KR102356040B1

KR102356040B1 - α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물 및 그 응용

Info

Publication number: KR102356040B1
Application number: KR1020197038361A
Authority: KR
Inventors: 후아베이 장; 후안 왕; 유 팡; 지안핑 리우; 슈시아 왕
Original assignee: 베이징사범대학교
Priority date: 2017-05-27
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2022-01-26
Also published as: AU2017416647A1; CN107188900B; JP6912602B2; CN107188900A; RU2019140828A; RU2756604C2; US20200147243A1; EP3632918C0; AU2017416647B2; WO2018218696A1; JP2020523292A; EP3632918A1; KR20200013702A; EP3632918A4; EP3632918B1; RU2019140828A3

Abstract

하기의 일반식 중 임의의 하나를 가지고, (1) 각각 할로겐인 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물을 제공한다. 상기 리간드 화합물은 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 우량한 리간드 화합물이고, 상기 리간드 화합물은 방사성 화학 표기를 거친 후, PET 현상제로 사용할 수 있다.

Description

α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물 및 그 응용

본 발명은 의약 기술 분야에 관한 것이고, 특히 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물 및 그 응용에 관한 것이다.

본 발명은 2017년 5월 27일자로 중국 특허청에 제출한 출원 번호가 201710395513.0이고, 명칭이 "α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물 및 그 응용”인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하고, 그 전부 내용을 본 발명에 원용한다.

니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR)는 일종의 게이트 트랜스미터 이온 채널이고, 보통 중추 신경 (CNS) 및 말초 신경계(PNS)에 존재하고, 여러가지 생리 기능에 관련된다. nAChR는 여러가지 아형이 존재하고, 이는 일반적으로 α서브유닛(예를 들어 α2-α10) 및 β서브유닛(β2-β4)로 구성된다. 여기서, α7니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7 nAChR)는 5개의 완전히 같은 α서브유닛으로 구성된 동종 오량체이고, 주로 해마, 시상 및 대뇌 피질 등 기억, 학습 등에 관련된 주요 구역에 존재한다. 최근의 임상 연구에 따르면, 알츠하이머병, 파킨슨병 등 신경 퇴행성 질환의 환자 뇌에서 α7 nAChR단백질 밀도의 감소가 발견되고, 유전자 녹아웃, 아형 선택적 리간드 등 방면의 연구에 따르면 타겟팅 α7 nAChR리간드는 인지 능력 및 청각 게이팅 흠결을 향상시키는 것을 발견하였고, 예를 들어 PNU-282987, PHA-543613 및 A-582941 등 고 선택성 α7 nAChR작용제는 감각-게이팅 흠결, 단기 작업 기억 및 기억 강화 등 모형의 인지 능력을 향상시켰다. 따라서, α7니코틴성 아세틸콜린 수용체 작용제 및 방사성 리간드의 합성도 더욱 폭넓은 주목을 받고 있다.

본 발명의 실시예는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물을 제공하여 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체와 고친화성을 가지는 방사성 또는 비방사성 리간드 분자를 획득하는 것을 목적으로 한다. 구체적인 기술 방안은 다음과 같다.

α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물에 있어서, 하기의 일반식 중 임의의 하나를 가지고,

여기서,

(1) X는

,

또는

이고,

R₁은

또는

이며, R₇은 할로겐이고,

(2) R₂는 수소이고, R₃는 할로겐 또는 아미노기이거나, 또는 R₃는 수소이고, R₂는 할로겐 또는 아미노기이며,

(3) R₆는 수소이고, R₄ 및 R₅는

로 결합되거나: 또는 R₄는 수소이고, R₅ 및 R₆는

로 결합되며,

(4) Y는 질소 또는 탄소이고, Z는

또는

이며；R₉, R₁₀는 각각 할로겐이며, 여기서“

”는 원자단과 모체의 연결 위치이다.

본 명세서에서, 설명하는 할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 할로겐은 방사성 표기를 하거나 또는 방사성 표기를 하지 않는다.

일부 실시형태에서, 상기 할로겐은 F 또는 ¹⁸F이다.

일부 실시형태에서, 본 발명에서 제공하는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물은 하기의 화합물에서 선택된다:

일부 구체적인 실시형태에서, 본 발명에서 제공하는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물은 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 작용제로 작용할 수 있다.

일부 구체적인 실시형태에서, 본 발명에서 제공하는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물은 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 일부 작용제로 작용할 수 있다.

분 명세서에서 사용되는 용어 "작용제(agonist)"는 제일 넓은 의미로 이해하여야 하고, 다시 말해서, 일부 또는 부분적으로 목표 재료(예를 들어, α7니코틴성 아세틸콜린 수용체)의 적어도 일종의 바이오 활성을 활성화하는 임의의 분자이다. 예를 들어, 본 발명에서 제공하는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물은 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 세포외 구조 구역에 특이성으로 결합되어 세포 내 신호 전달을 유도함으로써 인지 장애의 예방 및 치료 및 신경성 회복의 효과를 증명한다.

α7니코틴성 아세틸콜린 수용체는 학습, 기억 및 집중력 방면의 인지 능력을 향상시키는데 아주 중요한 작용을 하는 것이 알려져 있다. 예를 들어, α7니코틴성 아세틸콜린 수용체는 초기 인지 장애, 알츠하이머병, 연령 관련 인지 장애 및 기타 인지 장애, 정신 분열증, 주의결핍장애, 주의력 결핍 과잉 활동 장애(ADHD), 주사 또는 대사 실조로 인한 치매, 루이소체치매, 경련 예를 들어 간질, 다발성 뇌경색, 기분 장애, 강박증 및 중독성 행위, 염증성 질환 및 이러한 장애로 인한 통증 조절과 관련된 질병 및 병증 등 질환과 관련된다. α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 활성은 α7수용체 리간드를 사용하는 것을 통해 변화시키거나 조절할 수 있고, 상기 α7수용체 리간드의 비한정적인 실예로써 길항제, 작용제, 일부 작용제 및 역효과 작용제 등이 있다. α7수용체 리간드는 이러한 및 각종 종류의 인지 장애, 기타 병증 및 질병의 치료 및 예방에 사용될 수 있고, 그 작용제 및 일부 작용제는 설치류, 비인간 영장류 및 인류에게 인지 능력 및 집중력 개선할 수 있는 것이 알려져 있다.

이에 기초하여, 본 발명의 다른 일 형태에서 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물이 인지 장애를 예방 또는 치료하는 약물의 제조 중에서의 용도를 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "인지 장애"는 동물이 인지 능력 또는 인지 분야 범위에서 큰 범위로 퇴화가 발생하고, 예를 들어, 작업 기억력, 집중력 및 경각성, 언어 학습 등 기억, 시각 학습 및 기억, 추리, 및 문제 해결 방면, 특히 예를 들어, 집행 능력 업무 처리 속도 및/또는 사회 인지 방명에서 퇴화되는 것을 가르킨다. 인지 장애는 집중력 결핍, 무질서 사고, 사유 반응 굼뜸, 이해 곤란, 집중력 저하, 문제해결 능력 상실, 기억 부정확, 표달 사상 및/또는 종합 사유 및 감각 및 행위에서 곤란하거나 불합리한 사유를 제거하는데 곤란한 것으로 표현된다.

용어 "치료"는 동물의 인지 장애에 관련된 질병, 실조 또는 병증, 해당 동물이 과거에 인지 장애로 인한 이런 유형의 질병, 실조 또는 병증에 진단되지 않았으나 이런 질병 실조 또는 병증에 걸리기 쉬운 증상을 예방, 억제 및 완화(소퇴)하는 것을 가르킨다. 상응되게, 용어 "치료상의 유효량"은 치료하고자 하는 질병의 증상을 완화, 경감 또는 미리 예방하는데 필요한 유효 작용량의 임상 지표 또는 이러한 증상의 발작을 줄이거나 또는 지연시키는 유효 활성 화합물의 효과적인 자극량이며, 이는 치료하고자 하는 실명이 체내 및/또는 체외 모형에서 실험을 거쳐 경험에 근거하여 확인할 수 있다.

본 발명은 할로겐이 방사성 표기를 거치고 PET(Positron Emission Computed Tomography, 양전자 방출 단층 촬영) 현상제의 용도로 사용할 수 있는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물을 더 제공한다.

본 발명은 치료 상 유효량의 전술한 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 인지 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약물 조성물을 더 제공한다.

일부 구체적인 실시형태에서, 상기 인지 장애는 조기 발병 치매, 조발성 알츠하이머병, 노인성치매, 알츠하이머형 치매, 루이소체치매, 미니 경색 치매, AIDS관련 치매, HIV 치매, 루이체치매, 다운 증후군 관련 치매, 피크병, 초기 인지 능력 장애, 연령과 관련된 기억장애, 최근 단기 기억장애, 연령 관련 인지 장애인지 장애, 약물에 관련된 인지 장애, 면역 결핍증에 관련된 인지 장애, 혈관 질병에 관련된 인지 능력 장애, 정신 분열증, 주의결핍장애, 주의력 결핍 과잉 활동 장애(ADHD) 및 학습 결핍 장애에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 각 리간드 화합물과 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체는 비교적 높은 친화성을 가지고, α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 우량한 리간드 화합물이며, 추가로, 본 발명에서 제공하는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물은 방사성 화학 표기를 거친 후, PET현상제로 사용할 수 있고, 친화성이 우수하고 특이성이 높으며, 선택성이 높고, 뇌섭취 및 대사속도가 적합한 특징을 가져 임상 응용 가치를 가진다.

본 발명의 실시예 및 기존 기술의 기술안을 더욱 명백하게 설명하게 위하여, 아래에서 실시예 및 기존 기술에 필요한 첨부 도면에 대해 간단히 소개하도록 하고, 이하 서술한 첨부 도면은 본 발명의 일부 실시예에 불과하고, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서, 창조적인 노동을 들이지 않는 전제하에서 이러한 첨부 도면에 기초하여 다른 도면을 얻을 수 있는 것은 자명한 것이다.
도 1은 [¹⁸F]II-15 및 II-15의 HPLC 분석 스펙트럼이다.
도 2는 [¹²⁵I]α-bgt가 α7 nAChRs막단백질과 결합하는 특이성 결합 곡선이다.
도 3은 [¹²⁵I]α-bgt가 수용체 막단백질과 결합하는 Hill 직선이다.
도 4는 Scatchard 직선이다.
도 5는 프로비트Y와 LogD(X)의 곡선도이다.
도 6은 방사성 리간드 [¹⁸F]II-15의 소 태아 혈청 및 생리 식염수에서의 안정성 분석의 HPLC도이다.
도 7은 [¹⁸F]II-15의 마우스 뇌 내의 선택성 실험 결과이다.
도 8은 암컷 CD-1 랫의 PET 현상도이다.

본 발명의 목적, 기술방안 및 장점을 더욱 명백하게 이해하도록 하기 위해, 하기 첨부 도면을 참조하여 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하도록 한다. 설명하는 실시예는 본 발명의 일부 실시예에 불과하고 전부의 실시예가 아닌 것은 자명한 것이다. 본 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서, 창조적인 노동을 들이지 않는 전제하에서 본 발명의 실시예에 기초하여 얻은 기타 실시예는 모두 본 발명의 보호 범위 내에 속한다.

실시예 1:

의 합성（화합물 I-9로 약칭）

화합물I-9의 합성 경로는 하기와 같다:

(1) 화합물I-2의 합성

깨끗하고 건조한 플라스크에 화합물I-1(5g, 35.7mmol)을 넣고, 50mL의 메탄올로 용해시키며, 질소 가스로 3회 치환한 후, 메톡사이드 나트륨(2.89g, 53.5mmol)의 메탄올 용액(15mL)을 반응계에 적가하고, 실온에서 교반하여 30분간 반응시킨 후, 반응계의 온도를 0℃로 낮추며, 브로민(6.3g, 39.4mmol)을 적하 추가하고, 반응계의 온도를 0-5℃로 제어하는 조건하에서 4시간동안 반응시키며, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후(CH₂Cl₂ : CH₃OH=25 : 1), 소량의 10％ 아황산나트륨 수용액으로 반응을 종료시키고, 반응계 온도를 -15℃로 낮춘 후 황색의 고체를 석출하며, 감압 여과 후 콜드 메탄올(2Х5mL)로 필터 케이크를 세척하고 건조하여, 황색 고체 즉 목표 생성물I-2(4.2g, 53％)를 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, DMSO)δ7.85(d, J=8.64Hz, 1H), 7.66(d, J=8.64Hz, 1H)；MS(M+H⁺): m/z=216.97.

(2) 화합물I-3의 합성

화합물I-2(1g, 4.6mmol)을 3구 플라스크에 넣고, 20mL의 에탄올로 용해시키며, 질소 가스로 3회 치환한 후, 아연말(1.5g, 22.9mmol) 및 염화암모늄(2.46g, 46mmol)을 넣고, 다시 질소 가스로 치환하며, 50℃ 조건하에서 16시간동안 반응시켜, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후(CH₂Cl₂ : CH₃OH=25 : 1), 반응액을 여과하여 여과액을 수집하고, 감압 농축 후 석유 에테르/에틸 아세테이트(5 : 1)로 크로마토그래피 정제하여, 회흑색의 고체 즉 목표 생성물 I-3(524mg, 60％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, DMSO)δ9.70(s, 1H), 6.74(d, J=7.8Hz, 1H), 6.49(d, J=7.8Hz, 1H), 5.91(s, 1H)；MS(M+H⁺): m/z=188.99.

(3) 화합물I-5의 합성

플라스크에 화합물 I-3(0.3g, 1.59mmol)을 넣고, 10mL에탄올로 용해시킨후 교반하면서 이황화탄소(2.42g, 31.7mmol) 및 수산화칼륨(191mg, 4.76mmol)을 넣고, 80-85℃ 조건하에서 16시간동안 반응시키며, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후(CH₂Cl₂: CH₃OH=25 : 1), 감압 농축하여 에탄올 및 이황화탄소를 제거시키고, 물을 추가하여 용해시키며, 희염산으로 체계를 pH3좌우로 조절하여, 고체를 석출시키고, 여과 건조하여 화합물I-4의 미정제 생성물 0.26g을 얻으며, 직접 다음 반응을 진행한다.

3구 플라스크에 화합물I-4(0.26g, 1.13mmol) 및 탄산칼륨(156mg, 1.13mmol)을 넣고 10mL의 DMF로 용해시키며, 질소 가스로 3회 치환한 후, 반응계를 0℃로 낮춘 후 176mg의 요오드화메틸(1.24mmol)을 플라스크에 적하 추가하고, 적가 완료 후 0℃ 조건하에서 10분간 교반하여 반응시키며 그 후 실온에서 3시간동안 반응시키며, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후(CH₂Cl₂ : CH₃OH=25 : 1), 반응계에 60mL 물 및 20mL에틸 아세테이트을 넣고, 5분간 교반한 후 정지하며, 유기상을 수집하고, 무수 MgSO₄로 건조, 여과하고, 감압 농축하여 용매를 제거하여 갈색 고체 I-5(180mg, 65％)를 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, DMSO)δ8.06(d, J=8.4Hz, 1H), 7.55(d, J=8.4Hz, 1H), 2.79(s, 3H)；MS(M+H⁺): m/z=246.93.

(4) 화합물I-6의 합성

플라스크에 순차적으로 1,4-디아자비시클로 [3.2.2] 데칸(200mg, 1.58mmol), 화합물 I-5(466mg, 1.9mmol), 트리 에틸 아민(321mg, 3.17mmol) 및 10mL이소프로판올을 넣고, 교반하고 가열하면서 체계의 온도가 100℃가 되도록 하며, 용매가 휘발 완료된 후, 계속 교반하여 밤새 반응시켜며； TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후(에틸 아세테이트/메탄올=10 : 1), 직접 에틸 아세테이트(1％메탄올 및 1％트리 에틸 아민 함유)을 용리액으로 하여 크로마토그래피 정제하여, 담황색 고체 I-6(250mg, 48.8％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, DMSO)δ7.68(d, J=8.12Hz, 1H), 7.15(d, J=8.12Hz, 1H), 4.43-4.42(m, 1H), 3.90(t, J=5.56Hz, 2H), 3.09(t, J=5.76Hz, 2H), 3.04-2.95(m, 4H), 2.10-2.07(m, 2H), 1.84-1.76(m, 2H)；MS(M+H⁺): m/z=323.905.

(5) 화합물I-9의 합성

플라스크에 화합물I-6(100mg, 0.31mmol), 화합물I-7(70mg, 0.314mmol), 세슘 카보네이트(303mg, 0.93mmol) 및 Pd(dppf)Cl₂(45mg, 0.062mmol)을 넣고, 반응계를 질소 가스로 3회 치환한 후, 재증류한 1,4-디옥산(10mL) 을 넣고 85-90℃ 조건하에서 반응시키며, 반응 종료 후 감압 농축하여 용매를 제거하고, 에틸 아세테이트/메탄올(10 : 1)을 용리액으로 하여 크로마토그래피 정제하여, 담황색 고체 생성물 즉 I-9(89.4mg, 85％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.72(td, J=8.82Hz, 2Hz, 1H), 8.18(dt, J=1.76Hz, 4.32Hz, 1H), 7.61(dd, J=8.24Hz, 1.32Hz, 1H), 7.49(d, J=8.2Hz, 1H), 7.30(td, J=5.94Hz, 2.04Hz, 1H), 4.61(s, 1H), 3.99(m, 2H), 3.21-3.13(m, 4H), 3.06-2.99(m, 2H), 2.18-2.16(m, 2H), 1.88-1.80(m, 2H)； ¹³ C NMR(100MHz, CDCl₃)δ163.54, 161.83, 159.45, 158.78, 146.72, 146.02, 141.72, 141.05, 122.63, 122.37, 122.01, 116.37, 114.92, 56.96, 50.73, 46.32, 44.33, 26.82；MS(M+H⁺): m/z=340.15.

실시예2:

의 합성(화합물I-10로 약칭)

화합물I-10의 합성 경로는 하기와 같다:

플라스크에 화합물I-6(100mg, 0.31mmol), 화합물I-8(44mg, 0.313mmol), 세슘 카보네이트(303mg, 0.93mmol) 및 Pd(dppf)Cl₂(45mg, 0.062mmol) 을 넣고, 반응계를 질소 가스로 3회 치환한 후, 재증류한 1,4-디옥산(10mL)을 넣고；85-90℃ 조건하에서 반응시키며, 반응 종료 후 감압 농축하여 용매를 제거하여, 에틸 아세테이트/메탄올(10 : 1)을 용리액으로 하여 크로마토그래피 정제하여, 담황색 고체 생성물 I-10(53mg, 50％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.80(d, J=2.32Hz, 1H), 8.52(td, J=7.8Hz, 2.52Hz, 1H), 7.50(d, J=8.16Hz, 1H), 7.35(d, J=8.12Hz, 1H), 6.99(dd, J=8.52Hz, 2.8Hz, 1H), 4.65(s, 1H), 4.03(t, J=5.36Hz, 2H), 3.25-3.19(m, 4H), 3.10-3.04(m, 2H), 2.22(m, 2H), 1.93-1.86(m, 2H)； ¹³ C- NMR(100MHz, CDCl₃)δ164.88, 163.48, 162.49, 158.88, 149.03, 145.90, 141.07, 139.96, 133.43, 115.37, 112.24, 109.51, 109.14, 55.83, 50.57, 46.30, 26.43, 8.70；MS(M+H⁺): m/z=340.15.

실시예3: 화합물

의 합성（화합물II-5로 약칭）

화합물II-5의 합성 경로는 하기와 같다:

(1) 화합물II-2의 합성

1000mL의 플라스크에 30.0g 9-플루오레논(II-1)(0.17mol) 및 100mL물을 넣고, 80-85℃까지 가열한 후 30분 내에 브롬(32.0g, 0.2mol)을 플라스크에 적하 추가하고, 적가 완료 후, 계속하여 80-85℃ 조건하에서 4시간 동안 반응시키며, 반응계 온도가 실온으로 낮추어진 후, 300mL 물을 넣어 퀀칭 반응(quenching)을 시킨 후, 300mL 10％의 NaHSO₃용액을 넣고, 30분간 교반한 후 감압 여과하여 담황색 고체 물질을 얻고, 해당 담황색 고체 물질을 300mL에탄올에 용해시킨 후 80℃ 조건하에서 약 16시간동안 환류 교반하여, 온도가 실온까지 낮추어진 후 감압 여과하여 담황색 고체를 얻으며, 50℃ 조건하에서 진공 건조하여 2-브롬-9-플루오레논(II-2)(39.1g, 90.4％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.76(d, J=1.76Hz, 1H), 7.66(d, J=7.32Hz, 1H), 7.61(dd, J=7.88Hz, 1.76Hz, 1H), 7.51-7.50(m, 2H), 7.39(d, J=7.88Hz, 1H), 7.34-7.30(m, 1H)；MS(M+H⁺): m/z=260.98.

(2) 화합물II-3의 합성

1000mL의 플라스크에 23.4g 2-브롬-9-플루오레논(II-2)(0.09mol) 및 180mL물을 넣고, 80-85℃까지 가열한 후, 180mL 65％의 질산 용액(2.6mol) 및 180mL 98％의 황산 용액(3.3mol)의 혼합 용액을 반응계에 적하 추가하며, 약 30분간내에 적가를 완료하고, 반응계의 온도를 110-120℃까지 상승시키고 4시간동안 환류하며, 온도가 실온으로 낮추어진 후 300mL의 물을 넣어 퀀칭 반응을 시킨 후, 여과하여 황색의 고체를 얻으며, 획득한 고체를 물 (3Х100mL)로 세척한 후 다시 200mL메탄올로 비팅 세척하고, 고체를 여과하여 수집한 후, 50℃ 조건하에서 진공 건조하여, 2-브롬-7-니트로-9-플루오레논(II-3)(21.0g, 76.4％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.49(s, 1H), 8.44(d, J=8.16Hz, 1H), 7.90(s, 1H), 7.75(d, J=7.92Hz, 1H), 7.71(d, J=8.16Hz, 1H), 7.55(d, J=7.92Hz, 1H)；MS(M+H⁺): m/z=306.02.

(3) 화합물II-4의 합성

500mL플라스크에 순차적으로 2-브롬-7-니트로-9-플루오레논(II-3)(9.0g, 0.03mol), Pd₂(dba)₃(0.6g, 0.655mmol), BINAP(1.3g, 2.087mmol), 소듐터트부톡사이드(3.3g, 0.0343mol), 1,4-디아자비시클로 [3.2.2] 데칸(3.0g, 0.024mol) 및 1,4-디옥산(150mL)을 넣고, 질소 가스로 3번 치환한 후, 반응계를 80-85℃까지 가열하며, 질소 가스 보호하에서 16시간동안 반응시키고, 반응 종료 후, 150mL에틸 아세테이트을 넣은 후 규조토를 깐 깔때기로 불용성 물질을 여과하여 제거하고, 여과액에 10％ K₂CO₃용액을 넣어 pH8.0 좌우로 조절한 후, 수상이 무색이 될때까지 CH₂Cl₂으로 추출하며, 유기상을 합병하고, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하며, 감압 농축하여 남자색 생성물(II-4)(2.1g, 20.4％)을 얻고, 해당 생성물은 직접 다음 반응에 사용할 수 있다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.56(d, J=7.24Hz, 1H), 7.38(d, J=6.56Hz, 1H), 7.34(d, J=2.8Hz, 1H), 7.14-7.09(m, 2H), 6.78(d, J=8.16Hz, 1H), 4.13-4.11(m, 1H), 3.67-3.65(m, 1H), 3.61-3.58(m, 1H), 3.15-3.14(m, 4H), 3.04(m, 2H), 2.14(m, 2H), 1.78(m, 2H)；MS(M+H⁺): m/z=350.16.

(4) 화합물II-5의 합성

플라스크에 순차적으로 화합물II-4(2.1g, 6.02mmol), 철분(1.7g, 0.03mol), 에탄올(80mL), 물(54mL) 및 농염산(1.8mL)을 넣고, 온도를 80℃까지 상승시키며, TLC에 의해 원료가 완전히 반응된(약 5시간) 것을 측정하며, 10％ K₂CO₃용액으로 반응계의 pH치를 8.0좌우로 조절하고, 150mL에틸 아세테이트을 넣어 규조토를 깐 깔때기로 여과하며, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 세척하고, 유기상을 합병하며, 감압 농축하여 용매를 제거한 후 고체를 CH₂Cl₂에 용해시키고, 물을 추가하여 세척하여, 유기상을 분리하며, 무수 Na₂SO₄으로건조, 여과하고, 감압 농축하여 최종 생산물II-5(1.5g, 80％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.12(d, J=8.24Hz, 1H), 7.08(d, J=7.92Hz, 1H), 7.01(d, J=2.44Hz, 1H), 6.88(d, J=2.2Hz, 1H), 6.70(dd, J=8.24Hz, 2.52Hz, 1H), 6.64(dd, J=7.88Hz, 2.24Hz, 1H), 4.01(m, 2H), 3.51-3.48(m, 2H), 3.13-3.06(m, 4H), 3.01-2.94(m, 2H), 2.12-2.05(m, 2H), 1.75-1.67(m, 2H)； ¹³ C NMR(101MHz, CDCl₃)δ194.18, 148.14, 144.99, 135.02, 134.79, 134.56, 132.85, 119.00, 118.94, 117.11, 110.32, 108.94, 55.59, 50.91, 45.26, 43.25, 25.50；MS(M+H⁺): m/z=320.0.

실시예4: 화합물

의 합성（화합물II-6로 약칭）

화합물II-6의 합성 경로는 하기와 같다:

플라스크에 화합물II-5(1.9g, 6mmol) 및 테트라플루오로붕산(30mL)을 넣고, 플라스크를 얼음욕에 넣으며, 반응계의 온도를 0-5℃까지 낮춘 후 아질산나트륨 수용액(0.5g, 7.2mmol, 15mL)을 15분간 동안 반응계에 적하 추가하며, 적가 완료된 다음 계속하여 30분간 반응시킨 후, 교반을 정지하며, 감압 여과하고, 필터 케이크를 먼저 15mL의 에탄올로 세척하고, 다시 15mL의 메틸 삼차 부틸 에테르로 세척하며, 마지막으로 메틸 삼차 부틸 에테르로 비팅 세척하고, 여과하여 고체로 얻으며, 고체를 플라스크에 옮겨, 120℃까지 가열하며, TLC에 의해 측정하고, 원료가 완전히 전환된 후, 반응계를 실온으로 냉각하며, 50mL의 CH₂Cl₂을 넣어 용해시키며, 불용성 고체를 여과하여 제거하고 , 필터 케이크를 50mL의 CH₂Cl₂로비팅 세척하며, 유기상을 수집하고, 무수 Na₂SO₄로 건조후, 여과하며, 감압 농축하여 용매를 제거하고, 미정제 생성물을 디클로로메탄 및 메탄올 구배(CH₂Cl₂ : CH₃OH=25 : 1)로 크로마토그래피 정제하여, 자색 고체 즉 최종 생산물II-6(1.2g, 67.3％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.24-7.19(m, 3H), 7.05(d, J=2.28Hz, 1H), 7.02(dd, J=8.4Hz, 2.4Hz, 1H), 6.74(dd, J=8.32Hz, 2.56Hz, 1H), 4.0437-4.0391(m, 1H), 3.55-3.52(m, 2H), 3.15-3.07(m, 4H), 3.01-2.94(m, 2H), 2.12-2.05(m, 2H), 1.77-1.68(m, 2H)； ¹³ CNMR(101MHz, CDCl₃)δ192.51(d, J=2.2Hz), 162.49(s), 160.03(s), 148.88(s), 140.55(d, J=2.9Hz), 130.56(s), 120.13(s), 119.86(s), 119.63(s), 118.92(s), 118.85(s), 116.74(s), 110.86(s), 110.63(s), 108.67(s), 55.97(s), 50.73(s), 45.48(s), 43.49(s), 25.76(s)； ¹⁹ F NMR(376MHz, CDCl₃)δ-115.21(s)；MS(M+H⁺): m/z=323.2.

실시예5: 화합물

의 합성（화합물II-14로 약칭）

화합물II-14의 합성 경로는 하기와 같다:

(1) 화합물II-8의 합성

삼산화크롬(138.0g, 1.38mol)을 120mL물 및 80mL초산의 혼합 용액에 용해시키고, 교반하여 모두 용해시키며, 준비해두고, 플라스크에 40.0g의 플루오란텐(II-7)(0.2mol) 및 500mL초산을 넣고, 반응계를 80-85℃까지 가열한 후, 삼산화크롬 용액을 적하 추가하며, 체계의 온도를 80-85℃으로 제어하고, 적가 완료 후 반응계의 온도를 110-120℃로 올려, 2시간동안 반응시킨 후, 실온으로 냉각시키며, 반응액을 3L 물에 부어, 대량의 황색 고체가 석출되고, 감압 여과 후 고체를 600mL의 2M NaOH용액에 용해시키며, 불용성 불순물을 감압 여과하고, 500mL의 물로 필터 케이크를 세척하며, 메틸 삼차 부틸 에테르를 넣어 수상을 세척하여, 수상을 분리하여 얻고, 농염산으로 그 pH를 1.0좌우로 조절하여, 황색 고체를 재차 석출하며, 감압 여과 후 60℃ 조건하에서 진공 건조하여 목표 생성물II-8(9-플루오레논-1-카르복실산)(29.5g, 66.0％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.18(d, J=7.52Hz, 1H), 7.74-7.53(m, 5H), 7.36(t, J=7.16Hz, 1H)；MS(M+H⁺): m/z=225.10.

(2) 화합물II-9의 합성

플라스크에 9-플루오레논-1-카르복실산(II-8)(15.0g, 0.067mol) 및 300mL물을 넣고, 반응계를 80-85℃까지 가열한 후10mL의 Br₂(0.23mol)를 적하 추가하며, 적가 완료 후, 계속하여 16시간동안 반응시키고, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정(CH₂Cl₂: CH₃OH=10: 1)된 후, 10％의 아황산 수소 나트륨 수용액300mL를 추가하고, 30분간 교반하여, 여과하여 황색 고체를 얻으며, 50℃ 조건하에서 진공 건조하여 최종 생산물II-9(19.5g, 96.5％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.22(d, J=7.04Hz, 1H), 7.85(s, 1H), 7.73-7.66(m, 3H), 7.43(d, J=7.84Hz, 1H).

(3) 화합물II-10의 합성

교반 조건하에서, 플라스크에 순차적으로 II-9(6g, 19.87mmol), 톨루엔(60mL), 트리에틸아민(4.1mL, 29.8mmol), DPPA(6.4mL, 29.8mmol) 및 테르 부탄올(10mL)을 넣은 후 반응계의 온도를 110℃까지 올려 환류 반응을 진행하고, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후(원료, CH₂Cl₂: CH₃OH=5: 1； 중간체, 석유 에테르: 에틸 아세테이트=5: 1), 용매를 제거하고, 실리콘 칼럼으로 정제하여(석유 에테르: 에틸 아세테이트=30: 1) 황색 고체를 생산물II-10(5.5g, 74％)로 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.15(d, J=8.56Hz, 1H), 7.71(d, J=1.72Hz, 1H), 7.59(dd, J=7.88Hz, 1.8Hz, 1H), 7.42(dd, J=7.44Hz, 8.36Hz, 1H), 7.37(d, J=7.92Hz, 1H), 7.09(d, J=7.16Hz, 1H), 1.55(s, 9H).

(4) 화합물II-11의 합성

화합물II-10(808mg, 2.16mmol)을 40mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 여기에 22mL 1M의 염산(21.6mmol)을 추가하며, 82℃ 조건하에서 가열하여 4시간동안 반응시키고, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후, 실온으로 냉각시키며, 반응계에 적당량의 1M NaOH 용액을 넣어 pH를 강염기성으로 조절할 후 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 수집하며 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 감압 농축하여 용매를 제거하여, 황색 고체를 생산물II-11(500mg, 84.5％)로 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.71(d, J=1.4Hz, 1H), 7.55(dd, J=7.8Hz, 1H), 7.35(d, J=7.9Hz, 1H), 7.22(t, J=7.6Hz, 1H), 6.81(d, J=7.1Hz, 1H), 6.52(d, J=8.4Hz, 1H), 5.54(s, 2H)；MS(M+H⁺): m/z=273.99.

(5) 화합물II-12의 합성

25mL의 3구 플라스크에 1.729mL 30％의 과산화수소수(16.95mmol)을 넣고, 얼음욕에서 0℃까지 냉각시킨 후, 아르곤 가스 보호하에서, 여기에 트리 플루오로 아세트산 무수물(2.736mL, 19.68mmol)의 디클로로메탄(2mL) 용액을 적가하고, 적가 완료 후, 계속하여 0℃ 조건하에서 1.5시간동안 교반하며(반응 혼합물이 무색에서 갈색으로 변함), 그 후 반응계에 화합물II-11(500mg, 1.824mmol)의 디클로로메탄(4mL) 용액을 적가하고, 적가 완료 후 온도를 실온으로 올리며 1시간동안 교반하여 반응시키고, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후, 적당량의 물을 넣고 퀀칭 반응을 시키며, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기상을 수집하며, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 감압하고 용매를 회전 증발시켜 제거하며, 실리콘 칼럼 크라마토 정제(석유 에테르: 에틸 아세테이트=10: 1)를 거친 후, 황색 고체II-12(212mg, 38.2％)를 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.32(d, J=8.4Hz, 1H), 7.75(d, J=1.8Hz, 1H), 7.64(dd, J=7.9Hz, 1H), 7.54(t, J=7.6Hz, 1H), 7.41(d, J=7.9Hz, 1H), 7.31(d, J=7.4Hz, 1H).

(6) 화합물II-13의 합성

화합물II-12(100mg, 0.329mmol), 1,4-디아자비시클로 [3.2.2] 데칸(125mg, 0.989mmol) 및 세슘 카보네이트(426mg, 1.31mmol)를 2mL의 재증류한 무수 톨루엔에 용해시켜 준비해두고, 아르곤 가스 보호하에서, Pd₂(dba)₃(30mg, 0.033mmol) 및 (±)-BINAP(61mg, 0.099mmol)를 2mL의 재증류한 무수 톨루엔에 용해시키며, 90℃ 조건하에서 15분간 교반한 후(반응 혼합물은 암자색 혼탁액에서 등황색 정화액으로 변함), 실온으로 냉각시킨 후 전술한 용액을 해당 반응계에 넣고, 아르곤 가스 보호 및 60℃ 조건하에서 14시간 동안 교반한 후(반응 혼합물은 등황색 정화액에서 밤색 액체로 변함), 실온으로 냉각시키며, 10mL의 물을 넣어 퀀칭 반응시키고, 디클로로메탄으로 추출하며, 유기상을 수집하고, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 감압하고 용매를 회전 증발시켜 제거하며, 실리콘 칼럼 크라마토 정제(CH₂Cl₂: CH₃OH=20: 1)를 거친 후, 자흑색 고체 II-13(48mg, 41.8％)를 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.49-7.52(m, 2H), 7.36(d, J=7.9Hz, 2H), 7.10(s, 1H), 6.82(t, J=7.6Hz, 1H), 4.13(s, 1H), 3.62-3.63(m, 2H), 3.04-3.18(m, 6H), 2.31(s, 2H), 1.82-1.83(m, 2H)；MS (M+H⁺): m/z=350.37.

(7) 화합물II-14의 합성

플라스크에 순차적으로 II-12(2.1g, 6.02mmol), 철분(1.7g, 0.03mol), 에탄올(80mL), 물(54mL) 및 농염산(1.8mL)을 넣고, 온도를 80℃까지 올려 5시간 동안 반응시키고, TLC에 의해 원료가 반응 완료된 것이 측정된 후, 10％의 K₂CO₃용액으로 pH치를 8.0좌우로 조절하며, 150mL의 에틸 아세테이트을 넣고, 규조토를 깐 깔때기로 여과하고, 유기상을 합병하며, 감압 농축하여 용매를 제거한 후 고체를 CH₂Cl₂에 용해시키고, 물을 추가하여 세척하여, 유기상을 분리하여 얻고, 무수 Na₂SO₄으로 건조, 여과하고, 감압 농축하여 최종 생산물II-14(1.5g, 80％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.30(d, J=8.28Hz, 1H), 7.16-7.12(m, 1H), 7.06(d, J=2.48Hz, 1H), 6.75(dd, J=8.28Hz, 2.52Hz, 1H), 6.67(d, J=7.04Hz, 1H), 6.35(d, J=8.28Hz, 1H), 5.43(s, 2H), 4.10(s, 1H), 3.58(t, J=5.48Hz, 2H), 3.19-3.13(m, 3H), 3.07-3.00(m, 2H), 2.14-2.11(m, 2H), 1.80-1.74(m, 3H)； ¹³ C NMR(100MHz, CDCl₃)δ195.66(s), 150.20(s), 147.18(s), 137.02-136.73(m), 136.37(s), 131.22(s), 121.42(s), 116.55(s), 115.39(s), 108.58(s), 108.48(s), 57.06(s), 51.87(s), 46.56(s), 44.64(s), 26.91(s)；MS(M+H⁺): m/z=320.16.

실시예6: 화합물

의 합성（화합물II-15로 약칭）

화합물II-15의 합성 경로는 하기와 같다:

플라스크에 화합물II-14(1.3g, 4.07mmol) 및 테트라 플루오로 붕산(20mL) 을 넣고, 이를 얼음욕에 넣어 온도가 0-5℃까지 냉각된 후, 여기에 NaNO₂용액(0.4g, 5.8mmol, 10mL)을 적하 추가하고, 적가 완료 후 계속하여 30분간 반응시키며, 교반을 정지하고, 감압 여과하며, 필터 케이크를 먼저 15mL의 에탄올로 세척하고, 다시 15mL의 메틸 삼차 부틸 에테르로 세척하며, 마지막으로 메틸 삼차 부틸 에테르로 비팅 세척하여, 여과하여 고체를 얻으며, 고체를 플라스크에 옮겨, 120℃까지 가열하고, TLC에 의해 반응이 완료된 것이 측정된 후 온도를 실온으로 낮추며, 50mL의 디클로로메탄을 넣어 용해시키고, 불용성 고체를 여과하여 제거하며, 필터 케이크를 다시 50mL의 디클로로메탄으로 비팅 세척하고, 유기상을 합병하며, 감압 농축하여 용매를 제거하여 미정제 생산물을 얻고, 디클로로메탄 및 메탄올(25: 1)로 크로마토그래피 정제하여 자색 고체 II-15(446mg, 34.0％)를 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.39-7.34(m, 1H), 7.32(d, J=8.36Hz, 1H), 7.11(d, J=7.36Hz, 1H), 7.09(d, J=2.48Hz, 1H), 6.80-6.74(m, 2H), 4.10(s, 1H), 3.60(t, J=5.76Hz, 2H), 3.19-3.12(m, 4H), 3.05-2.99(m, 2H), 2.15-2.10(m, 2H), 1.82-1.73(m, 2H)； ¹³ C NMR(101MHz, CDCl₃)δ191.17(s), 158.08(s), 150.54(s), 137.22(s), 137.14(s), 135.82(s), 130.97(s), 121.76(s), 117.27(s), 115.33(s), 115.12(s), 114.98(s), 109.26(s), 56.85(s), 51.62(s), 46.36(s), 44.39(s), 29.70(s), 26.65(s)； ¹⁹ F NMR(376MHz, CDCl₃)δ-114.11(s)；MS(M+H⁺): m/z=323.2.

실시예7: 화합물

의 합성(화합물III-5로 약칭)

화합물III-5의 합성 경로는 하기와 같다:

(1) 화합물III-2의 합성

5-하이드록시 인돌(III-1)(10g, 75.1mmol)을 100mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 해당 용액에 디-터트-부틸디카보네이트(49.2g, 225.3mmol) 및 DMAP(917mg, 7.51mmol)를 추가하며, 실온에서 15시간동안 교반하고, 반응 종료 후, 반응액을 감압 농축하고 400mL의 메탄올을 넣어 용해시킨 후 다시 K₂CO₃(51.9g, 375.5mmol)을 넣으며, 실온에서 4시간동안 교반하고, 완전히 반응시킨 후, 초산으로 pH를 중성으로 조절하고, H₂O을 추가하여 희석하고, 유기상(에틸 아세테이트를 추출제로 사용)을 추출하며, 용매를 제거하여, 칼럼 크로마토그래피 분리(석유 에테르: 에틸 아세테이트=3: 1)를 통해 생산물 즉 화합물III-2(12.5g, 71％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.99(d, J=6.96Hz, 1H), 7.56(d, J=2.84Hz, 1H), 6.98(d, J=2.44Hz, 1H), 6.85-6.82(m, 1H), 6.46(d, J=3.64Hz, 1H), 1.66(s, 9H)；MS(M-H⁺): m/z=232.11.

(2) 화합물III-3의 합성

화합물III-2(3.2g, 13.7mmol)를 20mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, 디이소프로필 에틸 아민(1.77g, 13.7mmol)을 120mL의 테트라 하이드로 푸란에 용해시키며, 양자를 혼합한 후 혼합 용액을 천천히 트라이포스겐(1.3g, 4.38mmol)의 CH₂Cl₂(100mL) 용액에 넣고, 실온에서 한시간 교반한 후, 1,4-디아자비시클로 [3.2.2] 데칸(1.72g, 13.7mmol)의 CH₂Cl₂용액을 천천히 여기에 넣으며, 실온에서 4시간 동안 반응하고；반응 종료 후, H₂O를 넣어 희석하고, CHCl₃로추출하며, 유기상을 수집하고, NaCl의 포화 수용액으로 세척하며, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 용매를 제거하여 미정제 생성물을 얻으며, CHCl₃ 및 CH₃OH(90: 10)를 전개제로 칼럼 크로마토그래피 분리를 진행하여 생산물III-10(2.4g, 45％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.11(d, J=7.6Hz, 1H), 7.60(s, 1H), 7.30(m, 1H), 7.05(d, J=8.96Hz, 1H), 6.52(d, J=3.2Hz, 1H), 4.52-4.41(m, 1H), 3.89(t, J=5.48Hz, 1H), 3.78(t, J=5.68Hz, 1H), 3.20-3.06(m, 6H), 2.14-2.11(m, 2H), 1.82-1.72(m, 2H), 1.66(s, 9H)；MS(M+H⁺): m/z=386.21.

(3) 화합물III-4의 합성

화합물III-3(2.4g, 6.23mmol)을 20mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, 반응액의 온도를 0℃로 낮춘 후, 10mL의 트리플루오로 아세트산을 넣은 후 30℃ 조건하에서 2시간 동안 교반하고, 반응 종료 후, 반응액을 농축하며, 물을 넣어 희석하고, CH₂Cl₂으로추출하며, 수상을 포화 NaHCO₃용액으로 pH를 8-9으로 조절한 후, CH₂Cl₂으로추출하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 용매를 제거하여 생산물III-4(360mg, 20％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, DMSO)δ11.16(s, 1H), 7.38-7.26(m, 3H), 6.84(d, J=8.52Hz, 1H), 6.40(s, 1H), 4.53-4.33(m, 1H), 3.95(m, 1H), 3.79(m, 1H), 3.30(m, 6H), 2.20-2.10(m, 2H), 1.95-1.93(m, 2H)；MS(M+H⁺): m/z=286.15.

(4) 화합물III-5의 합성

0℃ 조건하에서, 화합물III-4(350mg, 1.23mmol)의 무수 DMF(3mL) 용액에 수소화 나트륨(59mg, 1.48mmol) 을 넣고, 20분간 교반한 후, 1-플루오로-2-요오드 에탄(321mg, 1.85mmol)의 무수 DMF(3mL)용액을 천천히 넣은 후 실온에서 2시간 동안 반응시키며, 반응 종료 후, 여기에 염화암모늄용액을 넣어 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하며, 유기상을 수집하고, CHCl₃ 및 CH₃OH(95: 5, 20 방울의 암모니아 함유)으로 크로마토그래피 정제하여 목표 생성물III-5(50mg, 12.3％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.36-7.34(m, 1H), 7.26(d, J=8.76Hz, 1H), 7.14(d, J=3.04Hz, 1H), 6.98(d, J=8.76Hz, 1H), 6.48(d, J=3.0Hz, 1H), 4.72(t, J=4.88Hz, 1H), 4.61(t, J=4.88Hz, 1H), 4.51(m, 1H), 4.39(t, J=4.88Hz, 1H), 4.32(t, J=4.88Hz, 1H), 3.87(t, J=5.72Hz, 1H), 3.76(t, J=5.8Hz, 1H), 3.17-3.01(m, 6H), 2.13-2.10(m, 2H), 1.80-1.69(m, 2H)；MS(M+H⁺): m/z=332.19.

실시예8: 화합물

의 합성（화합물III-12로 약칭）

화합물III-12의 합성 경로는 하기와 같다:

(1) 화합물III-9의 합성

6-하이드록시 인돌(III-8)(10g, 75.1mmol)을 100mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 해당 용액에 디-터트-부틸디카보네이트(49.2g, 225.3mmol) 및 DMAP(917mg, 7.51mmol)을 넣고, 실온에서 15시간 동안 교반하며 반응 종료 후, 반응액을 감압 농축하며, 400mL의 메탄올을 넣어 용해시킨 후 다시 K₂CO₃(51.9g, 375.5mmol)을 넣고, 실온에서 4시간 동안 교반하고, 완전히 반응시킨 후, CH₃COOH으로 pH를 중성으로 조절하며, H₂O를 넣어 희석하고, 유기상을 추출하여 수집하며(에틸 아세테이트를 추출제로 사용), 용매를 제거한 후, 칼럼 크로마토그래피 분리(석유 에테르: 에틸 아세테이트=3: 1)를 거쳐 생산물III-9(12.5g, 71％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.68(s, 1H), 7.45(d, J=3.16Hz, 1H), 7.39(d, J=8.4Hz, 1H), 6.79(dd, J=8.4Hz, 2.2Hz, 1H), 6.48(d, J=3.68Hz, 1H)；MS(M-H⁺): m/z=232.11.

(2) 화합물III-10의 합성

화합물III-9(3.2g, 13.7mmol)를 20mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, 디이소프로필 에틸 아민(1.77g, 13.7mmol)을 120mL의 테트라 하이드로 푸란에 용해시키며, 양자를 혼합한 후 혼합 용액을 천천히 트라이포스겐(1.3g, 4.38mmol)의 CH₂Cl₂(100mL)용액에 넣고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 1,4-디아자비시클로 [3.2.2] 데칸(1.72g, 13.7mmol)의 CH₂Cl₂용액을 천천히 넣고, 실온에서 4시간 동안 반응시키며, 완전히 반응시킨 후, H₂O를 넣어 희석하고, CHCl₃으로추출하며, 유기상을 수집하고, NaCl의 포화 수용액으로 세척하며, 무수 NaSO₄로 건조하고, 용매를 제거하여 미정제 생성물을 얻고, CHCl₃ 및 CH₃OH(90: 10)를 전개제로서 칼럼 크로마토그래피 분리를 진행하여 생산물III-10(2.4g, 45％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.97(s, 1H), 7.54(d, J=3Hz, 1H), 7.50(d, J=8.44Hz, 1H), 7.02(d, J= 8.44Hz, 1H), 6.54(d, J=3.64Hz, 1H), 4.50-4.40(m, 1H), 3.85(t, J=5.64Hz, 1H), 3.77(t, J=5.8Hz, 1H), 3.18-3.02(m, 6H), 2.13-2.10(m, 2H), 1.81-1.70(m, 2H), 1.65(s, 9H)；MS(M+H⁺): m/z=386.21.

(3) 화합물III-11의 합성

화합물III-10(2.4g, 6.23mmol)을 20mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, 반응액의 온도를 0℃로 낮춘 후, 10mL의 트리플루오로 아세트산을 넣고 그 후 30℃ 조건하에서 2시간 동안 교반하며, 반응 종료 후, 반응액을 농축하고, 물을 넣어 희석하며, CH₂Cl₂으로추출하며 수상을 NaHCO₃의 포화 용액으로 pH를 8-9로 조절한 후 CH₂Cl₂으로추출하고, 무수 NaSO₄로 건조하고, 용매를 제거하여 생산물III-11(360mg, 20％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.27(s, 1H), 7.57(d, J=8.52Hz, 1H), 7.17(d, J=2.36Hz, 1H), 6.87(d, J=8.48Hz, 1H), 6.52(m, 1H), 4.54-4.44(m, 1H), 3.90(t, J=5.72Hz, 1H), 3.80(t, J=5.72Hz, 1H), 3.22-3.08(m, 1H), 2.17-2.13(m, 2H), 1.84-1.74(m, 2H)；MS(M+H⁺): m/z=286.16.

(4) 화합물III-12의 합성

0℃ 조건하에서, 화합물III-11(350mg, 1.23mmol)의 무수 DMF(3mL)용액에 수소화 나트륨(59mg, 1.48mmol)을 넣고, 20분간 교반한 후, 1-플루오로-2-요오드 에탄(321mg, 1.85mmol)의 무수 DMF(3mL)용액을 천천히 넣으며, 그 후 실온에서 2시간 동안 반응시키고, 반응 종료 후, NH₄Cl용액을 넣어 희석시키며, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 수집하며, CHCl₃ 및 CH₃OH(95: 5, 20 방울의 암모니아수를 함유)으로 크로마토그래피 정제하여 목표 생성물III-12(50mg, 12.3％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.57(d, J=8.48Hz, 1H), 7.13-7.11(m, 2H), 6.90-6.87(m, 1H), 6.51(d, J=3.04Hz, 1H), 4.75(t, J=4.84Hz, 1H), 4.63(t, J=4.92Hz, 1H), 4.51(m, 1H), 4.38(t, J=4.92Hz, 1H), 4.31(t, J=4.88Hz, 1H), 3.87(t, J=5.64Hz, 1H), 3.77(t, J=5.68Hz, 1H), 3.18-3.01(m, 6H), 2.13-2.10(m, 2H), 1.81-1.69(m, 2H)；MS(M+H⁺): m/z=332.18.

실시예9: 화합물

의 합성（화합물III-19로 약칭）

화합물III-19의 합성 경로는 하기와 같다:

(1) 화합물III-15의 합성

화합물III-14(2g, 15.85mmol), 3-브로모 피리딘(3g, 18.99mmol), Pd₂(dba)₃(320mg, 0.35mmol), rac-BINAP(660mg, 1.06mmol) 및 소듐터트부톡사이드(1.83g, 19.04mmol)를 20mL의 톨루엔에 용해시키고, 85℃ 조건하에서 가열하여 16시간동안 반응시키며, 반응 종료 후, 냉각하고, 감압 농축하여 용매를 제거하며, 미정제 생성물을 CH₂Cl₂: CH₃OH(0.1％NH₃·H₂O)=10: 1로 칼럼 크로마토그래피 분리하여 갈색 고체 즉 목표 생성물III-15(2.2g, 68％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.05(d, J=2.4Hz, 1H), 7.98(d, J=4.52Hz, 1H), 7.12-7.09(m, 1H), 6.90(d, J=8.28Hz, 1H), 3.43-3.39(m, 2H), 3.23-3.20(m, 2H), 3.0025-2.9960(m, 2H), 2.76-2.72(m, 2H), 2.50-2.47(m, 2H), 2.34(s, 3H)；MS(M+H⁺): m/z=204.15.

(2) 화합물III-16의 합성

0℃ 조건하에서, 화합물III-15(2.2g, 10.82mmol)를 80mL의 아세토니트릴에 용해시킨 후 30분간 내에 N-브로모숙신이미드(1.93g, 10.82mmol)의 아세토니트릴(10mL)용액을 적하 추가하며, 30분간 교반한 후 온도를 실온으로 높히고, 40mL의 물로 퀀칭 반응을 시킨 후, CH₂Cl₂(2Х40mL)를 넣어 추출하며, 유기상을 수집하고, NaCl의 포화 용액으로 세척하며, 무수 NaSO₄으로 건조하고, 감압 농축하여 용매를 제거한 후, 미정제 생성물에 대해 CH₂Cl₂: CH₃OH(0.1％NH₃·H₂O)=15: 1크로마토그래피 정제하여 연갈색 고체 즉 목표 생성물III-16(1.4g, 46％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.74(s, 1H), 7.23(d, J=8.68Hz, 1H), 6.78(d, J=8.68Hz, 1H), 3.43-3.39(m, 2H), 3.18-3.16(m, 2H), 3.00(m, 2H), 2.69-2.66(m, 2H), 2.54-2.51(m, 2H), 2.34(s, 3H)；MS(M+H⁺): m/z=282.06.

(3) 화합물III-18의 합성

화합물III-16(1.35g, 4.78mmol), 화합물III-17(1.16g, 7.21mmol) 및 Pd₂(dba)₃(553mg, 0.48mmol)을 40mL의 1,4-디옥산에 용해시키고, 10분간 교반시킨 후 10mL의 탄산나트륨(1.93g, 18.21mmol)용액을 넣으며 반응계의 온도를 115℃로 높히고, 2시간 동안 환류하여 반응 종료 후, 냉각하며, 여기에 물/에틸 아세테이트(50: 50)의 혼합 용매를 넣고 고체를 여과 수집하며, 30mL의 에틸 아세테이트로 세척하여, 담황색 고체 즉 목표 생성물III-18(1.0g, 66％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.23(s, 1H), 8.16(m, 2H), 7.81(d, J=8.48Hz, 1H), 7.63(d, J=8.68Hz, 1H), 7.44(d, J=8.52Hz, 1H), 7.22(s, 1H), 7.03-6.99(m, 1H), 6.60(s, 1H), 3.47-3.43(m, 2H), 3.29-3.27(m, 2H), 3.01(m, 2H), 2.79-2.75(m, 2H), 2.50-2.47(m, 2H), 2.35(s, 3H)；MS(M+H⁺): m/z=319.19.

(4) 화합물III-19의 합성

0℃ 조건하에서, 94mg의 수소화 나트륨(2.35mmol)을 화합물III-18(500mg, 1.57mmol)의 무수 DMF(3mL)용액에 넣고, 30분간 교반한 후, 쉥1-플루오로-2-요오드 에탄(546mg, 3.14mmol)의 무수 DMF(3mL)용액에 천천히 넣고, 얼음욕에 옮겨 실온으로 높히며, 2시간 동안 반응시키고, 완전히 반응시킨 후, NH₄Cl용액으로 반응계를 희석시키고, CH₂Cl₂를 넣어추출하며, 유기상을 수집하고, CH₂Cl₂: CH₃OH(0.1％NH₃·H₂O)=15: 1로 칼럼 크로마토그래피 분리하여 목표 생성물III-19(180mg, 31％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ8.16(s, 2H), 7.85(d, J=8.6Hz, 1H), 7.64(d, J=8.64Hz, 1H), 7.37(d, J=8.64Hz, 1H), 7.16(d, J=2.8Hz, 1H), 7.03-7.00(m, 1H), 6.58(d, J=2.88Hz, 1H), 4.80(t, J=4.84Hz, 1H), 4.68(t, J=4.84Hz, 1H), 4.47(t, J=4.92Hz, 1H), 4.40(t, J=4.8Hz, 1H), 3.45-3.41(m, 2H), 3.31-3.29(m, 2H), 3.05(m, 2H), 2.88-2.87(m, 2H), 2.52-2.50(m, 2H), 2.40(s, 3H)； ¹³ C NMR(100MHz, CDCl₃)δ147.67, 143.13, 135.99, 135.71, 131.92, 129.22, 128.68, 121.21, 120.68, 120.28, 118.62, 109.19, 102.66, 83.21, 81.53, 63.13, 54.49, 42.37, 41.80；MS(M+H⁺): m/z=365.21.

실시예10: 화합물

의 합성（화합물III-24로 약칭）

화합물III-24의 합성 경로는 하기와 같다:

(1) 화합물III-21의 합성

2.22mL의 DIEPA(13.4mmol) 및 화합물III-14(847mg, 6.71mmol)을 화합물III-20(1g, 6.71mmol)의 옥탄올(20ML)용액에 넣고, 120℃ 조건하에서 밤새 반응시키며, 완전히 반응시킨 후, 감압 농축하여 용매를 제거하고, 미정제 생산물을 CH₂Cl₂: CH₃OH(2M NH₃·H₂O)=4: 1을 용리제로 사용하고 크로마토그래피 정제하여, 백색 고체 즉 목표 생성물III-21(1.2g, 75％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.165(d, J=9.36Hz, 1H), 6.656(d, J=9.4Hz, 1H), 3.72-3.68(m, 2H), 3.47(m, 2H), 3.06(m, 2H), 2.76-2.72(m, 2H), 2.59-2.57(m, 2H), 2.366(s, 3H)；MS(M+H⁺): m/z=239.11.

(2) 화합물III-23의 합성

실온에서, 화합물III-21(1.1g, 4.61mmol) 및 III-22(763mg, 5.53mmol)의 1,4-디옥산(80mL)의 혼합 용액에 Pd₂(dba)₃(421mg, 0.46mmol) 및 1, 3-비스 (2,6-디이소프로필 페닐) 클로라이드 이미다졸륨(587mg, 1.38mmol)을 넣고, 질소 가스로 3회 치환한 후, 여기에 20％의 Na₂CO₃(10mL, 18.4mmol)을 넣고, 재차 질소 가스로 치환하며(4회), 질소 가스 보호하에서 85℃ 조건하에서 19시간 동안 반응시키고, 반응 종료 후, 냉각시키며, 여기에 200mL의 에틸 아세테이트를 넣고, 규조토를 이용하여 여과하며, 여과액을 수집하고, 용매를 농축하여 제거하며, 미정제 생산물은 CH₂Cl₂: CH₃OH(2M NH₃·H₂O)=9: 1크로마토그래피 정제시켜, 갈색 고체 즉 목표 생성물III-23(850mg, 62％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.596(d, J=8.2Hz, 2H), 7.231(m, 1H), 6.722(d, J=8.24Hz, 2H), 6.388(d, J=9.44Hz, 1H), 3.72-3.70(m, 2H), 3.68-3.59(m, 2H), 3.093(m, 2H), 2.88-2.86(m, 2H), 2.67-2.63(m, 2H), 2.407(s, 3H)；MS(M+H⁺): m/z=297.16.

(3) 화합물III-24의 합성

1-플루오로-2-요오드 에탄(351mg, 2.02mmol)의 N,N-디메틸 포름 아미드(10mL)용액에, 순차적으로 K₂CO₃(652mg, 4.72mmol) 및 화합물III-23(400mg, 1.35mmol)을 넣고, 실온에서 교반하여 밤새로 완전히 반응시킨 후, 여기에 물 및 에틸 아세테이트를 넣어, 유기상 및 수상를 분리시키고, 수상은 에틸 아세테이트로 2번 추출하며, 유기상을 수집하고, 무수 Na₂SO₄로건조, 여과하며, 용매를 제거하고, 미정제 생성물은 CH₂Cl₂: CH₃OH(2MNH₃·H₂O)=9: 1로 칼럼 크로마토그래피 분리하여 목표 생성물III-24(160mg, 34.6％)을 얻는다. ¹ H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.947(d, J=8.68Hz, 2H), 7.587(d, J=9.4Hz, 1H), 7.014(d, J=8.72Hz, 2H), 6.751(d, J=9.4Hz, 1H), 4.844(t, J=3.92Hz, 1H), 4.726(t, J=4.08Hz, 1H), 4.304(t, J=3.96Hz, 1H), 4.234(t, J=4.16Hz, 1H), 3.76-3.72(m, 2H), 3.60-3.57(m, 2H), 3.116(m, 2H), 2.96-2.90(m, 2H), 2.60-2.58(m, 2H), 2.431(s, 3H)； ¹³ C NMR(100MHz, CDCl₃)δ158.21, 148.87, 139.36, 133.07, 121.35, 120.55, 120.09, 118.33, 110.13, 82.70, 81.01, 63.01, 54.79, 42.25, 41.70；MS(M+H⁺): m/z=343.19.

실시예11: 방사성 리간드

의 합성（[¹⁸F]II-15로 약칭）

[¹⁸F]II-15의 합성 경로는 하기와 같다:

15mg의 Kryptofix 222을 0.7mL의 무수 아세토니트릴에 용해시키고, 2mg의 K₂C₂O₄를 0.3mL의 물에 용해시킨 후 양자를 균일하게 혼합하여 1.0mL의 Kryptofix 222/K₂C₂O₄용리액으로 배합하고, 해당 용리액으로 QMA 칼럼에 포획된 ¹⁸F^-를플라스크에 용리시키며, 100℃ 조건하에서 N₂흐름으로 플라스크 중의 용매를 바람으로 말린 후, 여기에 0.5mL의 무수 아세토니트릴을 넣고, 다시 바람으로 말리며, 이러한 과정을 3차례 반복하여, 플라스크의 수분이 충분히 제거되도록 확보하고, 전구체II-13(2mg)를 표기한 무수 DMSO용액(0.3mL)을 신속히 상술한 플라스크에 넣고, 밀폐하며, 160℃ 조건하에서 30분간 반응시키고, 반응 종료 후, 증류수(2Х10mL)를 넣어 퀀칭 반응을 시키며, 주사기로 반응액을 빨아들여 미리 활성화한 Sep-PaKC18고상 추출 칼럼을 거친 후, 2ml의 아세토니트릴로 반응 생산물을 해당 C18칼럼에서 용리시켜, 용리액을 수집하고, 감압 농축하여 용매를 제거하며, 적당량의 아세토니트릴을 넣어 용해시킨 후 아세토니트릴: 물(0.2％의 아세트산 암모늄을 함유)=28: 72를 유동상으로 하여 radio-HPLC분리 정제하고, 유속은 4mL/min이고, 파장은 280nm이며, 반분취 칼럼은

ODS-3형 C18반상 반분취 칼럼(GLSciences, Inc.5μm, 10mmХ250mm)이다.

radio-HPLC분리 정제를 거친 후, 해당 방사성 리간드[¹⁸F]II-15의 방사 화학 순도는 98％보다 크고, 방사성 표기율은 대략13.1％(감쇠 보정을 거치지 않음)이며, 정제를 거친 [¹⁸F]II-15 및 표기하지 않은 안정 화합물II-15을 공통으로 주사하여 HPLC분석을 진행하며, 유동상 조성은 아세토니트릴: 물(0.2％의 아세트산 암모늄을 함유)=30: 70이고, 유속은 1mL/min이며, 파장은 280nm이고, 분석칼럼은AgelaTechnologies, VenusilXBP C18(L), 5μm, 150Å, 4.6Х250mm이며, 분석 결과는 도 1에 나타낸 바와 같고, [¹⁸F]II-15 및 II-15의 보존 시간은 각각 14.037min 및 13.466min이며, 양자의 보존 시간은 서로 매칭되어, 방사성 리간드의 정확성을 확인하였다.

실시예12: 리간드 화합물의 체외 경쟁 실험

(1) 포화 결합 실험

a) 수용체 단백질의 제조 및 그 농도의 측정

실험 과정에서 사용되는 수용체 단백질은 모두 암컷 SD랫(180-200g)의 대뇌에서 분리 추출한 것이다. 암컷 SD랫(180-200g)에 대하여 목을 끊어 죽인 후, 신속히 그 대뇌를 꺼내 얼음에 놓고, 찬 생리 식염수로 피를 ?어버린 후, 대뇌 피질(해당 구역은 α7 nAChRs수용체 단백질이 풍부함)을 해부해 내어, 10배 체적의 찬 50mM Tris-HCl 완충 용액(50mM Tris, 120mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, pH=7.4, 4℃)에 넣은 후, 비커를 얼음욕에 넣고 조직 호모지나이저(Tissue Tearor)로 해당 혼합물을 30초동안 균질한다(No.6로 설정). 균질 후의 막 용액을 3등분으로 나누어 50mL원심관에 넣고, 저온 고속 원심기로 20분간(4℃, 48000g) 원심처리 하며, 원심 완성 후 상등액을 버리고, 하층 침점물을 10배 체적의 찬 50mM Tris-HCl완충 용액에 용해시키며, 동일한 방법으로 혼합물에 대해 균질, 원심 및 세척을 진행한다. 해당 단계를 3차례 반복한 후 얻은 하층 침점물이 수용체 막 단백질로서, 이를 10배 체적의 찬 50mM Tris-HCl완충 용액에 용해시키고, 균질하여 충분히 균일하게 혼합되도록 한다. 10μL의 균일하게 혼합된 수용체 막단백질 용액을 취해, Lowry방법으로 단백질의 농도를 측정하고, 나머지 막용액을 2mL의 원심관에 나누어 담고, -80℃의 냉장고에 보관하여 둔다.

b) 수용체 막 단백질의 포화 결합 실험

포화 결합 실험은 방사성 리간드[¹²⁵I]α-붕가로 톡신 독소(약칭: [¹²⁵I]α-bgt)와 마우스 대뇌 막단백질의 결합을 측정하는 것으로 진행된다. 실험에서, [¹²⁵I]α-bgt는 8개의 서로 다른 농도점(0.005-5nM)을 설정하고, 각 농도점은 3조로 나뉜다. -80℃ 냉장고에 보관되어 있던 수용체 막단백질을 꺼내, 4℃ 조건하에서 융해하고, 융해한 후 측정된 단백질 농도에 따라 적당 체적의 찬 50mM Tris-HCl완충 용액(50mM Tris, 120mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, pH=7.4, 4℃)을 넣어 희석한다. 총결합관 중 반응 혼합물의 총체적은 500μL이고, 100μL의 막단백질 용액(최종적으로 각 시험관 중 단백질의 량은 1.5mg), 10μL의 다른 농도의 방사성 리간드[¹²⁵I]α-bgt 및 390μL찬 50mM Tris-HCl완충 용액을 포함하고, 첨가 순서는 막단백질, Tris-HCl완충 용액 및 [¹²⁵I]α-bgt(표 1)이다. 비특이성 결합은 2μM의 표기되지 않은 α-bgt로 결정되고, 시험관 중의 반응 혼합물은 100μL의 막단백질 용액(최종적으로 각 시험관 중의 단백질의 량은 1.5mg), 10μL의 다른 농도의 방사성 리간드[¹²⁵I]α-bgt, 100μL 2μM의 α-bgt 및 290μL 찬 50mM Tris-HCl완충 용액을 포함하고, 총체적은 500μL이며, 첨가 순서는 막단백질, Tris-HCl완충 용액, α-bgt 및 [¹²⁵I]α-bgt(표 2)이다. 첨가 종료 후, 시험관을 밀봉막으로 잘 밀봉하고, 몇초 동안 와류에 의해 충분히 혼합되도록 한 후 37℃의 상온 배양기에서 2.5시간동안 배양하고, 배양 완성 후, 시험관을 꺼내 얼음욕에 넣어 수용체 단백질과 리간드의 결합을 종료시킨 후 48 홀 세포 수집기로 혼합액을 WhatmaNGF/B여과지(미리 0.5％의 폴리에틸렌이민 용액으로 2.5시간동안 침지시킴)에 여과하고, 여과지를 5mL의 찬 50mM Tris-HCl완충 용액으로 3번 ?어 내어, 여과지를 꺼내 잘라서 측량하기 위한 PE관에 넣고, γ-counter으로 수량을 계측한다. 총결합(TB)과 비특이성 결합(NSB) 사이의 차이값이 특이성 결합(SB)으로서, 즉 SB(cpm)=TB(cpm)-NSB(cpm)이다.

[표 1] 포화 결합 실험 총결합관 첨가표

[표 2] 포화 결합 실험비특이성 결합관 첨가표

c) 실험 결과

포화 결합 실험에서, 방사성 리간드[¹²⁵I]α-bgt는 8개의 서로 다른 농도(0.005-5nM)를 설정하고, 각 농도은 3조로 나누어 측정한다. 실험 결과로 부터 알 수 있다시피, 측정한 농도 범위 내에서, [¹²⁵I]α-bgt와 수용체 막단백질의 특이성 결합은 신속히 포화에 도달하고, 그 특이성 결합 곡선은 도 2에 나타낸 바와 같으며, 특이성 결합곡선 및 공식log[B/(B _max-B)]=n_Hlog[L]-1ogK_d은 log[B/(B _max-B)]에 근거하여 log[L]을 작성하여, Hill직선(도 3에 나타낸 바와 같이)을 얻으며, y=1.05828x+0.08731(R=0.99031)이고, 경사도가 Hill계수n_H=1.058이고, [¹²⁵I]α-bgt와 수용체 막단백질의 결합은 간단한 단위점 작용 시스템인 것을 설명한다.

단위점 작용 시스템의 Scatchard방정식: B/F=-B/K_d+B _max/K_d에 근거하여, 특이성 결합량B으로 상응된 B/F를 작성하고(도 4에 나타낸 바와 같이), 선형회귀 방정식 y=46.42857-1.2987x(R=1)을 얻고, 해당 방정식에 근거하여 본 실험 조건하에서 얻은 [¹²⁵I]α-bgt의 평형 해리 상수는 K_d=0.77±0.088nM(95％신뢰 구간은 0.36-1.172nM)이고, 최대 결합량은 B_max=35.75±4.64fmol/mg단백질(95％신뢰 구간은 29.88 -41.62fmol/mg단백질)이다. 해당 실험 결과는 문헌에서 보도된 수치와 일치하고(K_d=1.5±0.7nM, B_max=63±17pmol/mg단백질), 본 명세서에서 이용하는 측정 방법은 신뢰할 수 있고, 피측정 화합물 바이오 활성을 측정하는데 사용할 수 있음을 설명한다.

(2) 경쟁 결합 실험

a) 실험 방법

정량으로 리간드 화합물과 α7 nAChRs의 친화성을 측정하기 위해, 우리는 [¹²⁵I]α-bgt를 방사성 표준품으로 하는 체외 경쟁 결합 실험을 진행하였다. 실험에서, 막단백질 용액(각 반응관 중의 단백질의 량은 1.5mg)과 0.4nM의 [¹²⁵I]α-bgt용액 및 일련의 8개 다른 농도 (각 농도는 3조로 나누에서 측정)의 비표기 리간드 용액은 37℃의 상온 배양기에서 함께 2.5시간동안 배양되고, 배양 완성 후, 전술한 포화 결합 실험과 동일한 방법으로 처리되고 γ-counter로 수량을 계측한다. 동시에, 해당 실험체계의 정확성 및 신뢰성을 확보하기 위해, MLA(기지의 α7 nAChRs의 고선택성, 고친화성 리간드)를 참조 리간드로 하여, 그와 마우스 뇌 중의 α7 nAChRs의 친화성을 측정한다. 리간드 화합물의 배합 방법 및 첨가 방법은 하기 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같다.

[표 3] 리간드 화합물의 배합 방법

주석: 표 3은 일부 농도 범위가 10^-3-10^-10mol/L인 화합물의 제조방법이고, 다른 화합물의 다른 농도 범위 예를 들어 10^-6-10^-14mol/L, 10^-5-10^-13mol/L는 도 3의 방법을 참조하여 약간의 조정을 진행하면 된다.

[표 4] 경쟁 결합 실험 첨가표

주석: 첨가 순서는 단백질, Tris-HCl완충 용액, 약물(리간드 화합물 및 MLA을 포함), [¹²⁵I]α-bgt이다.

b) 실험 결과

비교를 위해, MLA를 선택하여 참조 리간드로 하고, 동일한 실험 조건하에서 동시에 MLA 및 설계한 피측정 화합물이 α7 nAChRs에 대한 친화성을 측정한다.

경쟁 결합 실험에서, 참조 리간드MLA 및 일련의 피측정 화합물은 8개의 다른 농도(II-14가 10^-6-10^-14mol/L이고, II-5가 10^-5-10^-13mol/L인 것을 제외하고, 나머지 화합물은 10^-3-10^-10mol/L)를 설정하고, α7 nAChRs의 결합에 대한 0.4nM[¹²⁵I]α-bgt(K_d=0.77±0.088nM)의 억제를 통해 그 IC₅₀치를 측정하고, Cheng-Prusoff 공식(K_i=IC₅₀/(1+[L]/K_d))으로 각자의 K_i치를 계산한다. 측정 결과는 표 5에 나타낸 바와 같고, 해당 실험 조건하에서, MLA의 억제 상수는 K_i=2.88±0.78nM이고, 문헌에서 보도된 K_i치(1.09±0.09nM)와 기본적으로 비슷하여, 본 명세서에서 사용하는 실험 방법의 실행 가능성을 보여준다.

표 5로부터 알 수 있다시피, 각 리간드 화합물은 α7 nAChR 막단백질에 대해 친화성을 나타내고, 억제 상수(K_i)는 0.005-450nM범위 내에 분포되며, 여기서 화합물II-14, II-5, II-15, II-6 및 I-9는 [¹²⁵I]α-bungaratoxin에 대하여 강한 억제 작용을 나타내고, 그 K_i치는 각각 0.0069±0.004nM, 0.064±0.058nM, 2.98±1.41nM, 7.24±1.02nM 및 21.76±1.22nM이며, 이는 이들이 α7 nAChR에 대해 높은 친화성을 가지는 것을 설명하고, 특히 화합물II-14의 친화성(K_i=0.0069±0.004nM)은 이미 국제 동종 리간드 분자의 최고치(K_i=0.023nM)를 초과하였다.

[표 5] MLA 및 각 피측정 리간드 화합물이 α7 nAChRs에 대한 체외 결합 친화성(K_i, nM) ^[a]

[a] 3차례를 거쳐 측정한 평균치±표준 편차

실시예13: 체외 hERG 칼륨 이온 채널 억제 실험

a) 실험 방법

현재, 약물이 hERG 칼륨 채널에 대한 억제 작용을 측정하는 방법은 주로 전자동 patch clamp recording technique법, 전통 patch clamp recording technique법 및 FluxORTM Thallium Assay 이 3가지 방법을 사용한다. 본 명세서에서는 전통 patch clamp recording technique법을 이용하여 화합물이 hERG칼륨 채널에 대한 억제 작용을 측정하고, 해당 방법은 심장 독성 연구에서 공인하는 표준 방법이고, 가장 정확한 측량 방법이다. 실험 중에서, 시사프라이드(Cisapride, hERG칼륨 채널에 대해 강한 억제 작용을 가진 화합물로 알려짐)를 표준 화합물로 하여, 피측정 리간드 화합물이 hERG칼륨 채널에 대한 억제 작용을 평가한다.

37℃ 조건하에서, DMEM배지(10％소 태아 혈청 및 0.8mg/M1G418을 함유)로 hERG칼륨 이온 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293세포 체계(Creacell)(5％의 CO₂)를 배양하고, 계대 배양을 거친 후, TrypLE^TM Express용액으로 세포를 분리한 후 3Х10³세포를 커버 글라스에 펴놓고, 24홀판에서 18시간동안 배양한 후 세포의 전기 생리 활성을 측정하고, 전체 세포 기록의 hERG 전류가 안정된 후 약물 검출을 시작하며, 실험에서, 각 피측정 리간드 화합물은 4개의 농도 구배(0.4μM-50μM)를 설정하고, 인접한 농도 사이의 비율은5이며, 표준 화합물 시사프라이드의 농도 범위는 1nM-1μM이고, 인접한 농도 사이의 비율은 10이며, 검출 시, 각 약물(리간드 화합물 및 시사프라이드를 초함)농도가 5분간( 또는 전류가 안정될 때까지 지속 작용함) 지속된 후 다음 농도의 검출을 진행하고, 약물 용액은 중력 관류의 방법으로 저농도에서 고농도로 순차적으로 기록 챔버(recording chamber)를 거쳐 세포에 작용하며 기록 챔버에서 액체 교환을 진행하고, 약물 검출 전에 공백의 대조군을 만들며, 모든 실험군 및 대조군에 대해 독립적으로 3차례 중복 검출을 진행한다.

b) 실험 결과

데이터 처리 시, 먼저 공백 대조군의 기록 전류로 피측정 약물에 대한 각 농도의 작용전류를 교정(피측정 약물의 후미 전류 피크치/공백 대조의 후미 전류 피크치)한 후, 피측정 약물이 각 농도에 대응되는 억제률(1-피측정 약물의 후미 전류 피크치/공백 대조의 후미 전류 피크치)을 계산하여, 3차례 중복 실험의 평균치 및 상대 표준 편차를 얻은 후, 하기의 방정식으로 각 피측정 화합물의 반억제 농도(IC₅₀치)를 계산한다.

억제률=1/[1+(IC ₅₀/c) ^h]

여기서, c는 피측정 약물의 농도를 나타내고, h는 Hill계수를 나타내며, 곡선의 맞춤 및 IC₅₀치의 계산은 IGOR 소프트웨어를 보조 계산으로 완성된다.

표준 화합물 시사프라이드 및 피측정 화합물II-15, II-14, II-6, II-5이 hERG칼륨 이온 채널에 대한 억제 작용 결과는 표 6 및 7에 나타낸 바와 같다. 실험 결과로부터 알 수 있다시피, 화합물II-14는 hERG칼륨 이온 채널에 대해 거의 억제 작용이 없고(IC ₅₀＞10μM), 화합물II-5는 hERG칼륨 이온 채널에 대해 중간 정도의 억제 작용을 가지며(1μM≤IC₅₀≤10μM), 화합물II-15 및 II-6은 hERG칼륨 이온 채널에 대해 비교적 강한 억제 작용을 가지나(0.1μ≤IC₅₀≤1μM), 이들이 해당 이온 채널 단백질에 대한 친화성(IC₅₀치의 460nM-2500nM범위)은 α7 nAChR 막단백질에 대한 친화성(IC₅₀치의 0.21nM-21nM범위)(표 8를 참조)보다 훨씬 작고, 그 외, 해당 측정 방법은 hERG독성의 연구에서 제일 민감한 방법이긴 하나, 약물이 체내에서 hERG칼륨 전류에 대한 억제 작용은 그 혈액 중의 농도 등 생리 요소와도 관계되기에, 이러한 리간드 분자는 잠재적인 α7 nAChR작용제로써 추가로 연구할 수 있다.

[표 6] hERG칼륨 전류에 대한 표준 화합물 시사프라이드의 억제 작용(IC₅₀, nM)

[표 7] 화합물II-15, II-14, II-6, II-5의 hERG칼륨 전류에 대한 억제 작용(IC ₅₀, μM)

[표 8] hERG칼륨 이온 채널 및 α7 nAChR에 대한 화합물II-15, II-14, II-6, II-5의 친화성 비교

실시예14: 리간드 화합물II-15반치사 자극량LD₅₀의 측정

a) 실험 방법

쿤밍종 마우스(18-20g)를 취해, 암, 수 각각 절반씩 60마리이고, 실험 조건하에서 3일간 사육한 후, 금식하나 물을 금하지 않으며 12시간 후 하나씩 무게를 측정하여 기록하고, 체중, 크기에 따라 무작위로 6그룹으로 나누며, 각 그룹은 각각 10마리(암 수 각각 절발씩)이고, 예정 시험 탐색의 농도 범위에 따라 5개의 다른 농도의 용액 및 공백 대조 용액을 배합하며 실험군의 인접한 농도 사이의 비율은 0.90-0.95이고, 꼬리 정맥 주사의 투여 방식으로 각군의 마우스에게 0.1mL의 약품 용액 또는 공백 대조 용액을 주사하고, 주사 완성 후 마우스를 농도 및 암수에 따라 나누어 사육하며, 투여 후의 0.5h, 1h, 3h, 6h, 12h 및 24h 내에 마우스의 반응 상황(행위 활동 활발 여부, 자극에 대한 방응 상황, 음식 상황, 경련, 전광, 토혈, 비틀 거림 등 증상의 발생 여부)밀접하게 관찰하고 기록하며, 사망된 마우스에 대해서는 즉시 해부하여 각 기관의 이상 현상을 관찰하고, 그 후 매일 정시에 관찰하고, 투여후의 제2, 4, 6, 8, 10, 12, 14일에 각각 각군의 마우스의 체중을 측정하고 기록하며, 관찰기간 내 각군의 마우스의 사망률을 계산하고, 각군의 실험 농도 및 사망률을 계산을 통해 해당 화합물이 마우스에 대한 반치사 자극량LD₅₀을 계산한다.

b) 실험 결과

1. 관찰 기간 내 마우스의 반응 상황

실험 중에서, 투여 후 사망된 마우스는 관찰 단계에서 모두 경련 현상이 발생하고, 일부 마우스는 떨림, 토혈, 비틀거림, 광조 현상을 보였으며, 사망한 마우스에 대해 해부하여 각 조직 기관에 대해 관찰하였으나 이상이 발견되지 않았고, 모든 약물 투여 마우스는 투여 후 1시간 내에 모두 식욕 부진 현상을 보였으나 후에 정상적으로 회복되었고, 실험군에 생존한 마우스 및 공백 대조군 마우스는 관찰 기간 내에 체중 증가가 정상적이며, 각군 마우스의 체중 변화에는 현저한 농도군 차이 및 암수 차이가 발견되지 않았다. 관찰 기간 내 마우스 의 반응 상황 기록은 표 9에 나타낸 바와 같다.

[표 9] 관찰 기간 내 마우스의 반응 상황

2. 반치사 자극량LD₅₀의 계산

LD₅₀의 계산 방법은 여러가지가 있고, 여기서Bliss에서 창조되고 후에 연구자에 의해 발전한 가중 확률 단위법이 제일 정확하고, 신중하여, 연구자들이 공인하는 표준 LD₅₀계산 방법이다. 본 명세서에서 이러한 계산 방법을 이용하여 피측정 화합물이 마우스에 대한 LD₅₀치를 계산하여 얻는다.

[표 10] 화합물II-15의 LD₅₀계산표

주석: 가중=가중 계수*각군 동물 수량(n)；

프로비트(Y)에 근거하여 LogD(X)를 작성하여, 방정식 y=14.76x-20.53(도 5에 나타낸 바와 같이)를 얻고, 사망률이 50％일 경우, 표를 찾아 프로비트(Y)가 5.00이고, 방정식에 대입하여 x=m=LogD=1.73, D=53.70mg/kg를 얻는다.

표준 편차:

여기서

A=

;b=14.76；

상술한 공식에 근거하여, 표준 편차Sm²=0.0001977577, Sm=0.014를 계산하여 얻고,

m±1.96Sm=1.73±0.02744이고, 즉 1.70256-1.75744이며, 각각 그 역대수를 구해, LD₅₀의 95％신뢰 한계를 취하고, 50.4150-57.2058mg/kg이며, 따라서, 화합물II-15의 LD₅₀치는 53.70mg/kg이다.

상술한 과정으로부터 알 수 있다시피, 화합물II-15의 반치사 자극량LD₅₀치는 mg/kg수량 레벨이고, 임상에서 한차례 PET 현상에 필요한 자극량을 훨씬 넘기에 화합물II-15을 ¹⁸F로 표기하여 얻은 방사성 리간드[¹⁸F]II-15의 체내 적용은 안전한 것이다.

실시예15: [¹⁸F]II-15기름/물 분배 계수의 측정

대부분 신경류 약물의 연구 개발은 모두 반드시 혈관-뇌 장벽(BBB)을 통과하는 능력을 고려하여야 하고, 약물 분자가 혈관-뇌 장벽 통과 여부는 그 지용성의 크기에 밀접하게 연관된다. 통상적인 경우에, 리간드 분자의 지용성(log P)수치가 1.0-3.0 사이일 경우, 혈관-뇌 장벽을 통과할 수 있는 것으로 간주된다.

옥탄올과 pH=7.4의 PBS혼합 체계에서 [¹⁸F]II-15의 기름/물 분배 계수(log P)를 측정하고, 구체적인 실험 방법은 900μL PBS(사전에 옥탄올로 포화시킴 ) 및 1000μL 옥탄올(사전에 PBS로 포화 )을 함유하는 10mL원심관에 100μL 10μCi방사성 리간드(생리 식염수 용액)을 넣고, 혼합 용액을 5분간 흔든 후, 원심기에 놓고 5분간 원심 처리한다(7000rmp/min). 원심 처리된 후 각각 100μL유기상 및 수상을 취해 PE시험관에 넣어 방사성 수량을 계측하고, 각군에서 다시 100μL유기상을 취해 10mL원심관에 넣고, 900μL 옥탄올 및 1000μL PBS을 넣어 상술한 바와 같이 와류 원심을 진행하여, 방사성 카운트를 측정하고, 이와 같이 다시 3차례 반복하여 평균치를 구한다. log P=log(유기상 카운트/수상 카운트)

측정을 통해 얻은 방사성 리간드[¹⁸F]II-15의 기름/물 분배 계수 logP치는 1.64±0.12이고, 해당 수치는 약물이 혈관-뇌 장벽(BBB)을 통과하여 뇌 내에 진입하는 지용성 범위에 부합된다.

실시예16: [¹⁸F]II-15의 체외 안정성 실험

방사성 리간드의 체외 안정성은 그 추가적인 체외 연구에 중요한 의미를 가지고, 통상적인 경우에, 체외 안정성 연구는 생리 식염수 및 동물 혈청 중에서 진행된다. 구체적인 방법은 10μCi의 HPLC 정제를 거친 방사성 리간드[¹⁸F]II-15를 취해 100μL소 태아 혈청과 함께 37℃ 조건하에서 각각 1시간동안 및 2시간동안 배양시키고, 배양 종료 후 여기에 200μL의 아세토니트릴을 넣어, 단백질이 충분히 침전되도록 한 후 4℃ 조건하에서 5분간 원심처리하여(7000rpm), 상등액을 수집하고, 여과막 여과를 거친 후100μL를 취해 HPLC분석을 진행하고 다시 10μCi의 HPLC 정제를 거친 방사성 리간드[¹⁸F]II-15를 취해 100μL생리 식염수 중에서 실온에서 각각 1시간동안 및 2시간동안 배양한 후 직접 HPLC을 통해 분석한다.

방사성 리간드[¹⁸F]II-15의 체외 안정성 실험 결과는 도 6에 나타낸 바와 같고, 도 6으로부터 알 수 있다시피, [¹⁸F]II-15는 생리 식염수 및 소 태아 혈청에서 모두 우수한 안정성을 보인다. 37℃ 조건하에서, 소 태아 혈청에서 1시간동안(도 6 중A도) 및 2시간동안(도 6 중 B도) 배양 후, 그 방사 화학적 순도는 모두 98％보다 크고, 실온에서, 생리 식염수에서 1시간동안 (도 6 중 C도) 및 2시간동안(도 6 중 D도)배양한 후, 그 방사 화학적 순도도 여전히 98％보다 크다.

실시예17: [¹⁸F]II-15의 동물 체내 분포실험

HPLC정제를 거친 [¹⁸F]II-15(10μCi, 0.1mL생리 식염수에 용해, 5％DMSO를 함유)를 꼬리 정맥 주사의 방식을 통해 정상적인 쿤밍종 마우스 체내(18-22g, 암컷, n=5)에 주입하고, 각각 5분, 15분, 30분, 60분, 90분 시, 마우스에 대해 목을 끊어 죽인 후, 혈, 뇌, 심장, 폐, 간장, 비장, 신장, 근육, 뼈 및 꼬리를 해부해 내어 각 기관의 습중량을 측정하고, γ-counter를 이용하여 수량을 계측하며, 각 조직의 섭취 상황을 최종 ％ID/g로 표시하고, ％ID/g=ID/gχ1％이며, 여기서ID/g=조직의 방사성 카운트(counts)χ조직 질량(mg), 1％=각 시간 위상 1％ID의 평균치-후미 방사성 계수/100이고, 그 방사성 리간드의 체내 분포 결과는 표 11을 참조한다.

[표 11] 화합물[¹⁸F]II-15이 암컷 쿤밍종 마우스(18-22g) 체내의 분포 상황

표의 데이터는 5차례 측량한 평균치±표준 편차이다.

표 11로부터 알 수 있다시피, ¹⁸F표기한 방사성 리간드[¹⁸F]II-15는 마우스 뇌 내에서 아주 높은 최초 뇌 섭취를 가지고, 주사 5분 후 그 섭취치는 8.98±0.41％ID/g에 달하고, 15min후 최고의 뇌 섭취치 11.60±0.14％ID/g를 보이며, 동시에 해당 방사성 리간드는 적절한 뇌제거속율을 나타내고, 약물 투여 60분, 90분 후, 그 뇌 내의 섭취치는 각각 5.46±0.27％ID/g 및 3.63±0.25％ID/g으로 감소되고, 이는 해당 화합물이 적절한 뇌내 동력학 성질을 가지는 것을 보여주고, 해당 결과는 현재 보도된 임상실험을 진행한 [¹⁸F]ASEM(그 최고 뇌 섭취치가 7.5％ID/g이고, 약물 투여 5분 후에 나타남)에 비해, 현저한 우세를 보여준다. 그 외, [¹⁸F]II-15는 혈액 중에서의 섭취치가 아주 낮고 아주 높은 뇌/혈 비율치를 보여주며, 5분 및 15분 시 각각 9.35 및 9.57이다.

방사성 리간드의 체내 탈불소화 현상은 F-18표기된 현상제를 연구하는 과정에서 반드시 고려하여야 하는 문제이고, 상기 표의 실험 결과로부터 알 수 있다시피, [¹⁸F]II-15의 뼈 흡수치는 연구한 시간 범위 내에서 증가되나, 증가 속도 및 증가폭은 크지 않으며, 이는 해당 화합물의 체내 탈불소화 현상이 비교적 약하고, 해당 형상은 방사성 리간드의 체내 현상 연구에 너무 큰 노이즈로 작용하지 않을 것으로 예상된다. 그 외, 기타 조직 기관에서 비교적 높은 방사성 섭취를 가지는데 예를 들어 신장 및 폐에서 방사성 리간드의 초기 섭취량은 모두 아주 높으나, 시간의 연장에 따라 그 섭취치는 점차 감소되고 제거 속도가 아주 빠르며, 해당 방사성 리간드는 [¹⁸F]ASEM에 비해, 더욱 우수한 뇌부 흡수 특징을 가진다.

실시예18: [¹⁸F]II-15의 뇌 구역 분포 실험

HPLC정제를 거친 [¹⁸F]II-15(10μCi, 0.1mL생리 식염수에 용해, 5％ DMSO를 함유)를 꼬리 정맥 주사의 방식을 통해 정상적인 쿤밍종 마우스 체내(18-22g, 암컷, n=5)에 주입하고, 각각 5분, 15분, 30분, 60분, 90분 시, 경추 탈구의 방식으로 마우스를 죽여 신속히 뇌부를 해부하여 내어 얼음에 놓고, 찬 생리 식염수로 핏자국을 제거한 후 구역을 나눠서 피질, 선조체, 해마, 상하구, 시상, 소뇌 및 잔여 뇌를 해부해 내고, 각 뇌 구역의 습중량을 측정하고 γ-counter를 이용하여 방사성 카운트를 측정하며, 각 구역의 방사성 리간드 섭취 상황을 최종 ％ID/g으로 표시하면 ％ID/g=ID/gχ1％이고, 여기서 ID/g=조직의 방사성 카운트(counts)χ조직질량(mg), 1％=각 시간 위상 1％ID의 평균치이며, 해당 방사성 리간드의 뇌 구역분포 상황은 표 12를 참조한다.

표 12에서 알 수 있다시피, 10μCi[¹⁸F]II-15을 마우스 체내에 주입한 후, 해당 방사성 리간드는 α7 nAChR은 피질, 선조체 및 해마가 제일 풍부한 구역에서 비교적 높게 흡수되고, 약물 투여30분간 후에 피크치에 달하며, 각각 9.39±0.24％ID/g, 8.37±0.27％ID/g 및 6.31±0.82％ID/g이고, 그 후의 관찰 기간 내, 이러한 구역의 섭취치는 점차 줄어들며, 중도 섭취 구역은 상하구 및 시상이고, 섭취가 제일 낮은 구역은 소뇌(마우스 뇌 내α7 nAChR분포가 제일 적은 구역)이다. 해당 뇌 구역분포 특점은 [¹⁸F]ASEM와 유사하고, 또한 문헌에 보도된 α7 nAChR가 체내, 체외에서의 분포 상황과 일치하며, α7 nAChR밀집 구역의 섭취치는 [¹⁸F]ASEM에 비해 일정한 우세를 가지고, [¹⁸F]ASEM은 투여 후 5분 시 흡수 최고치에 달하고, 피질, 선조체 및 해마구의 섭취치는 각각 7.2％ID/g, 6.0％ID/g 및 5.0％ID/g이다. 전체 실험 과정에서, 조직/소뇌 비율은 점차 증가되고, 약물 투여 90분에 2.5(피질), 2.9(선조체) 및 3.6(해마)(표 13)에 도달하며, 해당 방사성 리간드는 비교적 높은 뇌섭취를 가질뿐만 아니라 양호한 뇌 구역 선택성을 가지는 것을 보여준다.

[표 12] 화합물[¹⁸F]II-15이 암컷 쿤밍종 마우스(28-32g) 뇌 내에서의 분포 상황

[표 13] [¹⁸F]II-15이 마우스 뇌 내 각 조직에서 다른 시점에서의 조직/소뇌 비율

실시예19: [¹⁸F]II-15의 마우스 뇌 내의 선택성 실험

α4β2 nAChR에 대한 방사성 리간드의 선택성은 사전 5분 전에 피하 주사 방식으로 1mg/kg의 cytisine(제니스테인)(0.1mL, 동일 체적의 생리 식염수 및 1,2- 프로판 디올을 용매로 함)을 투여하여 연구하고, 세로토닌 수용체에 대한 선택성은 사전 10분 전에 피하 주사 방식으로 2mg/kg의 ondanstron(온단세트론)(0.1mL, 생리 식염수: DMSO=5: 1(V: V)을 용매로 함)을 투여하여 진행한다. 실험 중에서, 두군의 마우스(n=5, 쿤밍종 마우스 암컷 , 28-30g)는 꼬리 정맥 주사의 방식으로 [¹⁸F]II-150.1mL(60μCi)를 투여하고, 공백 대조군의 마우스는 동일한 방식으로 0.1mL에 대응되는 용매를 투여한다. 약물 투여 60분 후, 마우스를 목을 끊어 죽이고, 신속히 그 대뇌를 꺼내 얼음에 놓고, 찬 생리 식염수로 핏자국을 제거한 후 구역을 나눠서 피질, 선조체, 해마, 상하구, 시상, 소뇌 및 잔여 뇌를 해부해 내고 각 구역의 질량 및 방사성 카운트를 측정하고 최종 섭취 상황을 ％ID/g로 표시한다.

Cytisine는 α4β2 nAChR의 선택성 작용제이고, Ondanstron는 세로토닌 수용체의 선택성 길항제이다. 도 7로부터 알 수 있다시피, 방사성 리간드[¹⁸F]II-15는 실험군 및 대조군에서 섭취가 현저한 차이가 없다. 이는 [¹⁸F]II-15은 α4β2 nAChR 및 세로토닌 수용체와 거의 결합하지 않고, 해당 방사성 리간드는 α7 nAChR에 대해 양호한 선택성을 가지는 것을 나타낸다.

실시예20: [¹⁸F]II-15의 랫PET현상

꼬리 정맥 주사의 방식으로 방사성 리간드[¹⁸F]II-15(0.3mL, 200μCi)을 암컷 CD-1랫(180-200g) 체내에 주입한 후 3％의 이소플루란으로 마우스를 마취하여 혼절시킨 후, 엎드린 자세로 마우스를 작은 동물 micro-PET/CT현상기기(SupeRArgus PET 4RL/CT 180)에 고정시키고, 스캔 현상 과정에서 1％의 이소플루란을 유지하여 마우스가 마취 상태에 처하게 한다. 각각 약물 투여 15분, 30분 및 60분 후 화상 수집을 진행하여 [¹⁸F]II-15가 마우스 뇌 내의 분포 상황을 관찰한다.

도 8은 각각 암컷 CD-1랫에게 [¹⁸F]II-15를 주사하고 15분, 30분 및 60분 후 후뇌부의 관상, 시상, 축상 micro-PET현상도이다. 도 8로부터 알 수 있다시피, [¹⁸F]II-15는 마우스 뇌 내에서 비교적 높은 섭취를 가지고, 뇌 내의 분포 상황은 기본적으로 동물 체내 분포실험 결과와 일치하며, 15min시 섭취가 제일 높고, 시간의 연장에 따라, 방사성 리간드의 농도가 점차 감소되는 동시에, 뇌 내에서의 체류가 적절하며, 약물 60분 후에 여전의 일정한 농도의 농축을 관찰할 수 있다. 상술한 우수한 현상 결과에 따라, [¹⁸F]II-15은 α7 nAChRPET 현상제로써 적합하다.

이상의 내용은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과하면 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 취지 및 원칙 내에서 실시하는 임의의 수정, 동등한 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호 범위 내에 포함되어야 한다.

Claims

하기의 일반식을 가지고,

여기서, (1) X는
이고,
(2) R₂는 수소이고, R₃는 할로겐 또는 아미노기이거나; 또는 R₃는 수소이고, R₂는 할로겐 또는 아미노기인 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물.
제1항에 있어서,
상기 할로겐은 방사성 표기를 하거나 또는 방사성 표기를 하지 않는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물.
제2항에 있어서,
상기 할로겐은 F 또는 ¹⁸F인 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물.
제3항에 있어서,
구조식이
인 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리간드 화합물은 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 작용제로 사용되는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리간드 화합물은 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 일부 작용제로 사용되는 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물.
인지 장애 예방 또는 치료용 리간드 화합물에 있어서,
상기 리간드 화합물은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물인 것을 특징으로 하는 인지 장애 예방 또는 치료용 리간드 화합물.
제4항에 기재된 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물을 이용하는 것을 특징으로 하는 PET(Positron Emission Computed Tomography) 현상제.
치료 상 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 α7니코틴성 아세틸콜린 수용체의 리간드 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 인지 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약물 조성물.
제9항에 있어서,
상기 인지 장애는 조기 발병 치매, 조발성 알츠하이머병, 노인성치매, 알츠하이머형 치매, 루이소체치매, 미니 경색 치매, AIDS관련 치매, HIV 치매, 루이체치매, 다운 증후군 관련 치매, 피크병, 초기 인지 능력 장애, 연령과 관련된 기억장애, 최근 단기 기억장애, 연령 관련 인지 장애, 약물에 관련된 인지 장애, 면역 결핍증에 관련된 인지 장애, 혈관 질병에 관련된 인지 기능 장애, 정신 분열증, 주의력 결핍장애, 주의력 결핍 과잉 활동 장애 및 학습 결핍 장애에서 선택되는 인지 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약물 조성물.