KR102331663B1 - 항-pdl1 항체 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-PDL1 항체를 포함하는 안정한 수성 제약 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 제제를 제조하는 방법 및 이러한 제제를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-PDL1 항체 제제 {ANTI-PDL1 ANTIBODY FORMULATIONS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 9월 27일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/883,953의 우선권 이익을 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일의 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일의 하기 제출 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF)의 서열 목록 (파일명: 146392022040SEQLIST.TXT, 기록된 날짜: 2014년 9월 26일, 크기: 24 KB).
발명의 분야
본 발명은 항-PDL1 항체를 포함하는 안정한 수성 제약 제제에 관한 것이다.
T-세포에 2개의 별개의 신호를 제공하는 것은 항원-제시 세포 (APC)에 의한 휴지 T 림프구의 림프구 활성화에 널리 허용되는 모델이다. 문헌 [Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. ScL 53: 27-42 (1975)]. 이 모델은 추가로 비-자기 면역 관용으로부터 자기 면역 관용의 구별을 제공한다. 문헌 [Bretscher et al., Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)]. 1차 신호 또는 항원 특이적 신호는 주요 조직적합성-복합체 (MHC)와 관련하여 제시된 외래 항원 펩티드의 인식 후에 T-세포 수용체 (TCR)를 통해 전달된다. 2차 또는 공동-자극 신호는 항원-제시 세포 (APC) 상에서 발현된 공동-자극 분자에 의해 T-세포로 전달되고, T-세포가 클론 확장, 시토카인 분비 및 이펙터 기능을 촉진하도록 유도한다. 문헌 [Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996)]. 공동-자극의 부재 하에, T-세포는 항원 자극에 대해 불응성이 될 수 있고, 효과적인 면역 반응을 탑재하지 않을 수 있으며, 추가로 외래 항원에 대해 소진되거나 관용이 생길 수 있다.
2-신호 모델에서 T-세포는 양성 및 음성 2차 공동-자극 신호를 둘 다 받는다. 이러한 양성 및 음성 신호의 조절은 면역 관용을 유지하고 자가면역을 방지하면서 숙주의 보호성 면역 반응을 최대화하는데 중요하다. 음성 2차 신호는 T-세포 관용을 유도하는데 필요한 것으로 보이는 반면에, 양성 신호는 T-세포 활성화를 촉진한다. 간단한 2-신호 모델이 나이브 림프구에 대해서는 여전히 유효한 설명을 제공하지만, 숙주의 면역 반응은 동적 과정이고, 공동-자극 신호는 또한 항원-노출된 T-세포에도 제공될 수 있다. 공동-자극 신호의 조작이 세포-기반 면역 반응을 증진시키거나 종결시키는 수단을 제공하는 것으로 나타났기 때문에, 공동-자극의 메카니즘이 치료 관심사이다. 최근에, T 세포 기능장애 또는 무반응은 억제 수용체인 프로그램화된 사멸 1 폴리펩티드 (PD-1)의 유도된 발현 및 지속된 발현과 공동으로 일어나는 것으로 발견되었다. 그 결과, PD-1의 치료 표적화 및 PD-1과의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 다른 분자, 예컨대 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1) 및 프로그램화된 사멸 리간드 2 (PD-L2)가 강력한 관심 영역이다.
PD-L1은 많은 암에서 과다발현되며, 종종 불량한 예후와 연관된다 (Okazaki T et al., Intern. Immun. 2007 19(7):813) (Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). 흥미롭게도, 대다수의 종양 침윤 T 림프구는 정상 조직 내의 T 림프구 및 말초 혈액 T 림프구와 달리 PD-1을 우세하게 발현하며, 이는 종양-반응성 T 세포 상에서의 PD-1의 상향-조절이 손상된 항종양 면역 반응에 대한 원인이 될 수 있다는 것을 나타낸다 (Blood 2009 114(8):1537). 이것은 T 세포 활성화의 감쇠 및 면역 감시의 회피를 유발하도록 PD-1 발현 T 세포와 상호작용하는 PD-L1 발현 종양 세포에 의해 매개되는 PD-L1 신호전달의 이용으로 인한 것일 수 있다 (Sharpe et al., Nat Rev 2002) (Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26:677). 따라서, PD-L1/PD-1 상호작용의 억제는 종양의 CD8+ T 세포-매개 사멸을 증진시킬 수 있다.
PD-1의 치료 표적화 및 PD-1과의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 다른 분자, 예컨대 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1) 및 프로그램화된 사멸 리간드 2 (PD-L2)는 강력한 관심 영역이다. PD-L1 신호전달의 억제는 암 (예를 들어, 종양 면역), 및 급성 및 만성 (예를 들어 지속성) 감염 둘 다를 비롯한 감염을 치료하기 위해 T 세포 면역을 증진시키기 위한 수단으로서 제안되었다. 그러나, 이 경로에서 표적에 대해 지시된 최적의 요법이 아직 상업화되지 않았기 때문에, 유의한 미충족 의료 필요가 존재한다.
본원에 인용된 특허 출원, 특허 공개 및 유니프롯케이비(UniProtKB)/스위스-프롯(Swiss-Prot) 등록 번호를 비롯한 모든 참고문헌은, 각각의 개별 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지는 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
항체를 포함하는 안정한 수성 제약 제제가 본원에 제공된다. 제제는 항체 (예를 들어, 항-PDL1 항체), 완충제, 수크로스 및 계면활성제를 포함하며, 여기서 제제의 pH는 약 5.0 내지 약 7.0이다.
한 측면에서, 약 40 mg/ml 내지 약 125 mg/ml의 농도의 항-PDL1 모노클로날 항체, 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, 약 60 mM 내지 약 240 mM의 농도의 수크로스, 약 0.005% (w/v) 내지 약 0.06% (w/v)의 농도의 폴리소르베이트를 포함하며, pH가 약 5.0 내지 약 6.3인 안정한 수성 제약 제제가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 제제 중 모노클로날 항체는 약 40 mg/ml 내지 약 80 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 모노클로날 항체는 약 54 mg/ml 내지 약 66 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 모노클로날 항체는 약 60 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 모노클로날 항체는 약 60 mg/ml 내지 약 125 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 모노클로날 항체는 약 125 mg/ml이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 상기 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨은 약 17 mM 내지 약 22 mM의 농도이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨은 약 20 mM의 농도이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 상기 수크로스는 약 60 mM 내지 약 180 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 수크로스는 약 120 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 수크로스는 약 240 mM이다.
일부 실시양태에서, 제제의 pH는 약 5.5 내지 약 6.1이다. 일부 실시양태에서, 제제의 pH는 약 5.5 또는 약 5.8이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 약 0.02% 내지 약 0.04%이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 약 60 mg/ml이고, 제제 중 수크로스는 약 120 mM이고, pH는 약 5.8이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 약 125 mg/ml이고, 제제 중 수크로스는 약 240 mM이고, pH는 약 5.5이다.
일부 실시양태에서, 제제는 약 60 mg/mL의 양의 모노클로날 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 항-PDL1 항체), 약 20 mM의 농도의 히스티딘 아세테이트, 약 120 mM의 농도의 수크로스, 및 0.04% (w/v)의 농도의 폴리소르베이트 20인 폴리소르베이트를 포함하며, 제제의 pH는 약 5.8이다.
일부 실시양태에서, 제제는 약 125 mg/mL의 양의 모노클로날 항체, 약 20 mM의 농도의 히스티딘 아세테이트, 약 240 mM의 농도의 수크로스, 및 0.02%의 농도의 폴리소르베이트 20인 폴리소르베이트를 포함하며, 제제의 pH는 약 5.5이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 사전 동결건조에 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 항원-결합 영역을 포함하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2 단편이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는
(a) (1) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 1)를 포함하는 HVR-L1;
(2) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 2)를 포함하는 HVR-L2;
(3) 아미노산 서열 QQYLYHPAT (서열 3)를 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(b) (1) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH (서열 4)를 포함하는 HVR-H1;
(2) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 5)를 포함하는 HVR-H2;
(3) 아미노산 서열 RHWPGGFDY (서열 6)를 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 상기 모노클로날 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 포함하는 제제는 유리 바이알 또는 금속 합금 용기에 저장된다. 일부 실시양태에서, 금속 합금은 316L 스테인레스 스틸 또는 하스텔로이이다. 일부 실시양태에서, 제제는 2-8℃에서 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월 또는 적어도 24개월 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체는, 저장 후에, 저장 전의 생물학적 활성의 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%를 보유한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 활성은 PD-L1에 대한 항체 결합에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 멸균된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 대상체에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 정맥내 (IV) 투여를 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 상기 및 본원에 기재된 안정한 수성 제약 제제 중 임의의 제제를 수용하는 용기를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 용기는 유리 바이알 또는 금속 합금 용기이다. 일부 실시양태에서, 금속 합금은 316L 스테인레스 스틸 또는 하스텔로이이다.
또 다른 측면에서, 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 질환 또는 장애의 치료 방법이며, 여기서 질환 또는 장애는 감염, 암 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 다양한 실시양태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 실시양태는 하기 상세한 설명에 추가로 기재된다.
도 1은 JMP 소프트웨어를 사용하여 ICIEF에 의한 40℃에서의 α-PDL1 제제의 안정성 데이터의 통계적 분석을 보여주는 일련의 그래프이다. a) 부분 요인 실험 설계 (DOE)로부터의 평균 주요 피크 손실률. b) 부분 요인 DOE로부터의 주요 피크 분석. 주요 피크는 분자의 pI (등전점)와 동일한 pH를 갖는 α-PDL1 하전된 종을 함유한다.
도 2는 JMP 소프트웨어를 사용하여 ICIEF에 의한 25℃에서의 α-PDL1 제제의 안정성 데이터의 통계적 분석을 보여주는 일련의 그래프이다. a) 부분 요인 실험 설계 (DOE)로부터의 평균 주요 피크 손실률. b) 부분 요인 DOE로부터의 주요 피크 분석. 주요 피크는 분자의 pI (등전점)와 동일한 pH를 갖는 α-PDL1 하전된 종을 함유한다.
도 3은 JMP 소프트웨어를 사용하여 SE-HPLC에 의한 40℃에서의 α-PDL1 제제의 안정성 데이터의 통계적 분석을 보여주는 일련의 그래프이다. a) 부분 요인 실험 설계 (DOE)로부터의 평균 주요 피크 손실률. b) 부분 요인 DOE로부터의 주요 피크 분석. 주요 피크는 α-PDL1 단량체를 함유한다.
도 4는 JMP 소프트웨어를 사용하여 SE-HPLC에 의한 25℃에서의 α-PDL1 제제의 안정성 데이터의 통계적 분석을 보여주는 일련의 그래프이다. a) 부분 요인 실험 설계 (DOE)로부터의 평균 주요 피크 손실률. b) 부분 요인 DOE로부터의 주요 피크 분석. 주요 피크는 α-PDL1 단량체를 함유한다.
도 5는 다양한 온도 및 시간에서 저장된 다양한 α-PDL1 제제의 유의한 PS20 분해의 결여를 보여주는 그래프이다. F1 내지 F10 제제에서 증발 광 산란 검출기 (ELSD)에 의해 검출 시에 제제에 남아있는 퍼센트 (%) PS20의 그래프. a는 제0 시점 (T0)이고; b는 40℃, 1M이고; c는 25℃, 2M이고; d는 5℃, 2M이고; e는 5℃, 6M이고; f는 5℃, 6M, 20cc 유리 바이알 (GV), 고 충전이고; g은 5℃, 6M, 20cc 유리 바이알 (GV), 저 충전이다.
도 6은 유리 바이알 (GV)에서 6개월 이하 동안 -20℃ 또는 5℃에서 저장된 α-PDL1 제제의 안정성을 보여주는 일련의 그래프이다. a) 나타낸 시간 동안 -20℃에서의 저장 동안 5회 동결 해동 주기 후에 제제 중 퍼센트 (%) 단량체의 그래프. b) 나타낸 시간 동안 5℃에서 저장된 제제 중 퍼센트 (%) 단량체의 그래프. c) 나타낸 시간 동안 -20℃에서의 저장 동안 5회 동결 해동 주기 후에 제제로부터 수득한 퍼센트 (%) 주요 피크의 그래프. d) 나타낸 시간 동안 5℃에서 저장된 제제로부터 수득한 퍼센트 (%) 주요 피크의 그래프.
도 7은 3회 동결 해동 주기 및 스테인레스 스틸 또는 하스텔로이 미니캔에의 저장 후에 α-PDL1 제제의 안정성을 보여주는 일련의 그래프이다. a) 3개월 동안 나타낸 온도에서의 저장 후에 제제 중 퍼센트 (%) 단량체의 그래프. b) 3개월 동안 나타낸 온도에서의 저장 후에 제제 중 퍼센트 (%) 주요 피크의 그래프.
도 8은 20cc 바이알 내 α-PDL1 제제 저장의 안정성을 보여주는 일련의 그래프이다. a) 3개월 동안 나타낸 온도에서의 저장 후에 제제 중 퍼센트 (%) 단량체의 그래프. b) 3개월 동안 나타낸 온도에서의 저장 후에 제제 중 퍼센트 (%) 주요 피크의 그래프.
도 9는 유리 바이알에서 교반될 때 다양한 농도의 PS20을 함유하는 α-PDL1 제제의 안정성을 보여주는 일련의 그래프이다. a) 실온에서 나타낸 시간 동안 교반 후에 제제 중 퍼센트 (%) 단량체의 그래프. b) 실온에서 나타낸 시간 동안 교반 후에 350nm에서의 흡광도에 의해 측정한 탁도의 그래프.
도 10은 나타낸 온도에서 일정 기간 동안 유리 바이알에 저장된 다음에 교반에 적용된 α-PDL1 제제의 안정성을 보여주는 그래프이다. 제제 중 퍼센트 단량체 변화는 SEC에 의해 측정하였다.
도 11은 pH 증가 하에 주당 α-PDL1 손실률의 비교를 보여주는 일련의 그래프이다. a) 40℃에서의 저장 후에 제제 중 주당 퍼센트 (%) 단량체 손실의 그래프. b) 40℃에서의 저장 후에 제제 중 주당 퍼센트 (%) 주요 피크 손실의 그래프.
I. 정의
본 발명을 상세히 기재하기에 앞서, 본 발명이 특정한 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되는 것이 아니며, 물론 달라질 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어가 단지 특정한 실시양태를 기재하려는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 의도를 갖지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 내용상 달리 명백히 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "분자"에 대한 언급은 임의로 2개 이상의 이러한 분자의 조합 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시양태를 포함 (및 기재)한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하는 것", 이들로 "이루어진 것" 및 이들로 "본질적으로 이루어진 것"을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "제약 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며 제제를 투여할 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 멸균된다. "제약상 허용되는" 부형제 (비히클, 첨가제)는 사용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 대상 포유동물에게 합리적으로 투여될 수 있는 것이다.
"멸균" 제제는 무균성이거나, 또는 모든 살아있는 미생물 및 그의 포자가 없거나 실질적으로 없다.
"동결된" 제제는 0℃ 미만의 온도에 있는 것이다. 일반적으로, 동결된 제제는 동결-건조되지 않거나, 또는 사전 동결건조 또는 후속 동결건조에 적용되지 않는다. 특정 실시양태에서, 동결된 제제는 (스테인레스 스틸 탱크에서) 저장을 위한 동결된 약물 물질, 또는 동결된 약물 제품 (최종 바이알 형태)을 포함한다.
"안정한" 제제는 저장 시에 내부의 단백질이 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 보유하는 것이다. 바람직하게는, 제제는 저장 시에 그의 물리적 및 화학적 안정성, 뿐만 아니라 그의 생물학적 활성을 본질적으로 보유한다. 저장 기간은 일반적으로 제제의 의도되는 보관-수명을 기반으로 하여 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 관련 기술분야에서 이용가능하고, 예를 들어 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에 검토되어 있다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 안정성은 응집체 형성의 평가 (예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 탁도 측정에 의해 및/또는 육안 검사에 의해); 양이온 교환 크로마토그래피, 영상 모세관 등전 포커싱 (icIEF) 또는 모세관 구역 전기영동을 사용하는 전하 이종성 평가; 아미노-말단 또는 카르복시-말단 서열 분석; 질량 분광측정 분석; 환원된 항체와 무손상 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 맵 (예를 들어, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능 평가 등을 비롯한 다양한 상이한 방식으로 정량적으로 및/또는 정성적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 응집, 탈아미드화 (예를 들어, Asn 탈아미드화), 산화 (예를 들어, Met 산화), 이성질체화 (예를 들어, Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화 (예를 들어, 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 비-쌍형성 시스테인(들), N-말단 확장, C-말단 처리, 글리코실화 차이 등 중 임의의 하나 이상을 수반할 수 있다.
단백질은, 색상 및/또는 투명도의 육안 검사 시에, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 측정 시에 응집, 침전 및/또는 변성의 징후가 없거나 거의 없는 경우에 제약 제제에서 "그의 물리적 안정성을 보유한다".
단백질은, 주어진 시간에서의 화학적 안정성에 의해 단백질이 하기 정의된 바와 같은 그의 생물학적 활성을 계속 보유하는 것으로 간주되도록 하는 경우에 제약 제제에서 "그의 화학적 안정성을 보유한다". 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출 및 정량화함으로써 평가될 수 있다. 화학적 변경은, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화/비행 시간형 질량 분광측정법 (MALDI/TOF MS)을 사용하여 평가될 수 있는 크기 변형 (예를 들어, 클리핑)을 수반할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변경은, 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피 또는 icIEF에 의해 평가될 수 있는 전하 변경 (예를 들어, 탈아미드화의 결과로서 발생함)을 포함한다.
항체는, 주어진 시간에서의 항체의 생물학적 활성이 검정 (예를 들어, 항원 결합 검정)에서 결정 시에 제약 제제를 제조한 시간에 나타난 생물학적 활성의 적어도 약 60% (검정의 오차 내)인 경우에 제약 제제에서 "그의 생물학적 활성을 보유한다". 항체에 대한 다른 "생물학적 활성" 검정은 하기 본원에 상세히 설명된다.
본원에 사용된 모노클로날 항체의 "생물학적 활성"은 항원에 결합하여 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있는 측정가능한 생물학적 반응을 생성하는 항체의 능력을 포함한다.
본원에서 "탈아미드화" 모노클로날 항체는 그의 1개 이상의 아스파라긴 잔기가, 예를 들어 아스파르트산 또는 이소-아스파르트산으로 유도체화된 것이다.
본원에서 "산화된" 모노클로날 항체는 그의 1개 이상의 트립토판 잔기 및/또는 1개 이상의 메티오닌이 산화된 것이다.
본원에서 "당화" 모노클로날 항체는 그의 1개 이상의 리신 잔기가 당화된 것이다.
"탈아미드화되기 쉬운" 항체는 탈아미드화되려는 경향이 있는 것으로 밝혀진 1개 이상의 잔기를 포함하는 것이다.
"산화되기 쉬운" 항체는 산화되려는 경향이 있는 것으로 밝혀진 1개 이상의 잔기를 포함하는 것이다.
"응집되기 쉬운" 항체는, 특히 동결 및/또는 교반 시에 다른 항체 분자(들)와 응집되는 것으로 밝혀진 것이다.
"단편화되기 쉬운" 항체는, 예를 들어 그의 힌지 영역에서 2개 이상의 단편으로 절단되는 것으로 밝혀진 것이다.
"탈아미드화, 산화, 응집 또는 단편화를 감소시키는 것"은 상이한 제제로 제제화된 모노클로날 항체에 비해 탈아미드화, 산화, 응집 또는 단편화를 방지하거나 그의 양을 감소시키는 것으로 의도된다.
제제화된 항체는 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (즉, 오염 단백질 등이 없음). "본질적으로 순수한" 항체는 조성물 중 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 90 중량%, 바람직하게는 적어도 약 95 중량%의 항체를 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 항체는 조성물 중 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 99 중량%의 항체를 포함하는 조성물을 의미한다.
"등장성"은 관심 제제가 본질적으로 인간 혈액과 동일한 삼투압을 갖는 것을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 갖는다. 등장성은, 예를 들어 증기압 또는 빙결 유형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 "완충제"는 그의 짝산-짝염기 성분의 작용에 의한 pH의 변화에 영향을 받지 않는 완충 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충제는, 바람직하게는 약 4.5 내지 약 7.0, 바람직하게는 약 5.6 내지 약 7.0, 예를 들어 5.6 내지 6.9, 5.7 내지 6.8, 5.8 내지 6.7, 5.9 내지 6.6, 5.9 내지 6.5, 6.0, 6.0 내지 6.4, 또는 6.1 내지 6.3 범위의 pH를 갖는다. 한 실시양태에서, 완충제는 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0의 pH를 갖는다. 예를 들어, 인산나트륨은 이 범위의 pH를 제어할 완충제의 예이다.
본원에 사용된 "계면활성제"는 표면-활성 작용제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 본원에서 계면활성제의 예는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 트리톤(Triton); 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일- 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿼트(MONAQUAT)™ 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.(Mona Industries, Inc.), 뉴저지주 패터슨); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어 플루로닉스(Pluronics), PF68 등) 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다.
약리학적 관점에서, 본 발명의 문맥상, 항체의 "치료 유효량"은 치료를 위해 항체가 효과적인 장애의 예방 또는 치료에 효과적인 양을 지칭한다. "장애"는 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻게 될 임의의 상태이다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태 포함)을 포함한다.
"보존제"는, 예를 들어 내부 박테리아 작용을 본질적으로 감소시켜 다용도 제제의 생산을 용이하게 하기 위해 제제에 임의로 포함될 수 있는 화합물이다. 잠재적 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알코올, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 보존제는 벤질 알콜이다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 임상 병리상태의 과정 동안 치료할 개체 또는 세포의 자연 과정을 변경하도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 경감 또는 개선된 예후를 포함한다. 예를 들어, 개체는 암성 세포의 증식의 감소 (또는 파괴), 질환으로부터 발생하는 증상의 감소, 질환을 앓고 있는 개체의 삶의 질의 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 의약의 용량의 감소, 질환 진행의 지연 및/또는 개체의 생존 연장을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암과 연관된 하나 이상의 증상이 완화되거나 제거되는 경우에 성공적으로 "치료된다".
본원에 사용된 "질환 진행의 지연"은 질환 (예컨대 암)의 발생을 미루고/거나, 방해하고/거나, 늦추고/거나, 지체시키고/거나, 안정화시키고/거나, 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은 치료할 질환 및/또는 개체의 병력에 따라 다양한 기간일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의한 지연은 사실상 개체에서 질환이 발생하지 않는 방지를 포괄할 수 있다. 예를 들어, 후기 단계 암, 예컨대 전이의 발생이 지연될 수 있다.
"유효량"은 적어도 특정한 장애의 측정가능한 개선 또는 방지를 일으키는데 요구되는 최소량이다. 본원에서 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 도출하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료상 유익한 효과가 치료의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 것이다. 예방적 용도의 경우에, 유익한 또는 목적하는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 그의 합병증 및 질환의 발생 동안 제시되는 중간 병리학적 표현형을 비롯한 질환의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 상기 질환의 중증도를 경감시키거나, 또는 상기 질환의 발병을 지연시키는 것과 같은 결과를 포함한다. 치료적 용도의 경우에, 유익한 또는 목적하는 결과는 질환으로부터 발생하는 하나 이상의 증상을 감소시키고/거나, 질환을 앓고 있는 개체의 삶의 질을 증가시키고/거나, 질환을 치료하는데 요구되는 다른 의약의 용량을 감소시키고/거나, 표적화를 통해서와 같이 또 다른 의약의 효과를 증진시키고/거나, 질환의 진행을 지연시키고/거나, 생존을 연장시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 암 또는 종양의 경우에, 유효량의 약물은 암 세포의 수를 감소시키고/거나; 종양 크기를 감소시키고/거나; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 늦추거나 바람직하게는 정지시키는 것); 종양 전이를 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 늦추거나 바람직하게는 정지시키는 것); 종양 성장을 어느 정도 억제하고/거나; 장애와 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효량은 직접 또는 간접적으로 예방적 또는 치유적 치료를 달성하는데 충분한 양이다. 임상 환경에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 1종 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 "유효량"이 고려될 수 있고, 1종 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우에 단일 작용제가 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 "와 함께"는 한 치료 양식뿐만 아니라 또 다른 치료 양식의 투여를 지칭한다. 이에 따라, "와 함께"는 한 치료 양식을, 개체에게 다른 치료 양식을 투여하기 전에, 그 동안 또는 그 후에 투여하는 것을 지칭한다.
"장애"는 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 치료로부터 이익을 얻게 될 임의의 상태이다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상 세포 증식과 연관된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 종양이다.
본원에 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성이든 양성이든) 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 지칭될 때 상호 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암 (예를 들어, 상피 편평 세포암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종을 비롯한 폐암, 복막암, 간세포성암, 위장암 및 위장 기질 암을 비롯한 위암 또는 위의 암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 표재 확산성 흑색종, 악성 흑자 흑색증, 말단 흑자 흑색종, 결절성 흑색종, 다발성 골수종 및 B-세포 림프종 (저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 비분할 소세포 NHL; 거대 종양 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수모구성 백혈병; 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), 뿐만 아니라 모반증과 연관된 비정상적 혈관 증식, 부종 (예컨대 뇌 종양과 연관된 것), 메이그스 증후군, 뇌암과 두경부암, 및 연관된 전이를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의한 치료가 잘 듣는 암은 유방암, 결장직장암, 직장암, 비소세포 폐암, 교모세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 신세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 다음으로부터 선택된다: 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 결장직장암 (CRC) 및 간세포성 암종. 또한, 일부 실시양태에서, 암은 다음으로부터 선택된다: 비소세포 폐암, 결장직장암, 교모세포종 및 유방 암종, 및 이들 암의 전이성 형태.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가Il (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 경구 알파-4 인테그린 억제제인 CDP323; 디네미신 A를 비롯한 디네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실(DOXIL)®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (미오세트(MYOCET)®), PEG화 리포솜 독소루비신 (케릭스(CAELYX)®), 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (유프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 콤브레타스타틴; 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레건주 유진); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®, 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®, 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®) 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®) 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®)을 비롯한, 튜불린 중합에 의한 미세관 형성을 방지하는 빈카; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 벡사로텐 (탈그레틴(TARGRETIN)®)을 비롯한, 레티노산과 같은 레티노이드; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®) 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R) (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)™)); 및 세포 증식을 감소시키는 VEGF-A; 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트(SUTENT)®, 화이자(Pfizer)); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어 PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제; 티로신 키나제 억제제; 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)™); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어); 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료 요법에 대한 약어), 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 호르몬 자체일 수 있으며, 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜을 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON).cndot.토레미펜을 비롯한, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM); 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소인 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어 PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 (미국 특허 번호 4,675,187 참조), 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합.
"성장 억제제"는 본원에 사용되는 경우에, 세포의 성장을 시험관내 또는 생체내 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 성장 억제제는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방지 또는 감소시키는 성장 억제 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 성장 억제제는 S 기에서 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 (S 기 이외의 다른 곳에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 전형적 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 상기 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 또한 S기 정지에도 작용한다. 추가의 정보는 문헌 [Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), e.g., p. 13]에서 찾을 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목으로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된 도세탁셀 (탁소테레®, 롱-프랑 로러)은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스큅)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관 조립을 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜 세포에서의 유사분열 억제를 유발한다.
"방사선 요법"은 정상적으로 기능하거나 세포를 파괴하는 능력이 완전히 제한되도록 세포에 대한 충분한 손상을 유도하기 위해 지정된 감마선 또는 베타선을 사용하는 것을 의미한다. 투여량 및 치료의 지속기간을 결정하기 위한 관련 기술분야에 공지된 수많은 방법이 있음을 이해할 것이다. 전형적인 치료는 1회 투여로 제공되며, 전형적인 투여량은 1일에 10 내지 200 유닛 (Gray) 범위이다.
치료 목적을 위한 "대상체" 또는 "개체"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 등을 비롯한, 표유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법으로 측정 시에 95 중량% 초과의 항체로, 및 일부 실시양태에서는 99 중량% 초과의 항체로; (2) 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하며, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 1종의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성한다고 여겨진다.
용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 함유하는 이뮤노글로불린의 다른 부분인 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 이뮤노글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에 있어서 광범위하게 상이하며, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역 (HVR)이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은, 주로 베타-시트 형상을 채택하여 3개의 HVR에 의해 연결되어 있는 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄에서의 HVR은 FR 영역에 의해 함께 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 수반되지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존성 세포 독성에의 항체의 참여를 나타낸다.
임의의 포유동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의"경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여, 카파 ("κ") 및 람다 ("λ")로 불리는 2종의 명백하게 다른 유형 중 1종으로 배정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 IgG "이소형" 또는 "하위부류"는 그의 불변 영역의 화학적 특징 및 항원 특징에 의해 정의된 이뮤노글로불린의 임의의 하위부류를 의미한다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 배정될 수 있다. 이뮤노글로불린의 5종의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있고, 일반적으로 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 하기 정의된 항체 단편이 아닌, 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원의 목적상 "네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 단편은 항원-결합 단편이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편으로 불리는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편이 생산되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-연결될 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 단단히 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-쇄 Fv (scFv) 종에서는, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결되어 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 구조와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있다. 이러한 형상에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 그에 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 강제되어 2개의 항원-결합 부위가 생성된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 예를 들어 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선택하는 것을 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선택 과정은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 고유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들어 표적에 대한 친화도 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 그의 생산 개선, 생체내에서의 그의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 모노클로날 항체인 것으로 이해되어야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는, 그의 특이성에 더하여, 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 점에서 유리하다.
수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)를 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원의 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는, 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들어 마카크 원숭이를 관심 항원으로 면역화시켜 생산된 항체로부터 유래된 것인 프리마티즈드(PRIMATIZED)® 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 임의의 제조 기술을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 분명히 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 비롯한 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다. 또한 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는, 항원 챌린지에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스에게 항원을 투여하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다.
"종-의존성 항체"는 제2 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 경우보다 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대해 더 강한 결합 친화도를 갖는 항체이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합하나" (예를 들어, 약 1x10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1x10-8 M 이하, 바람직하게는 약 1x10-9 M 이하의 결합 친화도 (Kd) 값을 가짐), 인간 항원에 대한 그의 결합 친화도보다 적어도 약 50배 또는 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1000배 더 약한, 제2 비인간 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화도를 갖는다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 바와 같은 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있으나, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 본원에 사용되는 경우에, 서열 내에서 초가변적이고/거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중 가장 높은 다양성을 나타내고, H3은 특히 항체에 대한 정밀한 특이성을 부여하는데 고유한 역할을 수행하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄의 부재 하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
다수의 HVR 설명이 사용되고 있으며 본원에 포괄된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 대신, 코티아는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기를 하기에 나타낸다.
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HVR은 하기와 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL 내 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH 내 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 이들 정의에 대해 카바트 등의 상기 문헌에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 카바트 등의 상기 문헌에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 그 내로의 삽입에 상응하게 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해 그 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬함으로써 결정될 수 있다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략적으로, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 카바트 등의 상기 문헌에 보고된 EU 인덱스). "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에 특이적으로 결합하다" 또는 "에 특이적인"은 생물학적 분자를 비롯한 이종 분자 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정하는, 표적과 항체 사이의 결합과 같은 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 표적 (에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 경우보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 기간 동안 상기 표적에 결합하는 항체이다. 한 실시양태에서, 비관련 표적에 항체가 결합하는 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의한 측정 시에 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.1 nM이다. 특정 실시양태에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 사이에 보존되는, 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만, 이를 필요로 하지는 않는다.
II. 항체 제제 및 제조
본 발명은 항체, 예컨대 항-PDL1 항체를 포함하는 안정한 수성 제제에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제제는 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체), 수크로스, 완충제 및 계면활성제를 포함하며, 여기서 제제의 pH는 약 5.0 내지 약 7.0이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 항-PDL1 항체)는 약 40 mg/ml 내지 약 125 mg/ml의 양이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 히스티딘 (예를 들어, 히스티딘 아세테이트) 또는 아세트산나트륨이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 완충제는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 수크로스는 약 60 mM 내지 약 240 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 계면활성제는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 폴리소르베이트는 약 0.005% (w/v) 내지 약 0.06% (w/v)의 농도이다. 일부 실시양태에서, 제제의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다. 일부 실시양태에서, 약 40 mg/ml 내지 약 125 mg/ml의 농도의 항-PDL1 모노클로날 항체, 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, 약 60 mM 내지 약 240 mM의 농도의 수크로스, 약 0.005% (w/v) 내지 약 0.06% (w/v)의 농도의 폴리소르베이트를 포함하며, pH가 약 5.0 내지 약 6.3인 안정한 수성 제약 제제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 125 mg/ml의 양의 항-PDL1 모노클로날 항체, 약 240 mM의 농도의 수크로스를 포함하며, pH가 약 5.5이다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 60 mg/ml의 양의 항-PDL1 모노클로날 항체, 약 120 mM의 농도의 수크로스를 포함하며, pH가 약 5.8이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 항체는 -20℃에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월, 적어도 2년, 적어도 3년 또는 적어도 4년 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체는 2-8℃에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월, 적어도 2년 또는 적어도 3약 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 저장 후 항체는 저장 전, 즉 제약 제제를 제조한 시점에 나타난 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 표적에 대한 결합 또는 치료 효력)의 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%를 보유한다.
특정 실시양태에서, 제제는 약 40℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28일 또는 그 초과의 기간 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 40℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과의 기간 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 25℃에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24개월 또는 그 초과의 기간 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 5℃에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24개월 또는 그 초과의 기간 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 -20℃에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48개월 또는 그 초과의 기간 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 제제는 5℃ 또는 -20℃에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48개월 또는 그 초과의 기간 동안 안정하다. 추가로, 제제는 바람직하게는 제제의 동결 (예를 들어, -20℃, -40℃ 또는 -70℃까지) 및 해동 후에, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5 주기의 동결 및 해동 후에 안정하다.
A. 항체 (예컨대 항-PDL1 항체)
일부 실시양태에서, 제제 중 항체는 중쇄 및/또는 경쇄 서열에 적어도 1개의 트립토판 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 트립토판은 항체의 CDR 영역, 프레임워크 영역 및/또는 불변 영역 내에 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 CDR 영역에 2개 또는 3개의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체는 항-PDL1 항체이다. 또한 PDL1, B7-H1, B7-4, CD274 및 B7-H로 공지된 PD-L1 (프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1)은 막횡단 단백질이고, PD-1과의 그의 상호작용은 T-세포 활성화 및 시토카인 생산을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PDL1 항체는 인간 PD-L1에 결합한다. 본원에 기재된 제제를 사용하여 제제화될 수 있는 항-PDL1 항체의 예는 PCT 특허 출원 WO 2010/077634 A1 및 US 8,217,149에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 항-PDL1 항체는 PD-L1과 PD-1 사이의 결합 및/또는 PD-L1과 B7-1 사이의 결합을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PDL1 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PDL1 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-PDL1 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PDL1 항체는 인간 항체이다.
WO 2010/077634 A1 및 US 8,217,149에 기재된 항-PDL1 항체는 본원에 기재된 제제 중에 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PDL1 항체는 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PDL1 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하며, 여기서
(a) HVR-H1 서열은 GFTFSX1SWIH (서열 11)이고;
(b) HVR-H2 서열은 AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (서열 12)이고;
(c) HVR-H3 서열은 RHWPGGFDY (서열 13)이고;
추가로 여기서 X1은 D 또는 G이고; X2는 S 또는 L이고; X3은 T 또는 S이다.
한 구체적 측면에서, X1은 D이고; X2는 S이고; X3은 T이다. 또 다른 측면에서, 폴리펩티드는 다음 화학식에 따라 HVR 사이에 병렬배치된 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). 또 다른 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 프레임워크 서열 중 적어도 1개는 하기와 같다:
HC-FR1은 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 14)이다.
HC-FR2는 WVRQAPGKGLEWV (서열 15)이다.
HC-FR3은 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 16)이다.
HC-FR4는 WGQGTLVTVSA (서열 17)이다.
추가 측면에서, 중쇄 폴리펩티드는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 가변 영역 경쇄와 추가로 조합되며, 여기서
(a) HVR-L1 서열은 RASQX4X5X6TX7X8A (서열 18)이고;
(b) HVR-L2 서열은 SASX9LX10S (서열 19)이고;
(c) HVR-L3 서열은 QQX11X12X13X14PX15T (서열 20)이고;
추가로 여기서 X4는 D 또는 V이고; X5는 V 또는 I이고; X6은 S 또는 N이고; X7은 A 또는 F이고; X8은 V 또는 L이고; X9는 F 또는 T이고; X10은 Y 또는 A이고; X11은 Y, G, F 또는 S이고; X12는 L, Y, F 또는 W이고; X13은 Y, N, A, T, G, F 또는 I이고; X14는 H, V, P, T 또는 I이고; X15는 A, W, R, P 또는 T이다.
추가 측면에서, X4는 D이고; X5는 V이고; X6은 S이고; X7은 A이고; X8은 V이고; X9는 F이고; X10은 Y이고; X11은 Y이고; X12는 L이고; X13은 Y이고; X14는 H이고; X15는 A이다. 추가 측면에서, 경쇄는 다음 화학식에 따라 HVR 사이에 병렬배치된 가변 영역 경쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 추가 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 프레임워크 서열은 VL 카파 I 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 프레임워크 서열 중 적어도 1개는 하기와 같다:
LC-FR1은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 21)이다.
LC-FR2는 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 22)이다.
LC-FR3은 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 23)이다.
LC-FR4는 FGQGTKVEIKR (서열 24)이다.
또 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
(a) 중쇄는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 여기서 추가로
(i) HVR-H1 서열은 GFTFSX1SWIH (서열 11)이고;
(ii) HVR-H2 서열은 AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (서열 12)이고;
(iii) HVR-H3 서열은 RHWPGGFDY (서열 13)이고;
(b) 경쇄는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고, 여기서 추가로
(i) HVR-L1 서열은 RASQX4X5X6TX7X8A (서열 18)이고;
(ii) HVR-L2 서열은 SASX9LX10S (서열 19)이고;
(iii) HVR-L3 서열은 QQX11X12X13X14PX15T (서열 20)이고
추가로 여기서 X1은 D 또는 G이고; X2는 S 또는 L이고; X3은 T 또는 S이고; X4는 D 또는 V이고; X5는 V 또는 I이고; X6은 S 또는 N이고; X7은 A 또는 F이고; X8은 V 또는 L이고; X9는 F 또는 T이고; X10은 Y 또는 A이고; X11은 Y, G, F 또는 S이고; X12는 L, Y, F 또는 W이고; X13은 Y, N, A, T, G, F 또는 I이고; X14는 H, V, P, T 또는 I이고; X15는 A, W, R, P 또는 T이다.
구체적 측면에서, X1은 D이고; X2는 S이고; X3은 T이다. 또 다른 측면에서, X4는 D이고; X5는 V이고; X6은 S이고; X7은 A이고; X8은 V이고; X9는 F이고; X10은 Y이고; X11은 Y이고; X12는 L이고; X13은 Y이고; X14는 H이고; X15는 A이다. 또 다른 측면에서, X1은 D이고; X2는 S이고; X3은 T이고; X4는 D이고; X5는 V이고; X6은 S이고; X7은 A이고; X8은 V이고; X9는 F이고; X10은 Y이고; X11은 Y이고; X12는 L이고; X13은 Y이고; X14는 H이고; X15는 A이다.
추가 측면에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함하고: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 추가 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 14)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV (서열 15)
HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 16)
HC-FR4 WGQGTLVTVSA (서열 17).
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카바트 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 21)
LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 22)
LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 23)
LC-FR4 FGQGTKVEIKR (서열 24).
추가의 구체적 측면에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 구체적 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가의 구체적 측면에서, 항체는 감소된 또는 최소 이펙터 기능을 갖는다. 추가의 구체적 측면에서, 최소 이펙터 기능은 "이펙터-무함유 Fc 돌연변이" 또는 비-글리코실화로부터 발생한다. 추가 실시양태에서, 이펙터-무함유 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서
(a) 중쇄는 GFTFSDSWIH (서열 25), AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 26) 및 RHWPGGFDY (서열 13) 각각에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 추가로 포함하거나, 또는
(b) 경쇄는 RASQDVSTAVA (서열 27), SASFLYS (서열 28) 및 QQYLYHPAT (서열 29) 각각에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 추가로 포함한다.
구체적 측면에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 측면에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함하고: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 다른 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 14)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV (서열 15)
HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 16)
HC-FR4 WGQGTLVTVSA (서열 17).
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카바트 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 21)
LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 22)
LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 23)
LC-FR4 FGQGTKVEIKR (서열 24).
추가의 구체적 측면에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 구체적 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가의 구체적 측면에서, 항체는 감소된 또는 최소 이펙터 기능을 갖는다. 추가의 구체적 측면에서, 최소 이펙터 기능은 "이펙터-무함유 Fc 돌연변이" 또는 비-글리코실화로부터 발생한다. 추가 실시양태에서, 이펙터-무함유 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
추가 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖거나:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA (서열 30), 또는
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 31).
구체적 측면에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 측면에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함하고: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 다른 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 14)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV (서열 15)
HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 16)
HC-FR4 WGQGTLVTVSA (서열 17).
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카바트 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 21)
LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 22)
LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 23)
LC-FR4 FGQGTKVEIKR (서열 24).
추가의 구체적 측면에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 구체적 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가의 구체적 측면에서, 항체는 감소된 또는 최소 이펙터 기능을 갖는다. 추가의 구체적 측면에서, 최소 이펙터 기능은 원핵 세포에서의 생산으로부터 발생한다. 추가의 구체적 측면에서, 최소 이펙터 기능은 "이펙터-무함유 Fc 돌연변이" 또는 비-글리코실화로부터 발생한다. 추가 실시양태에서, 이펙터-무함유 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 추가 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖거나:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 32), 또는
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 31).
구체적 측면에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 측면에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함하고: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 다른 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 14)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV (서열 15)
HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 16)
HC-FR4 WGQGTLVTVSS (서열 33).
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카바트 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 21)
LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 22)
LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 23)
LC-FR4 FGQGTKVEIKR (서열 24).
추가의 구체적 측면에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 구체적 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가의 구체적 측면에서, 항체는 감소된 또는 최소 이펙터 기능을 갖는다. 추가의 구체적 측면에서, 최소 이펙터 기능은 원핵 세포에서의 생산으로부터 발생한다. 추가의 구체적 측면에서, 최소 이펙터 기능은 "이펙터-무함유 Fc 돌연변이" 또는 비-글리코실화로부터 발생한다. 추가 실시양태에서, 이펙터-무함유 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
추가 측면에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함하고: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 추가 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열 34)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWVA (서열 35)
HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 16)
HC-FR4 WGQGTLVTVSS (서열 33).
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카바트 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 21)
LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 22)
LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 23)
LC-FR4 FGQGTKVEIK (서열 36).
추가의 구체적 측면에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 구체적 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가의 구체적 측면에서, 항체는 감소된 또는 최소 이펙터 기능을 갖는다. 추가의 구체적 측면에서, 최소 이펙터 기능은 "이펙터-무함유 Fc 돌연변이" 또는 비-글리코실화로부터 발생한다. 추가 실시양태에서, 이펙터-무함유 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서
(c) 중쇄는 GFTFSDSWIH (서열 4), AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 5) 및 RHWPGGFDY (서열 6) 각각에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 추가로 포함하거나, 또는
(d) 경쇄는 RASQDVSTAVA (서열 1), SASFLYS (서열 2) 및 QQYLYHPAT (서열 3) 각각에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 추가로 포함한다.
구체적 측면에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 측면에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함하고: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR 사이에 병렬배치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 다른 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 34)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV (서열 35)
HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 16)
HC-FR4 WGQGTLVTVSSASTK (서열 33).
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카바트 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 컨센서스 프레임워크이다. 추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기와 같다:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 21)
LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 22)
LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 23)
LC-FR4 FGQGTKVEIKR (서열 24)
추가의 구체적 측면에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 구체적 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 측면에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가의 구체적 측면에서, 항체는 감소된 또는 최소 이펙터 기능을 갖는다. 추가의 구체적 측면에서, 최소 이펙터 기능은 "이펙터-무함유 Fc 돌연변이" 또는 비-글리코실화로부터 발생한다. 추가 실시양태에서, 이펙터-무함유 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
추가 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖거나:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK (서열 8), 또는
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 7).
일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서 경쇄 가변 영역 서열은 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서 중쇄 가변 영역 서열은 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서 경쇄 가변 영역 서열은 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖고, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
추가 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖거나:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열 10), 또는
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 9).
일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서 경쇄 서열은 서열 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서 중쇄 서열은 서열 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공되며, 여기서 경쇄 서열은 서열 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖고, 중쇄 서열은 서열 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-PDL1 항체는 산화된 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 산화된 모노클로날 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 산화된 모노클로날 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 여기서 W33, W50 또는 W101 중 1개 이상은 산화된다. 일부 실시양태에서, 제제 중 산화된 모노클로날 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 여기서 M253 및 M429 중 1개 이상은 산화된다. 일부 실시양태에서, 산화된 모노클로날 항체는 저장 전, 즉 제약 제제를 제조한 시점에 나타난 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 표적에 대한 결합 또는 치료 효력)의 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%를 보유한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-PDL1 항체는 당화 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 당화 모노클로날 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 당화 모노클로날 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 여기서 리신 중 1개 이상은 당화된다. 일부 실시양태에서, 제제 중 당화 모노클로날 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 여기서 K65는 당화된다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-PDL1 항체는 비-글리코실화된다.
본원의 임의의 실시양태에서, 단리된 항-PDL1 항체는 인간 PD-L1, 예를 들어 유니프롯케이비/스위스-프롯 등록 번호 Q9NZQ7.1로 제시된 바와 같은 인간 PD-L1, 또는 그의 변이체에 결합할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 이전에 기재된 임의의 항-PDL1 항체를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 벡터를 추가로 포함한다. 추가의 구체적 측면에서, 벡터는 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포 내에 있다. 추가의 구체적 측면에서, 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이다. 추가의 구체적 측면에서, 진핵 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO)이다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 이전에 기재된 임의의 항-PDL1 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을, 상기 항체 또는 단편을 생산하는데 적합한 조건 하에서, 발현에 적합한 형태로 함유하는 숙주 세포를 배양하고, 항체 또는 단편을 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
B. 항체 제조
제제 중 항체는 항체의 생성을 위해 관련 기술분야에서 이용가능한 기술, 하기 섹션에 보다 상세히 기재되어 있는 예시적인 방법을 사용하여 제조된다.
항체는 관심 항원 (즉, PD-L1, 예컨대 인간 PD-L1)에 대해 지시된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 장애를 앓고 있는 포유동물에게 항체를 투여하는 것은 그 포유동물에서 치료 이익을 가져올 수 있다.
(i) 항원 제조
임의로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 그의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예컨대 수용체에 대해, 이들의 단편 (예를 들어 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
(ii) 특정 항체-기반 방법
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 이관능성 작용제 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서 R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어 단백질 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 다중 부위에 피내로 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후에 프로인트 완전 아주반트 중 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후에 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 바람직하게는, 상이한 단백질에 접합되었고/거나 상이한 가교 시약을 통해 접합되었으나 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반이 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.
본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재되고, 예를 들어 인간-인간 하이브리도마에 관하여 문헌 [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)]에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 인간 천연 IgM 항체의 생산에 관하여 미국 특허 번호 7,189,826에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
다양한 다른 하이브리도마 기술에 대해서는, 예를 들어 US 2006/258841; US 2006/183887 (완전 인간 항체), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; 및 미국 특허 번호 7,078,492 및 7,153,507을 참조한다. 하이브리도마 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 생산하는 예시적인 프로토콜은 하기와 같이 기재된다. 한 실시양태에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 도출하도록 면역화시킨다. 항체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편 및 아주반트, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (리비 이뮤노켐. 리서치, 인크.(Ribi Immunochem. Research, Inc.), 몬타나주 해밀턴)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성시킨다. 본 발명의 폴리펩티드 (예를 들어, 항원) 또는 그의 단편은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예컨대 재조합 방법 (이의 일부는 본원에 추가로 기재되어 있음)을 사용하여 제조할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 항-항원 항체에 대해 검정하고, 부스터 면역화를 임의로 투여한다. 항-항원 항체를 생산하는 동물로부터 림프구를 단리한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수 있다.
이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다. 예를 들어, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]을 참조한다. 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하며, 배지, 예컨대 HAT 배지에 감수성인 골수종 세포를 사용할 수 있다. 예시적인 골수종 세포는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) (미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재되었다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 적합한 배양 배지, 예를 들어 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다. 바람직하게는, 예를 들어 문헌 [Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)]에 기재된 바와 같이, 소 태아 혈청과 같은 동물-유래 혈청의 사용을 감소시키기 위해 혈청-무함유 하이브리도마 세포 배양 방법을 사용한다.
문헌 [Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)]에는 하이브리도마 세포 배양의 생산성을 개선하기 위한 도구로서의 올리고펩티드가 기재되어 있다. 구체적으로, 표준 배양 배지를 특정 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린) 또는 단백질 가수분해물 분획으로 풍부화시키면, 3 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고펩티드에 의해 아폽토시스가 유의하게 억제될 수 있다. 펩티드는 밀리몰 또는 더 높은 농도로 존재한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 본 발명의 항체에 결합하는 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정할 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]을 참조한다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Goding]을 참조한다. 이 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상의 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다. 하이브리도마 세포로부터 단백질의 단리를 위한 하나의 절차는 US 2005/176122 및 미국 특허 번호 6,919,436에 기재되어 있다. 방법은 결합 과정에서 최소 염, 예컨대 액방성 염을 사용하고, 바람직하게는 또한 용리 과정에서 소량의 유기 용매를 사용하는 것을 포함한다.
(iii) 특정 라이브러리 스크리닝 방법
본 발명의 항체는 조합 라이브러리를 사용하여 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 목적하는 결합 특징을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)]에 일반적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 관심 항체를 생성하는 하나의 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에 기재된 바와 같은 파지 항체 라이브러리의 사용을 통해서이다.
원칙적으로, 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 합성 항체 클론이 선택된다. 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 이러한 파지 라이브러리가 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론이 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리 내의 비결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론이 항원으로부터 용리되고, 항원 흡착/용리의 추가 주기에 의해 추가로 풍부화될 수 있다. 본 발명의 임의의 항체는 관심 파지 클론을 선택하기 위한 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계하고, 이어서 관심 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 구축함으로써 수득할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체의 항원-결합 도메인은 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성-결정 영역 (CDR)을 둘 다 제시하는 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 각각 1개인, 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역으로부터 형성된다. 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이, 가변 도메인은 VH 및 VL이 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유 연결된 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 VH 및 VL이 불변 도메인에 각각 융합되어 비공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에 사용된 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 통칭하여 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝하여 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합할 수 있고, 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론을 조사할 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 항원 및 또한 자기 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브 레퍼토리를 클로닝할 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다.
특정 실시양태에서, 소수 코트 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 사상 파지가 사용된다. 항체 단편은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이, 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 쇄 상에서 VH 및 VL 도메인이 연결된 단일쇄 Fv 단편으로서 디스플레이될 수 있거나, 또는 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이, 하나의 쇄는 pIII에 융합되고 다른 하나는 박테리아 숙주 세포 주변세포질로 분비되며 여기서 일부 야생형 코트 단백질을 대체함으로써 Fab-코트 단백질 구조의 조립이 파지 표면 상에 디스플레이되게 되는 Fab 단편으로서 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거된 면역 세포로부터 수득된다. 항-항원 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 바람직한 경우, 대상체를 항체 반응을 생성하도록 항원으로 면역화시키고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포, 다른 말초 혈액 림프구 (PBL)를 라이브러리 구축을 위해 회수한다. 한 실시양태에서, 항-항원 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는, 항원 면역화가 항원에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 보유하는 (기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결여된) 트랜스제닉 마우스에서 항-항원 항체 반응을 일으킴으로써 수득된다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에 기재된다.
항-항원 반응성 세포 집단에 대한 추가의 풍부화는, 예를 들어 항원 친화성 크로마토그래피 또는 형광색소-표지된 항원에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해, 항원-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 적합한 스크리닝 절차를 사용하여 획득할 수 있다.
대안적으로, 비면역화 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 제시를 제공하고, 또한 항원이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용한 항체 라이브러리의 구축을 허용한다. 시험관내 항체 유전자 구축이 혼입된 라이브러리의 경우에는, 대상체로부터 줄기 세포를 수거하여 재배열되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 관심 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 및 조류 종 등으로부터 수득할 수 있다.
항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산을 관심 대상 세포로부터 회수하여, 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 림프구로부터의 게놈 DNA 또는 mRNA의 단리에 이어서 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같은 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 목적하는 DNA를 수득할 수 있고, 이에 의해 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리가 제조된다. 문헌 [Orlandi et al. (1989) 및 Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기재된 바와 같이, 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서의 역방향 프라이머 및 J-절편을 기반으로 하는 정방향 프라이머를 사용하여, V 유전자를 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭시킬 수 있다. 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 역방향 프라이머는 또한 문헌 [Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기재된 바와 같이 리더 엑손을 기반으로 할 수 있고, 정방향 프라이머는 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같이 불변 영역을 기반으로 할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 [Orlandi et al. (1989) 또는 Sastry et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 축중성을 혼입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 기재된 바와 같이 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 한 말단에서 태그로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태그부착된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해, PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리가 시험관내에서 V 유전자 절편으로부터 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 맵핑되어 있으며 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 이들 클로닝된 절편들 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태 포함)은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성시키는데 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 초점이 맞추어진 모든 서열 다양성으로 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. 광범위한 VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이를 기반으로 하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭에 이어서, 배선 V-유전자 절편이 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 여러 방식으로 조합하여 구축할 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 이. 콜라이(E. coli) 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 제한을 극복하기 위해 Fab 단편의 2-쇄 특성을 이용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리를 하나는 파지미드 내로, 다른 하나는 파지 벡터 내로 개별적으로 클로닝한다. 이어서, 2개의 라이브러리를 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 조합하여 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하도록 하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 개수로만 제한된다 (약 1012개 클론). 벡터는 둘 다, VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘에서 재조합되어 파지 비리온 내에 공동-패키징되도록 하는 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이들 거대 라이브러리는 우수한 친화도 (약 10-8M의 Kd -1)를 갖는 다양한 항체를 대량으로 제공한다.
대안적으로, 레퍼토리는 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터에 순차적으로 클로닝될 수 있거나, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 후에 클로닝될 수 있다. VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA로 연결시켜 단일 쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성시키는데 PCR 조립이 또한 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, "세포 PCR 조립에서"는 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 림프구 내의 VH 및 VL 유전자를 조합한 후에 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하는데 사용된다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 친화도가 중등도일 수 있지만 (약 106 내지 107 M-1의 Kd -1), 상기 문헌 [Winter et al. (1994)]에 기재된 바와 같이 제2 라이브러리의 구축 및 이로부터의 재선택에 의해 시험관내에서 친화도 성숙이 또한 모방될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류-유발 폴리머라제 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관내에서 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은, 예를 들어 선택된 개별 Fv 클론에서 관심 대상 CDR에 이르는 무작위 서열을 보유하는 프라이머를 사용한 PCR을 사용하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 친화도가 더 높은 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에는 이뮤노글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 또 다른 효과적인 접근법은, 면역화되지 않은 공여자로부터 수득한 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 갖는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수회의 쇄 재셔플링으로 보다 높은 친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화도가 약 10-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술로 달성할 수 있다. 예를 들어, 항원은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용되거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에 발현되거나, 세포 분류에서 사용되거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합되거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에서 사용될 수 있다.
파지 라이브러리 샘플을, 파지 입자의 적어도 일부분을 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건 하에서 고정화된 항원과 접촉시킨다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 비롯한 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차로 항원 경쟁에 의해 용리시킨다. 단일 라운드의 선택으로 파지가 20-1,000배 풍부화될 수 있다. 또한, 풍부화된 파지가 박테리아 배양에서 성장되어, 추가적인 선택 라운드에 적용될 수 있다.
선택 효율은 세척 동안의 해리 동역학, 및 단일 파지 상의 다중 항체 단편들이 동시에 항원과 맞물릴 수 있는지 여부를 비롯한 다수의 인자에 따라 달라진다. 신속한 해리 동역학 (및 약한 결합 친화도)을 갖는 항체는 단시간 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체상 내의 항원의 고 코팅 밀도를 사용함으로써 보유될 수 있다. 고밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합을 돕는다. 느린 해리 동역학 (및 양호한 결합 친화도)의 항체의 선택은 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기재된 바와 같은 1가 파지 디스플레이 및 장시간 세척, 및 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 항원의 저 코팅 밀도를 사용함으로써 촉진될 수 있다.
항원에 대한 상이한 친화도, 심지어 근소하게 상이한 친화도를 갖는 파지 항체 사이에서의 선택이 가능하다. 그러나, 선택된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들어, 일부 친화도 성숙 기술로 수행되는 것)는, 대부분은 항원에 결합하고 몇몇은 보다 고친화도를 갖는 다수의 돌연변이체를 생성하기 쉽다. 항원을 제한하여, 희귀 고친화도 파지를 경쟁시킬 수 있다. 보다 높은 친화도의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지를 과량의 비오티닐화된 항원과 함께 인큐베이션시킬 수 있지만, 비오티닐화된 항원은 항원에 대한 표적 몰 친화도 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 이후에, 고친화도-결합 파지가 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이러한 "평형 포획"은 친화도가 더 낮은 과량의 파지로부터 친화도가 2배 정도 더 높은 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 감도로 항체가 이들의 결합 친화도에 따라 선택되도록 한다. 고체 상에 결합된 파지를 세척하는데 사용된 조건이 또한 해리 동역학을 기반으로 구별되도록 조작될 수 있다.
항-항원 클론은 활성을 기반으로 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 자연적으로 항원을 발현하는 살아있는 세포에 결합하거나, 또는 다른 세포 구조에 부착된 항원 또는 유리 부유 항원에 결합하는 항-항원 항체를 제공한다. 이러한 항-항원 항체에 대응하는 Fv 클론은 (1) 상기 기재된 파지 라이브러리로부터 항-항원 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 항원 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-항원 파지 클론을 고정화된 항원에 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정기와 중복되거나 공유되는 항원-결합 결정기를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용리시키고; (5) 단계 (4) 이후에 흡착되어 남아있는 클론을 용리시킴으로써 선택될 수 있다. 임의로, 본원에 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 목적하는 차단/비차단 특성을 갖는 클론을 추가로 풍부화시킬 수 있다.
본 발명의 하이브리도마-유래 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열분석한다. DNA를 단리하였으면, 이를 발현 벡터 내로 넣은 다음 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 (그렇지 않으면 상기 세포는 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않음) 재조합 숙주 세포에서 목적하는 모노클로날 항체의 합성을 얻는다. 항체-코딩 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 검토 문헌은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 카바트 등의 상기 문헌으로부터 얻을 수 있음)과 조합되어, 전장 또는 부분적 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 비롯한 임의의 이소형의 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있으며, 이러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 하나의 동물 (예컨대 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 Fv 클론이 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA로 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 것은 본원에 사용된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전장 또는 부분적 길이의 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-항원 항체를 코딩하는 DNA는 또한 예를 들어 하이브리도마 클론에서 유래된 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형될 수도 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 연결시킴으로써 하이브리도마- 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA를 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
(iv) 인간화 및 인간 항체
비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 인간 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 허용된다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
추가로, 항체가 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화되는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 한 실시양태의 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이들의 검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉 그의 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이 방식으로, FR 잔기는 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적으로 및 가장 실질적으로 수반된다.
본 발명의 인간 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 기재한 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 구축할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는, 예를 들어 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재되었다.
면역화 시에 내인성 이뮤노글로불린의 생산 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기재되었다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 챌린지 시에 인간 항체의 생산이 유발될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 Duchosal et al. Nature 355:258 (1992)]을 참조한다.
유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인"이라고도 불리는 이러한 방법에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라의 집단을 생성한다. 항원에 의한 선택 결과로서, 인간 쇄에 의해 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거 시에 파괴된 항원 결합 부위가 복원된 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되며, 즉 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 좌우 (각인)한다. 나머지 비-인간 쇄를 대체하기 위해 과정이 반복될 때, 인간 항체가 수득된다 (1993년 4월 1일 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.
(v) 항체 단편
항체 단편은 전통적인 수단, 예컨대 효소적 소화에 의해 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 상황에서는, 전체 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 클리어런스가 신속하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되어 그로부터 분비될 수 있어서 다량의 이들 단편의 용이한 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab') 2 단편은 미국 특허 번호 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 5,587,458을 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 이펙터 단백질의 융합체를 생성시키도록 구축될 수 있다. 상기 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck]을 참조한다. 예를 들어, 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고, 여기서 에피토프는 통상적으로 상이한 항원으로부터의 것이다. 이러한 분자는 정상적으로 단지 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 가진 항체, 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에 사용될 때 이 표현에 포괄된다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 편성으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 산물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 바람직하게는, 융합체는 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 융합체 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 전형적이다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 목적하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이는, 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동등하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 동등한 비의 발현이 고수율을 발생시키거나 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
이 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 상세내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
WO96/27011에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 하나의 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 1개 이상의 소형 아미노산 측쇄가 보다 대형의 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 대형 아미노산 측쇄를 보다 소형의 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 대형 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "함몰부"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이것은 다른 원치않는 최종-산물, 예컨대 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 원치않는 세포에 면역계 세포를 표적화하기 위해 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 다수의 가교 기술과 함께 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이들 단편을 디티올 착화제 아비산나트륨의 존재 하에서 환원시켜, 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
최근 진전은 이중특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있는 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하기 위해 시험관내에서 유도 화학적 커플링에 적용되었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 재-산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 사용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍형성하도록 강제되어 그에 의해 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되어 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. 문헌 [Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)].
(vii) 단일-도메인 항체
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조). 한 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.
(viii) 항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있으며, 단 최종 구축물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
(ix) 항체 유도체
본 발명의 항체는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1종 초과의 중합체가 부착되는 경우에, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선시킬 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 하여 결정될 수 있다.
(x) 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(a) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게는, 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (예를 들어, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환한다. 효모 분비의 경우에는, 천연 신호 서열을 예를 들어 효모 인버타제 리더, 인자 리더 (사카로미세스(Saccharomyces) 및 클루이베로미세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호에 의해 치환할 수 있다. 포유동물 세포 발현 시에는, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
(b) 복제 기점
발현 벡터 및 클로닝 벡터 둘 다는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2 μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 필요하지 않다 (단지 SV40 기점이 초기 프로모터를 함유하기 때문에, 전형적으로 이것이 사용될 수 있음).
(c) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커라고도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하며, 예를 들어 바실루스(Bacilli)의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.
선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포를 위한 적합한 선택 마커의 또 다른 예는 항체-코딩 핵산을 취하는데 적격인 세포의 확인을 가능하게 하는 마커, 예컨대 DHFR, 글루타민 신테타제 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이들 조건 하에서, DHFR 유전자를 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭시킨다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)를 사용할 수 있다.
대안적으로, GS 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 GS의 억제제인 L-메티오닌 술폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이들 조건 하에서, GS 유전자를 임의의 다른 공동-형질전환시킨 핵산과 함께 증폭시킨다. GS 선택/증폭 시스템을 상기 기재된 DHFR 선택/증폭 시스템과 조합하여 사용할 수 있다.
대안적으로, 관심 항체를 코딩하는 DNA 서열, 야생형 DHFR 유전자 및 또 다른 선택 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)로 형질전환시키거나 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택 마커, 예컨대 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418에 대한 선택제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조한다.
효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하의 성장에 의해 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
추가로, 1.6 μm 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로미세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 소 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템으로 케이. 락티스(K. lactis)가 보고되었다 (Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990)). 클루이베로미세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터가 또한 개시되었다. 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].
(d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 다수의 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 부가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에 존재한다. 이들 모든 서열들이 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 엔올라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득한 프로모터에 의해, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 열 쇼크 프로모터에 의해, 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성인 한 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부를 프로모터로 사용할 수 있다.
(e) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 다수의 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대해 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체-코딩 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
(f) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(g) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터에 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에, 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 다른 균주, 예컨대 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)가 적합할지라도, 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이다. 이들 예는 제한적이기보다는 예시적이다.
전장 항체, 항체 융합 단백질 및 항체 단편은 박테리아에서, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 때, 예컨대 치료 항체가 종양 세포 파괴에 있어서 그 차제로 유효성을 나타내는 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 접합될 때 생산될 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 보다 길다. 이. 콜라이에서의 생산은 보다 신속하고 보다 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기재하고 있는 미국 특허 번호 5,648,237 (Carter et al.), 미국 특허 번호 5,789,199 (Joly et al.), 및 미국 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.)을 참조한다. 또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재하고 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254]을 참조한다. 발현 후에, 항체는 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고, 예를 들어 이소형에 따라 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는, 예를 들어 CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행될 수 있다.
원핵생물에 추가로, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주가 본원에서 통상적으로 이용가능하고 유용하며, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스 숙주, 예컨대 케이. 락티스, 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈완니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 있다. 치료 단백질을 생산하기 위한 효모 및 사상 진균의 사용에 관한 논의를 검토하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]을 참조한다.
글리코실화 경로가 "인간화"됨으로써 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 특정 진균 및 효모 균주가 선택될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] (피키아 파스토리스에서의 글리코실화 경로의 인간화 기재); 및 상기 문헌 [Gerngross et al.]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공중 이용가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원의 바이러스로서 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 좀개구리밥 (렘나세아에(Leninaceae)), 알팔파 (엠. 트룬카툴라(M. truncatula)) 및 담배의 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 숙주로서 사용할 수 있고, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것 (조직 배양)이 상용 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268]을 참조한다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.
(h) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄(Ham)의 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코의 변형 이글 배지 (DMEM, 시그마)는 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 추가로, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 헤페스(HEPES)), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상적으로 제공되는 무기 화합물로 정의됨) 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 필요에 따라 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제가 또한 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 등은 이전에 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 사용된 것들이고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
(xi) 항체의 정제
재조합 기술을 사용하는 경우에, 항체는 세포내에서 생산되거나, 주변세포질 공간에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우에, 제1 단계로서 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편을, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비된 항체를 단리하는 절차를 기재한다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 먼저 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF는 단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계 중 임의의 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 우연한 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 여기서 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어형 세공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 신속한 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼 상의 분별증류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 크로마토그래피 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
일반적으로, 조사, 시험 및 임상에 사용하기 위한 항체를 제조하는 다양한 방법론이 관련 기술분야에 널리 확립되고 있고, 이는 상기 기재된 방법론과 일치하고/거나 특정한 관심 항체에 대해 통상의 기술자에게 인지되는 바와 같다.
C. 생물학적 활성 항체의 선택
상기 기재된 바와 같이 생산된 항체는 치료 관점 또는 항체의 생물학적 활성을 보유하는 제제 또는 조건 선택에 있어서 유익한 특성을 가진 항체를 선택하기 위해 하나 이상의 "생물학적 활성" 검정에 적용될 수 있다. 항체는 그를 생성하는 항원에 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 항-PDL1 항체의 경우, 항체의 항원 결합 특성은 PDL1에 결합하는 능력을 검출하는 검정에서 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 결합은, 예를 들어 포화 결합; ELISA; 및/또는 경쟁 검정 (예를 들어 RIA)에 의해 결정될 수 있다. 또한, 항체는, 예를 들어 치료제로서의 그의 유효성을 평가하기 위해 다른 생물학적 활성 검정에 적용될 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 항체에 대한 표적 항원 및 의도된 용도에 따라 달라진다. 예를 들어, 항체에 의한 PD-L1 차단의 생물학적 효과는, 예를 들어 미국 특허 8,217,149에 기재된 바와 같이, CD8+T 세포, 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV) 마우스 모델 및/또는 동계 종양 모델에서 평가될 수 있다.
관심 항원 상의 특정한 에피토프에 결합하는 항체 (예를 들어, 실시예의 항-PDL1 항체가 PD-L1에 결합하는 것을 차단하는 항체)를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 상용 교차-차단 검정을 수행할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 문헌 [Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)]에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행하여, 항체가 관심 에피토프에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다.
D. 제제의 제조
관심 항체의 제조 후 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이 제제화될 수 있는 항체를 생산하기 위한 기술은 하기에 상세히 설명되어 있고, 관련 기술분야에 공지되어 있음), 이를 포함하는 제약 제제를 제조한다. 특정 실시양태에서, 제제화될 항체는 사전 동결건조에 적용되지 않았고, 본원의 관심 제제는 수성 제제이다. 특정 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다. 한 실시양태에서, 제제 중 항체는 항체 단편, 예컨대 F(ab')2이며, 이 경우에 전장 항체에 대해 일어나지 않을 수 있는 문제 (예컨대 Fab로의 항체의 클리핑)를 다룰 필요가 있을 수 있다. 제제 중에 존재하는 항체의 치료 유효량은, 예를 들어 목적하는 투약 부피 및 투여 방식(들)을 고려하여 결정된다. 약 25 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 또는 약 30 mg/mL 내지 약 140 mg/mL, 또는 약 35 mg/mL 내지 약 130 mg/mL, 또는 약 40 mg/mL 내지 약 120 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 130 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 125 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 120 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 110 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 또는 약 54 mg/mL 내지 약 66 mg/mL가 제제 중 예시적인 항체 농도이다.
pH-완충 용액 중에 항체를 포함하는 수성 제제를 제조한다. 본 발명의 완충제는 약 5.0 내지 약 7.0 범위의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, pH는 약 5.0 내지 약 6.5 범위이거나, pH는 약 5.0 내지 약 6.4 범위, 약 5.0 내지 약 6.3 범위이거나, pH는 약 5.0 내지 약 6.2 범위이거나, pH는 약 5.0 내지 약 6.1 범위이거나, pH는 약 5.5 내지 약 6.1 범위이거나, pH는 약 5.0 내지 약 6.0 범위이거나, pH는 약 5.0 내지 약 5.9 범위이거나, pH는 약 5.0 내지 약 5.8 범위이거나, pH는 약 5.1 내지 약 6.0 범위이거나, pH는 약 5.2 내지 약 6.0 범위이거나, pH는 약 5.3 내지 약 6.0 범위이거나, pH는 약 5.4 내지 약 6.0 범위이거나, pH는 약 5.5 내지 약 6.0 범위이거나, pH는 약 5.6 내지 약 6.0 범위이거나, pH는 약 5.7 내지 약 6.0 범위이거나, 또는 pH는 약 5.8 내지 약 6.0 범위이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 6.0 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.9 또는 약 5.9의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.8 또는 약 5.8의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.7 또는 약 5.7의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.6 또는 약 5.6의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.5 또는 약 5.5의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.4 또는 약 5.4의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.3 또는 약 5.3의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.2 또는 약 5.2의 pH를 갖는다. 이 범위 내의 pH를 제어할 완충제의 예는 히스티딘 (예컨대 L-히스티딘) 또는 아세트산나트륨을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨을 함유한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 완충제는 약 15 mM 내지 약 25 mM, 약 16 mM 내지 약 25 mM, 약 17 mM 내지 약 25 mM, 약 18 mM 내지 약 25 mM, 약 19 mM 내지 약 25 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 약 21 mM 내지 약 25 mM, 약 22 mM 내지 약 25 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 또는 약 25 mM의 농도의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨을 포함한다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.0이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.1이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.2이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.3이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.4이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.5이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.6이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.7이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.8이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.9이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 6.0이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 6.1이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 6.2이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 6.3이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.2이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.3이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.4이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.5이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.6이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.7이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.8이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 5.9이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 6.0이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 6.1이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 6.2이다. 한 실시양태에서, 완충제는 약 25 mM의 양의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨, pH 6.3이다.
제제는 추가로 수크로스를 약 60 mM 내지 약 240 mM의 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 수크로스는 약 60 mM 내지 약 230 mM, 약 60 mM 내지 약 220 mM, 약 60 mM 내지 약 210 mM, 약 60 mM 내지 약 200 mM, 약 60 mM 내지 약 190 mM, 약 60 mM 내지 약 180 mM, 약 60 mM 내지 약 170 mM, 약 60 mM 내지 약 160 mM, 약 60 mM 내지 약 150 mM, 약 60 mM 내지 약 140 mM, 약 80 mM 내지 약 240 mM, 약 90 mM 내지 약 240 mM, 약 100 mM 내지 약 240 mM, 약 110 mM 내지 약 240 mM, 약 120 mM 내지 약 240 mM, 약 130 mM 내지 약 240 mM, 약 140 mM 내지 약 240 mM, 약 150 mM 내지 약 240 mM, 약 160 mM 내지 약 240 mM, 약 170 mM 내지 약 240 mM, 약 180 mM 내지 약 240 mM, 약 190 mM 내지 약 240 mM, 약 200 mM 내지 약 240 mM, 약 80 mM 내지 약 160 mM, 약 100 mM 내지 약 140 mM, 또는 약 110 mM 내지 약 130 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 수크로스는 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 mM, 약 180 mM, 약 190 mM, 약 200 mM, 약 210 mM, 약 220 mM, 약 230 mM, 또는 약 240 mM이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 40 mg/ml 내지 약 125 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 40 mg/mL 내지 약 120 mg/ml, 약 40 mg/mL 내지 약 110 mg/ml, 약 40 mg/mL 내지 약 100 mg/ml, 약 40 mg/mL 내지 약 90 mg/ml, 약 40 mg/mL 내지 약 80 mg/ml, 약 40 mg/mL 내지 약 70 mg/ml, 약 50 mg/mL 내지 약 120 mg/ml, 약 60 mg/mL 내지 약 120 mg/ml, 약 70 mg/mL 내지 약 120 mg/ml, 약 80 mg/mL 내지 약 120 mg/ml, 약 90 mg/mL 내지 약 120 mg/ml, 또는 약 100 mg/mL 내지 약 120 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 60 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 65 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 70 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 75 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 80 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 85 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 90 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 95 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 100 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 110 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체 농도는 약 125 mg/ml이다.
일부 실시양태에서, 계면활성제가 항체 제제에 첨가된다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188 등)를 포함한다. 계면활성제의 양은 제제화된 항체의 응집을 감소시키고/거나 제제 중 미립자의 형성을 최소화시키고/거나 흡착을 감소시키도록 첨가된다. 예를 들어, 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 0.5% (w/v)의 양으로 제제 중에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)은 약 0.005% 내지 약 0.2%, 약 0.005% 내지 약 0.1%, 약 0.005% 내지 약 0.09%, 약 0.005% 내지 약 0.08%, 약 0.005% 내지 약 0.07%, 약 0.005% 내지 약 0.06%, 약 0.005% 내지 약 0.05%, 약 0.005% 내지 약 0.04%, 약 0.008% 내지 약 0.06%, 약 0.01% 내지 약 0.06%, 약 0.02% 내지 약 0.06%, 약 0.01% 내지 약 0.05%, 또는 약 0.02% 내지 약 0.04%이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.005% 또는 약 0.005%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.006% 또는 약 0.006%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.007% 또는 약 0.007%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.008% 또는 약 0.008%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.009% 또는 약 0.009%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.01% 또는 약 0.01%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.02% 또는 약 0.02%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.03% 또는 약 0.03%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.04% 또는 약 0.04%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.05% 또는 약 0.05%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.06% 또는 약 0.06%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.07% 또는 약 0.07%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.08% 또는 약 0.08%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.1% 또는 약 0.1%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.2% 또는 약 0.2%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.3% 또는 약 0.3%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.4% 또는 약 0.4%의 양으로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)는 0.5% 또는 약 0.5%의 양으로 제제 중에 존재한다.
한 실시양태에서, 제제는 상기 확인된 작용제 (예를 들어, 항체, 완충제, 수크로스 및/또는 계면활성제)를 함유하고, 1종 이상의 보존제, 예컨대 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤제토늄 Cl이 본질적으로 없다. 또 다른 실시양태에서, 보존제는, 특히 제제가 다중용량 제제인 경우에 제제 중에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1% 내지 약 2%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1% 범위일 수 있다. 1종 이상의 다른 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재된 것은, 이들이 제제의 목적하는 특성에 유해한 영향을 미치지 않는 한 제제에 포함될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 다음을 포함한다; 추가의 완충제; 공-용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 생분해성 중합체, 예컨대 폴리에스테르; 및/또는 염-형성 반대이온. 예시적인 제약상 허용되는 담체는 본원에서 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 비롯한 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 1종 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
본원에서의 제제는 또한 치료될 특정한 적응증에 필요한 1종 초과의 단백질, 바람직하게는 다른 단백질에 유해한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 가진 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항체가 항-PDL1인 경우에, 이는 또 다른 작용제 (예를 들어, 화학요법제 및 항신생물제)와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제제 중 항체의 물리적 안정성, 화학적 안정성 또는 생물학적 활성이 평가되거나 측정된다. 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원 실시예에 기재된 임의의 방법이 제제 중 항체의 안정성 및 생물학적 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제제 중 항체의 안정성은 비제한적으로 크기 배제 크로마토그래피 (SEC 또는 SE-HPLC), 영상화 모세관 등전 포커싱 (ICIEF), 펩티드 맵핑, 소-부피 광 차폐 (HIAC) 검정 및 모세관 전기영동 (CE) 기술, 예컨대 CE-소듐 도데실 술페이트 (CE-SDS) 및 CE-글리칸 분석에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체는 -20℃에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 14개월, 적어도 약 16개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 20개월, 적어도 약 21개월, 적어도 약 22개월, 적어도 약 23개월, 적어도 약 24개월, 적어도 약 3년, 또는 적어도 약 4년 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항체는 2℃ 내지 8℃ (예를 들어, 5℃)에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 14개월, 적어도 약 16개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 20개월, 적어도 약 21개월, 적어도 약 22개월, 적어도 약 23개월, 또는 적어도 약 24개월 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 항체 (즉, 항체 단량체)의 안정성은 저장 후에 제제에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 항체 (즉, 항체 단량체)의 안정성은 저장 후에 제제에서 영상화 모세관 등전 포커싱에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 총 단백질 (예를 들어, 항체 및 응집체 포함)과 비교하여 제제 중 항체 단량체의 퍼센트는 -20℃에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월 또는 적어도 약 24개월 동안 저장 후에 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95% 초과이다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 항체 및 응집체 포함)과 비교하여 제제 중 항체 단량체의 퍼센트는 2℃ 내지 8℃ (예를 들어, 5℃)에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월 또는 적어도 약 24개월 동안 저장 후에 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95% 초과이다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 항체 및 응집체 포함)과 비교하여 제제 중 항체 단량체의 퍼센트는 실온 (예를 들어, 약 15℃ 내지 25℃)에서 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 20시간 또는 적어도 약 24시간 동안 교반 후에 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95% 초과이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 총 응집체 (예를 들어, 고분자량 종 및 저분자량 종)의 퍼센트는 -20℃에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월 또는 적어도 약 24개월 동안 저장 후에 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 총 응집체 (예를 들어, 고분자량 종 및 저분자량 종)의 퍼센트는 2℃ 내지 8℃ (예를 들어, 5℃)에서 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월 또는 적어도 약 24개월 동안 저장 후에 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 총 응집체 (예를 들어, 고분자량 종 및 저분자량 종)의 퍼센트는 실온 (예를 들어, 약 15℃ 내지 25℃)에서 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 20시간 또는 적어도 약 24시간 동안 교반 후에 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 중 임의의 것 미만이다. 본원의 임의의 실시양태에서, 안정한 제제는 유리 바이알, 금속 합금 용기 또는 정맥내 (IV) 백에 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 금속 합금은 316L 스테인레스 스틸 또는 하스텔로이이다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 제제의 제조 전에 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
III. 치료 방법 및 항체 제제의 투여
제제는 항체를 사용한 치료를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 공지된 방법에 따라, 예컨대 정맥내 투여 (예를 들어, 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해), 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 투여된다. 한 실시양태에서, 제제는 포유동물에게 정맥내 투여에 의해 투여된다. 이러한 목적을 위해, 제제는, 예를 들어 시린지를 사용하여 또는 IV 라인을 통해 주사될 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 포유동물에게 피하 투여에 의해 투여된다.
항체의 적절한 투여량 ("치료 유효량")은, 예를 들어 치료될 상태, 상태의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 사용되는 항체의 유형, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐서 투여되고, 환자에게 진단 이후 임의의 시점에 투여될 수 있다. 항체는 단독 치료로서, 또는 당해 상태의 치료에 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여될 수 있다.
일반적인 제안으로서, 인간에게 투여되는 항체의 치료 유효량은 1회 투여 또는 그 초과의 투여이든지 환자 체중 kg당 약 0.01 내지 약 50 mg 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, 사용된 항체는, 예를 들어 약 0.01 내지 약 45 mg/kg, 약 0.01 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 내지 약 35 mg/kg, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg, 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 내지 약 15 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 1 mg/kg 매일 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 15 mg/kg으로 투여된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PDL1 항체는 인간에게 21일 주기의 제1일에 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg 또는 약 1400 mg의 용량으로 투여된다. 용량은 단일 용량으로서 또는 다중 용량 (예를 들어, 2 또는 3회 용량)으로서 투여, 예컨대 주입될 수 있다. 조합 치료로 투여된 항체의 용량은 단일 치료와 비교하여 감소될 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술에 의해 용이하게 모니터링된다.
본원에 기재된 항-PDL1 항체를 함유하는 제제는 다양한 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체를 함유하는 제제는 대상체 또는 개체에게 질환 또는 장애 (예를 들어, PD-1 및 PD-L1 상호작용에 의해 매개되는 질환 또는 장애)를 치료하기 위해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 국부 진행성 또는 전이성이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양, 혈액암, 방광암, 뇌암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 위암, 신경교종, 두부암, 백혈병, 간암, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐암), 림프종, 골수종, 경부암, 난소암, 흑색종, 췌장암, 신암, 타액선암, 위암, 흉선 상피암, 갑상선암 및 두경부의 편평 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료된 대상체 또는 개체는 PD-L1 양성 암 세포 (예를 들어, IHC에 의해 검출됨)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 감염이다. 일부 실시양태에서, 감염은 지속성 감염이다. 일부 실시양태에서, 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 연충 감염 또는 원충 감염이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 감염은 시토메갈로바이러스 엡스타인-바르 바이러스, B형 간염, C형 간염 바이러스, 포진 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 T 림프향성 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 및/또는 리노바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 감염은 헬리코박터 종(Helicobacter spp.), 미코박테리움 종(Mycobacterium spp.), 포르피로모나스 종(Porphyromonas spp.), 클라미디아 종(Chlamydia spp.), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 리스테리아 종(Listeria spp.), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus spp.), 헤모필루스 종(Haemophilus spp.), 네이세리아 종(Neisseria spp.), 클레브시엘라 종(Klebsiella spp.), 보렐리아 종(Borrelia spp), 박테리오이데스 종(Bacterioides spp.) 및 트레포네마 종(Treponema spp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 원충 감염은 리슈마니아 종(Leishmania spp.), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 쉬스토소마 종(Schistosoma spp.), 톡소플라스마 종(Toxoplasma spp.), 트리파노소마 종(Trypanosoma spp.) 및 타에니아 종(Taenia spp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 진균 감염은 블라스토미세스증, 콕시디오이데스진균증, 히스토플라스마증, 칸디다증, 크립토코쿠스증, 아스페르길루스증, 털곰팡이증 및 폐포자충증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 염증성 질환이다. 일부 실시양태에서, 염증성 질환은 급성 파종성 뇌척수염, 애디슨병, 알츠하이머병, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 아테롬성동맥경화증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 관절염, 베체트병, 베르게르병, 수포성 유천포창, 복강 질환, 샤가스병, 담관염, 크론병, 피부근염, 제1형 당뇨병, 사구체신염, 굿패스쳐 증후군, 이식편-대-숙주 질환, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 심마진, 고 IgE 증후군, 특발성 혈소판감소성 자반증, 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 기관 이식 거부, 파킨슨병, 천포창, 악성 빈혈, 다발근염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 레이노 증후군, 류마티스 관절염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염, 갑상선염, 궤양성 결장염, 포도막염, 혈관염 및 베게너 육아종증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체를 포함하는 제제는 대상체 또는 개체에게 질환 또는 장애를 치료하기 위해 또 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 암을 치료하기 위해, 본원에 기재된 항-PDL1 항체 제제는 또 다른 항암 치료 (예를 들어, 화학요법 또는 상이한 항체 치료)와 함께 투여될 수 있다.
IV. 제조 물품 또는 키트
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 제제를 수용하고 임의로 그의 사용 지침서를 제공하는 용기를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 백 및 시린지를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 플라스틱 (예컨대 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀) 또는 금속 합금 (예컨대 스테인레스 스틸 또는 하스텔로이)으로부터 형성될 수 있다. 예시적인 용기는 300 cc 금속 합금 용기 (예를 들어, -20℃에서의 저장을 위한 것)이다. 또 다른 예시적인 용기는 10-50 cc 유리 바이알 (예를 들어, 2-8℃에서의 저장을 위한 것)일 수 있다. 예를 들어, 용기는 10 cc, 15 cc, 20 cc 또는 50 cc 유리 바이알일 수 있다. 용기는 제제를 수용하고, 용기 상의 또는 용기에 부속된 라벨은 사용 지침을 나타낼 수 있다. 제조 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용 지침서가 있는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제조 물품은 1종 이상의 또 다른 작용제 (예를 들어, 화학요법제 및 항신생물제)를 추가로 포함한다. 1종 이상의 작용제를 위한 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 백 및 시린지를 포함한다.
본 명세서는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 간주된다. 본원에 제시되고 기재된 것들 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재내용으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범주 내에 속할 것이다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 통상의 기술자에게 제안될 것이고, 본원의 취지 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예 1: 항-PDL1 항체의 제제 개발
항-PDL1 항체 (α-PDL1)는 PDL1/PD1 상호작용의 억제를 통해 T 세포 기능을 회복시키도록 의도된 CHO-유래 비-글리코실화 IgG1 항체이다. 개발의 착수 시에 도전과제는 CDR 영역에 또는 그 근처에 잠재적 Trp 산화 및 당화, 및 일부 메티오닌 산화를 포함하였다. 예비-강건성 연구는 이전에 표적화된 것 (pH 5.5)보다 높은 pH가 최적이라는 것을 나타냈다. 표적 투약은 고정 용량이었지만 중량 기준 용량을 또한 고려하였다. 다양한 제제의 안정성을 분석하기 위해 분석 연구를 수행하였고, 제제 (60 mg/mL α-PDL1, 20 mM His AcO pH 5.8, 120 mM 수크로스, 0.04% PS20)를 선택하였다. 초기 제제 연구는 약물 물질 (DS) 및 약물 제품 (DP)에서 3년 이하의 안정성을 지지하였다.
방법 및 물질
α-PDL1 제제의 생산
한외여과/투석여과를 겪은 α-PDL1 물질을 제제 개발 연구에 적용하였다. 물질을 10000 달톤 투석 카세트를 사용하여 다양한 제제 완충제 내로 투석하였다. 투석 후에, 단백질 농도를 표적 농도에 도달하도록 조정하고, 10% PS20 원액을 섞어 표적화된 PS20 농도를 달성하였다. 제제화된 물질을 2-cc 포르마 비트룸(Forma Vitrum) 유리 바이알 내에 1 mL 충전 부피로 무균 충전하고, 13 mm 다이쿄(Daikyo) 777-1 마개로 밀봉하였다. 샘플을 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 수직으로 세워 저장하였다.
색상, 외관 및 투명도 (CAC)
샘플 색상, 외관 및 투명도를 유럽 약전 (EP) 방법 (Council of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 7th Ed., EP 2.2.2 and EP 2.2.1)에 기재된 바와 같이 실온에서 흑색 및 백색 배경을 갖는 백색 형광 광 하에서 육안 검사에 의해 결정하였다. 3cc 유리 바이알에 1 mL의 각 시험 샘플을 충전하였다. 상응하는 샘플 부피를 갖는 음성 대조군 (정제수)을 비교용으로 사용하였다.
단백질 농도 측정
단백질 농도는 0.9% 염수를 사용한 대략 0.5 mg/mL로의 부피 샘플 희석을 통해 애질런트(Agilent) 8453 분광광도계 (캘리포니아주 산타 클라라) 상에서의 UV-흡광도의 측정에 의해 결정하였다. 샘플을 0.9% 염수에 대해 블랭크 처리하고, 흡광도를 대략 280 nm의 Amax 및 또한 320 nm에서 측정하였다. Amax와 A320 사이의 차이를 계산하여, 1.5mL cm-1 mg-1의 흡수도로 최종 단백질 농도를 결정하는데 사용되는 보정된 Amax를 수득하였다.
탁도 측정
샘플의 350 nm에서의 평균 광학 밀도는 애질런트 8453 분광광도계 상에서 1-cm 경로 길이를 갖는 석영 큐벳으로 측정하였다. 정제수를 블랭크로서 사용하였다.
육안으로 보이지 않는 입자를 위한 광 차폐 방법 (HIAC 검정)
샘플의 미립자 계수는 HIAC-로이코(Royco) 모델 9703 (HACH, 콜로라도주 러브랜드)에 의해 측정되는 광 차폐를 사용하여 수행하였다. 밀리리터당 ≥ 2 μm, ≥ 5 μm, ≥ 10 μm 및 ≥ 25 μm 입자의 평균 누적 개수를 팜스펙(PharmSpec) v2.0을 사용하여 각 샘플에 대해 표로 만들었다. 각 샘플의 총 1.6 mL를 소모하는 4개의 판독을 시험마다 수행하였고, 이때 제1 판독은 폐기하고, 나머지 3개의 판독은 평균내었다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC 또는 SE-HPLC)
크기 변형 분포는 애질런트 1200 HPLC (미국 캘리포니아주 산타 클라라) 상에서 30℃에서 토소하스 바이오사이언스(TosoHaas Bioscience) 칼럼 G3000 SWXL (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정하였다. 모든 샘플을 칼럼 상에 50 μg으로 비희석 주사하고, 280 nm에서의 UV 흡수 하에 60분에 걸쳐 용리시켰다. 2개의 상이한 SEC 방법을 샘플 시험에 사용하였다. 방법 1은 0.20 M 인산칼륨, 0.25 M 염화칼륨, pH 6.2를 사용하였고, 반면에 방법 2는 0.20 M 인산칼륨, 0.25 M 염화칼륨, pH 6.2와 이동상으로서의 10% (v/v) 이소프로판올을 사용하였다. 결과는 총 곡선하 면적에 대한 상대 퍼센트 피크 면적으로서 보고하였다.
영상화 모세관 등전 포커싱 (ICIEF)
전하 변이체의 분포는 플루오로카본 코팅된 모세관 카트리지 (100 μm x 5 cm)가 구비된 iCE280 분석기 (프로테인심플(ProteinSimple))를 사용하는 iCIEF에 의해 평가하였다. 양성전해질 용액은 정제수 중 0.35% 메틸 셀룰로스 (MC), 0.75% 파마라이트(Pharmalyte) 3-10 담체 양성전해질, 4.2% 파마라이트 8-10.5 담체 양성전해질, 및 0.2% pI 마커 7.40 및 0.15% pI 마커 9.77로 이루어졌다. 애노드액은 80 mM 인산이었고, 캐소드액은 100 mM 수산화나트륨이었으며, 둘 다 0.10％ 메틸셀룰로스 중에 존재하였다. 샘플을 정제수 중에 희석하고, CpB를 각각의 희석된 샘플에 1:100의 효소 대 기질 비로 첨가한 후, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. CpB 처리된 샘플을 양성전해질 용액과 혼합한 다음에, 1분 동안 1500 V의 전위를 도입한 후 10분 동안 3000 V의 전위를 도입함으로써 초점을 맞추었다. 초점이 맞추어진 α-PDL1 전하 변이체의 영상은 280 nm 자외선을 모세관을 통해 전하 커플링된 장치 디지털 카메라의 렌즈 내로 통과시킴으로써 수득하였다. 이어서, 이 영상을 분석하여 다양한 전하 변이체의 분포를 결정하였다.
펩티드 맵핑
펩티드 맵핑 기술을 사용하여 트립토판 (W) 및 메티오닌 (M) 산화를 모니터링하였다. α-PDL1 펩티드 맵을 생성하기 위해, 디술피드 결합을 환원시키고 생성된 유리 티올을 변경시켜 카르복시메틸 유도체를 생산하는 공정에서, 단백질을 디티오트레이톨 (DTT) 및 아이오도아세트산 (IAA)에 노출시킨 후에 단백질을 트립신으로 소화시켰다. 생성된 펩티드를 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 분리하고, 214 nm에서 모니터링하였다. 트립신 펩티드의 질량은 써모피셔 사이언티픽 LTQ-오비트랩(ThermoFisher Scientific LTQ-Orbitrap) 질량 분광계를 사용하여 분리된 소화 혼합물의 LC-MS 분석에 의해 결정하였다.
결과
완충제 시스템의 선택
제제 개발 동안, 2개의 완충제 시스템을 평가하였다. 하나는 pH 5.5에서의 20mM 히스티딘 아세테이트와 240mM 수크로스였고, 다른 하나는 pH 5.5에서의 200mM 아르기닌 숙시네이트였다. 가속 안정성 연구는 α-PDL1이 아르기닌 숙시네이트 완충제와 비교하여 히스티딘 아세테이트 완충제 중에서 보다 우수한 안정성을 갖는다는 것을 밝혀내었다 (표 1). 따라서 히스티딘 아세테이트를 추가의 제제 개발을 위해 선택하였다.
<표 1> 30℃에서 히스티딘 아세테이트 및 아르기닌 숙시네이트 완충제 중에서 ICIEF 및 SE-HPLC 주요 피크에 대한 α-PDL1의 0차 분해율
Figure 112016038794114-pct00002
주: 모든 제제를 30℃에서 1개월 이하 동안 저장하였다. 분석은 ICIEF 및 SE-HPLC를 사용하여 수행하였다; * pH 5.5에서의 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 240 mM 수크로스 및 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20 중 150 mg/mL α-PDL1; ** pH 5.5에서의 200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20 중 150 mg/mL α-PDL1.
안정화제의 선택
수크로스 (120 mM)는, 단백질을 동결/해동 유도 응집으로부터 보호하는 그의 능력뿐만 아니라 약물 물질 (DS)의 장기간 동결 저장 및 후속하여 2℃-8℃에서의 약물 제품 (DP) 저장 동안 동결보호제로서 기능하는 그의 능력을 기반으로 하여 α-PDL1 액체 제제를 위한 안정화제로서 선택하였다.
제제 개발 동안, 20 mM L-히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20 및 0 mM 내지 120 mM 범위의 다양한 농도의 수크로스 중 50 mg/mL의 α-PDL1을 5회 동결/해동 주기에 적용하였다. SE-HPLC에 의해 측정된 제품 품질은 60 mM 수크로스가 α-PDL1 HMWS에서 동결/해동 유도 증가를 방지하기에 충분하였다는 것을 나타냈다 (표 2). 또한, 120 mM 수크로스는 적어도 6개월 동안 -20℃에서 동결 저장하였을 때 약물 물질의 안정성을 유지하는 것으로 나타났다 (표 3). 따라서, 동결/해동 연구뿐만 아니라 -20℃에서 저장된 약물 물질의 장기간 안정성의 결과를 기반으로 하여, 120 mM의 농도의 수크로스를 α-PDL1 액체 제제를 위한 동결보호제로서 선택하였다.
<표 2> 동결 및 해동 동안 α-PDL1 SE-HPLC 퍼센트 고분자량 종의 안정성에 대한 수크로스 농도의 효과
Figure 112016038794114-pct00003
주: 모든 제제는 50 mg/mL α-PDL1, 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 5.5를 함유하였다. 분석은 SE-HPLC를 사용하여 수행하였다; F/T = 동결/해동; HMWS = 고분자량 종; SY = 미황색; CL = 투명; PFVP = 사실상 가시적인 입자가 없음.
<표 3> α-PDL1 약물 물질 개발 배치에 대한 장기간 안정성 데이터
Figure 112016038794114-pct00004
주: 모든 제제는 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 120mM 수크로스, 0.04% PS20, pH 5.8 중 60 mg/mL α-PDL1을 함유하였다. 25cc 316L 스테인레스 스틸 미니캔을 이 연구에 사용하였다; NA = 적용가능하지 않음; CAC = 색상, 외관 및 투명도; SY = 미황색, CL = 투명, PFVP = 사실상 가시적인 미립자가 없음; HMW = 고분자량; LMW = 저분자량; ICIEF = 영상화 모세관 등전 포커싱; CE-SDS = 모세관 전기영동 소듐 도데실 술페이트; NT = 시험하지 않음; TBD = 결정하여야 함.
예비-제제 강건성 연구: 단백질 농도, pH 및 폴리소르베이트 20 농도의 선택
부분 요인 실험 설계 (DOE)의 설계를 사용하여 단백질 안정성에 대한 α-PDL1 제제 파라미터의 효과를 추가로 검사하였다. 총 12종의 상이한 α-PDL1 제제를 시험하였다 (10회 실험 및 2회 중심점). 연구에서 가변적인 3개의 인자는 0.5 단위 간격의 pH 5.0 - 6.0 범위, 40 - 120 mg/mL의 단백질 농도 범위, 및 0.005% - 0.06% (w/v)의 폴리소르베이트 20 농도 범위였다 (표 4). 모든 제제는 표 4에 나타낸 바와 같이 마지막 2종의 제제를 제외하고는 20mM 히스티딘 아세테이트와 120mM 수크로스에 의해 완충제 처리하였다. 25mM 히스티딘 아세테이트 제제는 산화 위험의 관점에서 최악의 사례 시나리오인 것으로 간주되었기 때문에 평가하였다. 20mM 아세트산나트륨 완충제는 백업 완충제 시스템으로서 평가하고, 히스티딘 아세테이트 완충제와 비교하였다. 제제를 25℃에서 2개월 동안 및 40℃에서 1개월 동안 저장하였다. 상기 연구로부터의 안정성 데이터는 JMP 소프트웨어 (JMP, 버전 9, SAS 인스티튜트 인크.(SAS Institute Inc.), 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 제제 파라미터 사이의 상호작용에 대해 통계적으로 분석하였다.
<표 4> DOE 연구에서 평가된 α-PDL1 약물 물질 및 약물 제품 제제
Figure 112016038794114-pct00005
주: a 중심점; b 최악의 사례 시나리오: 저 단백질 농도, 고 PS20 농도, 고 히스티딘 농도; c 20 mM 아세트산나트륨 (Na-Ace) 완충제를 시험하였다.
pH 5.0 및 5.5와 비교하여, pH 6.0에서의 제제는 40℃ 및 25℃에서 ICIEF에 의해 결정 시에 약간 더 느린 주요 피크 손실률을 나타냈다 (각각, 도 1a-b 및 도 2a-b). 주요 피크 손실에 대한 농도의 어떠한 유의한 영향도 ICIEF에 의해 관찰되지 않았다. 제제 F1의 분석은 산성 변이체 증가가 ICIEF에서의 주요 피크 손실에 대해 주로 기여한 반면에 피크 손실에 대한 염기성 전하 변이체에 의한 기여는 유의하지 않았다는 것을 제시하였다. 동일한 저장 조건 하에서, pH 6.0에서의 제제는 또한 40℃ 및 25℃에서 SE-HPLC에 의해 측정 시에 보다 느린 단량체 피크 손실률을 나타냈다 (각각, 도 3a-b 및 도 4a-b). 제제 F1의 분석은 HMWS 및 LMWS 형성 둘 다가 SEC에서 승온 (즉, 40℃ 및 25℃)에서 단량체 손실에 기여하였다는 것을 제시하였다. SEC 및 ICIEF pH 비율 프로파일 둘 다는 pH 5.5-6.0이 α-PDL1에 대한 최적 pH 범위라는 것을 밝혀내었다. pH 5.5 초과에서 최적 단백질 안정성 내에 있기 위해 및 제제화된 약물 물질 및 약물 제품에 ± 0.3 pH 단위 범위를 허용하기 위해, pH 5.8의 표적을 선택하였다.
상기 제제 연구는 또한 5.0 - 6.0의 pH 범위에서의 120 mg/mL α-PDL1 제제가 SE-HPLC에 의해 결정 시에 동일한 pH의 40 mg/mL 제제와 비교하여 보다 높은 HMWS 형성 비율로 인해 약간 더 높지만 유의하지는 않은 단량체 피크 손실률을 나타냈다는 것을 밝혀내었다 (도 3a-b 및 도 4a-b). 이들 데이터를 기반으로 하여, 개선된 제품 안정성을 갖는 제제를 지원하기 위해 및 환자 투약을 용이하게 하기 위해, 60 mg/mL의 농도의 α-PDL1을 선택하였다.
상기 통계적 분석에 나타난 바와 같이 0.005%-0.06% (w/v) 범위의 폴리소르베이트 20 (PS20) 농도에 의해서는 단백질 안정성에 대한 어떠한 영향도 관찰되지 않았다 (도 1-4).
폴리소르베이트 20 원료에 함유된 과산화수소 불순물은 트립토판 (W) 및 메티오닌 (M) 산화를 야기할 수 있는 것으로 공지되었다. L-히스티딘은 또한 상기 산화 위험을 증가시킬 수 있다. 보다 높은 농도의 폴리소르베이트 20 및 L-히스티딘을 함유하는, 선택된 최악의 사례 시나리오 제제의 샘플을 펩티드 맵핑에 의해 분석하였다. 분석의 결과는 심지어 보다 높은 히스티딘 농도 (25mM 히스티딘 아세테이트 완충제) 및 보다 많은 양의 PS20 (0.06% PS20)의 조합이 유의한 산화 위험을 입증하지 않았고 (표 5), 히스티딘 완충제가 α-PDL1을 제제화하는데 사용하기에 적합하다는 것을 제시하였다.
<표 5> 펩티드 맵에 의한 선택된 제제에서의 Trp 및 M253 산화의 백분율
Figure 112016038794114-pct00006
주: 모든 제제를 40℃에서 1개월 이하 동안 저장하였다. 펩티드 맵을 사용하여 분석을 수행하였다.
W = 트립토판; M = 메티오닌
저장 시에 제제에서 PS20의 가능한 분해를 평가하기 위해, 제제 F1 내지 F10 (표 4)을 1개월 동안 40℃에서, 2개월 동안 25℃에서, 2개월 동안 5℃에서 또는 6개월 동안 5℃에서 저장하였다. 상승된 (즉, 40℃ 및 25℃) 및 5℃ 저장 온도 중 임의의 온도에서 평가된 제제에서 어떠한 PS20 분해도 관찰되지 않았다. 선택된 제제 (즉, F1, F2, F3 및 F6)의 충전 부피를 7 ml (고 충전) 또는 4 ml (저 충전)로 변경한 다음 6개월 동안 5℃에서 저장하는 것도 또한 PS20 분해율에 유의한 영향을 미치지 않았다 (도 5).
6개월 동안 5℃에서 저장하였을 때 상이한 제제 중 육안으로 보이지 않는 입자 (SbVP)의 형성을 안정성의 척도로서 HIAC 검정에 의해 평가하였다 (표 6). 시험된 제제에서 SbVP의 어떠한 측정가능한 변화도 관찰되지 않았다.
<표 6> 5℃에서의 6개월 저장 후 SbVP 형성에 대한 HIAC 데이터
Figure 112016038794114-pct00007
주: 2개의 1mL 충전 바이알을 함께 합하여 소 부피 HIAC 검정을 수행하였다.
제제의 안정성을 동결 해동 실험에 의해 추가로 조사하였다. 제제 F1 내지 F10 (표 4)을 -20℃에서의 저장 동안 5회 동결 해동 주기에 적용하거나 또는 0 내지 6개월 5℃의 상승된 저장 온도에서 저장하고, 이후에 SEC 및 ICIEF에 의해 α-PDL1 단량체의 백분율 (도 6a 및 b) 및 제제 중 주요 피크의 백분율 (도 6c 및 d)에 대해 분석하였다. 나타낸 시점에서 동결 해동 주기 및 저장 후에 퍼센트 단량체 및 퍼센트 주요 피크의 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다.
F2 제제에서의 약물 물질 안정성 (표 4)은, 6개월 이하 동안 -20℃에서 스테인레스 스틸 미니캔 내 저장 동안 5회 동결 해동 주기를 수행하고, 이어서 CAC, SEC 및 ICIEF에 의한 안정성 측정을 수행함으로써 평가하였다 (표 7). -20℃에서 6개월 저장 후에 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
<표 7> -20℃에서 저장된 스테인레스 스틸 미니캔 내 약물 물질 안정성
Figure 112016038794114-pct00008
주: F/T = 동결/해동; SY = 미황색; CL = 투명.
100 mg/mL α-PDL1, 20 mM 히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스, 0.04% PS20, pH 5.6을 함유하는 제제에서의 약물 물질 안정성은, 3회 동결 해동 주기를 수행하고, 이어서 3개월 이하 동안 -20℃, 5℃ 또는 25℃에서 스테인레스 스틸 미니캔 또는 하스텔로이 미니캔 내 저장하고, 이어서 SEC에 의해 안정성 측정을 수행함으로써 평가하였다 (도 7a 및 b). pH 5.6에서 스테인레스 스틸 미니캔 내 저장과 하스텔로이 미니캔 내 저장 사이에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 약물 물질은 3회 동결 해동 주기 후에 -20℃에서 3개월 이하 동안 안정하였다. 스테인레스 스틸 및 하스텔로이 미니캔 사이의 경미한 차이에도 불구하고, 둘 다는 약물 물질 저장에 사용하기에 적절하였다.
50 mg/mL α-PDL1, 20 mM 히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스, 0.04% PS20, pH 5.6을 함유하는 제제에서의 약물 제품 안정성은, 3개월 이하 동안 -5℃, 25℃ 또는 40℃에서 20cc 바이알 내 16 mL 충전으로 저장하였을 때 평가하였고, 이어서 SEC 및 ICIEF에 의해 안정성 측정을 수행함으로써 평가하였다 (도 8a 및 b). 3개월 저장 후에 5℃에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 40℃에서 개월당 pH 5.6 분해율은 SEC 및 ICIEF 분석에 의해 각각 0.66% 및 22%였다.
F12 제제에서의 완충제의 평가는 SE-HPLC 및 ICIEF에 의해 측정된 주요 피크 분해율을 기반으로 하여 아세트산나트륨 완충제가 히스티딘 아세테이트 완충제와 유사한 단백질 안정성을 제공하였다는 것을 나타냈다 (표 8). 시험된 2종의 제제는 pH 5.5에서의 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스 및 0.04% (w/v) 폴리소르베이트 20 중 50 mg/mL α-PDL1 및 pH 5.5에서의 20 mM 아세트산나트륨, 120 mM 수크로스 및 0.04% (w/v) 폴리소르베이트 20 중 0 mg/mL α-PDL1이었다.
<표 8> 40℃에서의 히스티딘 아세테이트 및 아세트산나트륨 완충제 중 ICIEF 및 SE-HPLC 주요 피크에 대한 α-PDL1의 0차 분해율
Figure 112016038794114-pct00009
주: 모든 제제를 40℃에서 1개월 이하 동안 저장하였다.
종합하면, DoE 설계된 안정성 연구는 40℃에서 주요 피크 손실에 대한 농도의 어떠한 유의한 영향도 ICIEF에 의해 관찰되지 않았고, 반면에 보다 낮은 pH는 약간 더 신속한 주요 피크 손실률을 나타냈다는 것을 밝혀내었다 (도 1a-b). 40℃에서 어떠한 유의한 상호작용도 SE-HPLC에 의해 관찰되지 않았지만, 보다 높은 농도 제제는 보다 신속한 단량체 손실을 나타냈다 (도 3a-b). 또한, 보다 낮은 pH는 보다 신속한 단량체 손실률을 나타내는 것으로 또한 밝혀졌다. 유사한 결과가 25℃에서 관찰되었다 (도 2a-b 및 도 4a-b). 통계적 분석은 시험된 제제 파라미터 중 임의의 것 사이에 어떠한 사실상 의미있는 상호작용 (연결)도 밝혀내지 못했다.
교반 및 열 응력 연구
유리 바이알에서 교반 응력을 겪을 때 증가하는 농도의 PS20의 존재 하에 약물 제품의 안정성을 조사하였다. 20 mM 히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스, pH 5.5 중 57 mg/mL를 함유하는 제제를 0.005% 내지 0.06% 범위의 다양한 농도의 PS20을 갖는 2cc 유리 바이알 내 1 mL 충전으로 평가하였다. 유리 바이알을 실온에서 3일 동안 70 rpm으로 교반한 후에 SEC에 의한 안정성 (도 9a) 측정 및 탁도 (도 9b) 측정을 수행하였다. 0.005-0.06% PS20 수준을 갖는 제제는 교반 동안 안정성에 변화가 없었다. 그러나, PS20이 결여된 제제는 HMWS 증가로 인한 단량체 손실의 증가를 보였다. 이 실험에서, 0.005% PS20은 유리 바이알에서 단백질을 교반 응력으로부터 보호하기에 충분하였다.
다양한 온도 및 시간에서 저장한 다음에 유리 바이알에서 교반 응력을 겪을 때 약물 제품 제제 (표 4)의 안정성을 조사하였다. 제제 F1-F10을 각각 2cc 유리 바이알 내 1 mL 충전으로 평가하였다. 유리 바이알을 실온에서 1일 동안 70 rpm으로 교반한 후에 SEC에 의한 안정성 측정을 수행하였다 (도 10). 이 실험에서, 교반은 40℃, 25℃ 또는 5℃에서 일정 길이의 시간 동안 저장할 때 약물 제품의 안정성에 영향을 미치지 않았다.
병원 세팅에서 종종 일어나는 IV 백 수송을 지원하기 위해, 20mM 히스티딘 아세테이트, 240mM 수크로스, pH 5.5와 0.005%-0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20에 제제화된 α-PDL1을 사용하여 IV 백 교반 연구를 수행하였다. 등장성 염화나트륨 용액 (0.9% NaCl)을 함유하는 가장 통상적으로 이용가능한 250mL 폴리비닐 클로라이드 (PVC) 또는 폴리올레핀 (PO) IV 백을, 400-600mg의 α-PDL1 용액을 주사하고, 6시간 이하 동안 5℃에서 100rpm으로 오비탈 진탕기를 사용하여 교반함으로써 평가하였다. 연구의 결과는 중량-기준 투약을 지지하였고, 수송 동안 가시적인 입자 형성 (단백질 침전과 관련됨)을 방지하기 위해 단백질 용액 중 최소 0.015% (w/v)의 폴리소르베이트 20이 필요하다는 것을 입증하였다 (표 9). 추가로, 보관 수명에 걸쳐 폴리소르베이트 20 분해의 위험을 완화하기 위해, 폴리소르베이트 20 농도를 0.02% (w/v)에서 0.04% (w/v)로 증가시켰다.
<표 9> α-PDL1 약물 제품에 상이한 양의 PS20을 갖는 IV 백 교반 연구
Figure 112016038794114-pct00010
주: 모든 제제는 pH 5.5에서의 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 240 mM 수크로스 중 50 mg/mL α-PDL1이었다. 분석은 SE-HPLC를 사용하여 수행하였다. NT = 시험하지 않음; CAC = 색상, 외관 및 투명도; CO = 무색; CL = 투명; PFVP = 사실상 가시적인 미립자가 없음.
α-PDL1 제제의 안정성 평가
20 mM 히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스 및 0.04% PS20을 함유하는 제제에서 마스터 셀 뱅크(Master Cell Bank) 및 워킹 셀 뱅크(Working Cell Bank)로부터 생산된 물질에 대해 pH 5.2 내지 6.3 범위에 걸쳐 추가의 pH 스크린을 수행하였다 (표 10). SE-HPLC 및 ICIEF에 의한 분석은 pH 5.7 - 6.3이 화학적으로 및 물리적으로 매우 안정하며 제제에서 허용되는 pH 5.5 - 6.3 범위가 적절하였다는 것을 제시하였다 (도 11a 및 b). 보다 높은 pH는 단량체 및 주요 피크 분해율을 감소시켰으며, 이때 비율은 약 pH 5.7 내지 6.3에서 차츰 평평해졌다.
<표 10> 제제의 pH 스크린
Figure 112016038794114-pct00011
α-PDL1 제제에서 트립토판 (W) 및 메티오닌 (M) 산화에 대한 제제 부형제의 효과를 조사하였다. 펩티드 맵핑은 유의한 산화 증가가 없었다는 것을 보였다. 20 mM 히스티딘 아세테이트, 120mM 수크로스, 0.04% PS20을 함유하며 용액 pH가 5.8인 제제는, 제제가 약물 제품 또는 약물 물질을 위해 승온에서 1개월 동안 저장될 때 어떠한 명백한 트립토판 및 메티오닌 산화 증가도 없었다는 것을 보였다 (표 11).
<표 11> 펩티드 맵에 의한 선택된 제제에서의 Trp, M253 및 M429 산화의 백분율
Figure 112016038794114-pct00012
주: α-PDL1의 모든 제제는 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 120mM 수크로스, 0.04% PS20, pH 5.8을 함유하였다.
이들 제제 연구 및 통계적 분석으로부터의 결과를 기반으로 하여, 20 mM 히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20 중 60 mg/mL α-PDL1로 이루어지며 표적 pH 5.8인 액체 제제를 임상 연구를 위해 선택하였다.
임상 시험을 위한 투여량은 환자당 1200 mg α-PDL1의 균일 용량으로서 수행할 것이다. 표적 제품 프로파일을 충족시키기 위해 20cc 유리 바이알 내 공칭 20mL 충전 (1200mg α-PDL1)의 바이알 구성을 선택하였다.
동결/해동 연구는 pH 5.8에서의 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스 및 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20 중 60 mg/mL α-PDL1을 함유하는 의도된 제제를 사용하여 수행하였다. 5회 동결/해동 주기 후의 검정 결과는 120 mM의 수크로스가 α-PDL1을 동결/해동-유도 응집으로부터 보호한다는 것을 확증하였다 (표 12). 유사하게 의도된 액체 제제의 장기간 안정성은 2-8℃에서 6개월 초과 동안 안정하다는 것을 나타냈다 (표 13). 36개월에 걸친 연속 모니터링이 이 제제에 대해 진행 중이다. α-PDL1 약물 물질 및 약물 제품을 위한 표적 제제 및 시험된 연구 범위가 표 14에 제시된다.
<표 12> α-PDL1 약물 물질 개발 배치에 대한 대표적인 동결/해동 안정성 데이터
Figure 112016038794114-pct00013
주: 배치 PP400L-02142013은 pH 5.8에서의 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스 및 0.04% (w/v) 폴리소르베이트 20 중 60 mg/mL α-PDL1을 함유하였다. CL = 투명; SY = 미황색; PFVP = 사실상 가시적인 미립자가 없음; NA = 적용가능하지 않음, ICIEF = 영상화 모세관 등전 포커싱; CE-SDS = 모세관 전기영동 소듐 도데실 술페이트; HMW = 고분자량; LMW = 저분자량.
<표 13> α-PDL1 약물 개발 배치에 대한 안정성 데이터
Figure 112016038794114-pct00014
배치 PP400L-02142013-DP는 pH 5.8에서의 20 mM L-히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스 및 0.04% (w/v) 폴리소르베이트 20 중 60 mg/mL α-PDL1을 함유하였다. NA = 적용가능하지 않음; CAC = 색상, 외관 및 투명도; SY = 미황색, CL = 투명, PFVP = 사실상 가시적인 미립자가 없음; HMW = 고분자량; LMW = 저분자량; ICIEF = 영상화 모세관 등전 포커싱; CE-SDS = 모세관 전기영동 소듐 도데실 술페이트, NT = 시험하지 않음.
<표 14> α-PDL1 약물 물질 및 약물 제품을 위한 표적 제제 및 시험된 연구 범위
Figure 112016038794114-pct00015
α-PDL1 약물 제품 (60 mg/mL)은 등장성 염화나트륨 용액 (0.9% NaCl) 중에 희석한 후에 주입에 의해 투여할 것이기 때문에, 활성 성분의 상용성 및 안정성을 하기 모의 제조 및 투여 조건 하에서 시험하였다: 1) 임상 연구에서의 용량 범위를 포함하는, 2.4 - 9.6 mg/ml (희석 후 공칭 농도) 범위의 0.9% NaCl을 함유하는 주입 백 내 α-PDL1 약물 제품의 희석; 2) 등장성 염화나트륨 용액을 함유하는 주입 백 (PVC 또는 폴리올레핀으로 이루어진 백 제품-접촉 표면 재료)에 대한 단기간 노출; 3) (PVC 또는 폴리올레핀의 제품-접촉 표면)을 갖는 IV 주입 라인의 사용; 및 4) 0.2 μm 인라인 필터 (PES의 필터 막)의 사용.
샘플을 2℃-8℃에서 24시간 저장 후에 또는 30℃에서 24시간 후에 확산 광에 대한 노출 하에 시험하였다. 샘플을 SE-HPLC 및 ICIEF에 의한 순도, 단백질 농도 (UV에 의함), 광 차폐에 의한 육안으로 보이지 않는 입자, 색상, 투명도/단백광, 및 pH를 비롯한 적절한 안정성 지시 방법을 사용하여 시험하였다 (표 15).
<표 15> 0.2 μm 인라인 필터가 있는 및 없는 0.9% NaCl 주입 백에 24시간 동안 5℃ 또는 30℃에서 희석 및 저장된 α-PDL1의 안정성
Figure 112016038794114-pct00016
표 15 (계속): 0.2 μm 인라인 필터가 있는 및 없는 0.9% NaCl 주입 백에 24시간 동안 5℃ 또는 30℃에서 희석 및 저장된 α-PDL1의 안정성
Figure 112016038794114-pct00017
CO = 무색, CL = 투명, PFVP = 사실상 가시적인 미립자가 없음, A350 = 350 nm에서의 흡광도
표 15 (계속): 0.2 μm 인라인 필터가 있는 및 없는 0.9% NaCl 주입 백에 24시간 동안 5℃ 또는 30℃에서 희석 및 저장된 α-PDL1의 안정성
Figure 112016038794114-pct00018
표 15 (계속): 0.2 μm 인라인 필터가 있는 및 없는 0.9% NaCl 주입 백에 24시간 동안 5℃ 또는 30℃에서 희석 및 저장된 α-PDL1의 안정성
Figure 112016038794114-pct00019
CO = 무색, CL = 투명, PFVP = 사실상 가시적인 미립자가 없음, A350 = 350 nm에서의 흡광도
<표 16> 6시간 이하 동안 5℃에서 0.9% NaCl 주입 백에 희석된 α-PDL1의 교반 안정성
Figure 112016038794114-pct00020
CO = 무색, CL = 투명, PFVP = 사실상 가시적인 미립자가 없음, A350 = 350 nm에서의 흡광도
상기 기재된 바와 같은 모의 투여 연구에서 시험된 제품은 시험된 조건 하에서 물리적으로 및 화학적으로 안정하였다. 상이한 제품-접촉 재료로 구성된 주입 백, 주입 세트, 필터 및/또는 IV 투여 보조물은 성공적으로 자격을 갖추었을 때 첨가하였다.
정적 안정성에 추가로, 20mM 히스티딘 아세테이트, 120mM 수크로스, pH 5.8 및 보관 수명에 걸쳐 약물 제품에서 관찰될 수 있는 잠재적으로 최저 PS20 수준인 0.02% PS20 중에 제제화된 α-PDL1을 사용하여 IV 백 교반 연구를 수행하였다. 2-8℃에서 오비탈 진탕기를 사용하여 100 rpm의 속도로 교반을 수행하였다. 데이터는 약물 제품에 0.02% PS20을 사용하는 경우에, α-PDL1이 IV 백에 희석된 후에 5℃에서의 교반 시에 안정하다는 것을 시사한다 (표 16).
실시예에 사용된 항체의 서열
α-PDL1 경쇄 가변 영역
Figure 112016038794114-pct00021
α-PDL1 중쇄 가변 영역
Figure 112016038794114-pct00022
α-PDL1 전장 경쇄
Figure 112016038794114-pct00023
α-PDL1 전장 중쇄
Figure 112016038794114-pct00024
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> ANTI-PDL1 ANTIBODY FORMULATIONS <130> 146392022040 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 61/883,953 <151> 2013-09-27 <160> 36 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = D or G <400> 11 Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = S or L <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = T or S <400> 12 Ala Trp Ile Xaa Pro Tyr Gly Gly Ser Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = D or V <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = S or N <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = A or F <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = V or L <400> 18 Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = F or T <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Y or A <400> 19 Ser Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Y, G, F, or S <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = L, Y, F or W <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Y, N, A, T, G, F or I <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = H, V, P, T or I <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = A, W, R, P or T <400> 20 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 31 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

Claims (46)

  1. 40 mg/ml 내지 125 mg/ml의 농도의 항-PDL1 모노클로날 항체,
    15 mM 내지 25 mM의 농도의 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨,
    60 mM 내지 240 mM의 농도의 수크로스,
    0.005% (w/v) 내지 0.06% (w/v)의 농도의 폴리소르베이트 20
    을 포함하며,
    pH가 5.0 내지 6.3이며,
    상기 모노클로날 항체가 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인
    안정한 수성 제약 제제.
  2. 제1항에 있어서, 제제 중 상기 모노클로날 항체가 40 mg/ml 내지 80 mg/ml인 제제.
  3. 제1항에 있어서, 제제 중 상기 모노클로날 항체가 54 mg/ml 내지 66 mg/ml인 제제.
  4. 제1항에 있어서, 제제 중 상기 모노클로날 항체가 60 mg/ml인 제제.
  5. 제1항에 있어서, 제제 중 상기 모노클로날 항체가 60 mg/ml 내지 125 mg/ml인 제제.
  6. 제1항에 있어서, 제제 중 상기 모노클로날 항체가 125 mg/ml인 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨이 17 mM 내지 22 mM의 농도인 제제.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히스티딘 아세테이트 또는 아세트산나트륨이 20 mM의 농도인 제제.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 상기 수크로스가 60 mM 내지 180 mM인 제제.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 상기 수크로스가 120 mM인 제제.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 5.5 내지 6.1인 제제.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 5.5 또는 5.8인 제제.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 상기 폴리소르베이트 20이 0.02% 내지 0.04%인 제제.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제제 중 상기 모노클로날 항체가 60 mg/ml이고,
    제제 중 수크로스가 120 mM이고,
    pH가 5.8인
    제제.
  15. 제1항 또는 제6항에 있어서,
    제제 중 상기 모노클로날 항체가 125 mg/ml이고,
    제제 중 수크로스가 240 mM이고,
    pH가 5.5인
    제제.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 사전 동결건조에 적용되지 않은 것인 제제.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 유리 바이알 또는 금속 합금 용기에 저장되는 것인 제제.
  18. 제17항에 있어서, 금속 합금이 316L 스테인레스 스틸 또는 하스텔로이인 제제.
  19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 2-8℃에서 적어도 6개월 동안 안정한 제제.
  20. 제19항에 있어서, 제제 중 항체가 저장 후에 그의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유하는 것인 제제.
  21. 제20항에 있어서, 생물학적 활성이 PD-L1에 대한 항체 결합에 의해 측정되는 것인 제제.
  22. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균된 제제.
  23. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여하기에 적합한 제제.
  24. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 (IV) 투여를 위한 제제.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체가 60 mg/mL의 양이고,
    상기 히스티딘 아세테이트가 20 mM의 농도이고,
    상기 수크로스가 120 mM의 농도이고,
    상기 폴리소르베이트 20이 0.04% (w/v)의 농도이고,
    pH가 5.8인
    제제.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체가 125 mg/mL의 양이고,
    상기 히스티딘 아세테이트가 20 mM의 농도이고,
    상기 수크로스가 240 mM의 농도이고,
    상기 폴리소르베이트 20이 0.02%의 농도이고,
    pH가 5.5인
    제제.
  27. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 안정한 수성 제약 제제를 수용하는 용기를 포함하는 제조 물품.
  28. 제27항에 있어서, 용기가 유리 바이알 또는 금속 합금 용기인 제조 물품.
  29. 제28항에 있어서, 금속 합금이 316L 스테인레스 스틸 또는 하스텔로이인 제조 물품.
  30. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 감염, 암, 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 제제.
  31. 삭제
  32. 삭제
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