KR101824256B1

KR101824256B1 - Ｋｌ-6 측정용 면역 측정 시약

Info

Publication number: KR101824256B1
Application number: KR1020117022822A
Authority: KR
Inventors: 준이찌 곤도우; 미쯔아끼 야마모또; 치에 가네꼬
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2009-06-30
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2018-01-31
Also published as: TW201100800A; HK1168648A1; US20120040476A1; TWI509248B; US8940549B2; CA2756106A1; JP4663822B2; CN102422159A; KR20120101280A; EP2450709B1; WO2011001999A1; EP2450709A1; JPWO2011001999A1; ES2535529T3; CN102422159B; CA2756106C; EP2450709A4

Abstract

본 발명은 KL-6을 정확하게 측정하는 측정 시약 및 측정 방법, 특히 류마티스 인자 및/또는 류마티스 인자 이외의 비특이 물질을 포함하는 시료에 있어서의 KL-6을 정확하게 측정하는 측정 시약 및 측정 방법의 제공을 과제로 한다. 류마티스 인자 간섭 억제제가 함유된 pH가 4.0 내지 5.5인 용액 및 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체 함유 용액을 포함하는 면역 측정 시약을 이용함으로써 류마티스 인자 및/또는 류마티스 인자 이외의 비특이 물질을 포함하는 시료에 있어서의 KL-6을 정확하게 측정할 수 있다.

Description

ＫＬ-6 측정용 면역 측정 시약 {IMMUNOLOGICAL MEASUREMENT REAGENT FOR USE IN MEASUREMENT OF KL-6}

본 발명의 기술 분야는 시료 중 KL-6의 측정 시약 및 측정 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 기술 분야는 면역 응집 시험의 방법에 관한 것으로, 이 방법에 있어서의 비특이 반응을 억제하기 위한 시약 및 방법에 관한 것이다.

KL-6은 시알화 당쇄항원이고, 폐의 섬유화에 관여하고 있다(비특허 문헌 1, 특허 문헌 1 참조). KL-6은 간질성 폐렴에 의해 고 수치가 되고, 병태를 반영하여 변동되므로, 간질성 폐렴의 진단 및 치료 지침의 결정 등을 위해 측정된다(특허 문헌 1). 또한, 혈청 중 MUC-1/KL-6치를 측정함으로써 인터페론 투여에 의한 간질성 폐렴의 발병을 예측하는 방법(특허 문헌 2 참조), KL-6을 측정함으로써 폐암 환자의 예후를 검사하는 방법(특허 문헌 3 참조), 췌액 중의 KL-6을 측정함으로써 췌관 내 유두 점액성 선암 또는 췌장암을 검출하는 방법(특허 문헌 4 참조) 등도 개시되어 있다. 최근 들어, 약제성 간질성 폐렴 및 교원병 유래의 간질성 폐렴 등의 간질성 폐렴의 진단 및 치료 지침의 결정, 폐암이나 췌장암 등의 암 환자의 진단 방법 및 항체 의약이 투여된 관절 류마티스, 크론병, 전신형 청년성 특발성 관절염, 캐슬맨병 등의 환자의 간질성 폐렴의 진단 및 치료 지침의 결정 등을 위해 KL-6 측정의 필요성이 높아지고 있다.

특허 문헌 1 내지 4에서는, KL-6의 측정에 효소 면역 측정법(이하, ELISA법이라고 함)이 사용되어 있다. ELISA법은 신뢰되는 방법이지만, 다수의 시료를 신속, 간편, 또한 저렴하게 시험하기 위해서는 라텍스 면역 응집법이 우수하여, 미량 성분을 측정하는 임상 검사약으로서 널리 보급되고 있다.

그러나, ELISA법이나 라텍스 면역 응집법 등의 면역학적 측정 방법에 있어서는, 류마티스 인자를 포함하는 시료를 시험하는 경우, 시료에 따라서는 류마티스 인자의 간섭에 의한 비특이 반응의 발생이 문제가 되는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 2 참조). 또한, 류마티스 인자와 마찬가지로, 헤테로 친화성 항체(항 마우스 면역 글로블린 항체: HAMA, 항 염소 면역 글로블린 항체: HAGA 등)의 간섭에 의한 비특이 반응의 발생도 문제가 되는 것이 알려져 있다.

라텍스 면역 응집법에 있어서, 류마티스 인자의 간섭을 억제하기 위해, 라텍스에 결합시키는 항체의 Fc 부위를 제거하는 방법, 류마티스 인자에 결합하는 항체를 이용하는 방법(특허 문헌 5) 등이 알려져 있다.

그러나, 본 발명자들은 상기한 기지의 방법을 이용해도 여전히 비특이 반응의 발생을 충분히 억제할 수 없는 시료가 존재하는 것을 발견하였다.

일본 특허 공고 평(7)-31207호 공보 일본 특허 출원 공개 제2005-121441호 공보 일본 특허 제4083855호 공보 일본 특허 공개 제2006-308576호 공보 일본 특허 공개 평(7)-12818호 공보

New serum indicator of interstitial pneumonitis activity. Sialylated carbohydrate antigen KL-6. Kohno N, Kyoizumi S, Awaya Y, Fukuhara H, Yamakido M, Akiyama M. Chest. 1989 Jul;96(1):68-73. Interference by rheumatoid factor with the detection of C-reactive protein by the latex agglutination method. Deyo RA, Pope RM, Persellin RH. J Rheumatol. 1980 May-Jun;7(3):279-87.

본 발명은 KL-6을 정확하게 측정하는 측정 시약 및 측정 방법, 특히 류마티스 인자 및/또는 류마티스 인자 이외의 비특이 물질을 포함하는 시료 중에 있어서의 KL-6을 정확하게 측정하는 측정 시약 및 측정 방법의 제공을 과제로 한다.

본 발명자가 예의 검토한 바, 놀랍게도, 류마티스 인자 간섭 억제제를 함유하는 pH가 4.0 내지 5.5인 용액과 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체의 용액을 포함하는 면역 측정 시약을 이용하는 것으로 류마티스 인자 및/또는 류마티스 인자 이외의 비특이 물질을 포함하는 시료 중의 KL-6을 정확하게 측정할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하는 것에 이르렀다. 구체적으로는, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.

(1) 류마티스 인자 간섭 억제제를 함유하는 pH가 4.0 내지 5.5인 용액 및 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체를 함유하는 용액을 포함하는 KL-6의 면역 측정 시약.

(2) 불용성 담체가 라텍스 입자인, 상기(1)의 면역 측정 시약.

(3) 시료, 류마티스 인자 간섭 억제제 및 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체를 이용하여, pH가 4.0 내지 5.5인 용액 중에서, 시료 중의 KL-6과 불용성 담체에 담지된 항 KL-6 항체와의 면역 반응에 의해 발생하는 불용성 담체의 응집에 따른 흡광도 변화를 측정하는, KL-6의 면역 측정 방법.

(4) 시료에, 류마티스 인자 간섭 억제제가 함유된 pH가 4.0 내지 5.5인 용액 및 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체를 함유하는 용액을 첨가하고, 시료 중의 KL-6과 불용성 담체에 담지된 항 KL-6 항체와의 면역 반응에 의해 발생하는 불용성 담체의 응집에 수반하는 흡광도 변화를 측정하는, KL-6의 면역 측정 방법.

(5) 불용성 담체가 라텍스 입자인, 상기 (3) 또는 (4)의 면역 측정 방법.

본 발명에서 이용되는 류마티스 인자 간섭 억제제로서는, 면역 측정 시에 류마티스 인자의 간섭을 억제하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 HBR(스칸티보디스 랩(Scantibodies Lab)사 제조), 류마티스 인자와 반응하는 동물 유래의 IgM, IgG, IgA 등의 면역 글로블린을 들 수 있다.

상기, 동물 유래의 면역 글로블린은 모노클로널 항체라도, 폴리클로널 항체라도 좋다.

상기 류마티스 인자 간섭 억제제의 이용량은, 바람직하게는 10 ㎍/mL 내지 200 ㎍/mL이다.

본 발명에서 사용되는 류마티스 인자 간섭 억제제가 함유된 pH가 4.0 내지 5.5인 용액으로서는, 시트르산, 아세트산, 글리신, 굿 등의 완충액에 류마티스 인자 간섭 억제제를 첨가한 것을 들 수 있고, 상기 완충액의 농도는, 바람직하게는 5 내지 200 mM이다.

본 발명에서 사용되는 항 KL-6 항체는 특허 문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 폐선암 유래의 세포주 VMRC-LCR을 항원으로서 마우스에게 면역하여, 통상법의 모노 클로널 항체의 제작법에 준하여 제작할 수 있다(Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Kohler G, Milstein C. Eur J Immunol. 1976 Jul;6(7):511-9.)

본 발명에서 사용되는 불용성 담체로서는, 예를 들면 유기 고분자 분말, 무기 물질 분말, 미생물, 혈구 및 세포편 등을 들 수 있다.

상기 유기 고분자 분말로서는, 예를 들면 불용성 아가로스, 셀룰로오스, 불용성 덱스트란 등의 천연 고분자 분말, 폴리스티렌, 스티렌-스티렌술폰산염 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산에스테르 공중합체, 아세트산비닐-아크릴산에스테르 공중합체 등의 합성 고분자 분말 등을 들 수 있고, 특히 합성 고분자 분말을 균일하게 현탁시킨 라텍스가 바람직하다.

상기 무기 물질 분말로서는, 예를 들면 금, 티탄, 철, 니켈 등의 금속편, 실리카, 알루미나, 탄소 분말 등을 들 수 있다.

상기 불용성 담체의 평균 입경은 측정 방법, 측정 기기에 따라서 다르지만, 0.05 내지 1.0 ㎛인 것이 통상 이용된다.

상기 불용성 담체에 항 KL-6 항체를 담지시키는 방법으로서는, 예를 들면 화학적 또는 물리적으로 결합시키는 방법을 들 수 있다.

상기 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체는, 통상은 용액에 함유되어, 이용되는 용액으로서는, 트리스, 글리신, 굿 등의 완충액을 들 수 있다.

본 발명의 측정 방법에 있어서의 측정 대상의 「시료」로서는, 주로 생체(생물) 유래의 체액을 들 수 있고, 구체적으로는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 객담, 누액, 이루 또는 전립선액을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

상기 시약을 이용하여 항원 항체 반응을 측정할 때의 측정계로서는, 예를 들면 라텍스 응집 반응, 혈구 응집 반응 등이 이용된다. 상기 반응에 의해 발생한 응집을 측정하는 방법으로서는, 응집의 정도를 광학적으로 관찰하는 방법을 채용할 수 있다.

구체적으로는, 광학적으로 관찰하는 방법에 있어서는, 측정은 시료, 상기 류마티스 인자 간섭 억제제를 함유하는 pH가 4.0 내지 5.5인 용액 및 상기 항 KL-6 항체를 담지하는 불용성 담체의 용액을 혼합한 후, 시료 중의 KL-6과 불용성 담체에 담지된 항 KL-6 항체와의 면역 반응에 의해 발생하는 불용성 담체의 응집에 수반하는 산란광 강도, 흡광도, 또는 투과광 강도를 측정한다. 여기서, 상기 혼합액의 pH는, 바람직하게는 4.0 내지 5.5의 범위이다. 측정의 파장은 300 ㎚ 내지 1000 ㎚를 사용할 수 있고, 측정 방법은 공지의 방법에 따라서, 이용하는 불용성 담체의 입경, 농도, 반응 시간에 의해 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도의 증가 또는 감소를 측정한다.

또한, 본 발명의 면역 측정 방법을 실시하기 위해서는, 시료, 류마티스 인자 간섭 억제제 및 항 KL-6 항체를 담지하는 불용성 담체가 pH 4.0 내지 5.5의 용액 중에 존재한 상태에서, 시료 중의 KL-6과 불용성 담체에 담지된 항 KL-6 항체와의 면역 반응이 행해지면 좋다.

상기 pH 4.0 내지 5.5의 용액으로서는, 바람직하게는 5 내지 200 mM의 시트르산, 아세트산, 글리신, 굿 등의 완충액을 들 수 있다.

본 발명에 따르면, 라텍스 면역 응집법 등의 불용성 담체의 응집 반응을 이용한 면역 측정 방법에 있어서, 류마티스 인자나 헤테로 친화성 항체에 기인하는 비특이 반응, 류마티스 인자에 결합하는 항체나 각종 동물 유래의 항체로 간섭이 억제되지 않는 비특이 반응, 류마티스 인자나 헤테로 친화성 항체 이외에 기인하는 비특이 반응 및 항체 의약의 사용에 의한 비특이 반응 등의 발생 또는 증강이 우려되는 경우에도, 다수의 시료를 신속, 간편, 염가, 또한 정확하게 시험하는 것이 가능해졌다.

[실험 재료 및 방법]

<항 KL-6 항체>

항 KL-6 항체는 특허 문헌 1에 기재된 방법(특히, 실시예 1)에서 얻어진 항체를 사용하였다. 특허 문헌 1에 기재되어 있는 항체의 제작 방법은 이하와 같다.

1) 면역

8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 5×10⁶개의 폐선암 유래의 세포주(이하, VMRC-LCR이라고 함)로 피하에 면역하고, 그 후 2주간의 간격으로 2회 복강 내에 8×10⁶개의 세포를 주입하였다.

2) 세포 융합

최종 면역보다 3일 후에 비장을 취출하고, 스테인리스 메쉬를 통과시킴으로써 세포 현탁액을 제작하였다. 이 8.4×10⁷개의 비장 세포와 4.2×10⁷개의 8아자구아닌 내성 골수종 세포 P3-NSI-Ag4/1(NSI)을 혼합하고, 원침 후 침사에 1 mL의 45％ 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 6000)을 가하여, 2분간 완만히 교반하였다. 세정 후, 세포 혼합액을 10％ 소태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지(완전 RPMI 배지)에 현탁하고, 96 구멍 마이크로 배양 플레이트에 1 구멍당 10⁶개의 비율로 0.1 mL씩 뿌렸다. 24시간 후, 히포크산틴 100 μM, 아미노프테린 0.4 μM, 티미딘 16 μM을 포함하는 완전 RPMI 배지(HAT 배지)를 0.1 mL 가하였다. 배양 개시 후 2일째, 3일째, 5일째, 7일째, 10일째에 배양 상청 0.1 mL을 버리고, HAT 배지 0.1 mL을 가하였다. 12일 후에 모든 구멍에 하이브리도마가 증식하는 것이 관찰되었다.

3) 하이브리도마의 선택

VMRC-LCR 세포에 대해 항체를 생산하고 있는 하이브리도마를 효소 항체법에 의해 선택하였다. 효소 항체법은 이하와 같이 행하였다.

VMRC-LCR 세포를 96 구멍 마이크로 배양 플레이트에서 증식 한계에 도달할 때까지 배양하고, 0.25％ 글루타르알데히드로 5 내지 7분간 고정하고, 5회 세정하였다. 하이브리도마의 배양 상청 0.1 mL을 가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 5회 세정한 후, 제2 항체로서 50 μL의 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표지 염소 항 마우스 면역 글로블린을 가하여, 1시간 반응시켰다. 6 내지 7회 씻은 후, 1.1％ 과산화수소수와 150 ㎍/mL의 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS)를 포함하는 50 mM 시트르산 완충액을 100 μL 가하여, 10분간 실온에서 발색시켰다. 정지액으로서 10％ 옥살산을 50 μL 가하고, 405 ㎚의 흡광도를 마이크로 플레이트용 분광광도계에 의해 측정하여, 0.02 이상 흡광도가 있는 하이브리도마를 선택하였다.

선택된 하이브리도마는 미리 BALB/c 마우스의 흉선 세포(피더 세포)를 권취한 24 구멍 배양 플레이트로 옮겨지고, 100 μM 히포크산틴과 16 μM 티미딘을 포함하는 완전 RPMI 배지(HT 배지)에서 배양하였다. 증식 한계에 도달한 후, 다시 효소 항체법에 의해 VMRC-LCR 세포에 대해 항체 생산을 행하고 있는 하이브리도마를 선택하였다.

다음에, 선택된 하이브리도마를 한계 희석법에 의해 클로닝하였다. 즉, 세포를 50개/mL 혹은 10개/mL로 희석하여, 미리 피더 세포를 권취한 96 구멍 마이크로 배양 플레이트에 0.1 mL씩 분주하고, HT 배지에 의해 2주간 배양하였다. 1구멍에 1개의 하이브리도마 콜로니가 형성된 경우를 클론으로서 취출하였다. 효소 항체법에 의해 VMRC-LCR 세포에 대해 반응하고, 정상인 폐선 유아 세포에 대해 반응하지 않는 항체가 분비되어 있는 하이브리도마 클론을 선택하였다.

또한, 이들 클론 중, 인간 폐선암 조직에 반응하는 클론을 동결 세그먼트의 면역 퍼옥시다아제 염색에 의해 선택하였다. 즉, 인간의 폐암, 그 밖의 장기암 및 정상 조직을 수술 재료에 의해 얻어, 그 4 ㎛ 동결 세그먼트를 제작하였다. 아세톤 고정 후, 하이브리도마 클론의 배양 상청을 가하여, 실온에서 30분 반응시켰다. 잘 씻은 후, 비오틴 표지 항 마우스 IgG 항체(γ쇄, λ쇄, κ쇄와 반응함)와 실온에서 30분 반응시켰다. 더욱 세정 후, 아비딘과 비오틴 표지 서양고추냉이 퍼옥시다아제를 가하여 실온에서 1시간 반응시키고, 잘 씻은 후 기질로서 0.5 ㎎/mL의 디아미노벤티딘과 0.01％ H₂O₂를 포함하는 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.0)을 가하여 발색시켰다.

이와 같이 하여, 폐포 상피, 세기관지 상피, 기관지선 장액 세포, 갑상선 여포 세포, 식도 상피, 분문선 세포, 췌관 상피, 뇨세관 상피, 방광 이행 상피, 자궁내막, 폐선암, 폐편평 상피암, 폐소세포암, 위ㆍ십이지장 유두부ㆍ담관ㆍ췌장ㆍ결장ㆍ직장ㆍ갑상선ㆍ유선의 선암, 식도 편평 상피암에는 반응하지만, 기관지 상피, 위 표층 점막 세포, 유문선, 십이지장 상피, 결장 상피, 직장 상피, 간세포, 췌장 외분비 세포, 췌장 내분비 세포, 신사구체 세포, 자궁경부 편평 표피 세포, 피부 상피, 자궁 편평 상피암, 간세포암에는 반응하지 않는 모노클로널 항체를 생산하는 하이브리도마가 얻어져, 이를 KL-6 세포라고 명명하고, 그 생산하는 모노클로널 항체를 KL-6 항체라고 명명하였다.

4) 모노클로널 항체의 제작

생체내 이식법

하이브리도마를 이식하는 BALB/c 마우스에 미리(5 내지 10일 전) 2, 6, 10, 14-테트라메틸펜타데칸을 복강 중에 0.5mL 주사해 둔다. 다음에 하이브리도마 5×10⁶개를 복강 내에 이식한다. 이식된 마우스를 3주간 사육하면, 복강 내에 하이브리도마의 종양이 형성되어, 복부가 비대해진다.

이 결과, 복수 및 혈청 중에 고농도의 모노클로널 항체가 생성되어, 이들을 채취하였다.

<라텍스 입자의 제작>

교반기, 환류용 냉각기, 온도 검출기, 질소 도입관 및 재킷을 구비한 글래스제 반응 용기(용량 2L)에, 증류수 1100g, 스티렌 200g, 스티렌술폰산나트륨 0.2g 및 증류수 50g에 과황산칼륨 1.5g을 용해한 수용액을 투입하여, 용기 내를 질소 가스로 치환한 후, 70℃에서 교반하면서 48시간 중합하였다.

중합 종료 후, 상기 용액을 여과지로써 여과 처리하여, 라텍스 입자를 취출하였다. 얻어진 라텍스 입자의 입경을 투과형 전자 현미경 장치(니혼 덴시사 제조, 「JEM-1010형」)를 이용하여 10000배의 배율로 라텍스 입자를 촬영하여, 최저 100개 이상의 입자에 대해 화상 해석함으로써 입경을 측정하였다. 얻어진 평균 입경은 0.2 ㎛였다.

<실시예>

[실시예 1]

[항 KL-6 항체 감작 라텍스 입자 함유 용액(항 KL-6 항체를 감작시킨 라텍스 입자를 함유하는 용액; 이하, 제2 시약이라 함)의 제조]

평균 입경 0.2 ㎛의 1.0％ 라텍스 입자 함유 용액(5 mM 트리스-HCl pH 8.0)에, 0.7 ㎎/mL로 조정한 항 KL-6 항체 용액(5 mM 트리스-HCl pH 8.0)을 등량 첨가하여 4℃에서 2시간 교반 후, 2.0％ BSA 용액(5 mM 트리스-HCl pH 8.0)을 등량 첨가하여 4℃에서 1시간 교반하였다. 이것을 원심하고 상청을 제거한 후, 침전을 5 mM 트리스-HCl pH 8.0으로 재현탁하고, 파장 600 ㎚에서의 흡광도가 4.5Abs가 되도록 5 mM 트리스-HCl pH 8.0으로 희석하여 제2 시약으로 하였다.

[류마티스 인자 간섭 억제제 함유 용액(이하, 제1 시약이라 함)의 제조]

1000 mM의 염화나트륨, 1.0％ BSA, 50 ㎍/mL의 HBR(스칸티보디스 랩, 3KC533)을 포함하는 30 mM 시트르산 완충액(pH 4.0)을 제조하여 제1 시약으로 하였다.

(시료)

류마티스 환자 시료의 류마티스 인자 농도를 N-어세이 TIA RF 닛토보(닛토보 메디컬사 제조)을 이용하여, 또한 KL-6 농도를 피콜미(등록 상표) KL-6(산코 준야쿠사 제조)을 이용하여, 각각 첨부 문서 및 제조사 장려의 방법에 따라서 측정하였다. 이 KL-6의 측정치를 100％로서 나타내고, 본 발명의 면역 측정 방법에 의한 측정치와 비교하였다.

(KL-6 농도의 측정 방법)

제1 시약과 제2 시약을 조합하여, 히다치 7170형 자동 분석 장치를 이용하여, 류마티스 인자를 포함하는 시료 중의 KL-6 농도를 측정하였다. 구체적으로는, 시료 2.5 μL에 제1 시약 150 μL을 가하여 37℃에서 5분간 보온한 후, 제2 시약 50μL을 가하여 교반하였다. 응집 형성에 수반하는 흡광도 변화를, 그 후 5분간에 걸쳐서, 주파장 570 ㎚, 부파장 800 ㎚에서 측정하고, 그 흡광도 변화량을 농도 기지의 표준 물질을 측정하여 얻어지는 검량선에 적용시켜, KL-6 농도를 산출하였다.

(혼합액의 pH 측정 방법)

상기 KL-6 농도 측정 방법과 동일 비율로 시료, 제1 시약 및 제2 시약을 혼합한 후, 카스타니 LAB pH 미터 F-21(호리바 제작소)을 이용하여 pH를 측정하였다.

[실시예 2 내지 4]

실시예 1의 제1 시약의 30 mM 시트르산 완충액(pH 4.0) 대신에, pH 4.5(실시예 2), pH 5.0(실시예 3) 및 pH 5.5(실시예 4)의 30 mM 시트르산 완충액을 이용한 것 이외는, 실시예 1과 같은 시약을 이용하여, 실시예 1과 같은 측정 방법으로 측정을 행하였다.

(비교예 1 내지 6)

실시예 1의 제1 시약의 30 mM 시트르산 완충액(pH 4.0) 대신에, pH 3.5의 30 mM 글리신 완충액(비교예 1) 및 pH 6.0(비교예 2), pH 6.5(비교예 3), pH 7.0(비교예 4), pH 7.5(비교예 5) 및 pH 8.0(비교예 6)의 30 mM 인산 완충액을 이용한 것 이외는, 실시예 1과 같은 시약을 이용하여, 실시예 1과 같은 측정 방법으로 측정을 행하였다.

[결과 및 고찰]

류마티스 인자를 고농도로 포함하는 시료(류마티스 인자 고가 시료)에 대해, 제1 시약의 pH를 변동시킨 경우의 비특이 반응 억제 효과의 검토를 행하였다. 류마티스 인자 고가 시료 A 및 B 및 통상 시료 C에 대해, 제1 시약의 pH를 pH 3.5 내지 8.0으로 하여 측정한 결과(실시예 1 내지 4, 비교예 1 내지 6)를 표 1에 나타내었다.

피콜미(등록 상표) KL-6의 KL-6 농도를 100％로서 나타낸 경우에, 본 발명의 측정 방법에 의한 KL-6 측정치가 85％ 미만 또는 115％를 초과하는 경우에는 비특이 반응이 일어나 있다고 판단하고, 한편 85 내지 115％의 범위 내이면, 당해 방법에 있어서도 충분한 정확성을 갖는다고 판단하여, 비특이 반응의 억제 효과를 확인하였다.

류마티스 인자 고 수치 시료 B에서는, 종래 기술의 pH 범위(pH 6.0 내지 8.0)에 있어서, 류마티스 인자 간섭 억제제를 이용함으로써, 측정치는 피콜미(등록 상표) KL-6의 측정치에 대해 85 내지 115％의 범위 내였다. 한편, 류마티스 인자 고 수치 시료 A에서는 종래 기술의 pH 범위에 있어서(비교예 2 내지 6), 측정치는 피콜미(등록 상표) KL-6의 측정치에 대해 115％를 상회하여, 류마티스 인자 간섭 억제제를 이용해도 충분히 억제할 수 없는 비특이 반응이 인정되었다.

놀랍게도, 제1 시약의 pH를 4.0 내지 5.5로 함으로써, 류마티스 인자 고 수치 시료 A 및 B 모두 측정치가 피콜미(등록 상표) KL-6 측정치의 85 내지 115％의 범위 내로 되어, 비특이 반응이 억제되었다(실시예 1 내지 4). 이 결과는, 본 발명에 따르면, 류마티스 인자 및 류마티스 인자 이외의 비특이 반응을 억제하여, 정확하게 측정치가 얻어지는 것을 나타내고 있다. 또한, 시료 C에 있어서, pH 또는 완충제 의존적인 측정치의 변동이 인정되지 않았으므로, pH 변동 또는 완충제의 차이에 의한 KL-6 측정치에 대한 영향은 없는 것이 확인되었다.

또한, 시료, 제1 시약 및 제2 시약을 상기 KL-6 농도의 측정 방법과 동일 비율로 혼합했을 때의 pH의 측정 결과를 표 2에 나타내었다.

상기와 같이, 비특이 반응의 억제가 인정된 제1 시약 pH 4.0 내지 5.5에 있어서, 혼합 후의 pH도 4.0 내지 5.5였다(실시예 1 내지 4). 이로 인해, 비특이 반응의 억제 효과는 KL-6 농도 측정 시의 pH를 4.0 내지 5.5로 함으로써도 마찬가지의 효과가 얻어지는 것이 시사되었다.

[실시예 5 내지 6 및 비교예 7 내지 10]

(제1 시약의 제조)

<실시예 5 내지 6>

류마티스 인자 간섭 억제제 함유 용액으로서 1000 mM의 염화나트륨, 1.0％ BSA, 50 ㎍/mL의 HBR(스칸티보디스 랩, 3KC533)을 포함하는, 30 mM 시트르산 완충액(실시예 5: pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5) 및 30 mM 아세트산 완충액(실시예 6:pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5)을 제조하였다.

<비교예 7>

류마티스 인자 간섭 억제제 비함유(HBR을 포함하지 않음) 용액으로서 1000 mM의 염화나트륨, 1.0％ BSA를 포함하는, 30 mM 인산 완충액(pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0), 30 mM 글리신 완충액(pH 3.5) 및 30 mM 시트르산 완충액(pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0)을 제조하였다.

<비교예 8>

류마티스 인자 간섭 억제제 함유 용액으로서 1000 mM의 염화나트륨, 1.0％ BSA, 50 ㎍/mL의 HBR(스칸티보디스 랩, 3KC533)을 포함하는, 30 mM 인산 완충액(pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0), 30 mM 글리신 완충액(pH 3.5) 및 30 mM시트르산 완충액(pH 6.0)을 제조하였다.

<비교예 9>

류마티스 인자 간섭 억제제 비함유 용액으로서 1000 mM의 염화나트륨, 1.0％ BSA를 포함하는, 30 mM 인산 완충액(pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0), 30 mM 글리신 완충액(pH 3.5) 및 30 mM 아세트산 완충액(pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0)을 제조하였다.

<비교예 10>

류마티스 인자 간섭 억제제 함유 용액으로서 1000 mM의 염화나트륨, 1.0％ BSA, 50 ㎍/mL의 HBR(스칸티보디스 랩, 3KC533)을 포함하는, 30 mM 인산 완충액(pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0), 30 mM 글리신 완충액(pH 3.5) 및 30 mM 아세트산 완충액(pH 6.0)을 제조하였다.

(시료의 측정)

상기 실시예 5 내지 6 및 비교예 7 내지 10의 란에 기재의 각 완충액을 각각 제1 시약으로 하고, 또한 실시예 1 기재의 제2 시약을 제2 시약으로 하고, 실시예 1과 같은 측정 방법으로 KL-6 농도 측정을 실시하였다.

[결과 및 고찰]

류마티스 인자 간섭 억제제를 함유하지 않거나 또는 함유하는 용액의 pH를 변동시킨 경우의, 비특이 반응 억제 효과의 검토를 행하였다. 결과를 표 3, 표 4 및 표 5에 나타내었다. 또한, 각 조건 하에서의 검체마다의 거동으로부터 표와 같이 시료를 a, b, c의 3군으로 분류하였다.

표 3, 표 4의 c군에 있어서, 어떤 pH라도 류마티스 인자 간섭 억제제의 유무에 관계없이 피콜미(등록 상표) KL-6에 대해 ±15％ 내로 양호한 측정치가 얻어졌으므로, 류마티스 인자 간섭 억제제 그 자체는 측정치에 악영향을 미치지 않는 것이 시사되었다.

한편, 표 3의 a 및 b군에 포함되는 검체와 같이, 류마티스 인자 간섭 억제제를 포함하지 않는 용액을 이용하여 측정하면, 측정치가 피콜미(등록 상표) KL-6에 대해 115％를 상회하는, 비특이 반응이 일어나는 검체가 존재하는 것을 확인하였다.

류마티스 인자 간섭 억제제를 첨가한 경우에는, 표 4의 b군의 검체에서는 pH에 의하지 않고 양호한 측정치가 얻어져, 류마티스 인자 간섭 억제제에 의해 비특이 반응이 억제되는 것이 확인되었다. 한편, 표 4의 a군의 검체에서는 류마티스 인자 간섭 억제제를 첨가해도 pH 3.5 및 pH 6.0으로부터 8.0 사이에서는 비특이 반응의 억제 효과가 인정되지 않고, pH 4.0으로부터 5.5 사이에서만 강한 비특이 반응의 억제 효과가 인정되었다.

또한, pH 4.0 내지 6.0의 완충액을 시트르산(트리카르복실산)으로부터 아세트산(모노카르복실산)으로 변경한 경우라도, 류마티스 인자 간섭 억제제를 포함하지 않는 용액에서는, 측정치가 피콜미(등록 상표) KL-6에 대해 115％를 상회하는, 비특이 반응이 일어나는 검체가 존재한 데 대하여[표 5(1)], 류마티스 인자 간섭 억제제를 포함하는 용액에서는, pH 4.0으로부터 5.5 사이에서, 시트르산 완충액의 경우와 마찬가지의 비특이 반응의 억제 효과가 인정되었다[표 5(2)]. 한편, 표 3 내지 표 5의 a군에 있어서는, 완충액의 종류로서 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액 중 어느 것을 이용하더라도, pH 6.0으로는 비특이 반응의 억제 효과가 인정되지 않았으므로, KL-6을 측정할 때에는 완충액의 종류에 따르지 않고, 류마티스 인자 간섭 억제제를 사용하고, 또한 시료 희석액의 pH를 pH 4.0으로부터 5.5 사이로 조정하는 것이, 비특이 반응을 가장 효과적으로 억제하는 것이 시사되었다.

본 발명은 간질성 폐렴의 진단 및 치료 지침의 결정 등에 도움되기 위해 KL-6을 측정하는 방법, 당해 방법을 실시하기 위한 측정 시약 또는 시약의 키트를 제공한다. 본 발명은 특히, 약제성 간질성 폐렴 및 교원병 유래의 간질성 폐렴 등의 간질성 폐렴의 진단 및 치료 지침의 결정, 폐암이나 췌장암 등의 암 환자의 진단 방법 및 항체 의약이 투여된 관절 류마티스, 크론병, 전신형 청년성 특발성 관절염, 캐슬맨병 등의 환자의 간질성 폐렴의 진단 및 치료 지침의 결정 등을 위해 유용하다. 또한, 본 발명은 필요에 따라서 시약, 시약의 키트 또는 이들의 제조에 있어서의 용도로서 보호되므로, 산업상의 이용 가능성을 갖고, 또한 불특허 사유에는 해당하지 않는다.

Claims

류마티스 인자와 반응하는 동물 유래의 면역 글로블린을 함유하는 pH가 4.0 내지 5.5인 용액 및 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체를 함유하는 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 KL-6의 면역 측정 시약.
제1항에 있어서, 불용성 담체가 라텍스 입자인 면역 측정 시약.
제1항 또는 제2항에 있어서, 류마티스 인자와 반응하는 동물 유래의 면역 글로블린이 IgM, IgG 또는 IgA인 면역 측정 시약.
시료, 류마티스 인자와 반응하는 동물 유래의 면역 글로블린 및 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체를 이용하여, pH가 4.0 내지 5.5인 용액 중에서, 시료 중의 KL-6과 불용성 담체에 담지된 항 KL-6 항체와의 면역 반응에 의해 발생하는 불용성 담체의 응집에 수반하는 흡광도 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 KL-6의 면역 측정 방법.
제4항에 있어서, 불용성 담체가 라텍스 입자인 면역 측정 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 류마티스 인자와 반응하는 동물 유래의 면역 글로블린이 IgM, IgG 또는 IgA인 면역 측정 방법.
시료에, 류마티스 인자와 반응하는 동물 유래의 면역 글로블린이 함유된 pH가 4.0 내지 5.5인 용액 및 항 KL-6 항체가 담지된 불용성 담체를 함유하는 용액을 첨가하여, 시료 중의 KL-6과 불용성 담체에 담지된 항 KL-6 항체와의 면역 반응에 의해 발생하는 불용성 담체의 응집에 수반하는 흡광도 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 KL-6의 면역 측정 방법.
제7항에 있어서, 불용성 담체가 라텍스 입자인 면역 측정 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 류마티스 인자와 반응하는 동물 유래의 면역 글로블린이 IgM, IgG 또는 IgA인 면역 측정 방법.