качалке (220 об/мин) при 37°С в течение 18 ч на среде (по 50 мл в каждой колбе) следую0 щего состава, мас.%:

D-галактоза1.0

Сульфат аммони 0.5

Фосфорна  кислота0.35

Едкий кали0,65

5 Сульфат магни 0.02

Кукурузный экстракт0.25

ВодаОстальное

Выращенный посевной материал е количестве 500 мл исполъзуют дл  засева ино0 кул тора емкостью 100 л с 50 л среды аналогичного состава, содержащей также О-галактозу в качестве источника углерода. Услови  выращивани : аэраци  0.5 объема воздуха на 1 объем среды, температура 5 37°С. скорость вращени  мешалки 390 об/мин, продолжительность выращивани  6 ч. после чего всю культуральную жидкость из инокул тора передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с 500 л среды следующего состава. мас.-%:

Сульфат аммони  Фосфорна  кислота

Едкий кали Сульфат магни  Кукурузный экстракт Вода рН

Услови  культивировани :аэраци  0,25 объема воздуха на 1 обьем среды, температура ,37°С, скорость вращени  мешалки 190 об./нин.

Глюкозу подают в ферментер в приточном режиме 2 ч от начала культивировани  в виде 7%.-ного водного раствора со скоростью 12,5 л/ч. контролиру , чтобы остаточное содержание глюкозы в культуральной жидкости было близким к нулю. Общее количество использованной глюкозы составл ет 1% среды.

После 8 ч ферментации получают биомассу с удельной активностью L-аспарагиназы23 ,0 МЕ/мгсухого веществаи выходом фермента 87.6 ME/мл среды.

. При мё р2. Посевной материал Erwinia carotovora 268M12R, выращенный в услови х , аналогичных примеру 1, в количестве 500 мл используют дл  засева инокул тора емкостью 100 li с 50 л среды, содержащей компоненты по примеру 1. Услови  выращивани  инокул та аналогичны примеру 1. После б ч роста всю культуральную жидкость инокул та передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с 500л среды, содержащей компоненты по примеру 1. Глюкозу в ферментер подают в приточном режиме через 1,5 ч с начала культивировани  в виде 7%ного водного раствора со скоростью 13 л/час, контролиру , чтобы остаточное содержание глюко:зы в культуральной жидко сти было близким к нулю. Услови  ферментации аналогичны примеру 1.

После 6,5 ч ферментации получают биомассу Erwinia carotovora с удельной активностью L-аспарагиназы 21,8 сухого вещества и выходом фермента 89,5 МЕ/мл среды.

Прим е р 3. Посевной материал Erwinia carotovora 268М выращивают на средэ ив услови х, аналогичных примеру 1. 500 мл посевного материала используют дл  засева инокул тора емкостью 100л с 50л среды, содержащей компоненты по примеру 1. После 6 ч роста всю культуральную жидкость инокул та передают в основной ферментер емкостью 1000л с 500л среды, содержащей компоненты по примеру 1. Глюкозу начинают подавать через .2ч с начала культивировани  в приточном режиме в виде 7%-ногр

во,цного раствора со скоростью 12,5 л/ч. Услови  культивировани  аналогичны примеру 1- , После 8 ч ферментации получают био5 массу с удельной активностью L-аспарагиназы 16,6 МЕ/мг сухого веса и выходом фермента 84,8 МЕ/мл среды.

П р и м е р 4. Посевной материал и

0 инокул т Erwfnia carotovora 268 выращивают в услови х, аналогичных примеру 1. Культуральную жидкость из инокул тора передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с 500 л среды, содержащей компоненты по примеру 1, Глюкозу подают в приточном режиме в виде 10%-ного водного раствора со скоростью 13 л/ч. Услови  культивировани  аналогичны примеру 1. После 6,5 ч ферментацию п рекращают. Лолучен0 на  Биомасса обладает удельной аспарагиназной активностью, равной 5,4 МЕ/мг сухого веса, и выходом фермента 35,1 МЕ/мл среды.

При м е р 5. Подготовка посевного

5 материала и инокул та Erwinia carotovora 268MV1 аналогична примеру 1.По;5ачу культуральной жидкости из инокул тора и услови  культивировани  врабочем ферментере сохран ют по примеру 1.-Глюкозу подают в

0 приточном режиме в виде 5%-ного водного раствора со скоростью 13 л/ч. После 6,5ч культивировани  ферментацию прекращают . Полученна  биомасса обладает удельной аспарагиназной активностью 22 МЕ/мг

5 сухого веса, выход фермента 44,0 МЕ/мл среды.

Предлагаемый способ получени  L-acпарагиназы при дробном введении глюкозы в среду обеспечивает выход биомассы с высокой удельной активностью до 21 МЕ/мг сухого вещества и сьем фермента до 83,6 МЕ/мл, а также сокращение продолжительности ферментации до 8-11 ч.

Формул а из о б ре тени  

5Способ получени  L-аспарагиназы, предусматривающий выращивание посевного материала и инокул та Erwinia carotovora на среде, содержащей источники углерода, аминного азота, минеральную соль и воду с

0 последующей аэробной глубинной ферментацией на среде, содержащей источник азота , минеральные соли и воду, и выделением фермента, отличающийс  тем, что, с целью увеличени  выхода и удельной активности фермента, выращивание посевного материала и инокул та ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода D-галактозу в количестве 0.9-1,1 мас.%, а ферментацию ведут на среде, содержащей в .качестве источника углерсзда глюкозу в

7 ,17139298

суммарном количестве 0,9-1.1 мас.%, вво-среде, близкого к нулю, в результате подимую в среду После 1,5-2.0 Ц роста с кон-треблени  ее культурой в течение всего

центрацией и скоростью, обеспечивающейпроцесса ферментации, поддержан ее остаГочногосЬдержани  в

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения L-аспарагиназы, предусматривающий выращивание посевного материала и инокулята Erwinia carotovora на среде, содержащей источники углерода, аминного азота, минеральную соль и воду с последующей аэробной глубинной ферментацией на среде, содержащей источник азота, минеральные соли и воду, и выделением фермента, отличающийся тем. что, с целью увеличения выхода и удельной активности фермента, выращивание посевного материала и инокулята ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода D-галактозу в количестве 0.9-Г. 1 мас.%, а ферментацию ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу в

   Ί , 1713929 суммарном количестве 0,9-1,1 мас.%, вводимую в среду после 1,5-2,0 Ч роста с концентрацией и скоростью, обеспечивающей поддержание ее остаточного сддержания в среде, близкого к нулю, в результате потребления ев культурой в течение всего процесса ферментации.

   Составитель В.Соина _х Редактор Н.Яцола Техред М.Моргентал Корректор о. Кравцова

   Заказ 661 Тираж Подписное

   ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5.

   Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101