TW201529603A

TW201529603A - α-烯醇化酶特異性抗體及其於癌症治療之應用

Info

Publication number: TW201529603A
Application number: TW103144368A
Authority: TW
Inventors: Shih-Chong Tsai; Neng-Yao Shih; Ta-Tung Yuan; Ko-Jiunn Liu; Shih-Chong Tseng; Chih-Yung Hu; Hsin-Yun Wang; Li-Tzong Chen
Original assignee: Develop Ct For Biotechnology
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2015-08-01
Also published as: CN106488932B; EP3083697A4; EP3083697A1; CA2949045C; RU2016129166A; TWI549967B; EP3083697B1; CA2949045A1; ES2729797T3; RU2656153C1; WO2015094330A1; AU2013408259A1; CN106488932A; AU2013408259B2

Abstract

本發明係關於一種抗-人類α-烯醇化酶(ENO1)抗體，該抗體可與包含人類ENO1蛋白(GenBank：AAH50642.1)之胺基酸序列296 F D Q D D W G A W Q K F T A 309(SEQ ID NO：9)及/或326 K R I A K A V N E K S 336(SEQ ID NO：10)的胜肽結合。本發明之抗體具有良好的結合活性(其結合親合力約為2.19×10-10mol/L)，且能夠顯著抑制各種腫瘤的細胞侵襲及腫瘤轉移。根據本發明所辨識之胜肽及抗體可用於診斷、預後以及治療已知可表現細胞表面ENO1的癌症，包含肺癌、乳癌、胰臟癌、肝癌、結腸直腸癌、前列腺癌與實體腫瘤。

Description

α-烯醇化酶特異性抗體及其於癌症治療之應用

本發明係關於一種與人類α-烯醇化酶蛋白(ENO1)特異性結合之抗體的製造及使用方法。

腫瘤起因於單一細胞之異常過度增生，形成一株轉型細胞。腫瘤細胞可表現出會被免疫系統辨識的獨特抗原。腫瘤相關抗原包括突變的致癌基因、突變的正常細胞蛋白、異常表現的細胞蛋白、異常的細胞表面蛋白和致癌基因的病毒蛋白質。免疫系統將這些腫瘤相關抗原視為非我，並且會製造抗體以消滅這些帶有外來抗原的腫瘤細胞，而留下健康的細胞。因此，鑑別出具免疫性之腫瘤相關抗原，可做為癌症治療臨床預後或治療應用之標的。

某些惡性腫瘤可藉由肺臟與胸腔壁間之過量體液(即，胸膜積水)作辨識。肺癌、乳癌以及淋巴癌佔全部惡性胸膜積水的大約75%。淋巴球浸潤與腫瘤細胞會使惡性胸膜積水被濃化。腫瘤相關免疫複合體或自體抗體，如抗-p53、抗核及抗-L-Myc抗體，已被發現存在於積水液中，而且與預後不良有關。數種肺癌相關抗原也已在惡性胸膜積水中被鑑別出，包含：細胞角蛋白19片段，神經元特異烯醇酶(ENO2)，鱗狀細胞癌抗原以及水溶性HLA-I等。

α-烯醇酶(enolase-1,ENO1)係一種多功能蛋白質，最早被發現係作為糖解途徑中之關鍵酵素。在一般情況下，ENO1會在細胞質中表現。然而亦發現ENO-1表現在許多癌細胞之細胞表面上做為血纖維蛋白溶酶原受體，且其亦表現於受活化的造血細胞，如嗜中性顆粒細胞、淋巴細胞和單核細胞上。已知，血纖維蛋白溶酶原受體蛋白之增量調控，會誘發尿激酶血纖維蛋白溶解系統(uPAS)的級聯反應。

尿激酶血纖維蛋白溶解系統(uPAS)是由尿激酶血纖維蛋白溶解酶原活化因子(uPA)、其共同結合受器(uPAR)以及兩個特異性抑制物：血纖維蛋白溶解酶原活化因子抑制劑1(PAI-1)與血纖維蛋白溶解酶原活化因子抑制劑2(PAI-2)所組成。尿激酶血纖維蛋白溶解酶原活化因子係將血纖維蛋白溶酶原轉換成一種活化的絲胺酸蛋白酶，即血纖維蛋白溶酶。血纖維蛋白溶酶參與許多組織重塑過程，例如基底膜BM和細胞外基質(ECM)重塑，這些都是腫瘤細胞增生和移轉時所需要的。此外，已有文獻指出尿激酶血纖維蛋白溶解系統會參與腫瘤之生成；影響腫瘤血管增生；腫瘤細胞增生、黏附與移轉；內部的血管形成以及在轉移部位生長。

具體而言，血纖維蛋白溶酶原之活化會造成胞外基質降解，反之則會導致增進癌細胞轉移和免疫細胞浸潤。換句話說，ENO1表現在癌細胞表面做為血纖維蛋白溶酶原受體，會增加癌細胞之侵襲活性。因此，ENO1為一種癌症治療之具潛力標的物。

本發明之具體實施態樣係關於一種可特異性結合人類ENO1之標靶結合劑，用以抑制配體(如：血纖維蛋白溶酶原)與ENO1結合。本發明之標靶結合劑可透過抑制血纖維蛋白溶酶原與ENO1之結合，來抑制血纖維蛋白溶酶原活化，減少細胞外基質的降解，進而阻止或降低癌細胞從胞外基質擴散。因此，根據本發明具體實施態樣之標靶結合劑，可用於抑制腫瘤生長及轉移。其可達到之作用機制包括(但不限於)抑制配體(例如血纖維蛋白溶酶原)與其受體ENO1結合，或阻絕受體ENO1與其配體之間的交互作用，藉以降低ENO1的有效濃度。

依據本發明之一項實施例，所述之標靶結合劑為一種能和人類ENO1特異性結合，而用以防止其配體(例如血纖維蛋白溶酶原)與ENO1結合的抗體。防止血纖維蛋白溶酶原與受體結合，可以避免血纖維蛋白溶酶原活化。此可導致在癌細胞細胞外基質中的尿激酶血纖維蛋白溶解系統受到抑制。

根據本發明之實施例，該抗體與ENO1有高度親和力，如具有K_d值小於0.3nM，此類緊密結合劑能夠以高效率抑制ENO1。

根據本發明之某些實施例，標靶結合劑為一種能和人類ENO1結合，且能有效抑制癌細胞中被誘發的血纖維蛋白溶酶活性(抑制效率高達80%、90%或100%)之抗體。可藉由在一癌細胞(例如U937人類淋巴瘤癌細胞)以10微克/毫升之脂多醣(LPS)培養5小時，誘導ENO1表現(即血纖維蛋白溶酶活化)進行抑制分析。可使用一適當濃度之抗體來分析對於此類被誘發的血纖維蛋白溶酶活性之抑制效果。使用本發明之抗體，可在20微克/ 毫升或更低之抗體濃度下偵測到此類抑制效果。

根據本發明之某些實施例，標靶結合劑為一種能和人類ENO1結合之抗體。該抗體可用於抑制癌細胞之侵襲活性。例如，本發明之抗體在50微克/毫升或是更低之抗體濃度時，可抑制人類非小細胞肺癌CL1-5細胞之侵襲活性達50%、60%或70%以上。

根據本發明之某些實施例，標靶結合劑為一種能和人類ENO1結合以抑制胞外基質降解，進而抑制癌細胞自細胞外基質游離之抗體。例如，本發明之抗體可在其抗體濃度為50微克/毫升或更低時，對於由血纖維蛋白溶酶介導之人類非小細胞肺癌CL1-5細胞從膠原蛋白或纖連蛋白游離，達到40%、50%或60%以上的抑制效果。

根據本發明之實施例，標靶結合劑(如抗體)可包含一具有如SEQ ID NO：1中所列其中一互補性決定區(Complementarity Determining Region,CDR)序列之重鏈胺基酸序列。

根據本發明之實施例，標靶結合劑(如抗體)可包含一具有如SEQ ID NO：2中所列其中一互補性決定區(Complementarity Determining Region,CDR)序列之輕鏈胺基酸序列。

根據本發明之某些實施例，所述之標靶結合劑為一抗體，該抗體可為單株抗體或多株抗體。

根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：2中所列LCDR1、LCDR2或LCDR3任一種序列之輕鏈胺基酸序列。

根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：2中所列LCDR1、LCDR2或LCDR3任二種序列(即，LCDR1與LCDR2、LCDR1與LCDR3、或LCDR2與LCDR3)之輕鏈胺基酸序列。

根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：2中所列LCDR1、LCDR2及LCDR3序列之輕鏈胺基酸序列。根據本發明之特定實施例，該抗體可為人源化抗體或全人源單株抗體。

根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：1中所列HCDR1、HCDR2或HCDR3任一種序列之重鏈胺基酸序列。

根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：1中所列HCDR1、HCDR2或HCDR3任二種序列(即，HCDR1與HCDR2、HCDR1與HCDR3、或HCDR2與HCDR3)之重鏈胺基酸序列。

根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：1中所列之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的重鏈胺基酸序列。根據本發明之某些實施例，該抗體可為人源化抗體或全人源單株抗體。

根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：2中所列任一種CDR序列之輕鏈胺基酸序列。根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：1中所列任一種CDR序列之重鏈胺基酸序列。根據本發明之某些實施例，該抗體可為人源化或全人源單株抗體。

根據本發明之某些實施例，所述可與人類ENO1結合之抗體包含，一具有如SEQ ID NO：1中所列任一種CDR序列之重鏈胺基酸序列，以及一具有如SEQ ID NO：2中所列任一種CDR序列之輕鏈胺基酸序列。根據本發明之某些實施例，該抗體可為人源化或全人源單株抗體。

根據本發明之某些實施例，所述之標靶結合劑(如抗體)可與血纖維蛋白酶原競爭結合至人類ENO1蛋白。根據本發明之某些實施例，所述之標靶結合劑包含，一具有如SEQ ID NO：1中所列至少一種CDR序列之重鏈胺基酸序列，以及一具有如SEQ ID NO：2中所列至少一種CDR序列之輕鏈胺基酸序列。

根據本發明之某些實施例，所述之標靶結合劑可與一包含人類ENO-1蛋白質(GenBank：AAH50642.1)之胺基酸序列²⁹⁶ F D Q D D W G A W Q K F T A ³⁰⁹(SEQ ID NO：9)，或³²⁶ K R I A K A V N E K S³³⁶(SEQ ID NO：10)之抗原決定基結合。根據本發明之某些實施例，所述之標靶結合劑包含，一具有如SEQ ID NO：1中所列至少一種CDR序列之重鏈胺基酸序列，以及一具有如SEQ ID NO：2中所列至少一種CDR序列之輕鏈胺基酸序列。

根據本發明之某些實施例，本發明之結合劑可包含一存在非抗體分子中之抗原結合位置。例如，所述之結合劑可包含一或多個CDR，如一組存在於非抗體蛋白支架的CDR，於後續進一步討論。

本發明之某些實施例係關於，一種用於檢測病患或病患樣本中人類ENO1蛋白含量之分析方法。本發明之方法包含：將抗-ENO1抗體與取自患者的生物樣本接觸，並檢測該抗體與存在該樣本中的人類ENO1蛋白質之間的結合程度。在更特別的具體實施例中，所述之生物樣本為血液或血漿。

本發明之其他具體實施態樣係關於，一種包含一標靶結合劑(其可包括一抗體或其功能性片段)，及一醫藥上可接受的載體之組合物。

本發明之另外其他具體實施態樣係關於，用於有效治療患有ENO1疾病或失調症之個體(例如，人類或動物)的方法。所述之方法可包括，挑選需要施予腫瘤或非腫瘤疾病治療之個體，以及將治療上有效劑量之可與ENO1特異性結合的抗體(可為人源化或全人源單株抗體)投藥予該個體。

本發明之抗體可用於治療人類ENO1蛋白相關的疾病或失調症。所述人類ENO1蛋白相關的疾病或失調症可為任一種因人類ENO1蛋白質異常活化或表現而引起的病況。此類疾病之實例包括，其中人類ENO1蛋白質與其配體異常相互作用，從而改變細胞粘附或細胞信號傳遞特性者。這種在細胞粘附或細胞信號傳遞特性的改變，會導致腫瘤性疾病或某些免疫疾病。

舉例而言，所述人類ENO1蛋白相關疾病可為一腫瘤性疾病，例如肺癌、乳腺癌.胰腺癌、肝癌、結腸直腸癌及前列腺癌。根據本發明之某些實施例，所述標靶結合劑(如抗體)可與包含人類ENO1蛋白質(GenBank：AAH50642.1)之胺基酸序列²⁹⁶F D Q D D W G A W Q K F T³⁰⁸(SEQ ID NO：9)，或³²⁶ K R I A K A V N E K S³³⁶(SEQ ID NO：10)的胜肽結合，且可用於治療上述的人類ENO1蛋白相關疾病或失調症。

本發明之其他具體實施態樣係關於，用於抑制因ENO1所誘發之個體內細胞從癌細胞外基質脫離之方法。此等方法可包括，挑選需要治療因ENO1所誘發的細胞脫離之疾病的個體(例如，人或動物)，及將治療上有效劑量之抗體投藥予該個體，其中所述之抗體係與ENO1特異性結合。所述抗體可為人源化或全人源單株抗體。

本發明進一步之實施態樣係關於，一抗體用於製備治療個體(例如，人或動物)之ENO1相關疾病或失調症之藥物的用途，其中所述之抗體係與ENO1特異性結合。所述抗體可為人源化或全人源單株抗體。

根據本發明之某些實施例，所述之標靶結合劑可用於製備治療動物體內因ENO1所誘發的細胞自細胞外基質游離之藥物，其中所述之抗體係與ENO1特異性結合。所述抗體可為人源化或全人源單株抗體。

本發明所描述之某些實施例係關於，其與人類ENO1結合並影響人類ENO1功能之單株抗體。本發明之其它實施例係關於，一種具有所希望治療應用特性之抗-ENO1抗體製劑。所述之特性可包括：對於ENO1具有高親和力、可於活體外及活體內中和ENO1活性之能力、以及抑制由ENO1所誘發的腫瘤細胞游離、生長與轉移的能力。

於某些實施例中，本發明係關於一種可以極高親和力(亦即，低的K_d值)與人類ENO1結合之抗體。例如一種能以低於約10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10¹⁰或約10^-11M，或任何介於彼等之範圍或數值的K_d值與ENO1結合之人類、兔、小鼠、嵌合型或人源化抗體。可使用如本說明書或根據本發明技術領域已知技術所述之ELISA及/或BIACORE方法，測定其抗原親和力及/或結合性。

應當理解，本發明之實施例並不限於任何特定形式之抗體，或抗體產生或製造方法。例如，所述之抗-ENO1抗體可為全長抗體(如，具有完整的人類Fc區域)或抗體片段(如，一種Fab、Fab'或F(ab')₂、FV或Dab，Dab為人類抗體之最小功能性結合單位)。此外，所述之抗體可從能夠分泌該抗體之融合瘤細胞，或從已經由編碼該抗體之一個或多個基因轉形或轉染的重組細胞製得。

本發明之其它實施例係關於，一種編碼本文發明所述任一抗體之分離核酸分子、具有編碼抗-ENO1抗體之分離核酸分子的載體、或由任一所述之核酸分子轉形的宿主細胞。

除此以外，本發明之某些實施例係關於，一種用於製造抗-ENO1抗體之方法，其包含將宿主細胞培養於可使核酸分子被表達而產生所述抗體的條件下，隨後再將所述之抗體回收。應了解，本發明之實施例亦可包括任何編碼本發明之抗體或其抗體片段的核酸分子，包括經最適化用以於其轉染至宿主細胞中產生抗體時，增加抗體或抗體片段產率之核酸序列。

本發明之進一步實施例係關於，用於製造對ENO1具高親和力抗體之方法，其包含使用人類ENO1蛋白質、其蛋白片段及其一或多種直系同源序列或片段免疫一哺乳動物。

其它實施例係關於，一種產生及鑑別得到可與人類ENO1特異性結合之單離抗體的方法。ENO1生物活性之抑制作用可由此等抗體執行，而達到防止ENO1所誘導的癌細胞游離、侵襲及其他所希望對於癌症的作用。

本發明之其它實施例係關於，包含有效劑量之抗-ENO1抗體之醫藥組成物。該組成物可進一步包含藥學上可為接受之載體或稀釋劑。於另外之實施例中，所述之抗-ENO1抗體或其片段，可與一治療劑共軛結合。所述之治療劑可為(例如)一種毒素或放射性同位素。

本發明之另外其它實施例係關於，用於治療患者之與ENO1表現相關的疾病或失調症的方法。該方法可包括對患者投藥予一有效劑量之抗-ENO1抗體。所述之抗-ENO1抗體可單獨投藥或，或可與其他抗體或化療藥物或放射療法結合投藥。例如，用以阻斷細胞游離之單株、寡株或多株的ENO1抗體混合物，可與一種顯示能直接抑制腫瘤細胞增殖的藥物結合投藥。該方法可在體內進行，且所述之患者較佳地為人類病患。於一較佳實施例，該方法涉及治療一種與ENO1相關疾病或失調症，包括(但不限於)腫瘤性疾病，如肺癌、乳癌、胰腺癌、肝癌、結腸直腸癌、前列腺癌和/或實體腫瘤。

本發明之某些實施例係關於，一種用於監測癌症發展之方法。該方法可包含檢測一檢體(如，腫瘤細胞)中α-烯醇酶蛋白之含量，其中ENO1增加的程度係與癌症嚴重程度相關聯。根據本發明之實施例，該可藉由測量ENO1特異性抗體與ENO1蛋白的結合而測定所述ENO1蛋白之含量。

本發明之某些實施例係關於，一種用於檢測癌症之方法。該方法可包含測定血清檢體中ENO1特異性抗體之含量，其中低含量之ENO1特異性抗體濃度係指出惡性腫瘤的存在。

圖1A與1B分別顯示使用流式細胞儀分析(圖1A)及免疫染色法(圖1B)偵測NO1存在惡性腫瘤細胞之表面位置的研究結果，詳細步驟如實施例1所述。數據顯示，ENO1係位於惡性腫瘤細胞(NHRI-L89及CA926)表面上，但並未出現於正常肺表皮細胞(NHBE及SAEC)之細胞表面。

圖2顯示由抗細胞表面ENO1之多株抗體對於高侵入性CL1-5肺腺癌細胞之侵襲活性的抑制作用。其詳細實驗步驟如實施例2所述。數據顯示，投藥抗-ENO1多株抗體可減弱CL1-5之侵襲。

圖3顯示抗人類ENO1多株抗體減弱CL1-5F4細胞在肺臟的組織侵襲能力。對動物施予抗體投藥，並在使用IVIS系統注射腫瘤後第12天與第19天，偵測動物內之肺轉移性群落形成。詳細實驗步驟如實施例3所述，結果顯示ENO1多株抗體可在活體內抑制CL1-5F4轉移至肺臟。

圖4係顯示抗-ENO1抗體融合瘤細胞之產生，以及利用流式細胞儀檢驗每一單株抗體選殖株。於實施例4描述用於免疫小鼠與產生融合瘤，以及每一抗體之製造與利用流式細胞儀檢驗抗體之步驟。結果顯示，所有5種融合瘤抗體皆可辨識存在CL1-5F4肺腺瘤細胞上之表面ENO1。

圖5A顯示利用ELISA方法，偵測5種分離自各別融合瘤腹水之抗體與ENO1的結合情形。硫酸銨分離純化、蛋白A管柱分離純化以及SDS-PAGE分離純化係如實施例5所述。圖5B係顯示5種不同抗人類ENO1抗體之K_d值。

圖6顯示5種分離自各別融合瘤腹水之抗體分別進行U937血纖維蛋白溶解測試之結果。藉由LPS處理誘發ENO1在人類U937淋巴瘤細胞株表現，以及血纖維蛋白溶酶原活性測試方法係如實施例6所述。此等數據亦顯示，5種不同抗-ENO1抗體在對抗ENO1之血纖維蛋白溶酶原受體方面，具有不同抑制活性，而且其抑制活性與解離常數K_d值有相關聯。

圖7顯示分別以5種分離自各別融合瘤腹水之抗體處理CL1-5細胞對於其侵襲活性之抑制作用。其詳細步驟如實施例7所述。此等數據顯示，所有5種不同抗-ENO1抗體皆可抑制CL1-5細胞之侵襲活性。感興趣的是，即使單株編號8之解離常數高於單株編號10之解離常數約7.2倍，單株編號8對CL1-5細胞侵襲活性之抑制仍近似於單株編號10。

圖8A顯示以不同濃度之分離自融合瘤的EN10 mAb處理過的CL1-5細胞之侵襲活性。詳細實驗步驟如實施例8所述。此等數據顯示，EN10 mAb係以劑量依存方式抑制CL1-5之侵襲活性。

圖8B顯示，在利用LPS誘導細胞表現表面ENO1後，偵測以不同濃度之分離自融合瘤的EN10 mAb處理過的U937細胞之侵襲活性結果。詳細步驟如實施例8所述。此等數據顯示，EN10 mAb係以劑量依存方式抑制U937細胞之侵襲活性。

圖9顯示，EN10 mAb可辨認存在於經LPS處理之U937細胞的細胞表面ENO1。詳細步驟如實施例9所述。

圖10A顯示CL1-5肺腺瘤細胞對於基質蛋白質之附著活性。附著力測試如實施例10所述。此等數據顯示，CL1-5細胞對於膠原蛋白及纖連蛋白具有較高的附著活性。

圖10B顯示經由EN10 mAb處理，對於CL1-5細胞自纖連蛋白游離之抑制結果。細胞相關的附著分析如實施例10所述。此等數據顯示，EN10 mAb係以劑量依存方式抑制CL1-5細胞自纖連蛋白游離之活性。

圖10C顯示經由EN10 mAb處理，對於CL1-5細胞自膠原蛋白游離之抑制結果。細胞相關的附著分析如實施例10所述。此等數據顯示，EN10 mAb係以劑量依存方式抑制CL1-5細胞自膠原蛋白游離之活性。

圖11A描述EN10m Ab之可變重鏈區胺基酸序列(SEQ ID NO：1)。其骨架區(FR1、FR2、FR3與FR4)及CDRs(HCDR1、HCDR2與HCDR3)如所示。選殖單株EN10 mAb cDNA之方法如實施例11所述。

圖11B描述EN10m Ab之可變輕鏈區胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。其骨架區(FR1、FR2、FR3與FR4)及CDRs(LCDR1、LCDR2與LCDR3)如所示。選殖單株EN10 mAb cDNA之方法如實施例11所述。

圖12A顯示EN10 mAb與ENO1之刪減變異型的結合活性。EN10 mAb之結合抗原決定基係位於人類ENO1蛋白之胺基酸殘基編號293和434之間。ENO1之大部分刪減以決定EN10 mAb之結合區域的方法如實施例12所述。

圖12B顯示從大腸桿菌純化出6種ENO1之C-端缺失突變蛋白的12% SDS-PAGE分析結果。ENO1缺失突變型之詳細純化步驟如實施例12所述。

圖12C顯示6種ENO1之C-端缺失突變型的EN10 mAb結合活性。EN10 mAb之結合抗原決定基係位於人類ENO1蛋白之胺基酸殘基編號296和336之間。ENO1之大部分刪減以決定EN10 mAb之結合區域的方法如實施例12所述。

圖13A描述人類ENO1蛋白之介於胺基酸殘基編號296和336之間的晶體結構及表面-曝露。結構推測分析如實施例12所述。

圖13B顯示於大腸桿菌純化得11種ENO1之丙胺酸掃描突變型蛋白的12% SDS-PAGE分析結果。ENO1突變型蛋白之詳細純化步驟如實施例13所述。

圖13C顯示11種丙胺酸掃描突變型蛋白對於EN10 mAb的ENO1結合ELISA分析結果及K_d值。結果顯示，ENO1抗原決定基1,FD Q D D W G A W Q K F TA(SEQ ID NO：9)及抗原決定基2,K R I A K A V N EK S(SEQ ID NO：10)係位於人類ENO1蛋白之胺基酸殘基編號296和336之間，且涉及EN10 mAb之結合。丙胺酸掃描方法如實施例13所述。

圖13D顯示位於人類ENO1蛋白之胺基酸殘基編號296和336(SEQ ID NO：49)之ENO1抗原決定基1(FDQDDWGAWQKFTA(SEQ ID NO：9))及抗原決定基2(KRIAKAVNEKS(SEQ ID NO：10))的序列，其參與人類ENO1蛋白和EN10 mAb之結合。

圖14A顯示人類ENO1蛋白之3D結構。圖14B描述EN10 mAb Fab位於其與人類ENO1蛋白之血纖維蛋白溶酶原結合區之複合體中的演繹構造(以條帶-螺旋、輕鏈灰色、重鏈黑色表示)。ENO1蛋白與EN10 mAb之晶體結構推測分析如實施例14所述。

圖15A顯示用於產生小鼠-人類嵌合型EN10 mAb抗體之表現載體。EN10 mAb嵌合型抗體之詳細純化步驟如實施例15所述。

圖15B描述使用嵌合型抗體測定EN10 mAb之結合親和力與動力常數的結果。嵌合型抗體之表現、純化及K_d值分析的詳細步驟如實施例15所述。

圖16顯示EN10 mAb在有補體存在下對於肺腫瘤生長的抑制作用。EN10 mAb之投藥及經以抗體處理之腫瘤生長遲滯分析如實施例16所述。數據顯示，在CL1-5異種移植小鼠模式中，每週兩次投藥EN10 mAb與補體，具有近似於以相同劑量之市售藥物ErbituxTM所達到的治療功效。

圖17A、17B與17C顯示使用脾臟-肺臟轉移群落形成分析檢視以EN10 mAb阻礙胰臟癌腫瘤擴散之結果。EN10 mAb之投藥及經以抗體處理的轉移性腫瘤生長抑制分析如實施例17所述。研究結果顯示，在脾臟-肺臟轉移性小鼠模式中，相較於以相同劑量對照組IgG處理之小鼠，每週兩次投藥10mpk EN10 mAb可減低小鼠的轉移性腫瘤結節數量、腫瘤體積及腫瘤重量。

定義

除非另行指定，本說明書中所使用的科學與技術術語，應具有熟悉本發明技術領域者所一般理解的定義。而且，除非內文中另有需要，單數名詞應包括其多數形式，反之複數名詞亦應包括其單數形式。一般而言，與本文所述之細胞和組織培養、分子生物學及蛋白質和寡-聚核苷酸化學與雜合技術結合使用的專有名詞，為本發明所屬技術領域所熟知且慣用者。

本發明使用習知於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養與轉型(例如，電穿孔法、脂質感染等)之標準技術。酵素反應及純化技術係根據製造商的說明書，或依所屬領域例常使用或如本說明書中所述的方法進行。前述之技術與製程一般係根據所屬技術領域習知的方法完成，且經描述於各種於本發明說明書所引用及討論之一般及較特別的參考文獻中。參考(例如)Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊(第3版，Cold Spring Harbor Laboratory出版，冷泉港，N.Y.(2001))，其以引用方式納入本說明書。與本文所述之分析化學、合成有機化學及醫學和製藥化學雜合技術結合使用的專有名詞及實驗方法與技術，為本發明所屬技術領域所熟知且慣用者。使用標準技術進行化學合成、化學分析、醫藥品之製備、調配與遞送及患者之治療。

根據本發明之揭露，所使用的下列術語(除非另行制定)應了解是具有以下定義：術語”及/或”用於本文係指，兩種所指定之特徵或組成分其個別特定揭露包含或不包含另一者。舉例而言，”A及/或B”係指(i)A、(ii)B與(iii)A及B之任一特定揭露，就如同本文中逐一所列者。

拮抗劑可為一種多肽、核酸、醣類、脂質、小分子量化合物、寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、反義分子、重組蛋白、抗體或其共軛物或融合蛋白質。關於RNAi之回顧文獻請參見Milhavet O,Gary D S,Mattson M P.(Pharmacol Rev.2003 December；55(4)：629-48.Review.)；而關於反義方案之回顧文獻請參見Opalinska J B,Gewirtz A M.(Sci STKE.2003 Oct.28；2003(206)：pe47)。

疾病相關之"ENO1"異常活化或表現，可為任何不正常、不希望或病態的細胞附著，例如與腫瘤相關之細胞附著。與細胞附著相關之疾病包括(但不限定於)非實體腫瘤，如白血病(或淋巴瘤)，及實體腫瘤如黑色素瘤、小細胞肺癌、肝細胞(肝)癌、胃癌、頭與頸癌、肝系統癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、子宮癌、女陰癌、結直腸癌與胰臟癌。

術語ENO1意指由ENO1與ENO2或ENO3所組成的異二聚體。

用於本文，術語“抗體”係廣義地泛指免疫球蛋白、自體抗體、單株抗體和多株抗體，以及其活性片段。所述之片段可指其具有與同源抗體結合之活性，或其在生物功能方面具有活性。本發明之抗體可為使用本發明所屬領域已知的技術製得之嵌合型、人源化或全人源抗體。

用於本文，術語“單株抗體”係指在化學及免疫學上為同源的抗體，一般係由融合瘤製造。參見，實驗室手冊，Harlow與Lane編著，冷泉港，N.Y.(1988)。

用於本文，術語“多株抗體”係指由一株以上抗體-合成性漿細胞(B-淋巴細胞)純系，對於同一抗原反應時所產生的抗體。彼等通常係由動物體在受該抗體免疫之後產生。

用於本文，術語“嵌合型抗體”係指含有源自一種以上來源之序列的抗體。例如，此類抗體可含有源自非-人類來源之序列，其後藉由導入人類序列而進行修式。用於本文，術語“人源化抗體”係指其中將非-人類抗體之最小部分導入另一人類抗體所得之抗體。用於本文，術語“全人源抗體”係指其中實際上每一蛋白部分在人體內為實質不具免疫原性之抗體，僅具有少數的序列改變或變異。

用於本文，術語“α-烯醇化酶特異性抗體”係指一種對於哺乳動物ENO1(但非對於ENO2或ENO3)具有高特異性之抗體。同樣，術語“ENO1-特異性抗體”係指一種與α-烯醇化酶結合之抗體。

術語“中和性”當引用於描述一標靶結合劑(如抗體)時，係關於該標靶結合劑可消除(或明顯減低)標靶抗原活性之能力。因此，“中和性”ENO1抗體能夠消除或明顯減低ENO1之活性。中和性ENO1抗體可(例如)具有阻斷ENO1與血纖維蛋白溶酶原之作用。經由阻斷此結合，可顯著(或完全)消除由血纖維蛋白溶酶原所介導之細胞游離。理想情況下，抗ENO1之中和性抗體可增進細胞附著。

術語“多肽”用於本文作為廣義術語係指一多肽序列之天然蛋白質、片段或類似物。因此，天然蛋白質、片段及類似物為該多肽屬類之種類。根據本發明之較佳多肽包含人類重鏈免疫球蛋白分子與人類輕鏈免疫球蛋白分子，以及經由包含該重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子(如，κ或λ輕鏈免疫球蛋白分子)，及其片段或類似物之組合所形成的抗體分子，反之亦然。根據本發明之較佳多肽亦可僅包含人類重鏈免疫球蛋白分子或其片段。

於本文，術語“聚核苷酸”意指一種其長度具有至少10個鹼基之核苷酸聚合形式，為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸，或是一種任一類核苷酸之經修飾形式，或為RNA-DNA異元-雜交雙鏈。該術語包括DNA之單股及雙股形式。

術語“CDR區”或“CDR”意指免疫球蛋白之重鏈或輕鏈的高可變區，如Kabat等人，1991(Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生和公眾服務部，公眾事業，NIH，Washington)所定義。一抗體代表性地含有3個重鏈CDR與3個輕鏈CDR。用於本文，術語CDR(根據情況)意指此等區域其中之一或數種(或甚至全部)此等區域，其含有大部分負責藉由該抗體對於其所辨識之抗原或抗原決定基的親和力，進行結合之胺基酸殘基。

於該等六種短CDR序列中，重鏈之第三CDR(HCDR3)具有較大的長度可變性(基本上是由於其所具有的基因排列機制而具有較大多樣性)。其可短至2個胺基酸，最長已知可達26個胺基酸。CDR長度亦可隨能夠被特定基本骨架容納的長度而變化。功能上，HCDR3扮演參與決定抗體特異性之角色(Segal等人，PNAS,71：4298-4302,1974)。

術語“一組CDRs”於本文係指包含CDR1、CDR2與CDR3。因此，一組HCDRs係指HCDR1、HCDR2與HCDR3(意指可變重鏈)，而一組LCDRs係指LCDR1、LCDR2與LCDR3(意指可變輕鏈)。除非另行指定，“一組CDRs”包括HCDRs及LCDRs。

術語“對應於”用於本文意指，一聚核苷酸序列與一參考聚核苷酸序列之全部或一部分同源(亦即，互為相同但在進化上沒有嚴格關係)，或者一多肽序列與參考多肽序列相同。

在對比上，術語“互補於”用於本文意指，該互補序列與一參考聚核苷酸序列之全部或一部分同源。用於說明，核苷酸序列"TATAC"係對應於參考序列“TATAC”，而互補於參考序列“GTATA”。

術語“序列同一性”意指，兩聚核苷酸或胺基酸序列透過比對視窗為相同(亦即，基於聚核苷酸-對-聚核苷酸或殘基-對-殘基)。術語“序列同一性百分比”之計算係藉由，將兩經最適化排列之序列通過比對視窗進行比對，決定於該二序列中，具有相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、U或I)或胺基酸殘基，之位置、數量以產生匹配的位置，將所述匹配的位置數除以該比對視窗中的總位置數(亦即，該比對視窗之大小)，並將結果乘以100而產生序列同一性百分比值。

術語“實質同一性”或“實質上相同”用於本文係描述一種核苷酸或胺基酸序列的特徵，其中該核苷酸或胺基酸包含一種透過至少18個核苷酸(6個胺基酸)位置之比對視窗，通常是透過至少24-48個核苷酸(8-16個胺基酸)位置之比對視窗，而相較於一參考序列具有至少85%序列同一性(較佳地至少90至95%，更佳地至少99%序列同一性)的序列，其中所述序列同一性百分比之計算係藉由，將參考序列與可能包括總共達該參考序列之20%或以下缺失或添加之序列通過比對視窗進行比對。所述之參考序列可為一較大序列的次組。

用於本文，二十種習知胺基酸及其縮寫係依照習知的用法使用。二十種習知胺基酸之立體異構物(例如，D-胺基酸)、非天然胺基酸如α,α-二經取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習知的胺基酸，亦適用於本發明多肽之組成。非習知胺基酸的實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基賴胺酸、ε-N-乙醯基賴胺酸、O-二氧磷基絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基賴胺酸、σ-N-甲基精胺酸與其他類似的胺基酸，及亞胺基酸(例如，4-羥基脯胺酸)。本文所使用的多肽表示法中，根據標準用法及成規，往左邊方向為胺基端方向，而往右邊方向為羧基端方向。

同樣，除非另行指定，單股聚核苷酸序列之左端為5'端；往雙股聚核苷酸序列之邊方向稱為5'方向。新生RNA轉錄產物的5'至3'添加方向稱為轉錄方向；位於具有與RNA相同序列之DNA股上，且為RNA轉錄產物的5'至5'末端的序列區稱為“上游序列”；位於具有與RNA相同序列之DNA股上，且為RNA轉錄產物的3'至3'末端的序列區稱為“下游序列”。

對於多肽而言，術語“實質同一性”意指兩胜肽序列(當經過最適化排列，例如經由使用不履行空隙加權之軟體GAP或BESTFIT進行排列時)共享至少80%序列同一性，較佳地至少90%序列同一性，更佳地至少95%序列同一性，且最佳地至少99%序列同一性)。較佳地，不為相同的殘基位置係非保守性胺基酸取代。

如本文所述，本發明亦包含抗體或免疫球蛋白分子中的非主要變異，其條件為該等胺基酸序列變異仍維持與本發明所述抗體或免疫球蛋白分子至少約75%(更佳地80%、90%、95%，且最佳地約99%)序列同一性。尤其，亦包含保守性胺基酸置換。

藉由分析多肽衍生物之比活性，可容易地測定胺基酸改變是否產生功能性肽類。詳細分析方法如本文所述。抗體或免疫球蛋白分子之片段或類似物，可容易地藉由本發明所術領域常用的方法製備。片段或類似物之較佳胺基-及羧基-末端係位於接近功能性區域的邊界處。可藉由將核苷酸及/或胺基酸序列數據與公知或專屬的序列資料庫進行比對，而鑑定出結構性與功能性區域。用於鑑定經摺疊成已知三維立體結構之蛋白質序列的方法為已知。參見Bowie等人(1991)Science 253：164。因此，後述的實施例證明，習於本發明所屬技術領與者能根據本發明所述之抗體而辨識得到，可用於定義結構性與功能性區域的序列基序及構造型態。

本發明之進一方面為一種包含與序列1(參見序列表)所示之任一抗體，或如本文所述之抗體，或具有序列1所示之HCDR(例如，HCDR1、HCDR2或HCDR3)的VH功能域，具有至少約60、70、80、85、90、95、98或約99%胺基酸同一性之VH功能域的抗體之標靶結合劑或抗體分子。所述之標靶結合劑或抗體分子可視需要地亦包含與序列2(參見序列表)所示之任一抗體，或如本文所述之抗體，或具有序列2所示之LCDR(例如，LCDR1、LCDR2或LCDR3)的VL功能域，具有至少約60、70、80、85、90、95、98或約99%胺基酸同一性之VL功能域。可用於計算兩胺基酸序列之同一性百分比值的演算法，包含例如BLAST(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：405-410)、FASTA(Pearson與Lipman(1988)PNAS USA 85：2444-2448)，或Smith-Waterman演算法(Smith與Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)，例如使用不履行空隙加權。於某些具體實施例，共有如上所述胺基酸同一性之標靶結合劑或抗體分子，呈現與所參考之抗體實質上相同的活性。舉例而言，實質上相同的活性包含至少一種與參考抗體差異小於約50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%或以下之活性。

抗原結合部位一般係由可變重鏈與可變輕鏈免疫球蛋白功能域所形成，具有由六個表面多肽環(稱為互補性決定區(Complementarity Determining Region,CDR))形成的抗原結合介面。於每一VH及每一VL各含有三個CDRs(HCDR1、HCDR2、HCDR3)與(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，以骨架區(FRs)連結在一起。

代表性地，VH功能域係與VL功能域成對提供抗體抗原結合部位，然而單獨VH或VL功能域及可用於結合抗原。VH功能域(例如源自序列1)可與VL功能域(例如源自序列2)配對，以形成包含VH與VL二功能域之抗原結合部位。針對本文所揭露之其他VH與VL功能域提供類似實施態樣。於其他實施例，係將序列1之VH鏈與一異源的VL功能域配對。輕鏈雜交為該項技藝已建立之技術。又，本發明亦針對本文所揭露之其他VH與VL功能域提供類似實施態樣。因此，位於序列2之母本或任何抗體鏈的HV可與位於序列1之母本或任何抗體鏈的VL配對。

抗原結合部位可包含一組存在序列1及2中之母本或任何抗體鏈的H及/或L CDRs，具有至多二十、十六、十、九個或更少(一、二、三、四或五個)胺基酸添加、取代、缺失及/或插入於所揭示之H及/或L CDRs組內。此類修飾可於該CDRs組內的任何殘基上進行。

較佳之胺基酸取代為：(1)減低對於蛋白分解作用之易感受性、(2)減低對於氧化作用之易感受性、(3)改變用於形成蛋白複合物之結合親和性、(4)改變結合親和力及(5)授予或更改此等類似物之物化或功能特性。類似物可包括各種具有天然肽類序列以外的突變型蛋白質。例如，可於天然序列(較佳係於位在該多肽之形成分子間接觸的功能域外之部分)進行單一或多數胺基酸取代(較佳為保守性胺基酸取代)。保守性胺基酸取代應該不會實質上改變母本序列之結構特徵(例如，胺基酸置換應不欲打斷母本序列中的螺旋，或破壞作為母本序列特徵之其他次級結構類型)。

本發明之其他方面為包含一與序列1(參見序列表或本文所述)所列任一抗體之VH功能域具有至少約60、70、80、85、90、95、98或約99%胺基酸序列同一性，或具有序列1(參見序列表或本文所述)中所示HCDR(例如，HCDR1、HCDR2或HCDR3)之VH功能域的抗體分子。所述之抗體分子可視需要地亦包含一與序列2(參見序列表或本文所述)所列任一抗體之VL功能域具有至少約60、70、80、85、90、95、98或約99%胺基酸序列同一性，或具有序列2中所示LCDR(例如，LCDR1、LCDR2或LCDR3)之VL功能域。可用於計算兩胺基酸序列之同一性百分比值的演算法，包含例如 BLAST、FASTA或Smith-Waterman演算法。

可藉由進行序列改變或突變，以及篩選具有所希望抗原靶定特性之方法，獲得本發明VH與VL二功能域及CDRs之變異型，包括於本文所闡述之胺基酸序列變異型，及可用於針對人類ENO1蛋白之標靶劑與抗體的變異型。所希望特性之實例包括(但不限定於)：相較於對抗某一抗原之抗體，已增加對於該抗原之結合親和力；相較於對抗某一抗原之抗體，已增加中和該抗原之活性，倘若該活性為已知；具有與已知抗體或配體競爭對抗某一抗原之特定競爭能力(達特別的莫耳比)；形成免疫沉澱複合物之能力；與特定抗原決定基結合之能力；為直線型抗原決定基，例如使用本文所述之肽類-結合掃描鑑定得之肽序列，例如使用直線及/或受限構型篩選得之肽類；為結構型抗原決定基，由非-連續性殘基形成；具有調制人類ENO1蛋白之或下游分子之新的生物活性之能力。於本文亦提供此等方法。

本發明之進一方面係關於一種標靶結合劑(即抗體)，包括其胺基酸序列可與包含和序列9或10所列人類ENO1蛋白之胺基酸序列具有至少約60、70、80、85、90或約92%胺基酸序列同一性的胺基酸序列之抗原決定基肽類結合，且可用於治療者人類ENO1蛋白疾病或失調症者。人類ENO1蛋白疾病或失調症者可為任何因人類ENO1蛋白質異常活化或表現而引起的病況。於一項實例，所述之人類ENO1蛋白-相關疾病為一種腫瘤性疾病，如小細胞肺癌、肝細胞(肝)癌、胃癌、乳癌、胰管腺癌。

由一VH功能域與一VL功能域組成抗體抗原結合部位，代表性地係由六個多肽環形成：三個來自輕鏈可變區(VL)及三個來自重鏈可變區(VH)。針對具有已知原子結構之抗體所進行的分析，已說明抗體結合部位之序列與三為結構間的關係。此等關係意味，除了VH功能域之第三區(環)之外，結合部位環具有少數主鏈構型：標準結構的其中一種。於特別環中形成之標準結構已經顯示可由其大小，及位於該環與骨架區中的關鍵位置之特定殘基百分比值來決定。

用於在CDRs、抗體VH或VL功能域及/或結合劑之胺基酸序列進行取代所需要的技術，可於本發明所屬技術領域取得。可藉由可能或可能不會預期對活性產生最小或有助益影響之取代作用，並針對結合與/或中和能力及/或任何其他所希望特性進行測試，而製得變異型序列。任何其序列已於本文特別揭示之VH及VL功能域的可變區胺基酸序列變異型，皆可用於本發明(如下論述)。

術語“多肽片段”用於本文意指，一種具有胺基-端及/或羧基-端缺失，但其剩餘胺基酸序列與所推演(例如，從全長cDNA序列推演得)之天然序列中相對應位置相同的多肽。所述片段代表性地其長度具有至少約5、6、8或10個胺基酸，較佳地至少約14個胺基酸，更佳地至少約20個胺基酸，通常長度為至少約50個胺基酸，且甚至更佳地長度為至少約70個胺基酸。術語“類似物”用於本文意指，由一段具有至少約25個與所推演胺基酸序列實質上相同之胺基酸的片段所組成，且具有至少一種下列特性的多肽：(1)在適宜之結合條件下可與人類ENO1蛋白結合，(2)具有阻斷適當配體/ENO1蛋白結合之能力，或(3)能夠抑制ENO1蛋白活性。代表性地，多肽類似物包含對於天然序列之保守性胺基酸取代(或添加或缺失)。類似物代表性地具有長度為至少約20個胺基酸，較佳地至少約50個胺基酸或更長，且其長度往往可與全長天然多肽相同。

用於本文，“標靶結合劑”為一種可優先與標靶部位結合之物質，例如抗體或其結合片段。於一項具體實例，所述之標靶結合劑係對單一標靶部位具特異性。於其他具體實例，所述之標靶結合劑係對一個以上標靶部位具特異性。於一項具體實例，所述之標靶結合劑可為單株抗體，且所述之標靶部位可為抗原決定基。如下所述，標靶部位可包含至少一個抗體之抗原結合區域，其中該區域係與一異源蛋白融合或包含在其中。

抗體可為寡株、多株抗體、單株抗體、嵌合型抗體、CDR-移植抗體、多專一性抗體、雙特異性抗體、催化性抗體、人源化抗體、權人源抗體、抗-個體遺傳型抗體及可被標記呈可溶或結合形式之抗體，以及其片段、變異型或衍生物，可單獨存在或利用已知技術與其他胺基酸序列組合。術語抗體亦包括本發明抗體之結合片段；例舉性片段包括Fv、Fab、Fab'、單股抗體(svFC)、可變區二聚體(Diabody)及經二硫化物穩定的可變區(dsFv)。抗體之“結合片段”可藉由重組DNA技術製造，或經由將完整抗體進行酵素及化學裂解製得。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv及單鏈抗體。

將抗體以酵素(木瓜酵素)分解，會產生兩個相同的片段(已知稱為“Fab”片段)，及一個不具有抗原結合活性但具有結晶能力的"Fc"片段。將抗體以酵素(胰蛋白酶)分解會產生一個F(ab')₂片段，其中抗體分子的兩臂仍相連結，且包含兩個抗原結合部位。F(ab')₂片段具有與抗原鍵聯之能力。"Fv"用於本文係指，其保留抗原辨識及抗原結合部位之最小抗體片段。"Fab"用於本文係指，其包含輕鏈恆定區與重鏈CH1功能域的抗體片段。術語“mAb”意指單株抗體。

術語“抗原決定基”包括，任何能夠與免疫球蛋白或T-細胞受體專一性結合之蛋白質決定基。抗原決定基通常由具化學活性的分子表面基團，例如胺基酸或醣類側鏈所組成，且可能(但非一定)具有特別的三維立體結構特徵，以及特別的電荷特徵。當一抗體之解離常數係1μM(較佳地100nM，且最佳地10nM)時，即稱其與一抗原專一性結合。

“具活性”或“活性”與ENO1多肽相關時係指，一ENO1多肽中具有天然ENO1多肽之生物或免疫活性的部分。“生物的”用於本文意指，由於天然ENO1多肽之活性所導致的生物功能。較佳之ENO1生物活性包括(例如)誘導的血纖維蛋白溶酶原活性。

“哺乳動物”用於本文意指，任何被認為是哺乳動物的動物。較佳地，所述之哺乳動物為人類。術語“個體”包括人類與及獸醫的個體。

術語“醫藥製劑或藥物”用於本文意指，當其經適當投藥予一患者時，能夠誘發所希望治療功效之化學化合物或組成物。於本文中其他化學術語之使用，係根據本發明所屬技藝的習之用法，例如參見McGraw-Hill化學術語辭典(Parker,S.編著，McGraw-Hill出版，三藩市(1985))。

用於本文，“實質上純的”意指標的物種為所存在之優勢物種(亦即，以莫耳濃度為基礎，其較該組成物中任何其他個別物種豐富)，且較佳地一實質上純的部分係指其中標的物種占全部所存在物種之至少約50%(以莫耳濃度為基礎)的組成物。一般而言，實質上純的組成物係包含該組成物中全部所存在高分子物種的大於約80%，較佳地大於約85%、90%、95%及99%。最佳地，標的物種係經純化達到實際上的同質性(以習知偵測方法無法在該組成物中偵測到污染物種)，其中該組成物實際上係由單一高分子物種組成。

用於本文，術語“監測”係指藉由測定癌細胞中ENO1蛋白之含量，以偵測及/或觀察癌症發展的方法。

用於測定癌細胞中ENO1蛋白含量之方法包括(但不限定為)，測量ENO1蛋白與ENO1-特異性抗體之結合、西方轉漬法、流式細胞儀分析、免疫組織化學染色(IHC)、RT-PCR及/或基因微陣列分析。

實施例

本發明之實施會使用之技術包含，所屬領域之一般技術中的細胞生物學習知技術、細胞培養、抗體技術及遺傳工程。此等技術於文獻中有完整闡述。

以下實施例係說明用於藉由誘發抗-ENO1免疫反應，來抑制腫瘤生長之ENO1-特異性抗體的研發及應用。

實施例1. 惡性腫瘤細胞中ENO1所存在之細胞表面位置

為分析ENO1位在惡性腫瘤細胞上的細胞位置，遂使用流式細胞儀技術確定ENO1之細胞表面位置。腫瘤細胞係得自17名罹患肺癌之患者的胸膜滲出液。其中，以得自2癌症患者之腫瘤細胞(NHRI-L89與CA926滲出腫瘤細胞)為本文所示之代表性個案。NHBE及SAEC細胞為正常人類肺原生細胞。將完整細胞以或不以ENO1抗血清染色，並使用對抗ENO1蛋白之特異性抗體，於流式細胞儀進行表面ENO1分布分析(如圖1A)。進一步以免疫組織化學染色，確認肺癌細胞系NHRI-L89之ENO1細胞位置(圖1B)。簡述之，將1×10⁴個NHRI-L89細胞於經塗覆以纖維粘連蛋白之腔室培養玻片上，於含有10% FCS之DMEM培養基中進行培養。經過夜培養後，將玻片以PBS清洗並使用山羊血清進行封阻1小時。將完整細胞以對照組(CTL)或抗表面ENO1之ENO1抗體染色，隨後再以PI染色進行細胞核偵測。於共軛焦顯微鏡觀察染色結果(400×；圖1B)。

本實驗結果如圖1A(流式細胞儀分析)及1B(免疫染色)所示。相較於將細胞與對照組抗體進行反應，與ENO1抗體培養之NHRI-L89及CA926細胞的頻率分布曲線向右偏移。正常NHBE及SAEC人類肺原生細胞顯示無明顯的偏移現象(圖1A)。此結果表示，ENO1蛋白係表現於肺癌細胞上，而不會表現於正常原生細胞上(圖1A)。當進一步使用免疫組織化學染色分析ENO1之細胞定位時，以ENO1抗體染色的完整NHRI-L89細胞顯示在其細胞表面有訊號出現(圖1B)。此結果暗示，ENO1係表現於肺及某些癌細胞之表面上，而因此可做為免疫療法之潛力標靶物。

實施例2. 抗ENO1抗體抑制人類肺癌細胞之侵襲能力

為研究ENO1抗體對於癌細胞侵襲之功效，遂使用Transwell分析，將ENO1抗體添加至生長於塗覆以胞外基質(基質膠matrigel)(Becton Dickinson)之微孔過濾膜(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)的CL1-5細胞培養物中，分析CL1-5細胞之侵襲活性。待分別與1：20、1：100及1：500稀釋倍數之抗-ENO1抗體混合後，將2×10⁴個CL1-5細胞接種於，一兩腔室分析系統中含有2% FBS之培養基的上層腔室內，並與下層腔室內含有10% FBS之培養基進行培育24小時。使用抗-GST小鼠多株抗體做為陰性對照組。兩層腔室以塗覆有基質膠之微孔過濾膜(孔徑12微米)分隔開。經過培育後，將該經基質膠塗覆之過濾膜染色，並於顯微鏡下定量侵襲入該經基質膠塗覆之過濾膜的細胞數。重複進行該項實驗三次。數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。

結果如圖2所示。未經處理組(160±8；N=3)與抗-GST多株抗體處理組(168±12；N=3)間，細胞數量並無顯著差異。然而，當CL1-5細胞施予不同稀釋倍數之ENO1多株抗體處理時，CL1-5之細胞數量減少，範圍介於1：20稀釋倍數組之52±12(N=3)至1：500稀釋倍數組之156±30(N=3)；減少程度與ENO1多株抗體濃度成正比。ENO1多株抗體之1：20稀釋倍數組與抗-GST多株抗體之1：20稀釋倍數組間，細胞數量具有統計上的顯著差異(P<0.05)。此等結果暗示，於活體外對CL1-5細胞施予ENO1抗體處理，可抑制該細胞之侵襲活性。

實施例3. ENO1多株抗體減弱CL1-5F4細胞於肺部之組織侵襲能力

為研究投藥ENO1抗體對於肺癌細胞轉移之影響，以及評估抗ENO1抗體在癌症治療方面的潛力，遂將具有螢光素酶報告基因之高侵襲性CL1-5F4細胞(1×10⁶個細胞/小鼠)以靜脈內注射入NOD-SCID小鼠，並施予ENO1抗體或對照組(CTL)抗血清每週兩次。於腫瘤注射後12及19天，使用IVIS系統監測肺轉移群落形成。使用注射以具有抑制ENO1基因表現之CL1-5F4細胞的小鼠做為陰性對照組。於第12及19天將小鼠犧牲後，觀察並計數轉移群落及腫瘤大小。

結果如圖3所示。當帶有含螢光素酶報告基因之CL1-5F4細胞給予對照組抗體處理時，小鼠肺部於第12天開始呈現螢光訊號。另一方面，在經ENO1多株抗體處理之小鼠，及帶有CL1-5F4細胞並已抑制ENO1基因表現之小鼠，並未偵測到訊號。於第19天，以對照組抗體處理之小鼠出現較強的訊號，表示存在更多細胞侵入或腫瘤生長。同一天，在經ENO1多株抗體處理之小鼠，或帶有CL1-5F4細胞並抑制ENO1基因表現之小鼠，仍未偵測到訊號。此等結果顯示，CL1-5F4細胞之轉移經由ENO1抗體或抑制ENO1基因表現而被破壞(圖3；上)。於第12及19天後，將每一處理組之肺取出並測定腫瘤結節。結果如圖3下所示。於具有明顯腫瘤大小之對照組抗體處理小鼠中，出現一些腫瘤結節。但是，以ENO1多株抗體處理之小鼠，或帶有CL1-5F4細胞並抑制ENO1基因表現之小鼠，顯示無清楚的腫瘤結節，表示在此二組小鼠中腫瘤轉移受到延遲。本研究之結果暗示，投藥ENO1抗體，在活體內對於癌細胞具有抗-轉移或抗-增生功效，且ENO1抗體具有潛力應用在癌症治療方面。

實施例4. 產生抗-人類ENO1單株抗體

由實施例2與3已清楚了解，ENO1抗體能減弱癌細胞之組織侵襲及轉移。因此，ENO1抗體可經研發成為一種治療性抗體。為產生抗-人類ENO1之單株抗體，遂將BALB/c小鼠以純化重組人類ENO1抗原(50μg/小鼠)引發免疫反應，隨後以乳化的CpGa佐劑加速ENO1體液性反應。根據標準製程，收取脾臟細胞、與Fo細胞進行融合然後稀釋。使用抗原-為底之ELISA，篩選出可分泌辨識ENO1抗原之單株抗體的融合瘤細胞。接著將所選出的純株使用完整全細胞染色，於流式細胞儀分析(如實施例1所述)檢驗該等抗體對於位在CL1-5F4肺腺癌細胞之細胞表面ENO1的結合活性。

結果如圖4所示。以相較於對照組抗體其頻率分布曲線向右偏移之結果證實，所單離得的五株抗體純株皆會辨識位在CL1-5F4上之細胞表面ENO1。

實施例5. 所單離得五株抗體純株的ENO1結合ELISA

為研究上述所單離得5抗體純株的ENO1結合親和性，將個別融合瘤培養於含有10% FCS之RPMI培養基中。一週後，收取1×10⁶個細胞，以PBS清洗，再懸浮於200ul RPMI培養基中，並將其經由IP注射至SCID小鼠。待3星期後，收集小鼠腹水並稀釋至15ml。將抗體進一步以40%硫酸銨沉澱及蛋白A管柱(Montage抗體純化套組，Millipore)進行純化。將純化之抗體以Amicon Ultra-15離心過濾裝置，依照廠商(Millpore)所提供的程序進行濃縮。經由12% SDS PAGE分析抗體之純度。將人類ENO1蛋白(400ng)塗覆於96-孔ELISA平盤，並將該平盤以PBS清洗兩次。將一系列稀釋(1×10^-11至1×10^-7M)之個別抗體加入該平盤中，並將該平盤置於37℃反應1小時。之後將HPRT共軛之山羊抗小鼠IgG加入，反應1小時後，再將TMB加入。讀取OD405值以計算活性。每項實驗重複三次，數據以平均值±SD表示。使用OD讀值與抗體濃度，以Sigmaplot^TM製作多重散佈圖。藉由四參數邏輯配合，估算出個別純株之K_d值。

本實驗之結果如圖5所示。所有抗體融合瘤產量達20.4mg至4.6mg每隻小鼠。抗體之K_d值範圍介於1.77×10^-10±0.12至1.6×10^-5±0.2M(N=3)。此等結果暗示，這5株抗體純株皆可辨識人類ENO1蛋白，且純株10具有最佳親和力，其K_d值為約1.77×10^-10±0.12M(N=3)。

實施例6. 所單離得5抗體純株之血纖維蛋白溶酶原受體拮抗劑活性

為研究所單離得抗-人類ENO1抗體之ENO1拮抗劑活性，將U937人類淋巴瘤細胞系培養於含有10% FCS之RPMI培養基中。將細胞以10 微克/ml之LPS處理6小時，誘導ENO1蛋白表現於細胞表面。將每毫升含有1.5×10⁶個細胞的生理食鹽水分別與1微克/ml之人類Lys-血纖維蛋白溶酶原，及10微克/ml之不同抗ENO1抗體純株進行預先培育一小時。將樣本以PBS清洗兩次，然後將3nM組織特異性血纖維蛋白溶酶原活化劑與0.5mM產色之受質S-2251加入。於37℃反應一小時後，讀取OD405值計算活性。每項實驗重複三次，並分析結抗活性。數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。

本實驗之結果如圖6所示。所有5純株抗體結具有血纖維蛋白溶酶原受體的結抗劑活性，其可抑制LSP-所誘發之ENO1比活性達52%至100%。由此等實驗顯示，各純株之血纖維蛋白溶酶原受體結抗劑活性與其K_d值成正比，且純株10具有最佳抑制活性，可抑制LSP所誘發之ENO1比活性達幾近於100%。

實施例7. ENO1單株抗體抑制人類肺癌細胞之侵襲能力

以使用已塗覆胞外基質(基質膠)(Becton Dickinson)之微孔過濾膜(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)進行之穿孔分析(Transwell assay)，分析各抗體純株對於CL1-5細胞之侵襲能力的抑制活性。待與10微克/ml之各別5純株抗體混合後，將2×10⁴個細胞接種於一兩腔室分析系統中的上層腔室內，並與下層腔室內含有10% FBS之培養基進行反應24小時。使用抗-GST小鼠IgG及5-阿扎-2-去氧胞苷(5ADC)分別做為陰性對照組與陽性對照組。兩層腔室以塗佈有基質膠之微孔過濾膜(孔徑12微米)分隔開。經過培育後，將該經基質膠塗覆之過濾膜染色，並於顯微鏡下定量侵襲入該經基質膠塗覆之過濾膜的細胞數。每一項實驗重複進行三次。數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。

此等實驗之結果如圖7所示。結果顯示，所有抗-人類ENO1抗體純株皆具有對抗CL1-5之侵襲能力的抑制活性，且純株10具有最佳抑制活性，該組之侵襲能力為對照組IgG之約65.5±0.3%(N=3)。

綜合實施例5、6與7之結果，選擇抗-人類ENO1抗體純株10進一步研究，並於本發明之說明書中稱做為EN10 mAb。

實施例8. EN10 mAb抑制人類肺癌細胞及淋巴瘤細胞之侵襲能力

以使用已塗覆胞外基質(基質膠)(Becton Dickinson)之微孔過濾膜(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)進行之穿孔分析(Transwell assay)，分析EN10 mAb對於CL1-5細胞之侵襲能力的抑制活性。經過分別與10、50及100微克/ml之EN10 mAb混合後，將2×10⁴個細胞接種於，一兩腔室分析系統中含有2% FBS之培養基的上層腔室內，並與下層腔室內含有10% FBS之培養基進行培育24小時。使用抗-GST小鼠多株抗體做為陰性對照組。兩層腔室以塗覆有基質膠之微孔過濾膜(孔徑12μm)分隔開。經過培育後，將該經基質膠塗佈之過濾膜染色，並於顯微鏡下定量侵襲入該經基質膠塗覆之過濾膜的細胞數。重複進行該項實驗三次。數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。結果如圖8A所示。

同樣，使用已塗覆胞外基質(基質膠)(Becton Dickinson)之微孔過濾膜(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)進行之穿孔分析(Transwell assay)，分析EN10 mAb對於U937細胞之侵襲能力的抑制活性。將人類淋巴瘤 U937細胞系培養於含有10% FCS之RPMI培養基中。將細胞以10微克/ml之LPS處理6小時，誘導ENO1蛋白表現於細胞表面。經過分別與10、50及100微克/ml之EN10 mAb混合後，將2×10⁴個細胞接種於，一兩腔室分析系統中的上層腔室內，並與下層腔室內含有10% FBS與10nM MCP-1之培養基進行培育24小時。使用抗-GST小鼠多株抗體做為陰性對照組。兩層腔室以塗覆有基質膠之微孔過濾膜(孔徑8μm)分隔開。經過培育後，於顯微鏡下使用血球計數器計算存在下層腔室內之細胞數。每項實驗重複進行三次。數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。

結果如圖8A與8B所示。當細胞施予10微克/ml至100微克/ml之EN10 mAb處理時，CL1-5之侵襲能力受抑制的程度達對照組IgG之31±2至77±1%(N=3)(圖8A)。此等結果與實施例4所述類似，且與EN10 mAb之濃度成正比，所估計的EC₅₀值為約30微克/ml。

為探討上述對侵襲之抑制作用是否亦可應用於其他癌細胞，使用類似方法將U937細胞以濃度介於5微克/ml至50微克/ml之EN10 mAb處理。U937之侵襲活性受抑制的程度達對照組IgG之91.2±2至49.1±1%(N=3)(圖8B)。此等結果表示，CL1-5及U937之侵襲活性以劑量-相依的方式受EN10 mAb抑制，可能是經由抑制ENO1之血纖維蛋白溶酶原受體活性。

實施例9. EN10 mAb辨識LSP-所誘導之淋巴瘤細胞表面

將人類U937細胞培養於含有10% FCS之RPMI培養基中。將細胞以10微克/ml之LPS處理6小時，誘導ENO1蛋白表現於細胞表面。對於流式細胞儀分析，係將完整細胞以或不以EN10 mAb(1：300稀釋倍數)染色，以 FITC-共軛之山羊抗小鼠IgG(Jackson Lab)呈色，並使用FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson)進行分析。經由所得之螢光強度測量ENO1表現度。

此等實驗之結果如圖9所示。將U937與LPS培養並以EN10 mAb處理，相較於未與LPS培養但以EN10 mAb處理之細胞，其頻率分布曲線向右偏移，表示U937細胞係將ENO1蛋白表現於其細胞表面。此等數據支持，EN10 mAb可辨識位於淋巴瘤細胞上LSP-誘導的表面ENO1。

實施例10. EN10 mA抑制CL-5細胞從膠原蛋白或纖連蛋白游離

為分析血纖維蛋白溶酶原受體-血纖維蛋白溶酶與胞外受質之間的訊號傳遞途徑，分別將1mg/ml明膠、100微克/ml血纖維蛋白原、10微克/ml膠原蛋白及10微克/ml纖連蛋白塗覆於未經處理之ELISA平盤過夜。將CL1-5細胞(4×10⁴個細胞)接種於上述平盤，並將50微克/ml EN10 mAb加入200μL含有10% FCS之DMEM培養基中。將細胞於37℃培養24小時，然後以PBS清洗兩次。將10% WST加入，並將反應混合物於37℃反應4小時。經由讀取OD450值估算平盤中的相對細胞數。每項實驗重複三次，數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。

此等實驗之結果如圖10A所示。此等數據顯示，由經纖連蛋白及膠原蛋白塗覆之平盤所讀取的OD450值為2.45±0.37(N=3)及1.83±0.44(N=3)。該等數值較由明膠及血纖維蛋白原平盤所讀取者(其數值與背景讀值無顯著差異)高出甚多。經EN10 mAb處理組與未經處理組之間無顯著差異。此等結果暗示，CL1-5細胞喜好與纖連蛋白及膠原蛋白結合，且當細胞培養於不含下游蛋白酶(例如血纖維蛋白溶酶原及tPA)之培養基時，EN10 mAb並未參與細胞締合途徑。於圖10A所示之數據暗示，ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性並未涉及胞外基質中的細胞締合途徑。

進一步測試ENO1是否參與胞外基質中的細胞游離途徑。分別將1微克/ml纖連蛋白及10微克/ml膠原蛋白塗覆於未經處理之ELISA平盤過夜。將CL1-5細胞(4×10⁴個細胞)接種於上述平盤，並分別將0、6.25、12.5、25及50微克/ml EN10 mAb加入200μL含有10% FCS之DMEM培養基中。另外將10微克/ml Glu-血纖維蛋白溶酶原與2nM tPA加入。將細胞於37℃培養24小時，並以PBS清洗兩次。然後將10% WST加入，並將反應混合物於37℃反應4小時。經由讀取OD450值估算平盤中的相對細胞數。每項實驗重複三次，數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。

此等實驗之結果如圖10B及圖10C所示。此等數據顯示，在該二胞外基質組中，當培養基含有ENO1受體下游蛋白酶血纖維蛋白溶酶原及tPA時，細胞數是直接與EN10 mAb處理之濃度成正比。在該二胞外基質組中，50微克EN10 mAb處理組與對照組IgG組之間有顯著差異(P<0.05)。此等數據暗示，ENO1涉及CL1-5細胞從胞外基質游離的途徑，可能是經由增進血纖維蛋白溶酶原及tPA蛋白酶活性。EN10 mAb(其功能作為一種ENO1拮抗劑)可阻斷ENO1之受體活性，導致血纖維蛋白溶酶原與tPA之活化作用受抑制，而因此抑制CL1-5細胞從胞外基質游離及侵襲。

實施例11. 製備編碼單株抗體之基因

編碼抗體EN10 mAb之基因係根據下述方法進行選殖。

(1)抗體之cDNA選殖及製備

將融合瘤培養於含有10% FCS之RPMI培養基(由Gibco製造)。待細胞數達到約10×10⁶/ml時，以離心收取細胞，然後將TRIzol®(由Invitrogen製造)加入，並根據操作手冊萃取總體RNA。使用小鼠Ig-啟動子組(由Novagen製造)，根據操作手冊進行抗體可變區cDNA之選殖。

(a)根據SuperScript® III第一股合成系統(由Invitrogen製造)之操作手冊合成第一股cDNA

使用5微克總體RNA作為模板製備第一股cDNA。將5微克總體融合瘤RNA、1微升50ng/μL之隨機引子與1微升10mM dNTP混合於一200μl PCR離心管中，加入DEPC-處理之水使體積達10μl。將反應混合物於65℃下培育5分鐘，然後置於冰上至少1分鐘。將10微升含有2微升10×RT緩衝液、4微升25mM MgCl₂、2微升DTT、1微升4單位RNaseOUT^TM與1微升200單位SuperScript® III RT之cDNA合成混合物加入，將其溫和地混合，並以粗略離心收集。將反應試管於25℃培育10分鐘，隨後於50℃反應50分鐘。將反應置於85℃下5分鐘及於冰上猝冷進行終結。將試管粗略離心收集反應物，並將1微升RNase H加入，於37℃培育20分鐘。

(b)以PCR擴增重鏈基因與輕鏈基因

製備一組成包含5微升cDNA、5微升10×反應緩衝液、1微升10mM dNTP mix、1微升2.5單位Taq聚合酶、及由引子組所提供之1微升前向引子與1微升反向引子，並以二次蒸餾水使最終體積為50微升之反應溶液，將其進行PCR反應。

對於抗體輕鏈及重鏈之擴增，係使用一於94℃反應10分鐘之週期，然後重複一於94℃反應1分鐘、於52℃反應1分鐘及於72℃反應1分鐘之週期35次，及再將反應於72°下進行10分鐘。將反應混合物進行2%瓊脂糖凝膠電泳術，分析反應產物。將具有正確分子量(重鏈約為463bps，輕鏈約為451bps)之產物，根據製造商所附之操作手冊，接合至一用於進行次選殖的pCR 2.1-TOPO載體(由Invitrogen製造)。然後使用M13前向引子(5'-GTAAACAAC GACGGCGAG--3'(SEQ ID NO：11)與M13反向引子(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC--3'(SEQ ID NO：12))進行核苷酸定序。基於所得之序列資料，使用ExPASY-轉譯工具將抗體序列轉譯成蛋白質序列。所得之EN10 mAb序列包含重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列，具有經由等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生和公眾服務部，公眾事業，NIH出版91-3242,Bethesda Md.(1991),vols.1-3)公開之方法所決定的互補性決定區(CDR)。

圖11A描述EN10 mAb之重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：1)。其中指出骨架區(FR1、FR2、FR3與FR4)及CDRs，包括HCDR1(SEQ ID NO：3)、HCDR2(SEQ ID NO：4)與HCDR3(SEQ ID NO：5)。

圖11B描述EN10 mAb之輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。其中指出骨架區(FR1、FR2、FR3與FR4)及CDRs，包括LCDR1(SEQ ID NO：6)、LCDR2(SEQ ID NO：7)與LCDR3(SEQ ID NO：8)。

實施例12. 抗原決定基之基因定位

為決定存在人類ENO1蛋白上之EN10Mab抗原決定基，遂設計兩段具有核苷酸序列5’-GGATCCGCAGCAAACTTCAGGGAAGCCATG-3’(SEQ ID NO：13)及 5’-GGATCCTCGAAGATCCCTTTGACCAGGATG-3’(SEQ ID NO：14)之前向引子，與一段反向引子(5’-TCAGGCTGAAAATCTCTCATCCGC-3’(SEQ ID NO：15))。使用含有人類ENO1 cDNA基因之大腸桿菌表現質體pTRC-HIS ENO1做為模板，擴增得ENO1缺失突變型。使用具有SEQ NO：13及SEQ NO：14之引子做為前向引子，以SEQ ID NO：15做為反向引子，分別擴增得缺失突變型△1-189(圖12A)和△1-297(圖12A)。使用另一組具有序列5’-GGATCCTATCTATTCTCAAGATCCATGCC-3’(SEQ ID NO：16)與5’-CTCGAGGTCATGGTGTCTCATCGTTCGCTCGAG-3’(SEQ ID NO：17)之引子，擴增得缺失突變型△297-434。對於每一突變型之擴增作用，係使用組成包含1微升約0.1ng模板cDNA之1：1000稀釋液、5微升10×反應緩衝液、1微升10mM dNTP mix、1微升2.5單位Taq聚合酶、1微升前向引子與1微升反向引子，並以二次蒸餾水製備最終體積為50微升之反應溶液，進行PCR反應。使用一於94℃反應10分鐘之週期，然後重複於94℃反應1分鐘、於52℃反應1分鐘及於72℃反應1分鐘之週期35次，及將反應於72°下再進行10分鐘。將此反應溶液進行2%瓊脂糖凝膠電泳術，分析反應產物。將具有正確分子量之產物，根據製造商所附之操作手冊，接合至一用於進行次選殖的pCR 2.1-TOPO載體(由Invitrogen製造)。然後使用M13前向引子(5'-GTAAACAAC GACGGCGAG--3'(SEQ ID NO：11)與M13反向引子(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC--3'(SEQ ID NO：12))進行核苷酸定序。將每一具有正確序列之突變株以限制酵素BamHI與XhoI分解，並將分解產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳術。將各突變株之插入片段從上述瓊脂糖凝膠切出，並使用Gene Clean Kit根據製造商(BIO101)所附之操作手冊進行純化。將每一突變株之BamHI與 XhoI片段接合至大腸桿菌表現載體pTRC His A(Invitrogen)的BamHI與XhoI切位。將所得之質體轉形入大腸桿菌BL21 Rosseta中。藉由IPTG誘導使ENO1突變蛋白於大腸桿菌進行表現，並於將細菌沉澱以超音波震碎後，使用Ni-agarose根據製造商(Qiagen)所附之操作手冊進行純化。以12% SDS PAGE分析每一突變型的純度。測定每一突變型蛋白之結合活性，係將400ng人類ENO1及其突變型蛋白分別塗覆於96-孔ELISA平盤，並將該平盤以PBS清洗。將10微克EN10 mAb抗體加入該平盤中，並將該平盤置於37℃反應1小時。將所成之結合複合物以PBS清洗兩次後，將與HPRT共軛之山羊抗-小鼠IgG加入。反應1小時後，將TMB加入。讀取OD405值計算結合親和性。每項實驗重複進行三次。數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。

結果如圖12A所示。ENO1突變型△1-189及△1-297具有OD405讀值為約1.43±0.18及1.56±0.08(N=3)(此等即圖12A所示之1.43與1.56)，其分別為野生型ENO1(2.87±0.08)(N=3)的約42%及39%。然而，當297至434之胺基酸殘基被刪除時，此突變型ENO1對於EN10 mAb之結合活性喪失(相較於BSA背景值)。此等結果暗示，297至434之胺基酸殘基為ENO1蛋白與EN10 mAb結合所需，且突變型△1-182及△1-297之結合活性減低，可能是由於該等突變型蛋白不穩定，或是結構發生改變。

設計6段反向引子，進一步探索位於ENO1蛋白內之EN10 mAb抗原決定基，其序列為5’-CTCGAGAGGGATCTTCGATAGACACCACTGGG-3’(SEQ ID NO：18)、5’-CTCGAGCTACCTGGATTCCTGCACTGGCTG-3’(SEQ ID NO：19)、 5’-CTCGAGACTTCTCGTTCACGGCCTTGGCGATC-3’(SEQ ID NO：20)、5’-CTCGAGACTTCTCGTTCACGGCCTTGGCGATCC-3’(SEQ ID NO：21)、5’-CTCGAGCAGTCTCCCCCGAACGATGAGACACC-3’(SEQ ID NO：22)及5’-CTCGAG CACCAGTCTTGATCTGCCCAGTGCAC-3’(SEQ ID NO：23)。使用含有人類ENO1 cDNA基因之大腸桿菌表現質體pTRC-HIS ENO1做為模板，將ENO1缺失突變型進行擴增。使用SEQ ID NO：16做為前向引子，分別與SEQ ID NO：18、SEQ ID：19、SEQ ID：20、SEQ ID：21、SEQ ID：22及SEQ ID：23引子，擴增ENO1缺失突變型296-434、316-434、336-434、376-434及396-434。對於每一突變型之擴增作用，係使用組成包含1微升約0.1ng模板DNA之1：1000稀釋液、5微升10×反應緩衝液、1微升10mM dNTP mix、1微升2.5單位Taq聚合酶、1微升前向引子與1微升反向引子，並以二次蒸餾水製備最終體積為50微升之反應溶液，進行PCR反應。使用一於94℃反應10分鐘之週期。然後，重複進行於94℃反應1分鐘、於52℃反應1分鐘及於72℃反應1分鐘之週期35次，及將反應於72°下再進行10分鐘。將此反應溶液進行2%瓊脂糖凝膠電泳術，分析反應產物。將具有正確分子量之產物，根據製造商所附之操作手冊，接合至一用於進行次選殖的pCR 2.1-TOPO載體(由Invitrogen製造)。然後使用M13前向引子(5'-GTAAACAAC GACGGCGAG--3'(SEQ ID NO：11)與M13反向引子(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC--3'(SEQ ID NO：12))決定核苷酸序列。將每一具有正確序列之突變株以限制酵素BamHI與XhoI分解，並將分解產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳術。將各突變株之DNA片段從上述瓊脂糖凝膠分離出，並使用Gene Clean Kit根據製造商(BIO101)所附之操作手冊進行純化。將每一突變株之BamHI與XhoI片段接合入大腸桿菌表現載體pTRC His A(Invitrogen)的BamHI與XhoI切位。將所得之質體轉形至大腸桿菌BL21 Rosseta中。藉由IPTG誘導使ENO1突變蛋白於大腸桿菌進行表現，並於將細菌沉澱以超音波震碎後，使用Ni-agarose根據製造商(Qiagen)所附之操作手冊進行純化。以12% SDS PAGE分析每一突變型的純度。測定每一突變型蛋白之結合活性，係將400ng人類ENO1蛋白或突變型蛋白塗覆於96-孔ELISA平盤，並將該平盤以PBS清洗。將10微克EN10 mAb抗體加入該平盤中，並將該平盤置於37℃反應1小時。將所成之結合複合物以PBS清洗兩次後，將與HPRT共軛之山羊抗-小鼠IgG加入。反應1小時後，將TMB加入。讀取OD405值計算結合親和性。每項實驗重複進行三次。數據以平均值±SD表示。使用T-測試比較各組間的活性。P值<0.05即認為統計學上具顯著差異。

每一突變型與野生型蛋白之12% SDS PAGE分析結果如圖12B所示。各突變型之分子量係從296-343突變型增加至野生型。此結果暗示，吾等可從各突變珠產生完整蛋白質，甚至可見到突變型336-434及376-434之分解。如圖12C所示，野生型ENO1與缺失突變型336-434、376-434及369-343對於EN10 mAb之結合親和性之間無顯著差異。然而，當296至316及317至336之胺基酸殘基缺失時，此二ENO1突變型對於EN10 mAb之結合活性喪失，相較於大腸桿菌細胞溶解產物背景值。此等結果暗示，296至336之胺基酸殘基對於ENO1蛋白與EN10 mAb之結合具有重要性。

實施例13. 丙胺酸掃描

進一步探究人類ENO1之296至336中那些胺基酸殘基對於EN10 mAb結合具有重要性。從蛋白質資料庫(pdb-entry：2PSN)下載ENO1之晶體結構。經過結構分析後，推測胺基酸殘基D300、W301、G302、Q305、K306、 A309、K326、K330、N333、E334及K335被暴露在蛋白質表面，且為用於分析彼等是否對EN10 mAb結合確實具有重要性之候選殘基。選擇此等11殘跡其中10個(除了突變成甘胺酸之A309以外)，使用QuickChange II定點誘變套組，根據製造商(Agilent Technology)所附之操作手冊進行突變成丙胺酸。下列用於丙胺酸掃描之致變寡核苷酸(表1)係由Genomics BioScience and Technology公司製造。

對於每一突變型之擴增作用，係使用組成包含3微升約30ng之模板cDNA、5微升10×反應緩衝液、1微升10mM dNTP mix、1微升2.5單位pfu聚合酶、12.5微升125ng之前向引子與12.5微升125ng之反向引子，並以二次蒸餾水製備最終體積為50微升之反應溶液，進行PCR反應。使用一於95℃反應10分鐘之週期。然後，重複進行於95℃反應30秒、於55℃反應30秒及於68℃反應6分鐘之週期16次。於PCR反應後，將1微升DpnI加入每一PCR試管中，於37℃下培育1小時，然後於80℃加熱20分鐘使DpnI去活化。將反應產物根據製造商(Invitrogen)所附之操作手冊，進行轉形至50微升XL1-Blue勝任細胞。使用ENO1 R400-420引子(5'-GCAAGGGGCACCAGTCTTGATCTG--3'(SEQ ID NO：48))進行核苷酸定序。將每一具有正確序列之突變株質體轉形至大腸桿菌BL21 Rosseta中。藉由IPTG誘導使ENO1突變蛋白於大腸桿菌進行表現，並於將細菌沉澱以超音波震碎後，使用Ni-agarose根據製造商(Qiagen)所附之操作手冊進行純化。以12% SDS PAGE分析每一突變型蛋白的純度。

測定每一突變型蛋白之結合活性，於4℃下，將400ng/100微升人類ENO1蛋白或突變型ENO1蛋白塗覆於96-孔ELISA平盤過夜，並將該平盤以PBS清洗。於室溫下將平盤以1% BSA(w/v)之PBS溶液進行封阻1小時，然後再次以1X PBS清洗。將一級抗體(EN10 mAb)進行2-倍系列稀釋成15種不同濃度，並加入該平盤中於37℃反應1小時。於反應完成後，將平盤以1X PBS清洗三次。將1/8000稀釋之山羊抗-小鼠-HRP抗體加入，並於37℃反應1小時，將平盤以1X PBS清洗三次。然後將TMB受質加入，並使反應於室溫下進行30分鐘。藉由添加1N HCl終止反應，並讀取OD405值以測定活性。每項實驗重複進行三次。數據以平均值±SD表示。使用OD讀值與抗體濃度，以Sigmaplot^TM製作多重散佈圖。藉由四參數邏輯配合估算出K_d值。

根據實施例9所示之ENO1大部分缺失研究結果，從殘基第296至336號之肽序列FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS(SEQ ID NO：49)，為ENO1蛋白與EN10 mAb緊密結合所需。“緊密結合”用於本文意指，特定結合劑(例如，抗體、scFv或Fab片段)與配體/標靶物(例如，肽類、蛋白質或細胞)間之結合的解離常數(K_d)為10nM或以下，較佳為1.0nM或以下。

上述缺失實驗確認ENO1之殘基296至336為抗體結合區域。為進一步鑑定確實的結合部位(例如，抗原決定基)，遂從蛋白質資料庫(pdb-entry：2PSN)下載ENO1之晶體結構，從此等區域分析殘基位置。其中包括D300、W301、G302、Q305、K306、A309、K326、K330、N333、E334及K335之十一個胺基酸殘基係暴露在蛋白質表面(圖13A，推演之抗原決定基)。經由定點誘變作用，將此11個胺基酸進行突變，並將所得之突變型蛋白分別於大腸桿菌中表現並純化(圖13B)。使用ELISA分析每一純化ENO1突變型蛋白相較於ENO1結合之K_d值變化量。

此等結果表示，此等突變型中有三類功能胺基酸殘基。胺基酸殘基W301及K330對於ENO1與EN10 mAb間之結合很重要。若將此二胺基酸殘基分別突變成丙胺酸，此二ENO1突變型與EN10 mAb的結合活性明顯受抑制。第二類胺基酸殘基包括A309、E334、K335及D300。若分別將E334、K335及D300突變成丙胺酸，或將A309突變成甘胺酸，此等ENO1突變型與EN10 mAb的結合活性受抑制。最後一類胺基酸殘基包括G302、Q305、K306、N333及K326，屬於對於ENO1與EN10 mAb間之結合不具顯著影響的胺基酸殘基(圖13C及表2)。此等結果暗示，W301、K330、A309、E334、K335及D300對於ENO1與EN10 mAb間之具有重要性。此等胺基酸殘基屬於肽1(²⁹⁶FD Q D D W G A W Q K F T A ³⁰⁹(FIG.13D,SEQ ID NO：9))，及肽2(³²⁶ K R I A K A V N EK S³³⁶(FIG.13D,SEQ ID NO：10))之序列，此二序列可能是EN10 mAb之位於人類ENO1胺基酸序列編號至內的抗原決定基(圖13D；SEQ ID NO：49)。

實施例14. ENO1與EN10 mAb之結構分析

從蛋白質資料庫(pdb-entry：2PSN)下載α-烯醇化酶之晶體構造。使用同源性模擬(homology modeling)建構EN10 mAb之片段結構。第一步係找出與EN10 mAb具有高度序列相似性之模板結構。搜尋NCBI資料庫(www.ncbi.nlm.nih.gov.)並找出許多高度同源的符合型。選出重鏈框架(pdb-entry：3DGG)(同一性89%)與輕鏈框架(pdb-entry：1F6L)(同一性95%)。以 Accelrys Discovery Studio程式建構EN10 mAb之抗體同源性模型。使用ENO1與抗體構造進行分子對接。為減輕電腦運算的負荷，僅將抗體可變區之CDR環與ENO1進行分子對接。固定抗體框架。由於分子對接程序顯是在起始位置附近有一相對較大的區域，故不需要很小心定出分子對接配偶體之初始位置。當使用ZDock時，結構會受到x-y-z軸移動干擾(沿著中心線擾動，於垂直於中心線之平面的埃度微擾，埃度-旋轉微擾，以度計)，且每一分子對接回合產生大約500種態勢。以5Å與10Å截斷匯集ZDock之分析結果。選擇ENO1之交互作用殘基進行抗原決定基定位。

人類ENO1蛋白之3D結構如圖14A所示。標示出胺基酸殘基W301、K330、300D、E334與K335。指出位於由Wang等人所發表之ENO1蛋白血纖維蛋白溶酶原結合部位中的重要殘基(250-FFRSGKY 256)。圖14B顯示，ENO1與EN10 mAb之結合複合體預測係靠近ENO1蛋白血纖維蛋白溶酶原結合部位約5Å至15Å。血纖維蛋白溶酶原結合部位與EN10 mAb間之空隙小於34Å，此為人類血纖維蛋白溶酶原之分子大小。本項研究暗示，ENO1與EN10 mAb之結合遮蓋ENO1的血纖維蛋白溶酶原結合部位，而防止細胞從胞外基質游離。

實施例15. Biacore分析

使用可溶性ENO1蛋白與固定於CM5晶片上之抗體結合，進行Biacore分析。

將小鼠可變區與人類之嵌合型抗體表現載體pTCAE8-ENO1(如圖15A所示)導入宿主細胞，而製備重組抗體-表現細胞。使用FreeStyle293細胞(由Invitrogen製造)做為宿主細胞。使用脂質體2000轉染試劑，根據製造商所附之操作手冊(由Invitrogen製造)，將載體導入宿主細胞。將約2.5微克抗體表現載體以限制酵素切成線形，將基因導入4×10⁶細胞中，並將細胞接種於6-孔培養盤中。加入相當於該表現載體篩選標記之試劑，並將細胞進行連續培養而形成穩定的匯集。

使用下述之方法，製備含有人類IgG抗體之培養物上清液。將抗體-製造細胞馴養於Free style^TM293表現培養基(GIBCO)。細胞培養於組織培養瓶，在細胞存活率達90%時收集培養物上清液。將培養物上清液通過10微米及0.2微米濾膜(由Millpore製造)過濾，以除去雜質。將含有抗體之培養物上清液使用蛋白質A(由Millpore製造)進行親和性純化，其中為吸收緩衝液，且20mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0)做為溶析緩衝液。添加50mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0)，將溶析流份調整至約pH 6.0。使用透析膜(截斷大小10,000MW，由Spectrum Laboratories製造)將製備得之抗體溶液以PBS進行置換，並通過孔徑為0.22微米之薄膜過濾器(由Millpore製造)進行過濾滅菌，而產生純化的抗體。藉由測量於280nm之吸光度，並將所測得數值基於1.45光密度等於1mg/m進行轉換，而測定純化抗體之濃度。

關於結合動力學，係使用BIAcore 2000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)進行表面電漿共振(SPR)，如Karlsson&Falt,(1997)J.Immunol Methods 200：121-133所述。根據供應商之說明，將羧甲基化葡萄聚醣生物感測晶片以N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-羰二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)進行活化。將嵌合型EN10 mAb以10mM醋酸鈉(pH 4.8)稀釋成5微克/ml，之後以20μL/分鐘之流速注射而達到大約100反應單位(RU)之偶合蛋白，隨後再注射1M乙醇胺阻斷未反應的基團。對於動力學測量，係於25 ℃以25μL/分鐘之流速，將兩倍系列稀釋之ENO1(0.3125nM至40nM)注射於製造商(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)所提供之電泳緩衝液中，並藉由減去於空白流室之反應值校正對於EN10 mAb之結合反應。使用單純一對一Langmuir結合模式，以及kon與koff分別進行擬合，計算締合速率(kon或ka)與游離速率(koff或kd)。(BIAcore.TM.估算軟體3.2版)

結果如圖15B及表3所示。EN10 mAb與ENO1結合之kon及koff值分別為3.57x10⁵和8.271x10^-5，且K_d值為2.311±0.003x10^-10mol/L。經由SPR分析所得之K_d值與實施例2之結合ELISA所得者非常接近。

實施例16. 於補體存在下EN10抗體對於腫瘤生長之抑制功效

ENO10mAb具有良好的親和力(K_d值約2.311±0.003x10^-10mol/L)以及用於進一步研發之潛力。使用CL1-5小鼠異種移植模式評估EN10 mAb之治療功效。於第0天，以皮下接種CL1-5F4肺腺癌細胞(1×10⁶個細胞/小鼠；5隻小鼠/組)。於腫瘤接種14天後，投藥10mpk(mg/Kg)同型對照組(CTL)、EN10 mAb或Erbitux^TM抗體每周兩次，進行治療程序。注射後2小時施予兔仔血清。每週測量各別小鼠之腫瘤體積與體重。各組的數據以平均值±SD表示。

結果如圖16所示。14天後，帶有CL1-5之小鼠的腫瘤大小為約30至100mm³，且在經過25天後，對照組、EN10 mAb與Erbitux處理組的腫瘤大小之間無顯著差異。於29天後，對照組小鼠之腫瘤開始呈指數型生長，而經Eribitux^TM及EN10 mAb處理之小鼠其腫瘤無明顯成長。第36天後，對照組小鼠之平均腫瘤大小為4330±990mm³(N=5)，而以10mpk EN10 mAb及Erbitux處理之小鼠的平均腫瘤大小分別為358.6±240mm³(N=5)及219±98mm³(N=5)。EN10 mAb及Erbitux處理組之平均腫瘤大小皆明顯較對照組小，P值分別為0.004和0.003。EN10 mAb與Erbitux處理組之間，無顯著的腫瘤大小差異(P=0.41)。此結果指出，於小鼠異種移植模式中，當EN10 mAb及Erbitux與補體組合時，對於CL1-5細胞具有生長抑制活性，且可有效做為用於癌症治療的試劑。

實施例17. 以脾臟-肺臟轉移群落形成分析檢視阻礙胰臟癌擴散之功效

由實施例2與3之結果顯示，投藥ENO1抗體能減弱癌細胞侵襲及轉移，且由實施例16之結果指出，ENO1 mAb當與補體組合時，具有抑制腫瘤成長的功效。為評估EN10 mAb於活體內對癌細之抗-轉移活性，遂進行脾臟-肺臟轉移分析。將PDAC1胰腺癌細胞注射入脾臟中(1×10⁶個細胞/小鼠；5隻小鼠/組)。然後經由分別將10mpk EN10 mAb及IgG對照組投藥予各組小鼠。於腫瘤接種後6週，將小鼠犧牲。分別計數及測量各別小鼠之肝中腫瘤結節數及器官重量，包括肺臟、脾臟、肝臟、胰臟和腎臟。數據以各別組之平均值±SD表示。

結果如圖17A、17B與17C所示。當比較肝腫瘤結節及體積時，以對照組IgG處理之動物組的平均肝腫瘤結節及體積分別為34±10(N=3)和8500±3500(N=5)。但是，當相同背景小鼠以10mpk之EN10 mAb處理時，平均肝腫瘤結節及體積分別為10±4(N=3)和500±120(N=5)。10mpk EN10 mAb處理組與對照組IgG處理組之間，肝腫瘤結節及體積有顯著差異(P<0.05)(圖17A與17B)。當比較10mpk EN10 mAb處理組與對照組IgG處理組之平均器官重量時，該二組之間無顯著的器官重量差異，包括肺臟、脾臟、胰臟和腎臟。然而，以10mpk IgG處理之小鼠具有平均肝臟重量約7.2±3g(N=5)，與以10mpk EN10 mAb處理之小鼠比較具有統計上差異(1.6±0.2g(N=5),P<0.05)。此等結果暗示，投藥可抑制PDAC1細胞從原發腫瘤部位轉移至肝臟。

綜合上述，EN10 mAb利用其ENO1血纖維蛋白溶酶原受體拮抗劑活性抑制血纖維蛋白溶酶原活化，藉而誘導減量調節細胞表面上的蛋白酶活性，之後導致癌細胞從胞外基質游離受到抑制。結果，對抗ENO1之抗體能夠抑制癌細胞的侵襲能力。此等數據支持，ENO1抗體(例如EN10 mAb)具有較佳的親和性、功效及做為用於治療癌症之治療性抗體的潛力。

除了抑制癌細胞從胞外基質游離，以及因此抑制癌症侵襲之外，本發明之抗體亦可用於診斷癌症病況。如上所述及圖1A與圖1B所示，癌細胞ENO1將表現於細胞表面上，而正常細胞不會。因此，吾等可偵測抗體與細胞表面ENO1之結合，做為癌症病況的指標。

例如，根據本發明之實施態樣，可將測試樣本與抗-ENO1抗體(例如EN10 mAb)反應，並測定該抗體與該樣本之結合，例如藉由、螢光細胞分選、螢光顯微鏡或任何本發明所屬技術領域已知的適宜方法。若有偵測到結合或超過閥值(例如，對於正常細胞之參考值)，則可結論該樣本中含有癌細胞。

雖然本發明已描述其有限的具體實施範例，然習於本發明所屬技術領域者可借助於本說明書之揭示而了解，在不偏離本說明書所揭露之範圍下，可衍生出其他實施態樣。於是，本發明之範圍應受限於所附的申請專利範圍。

<110> 生物技術發展中心(Development Center for Biotechnology)

<120> α-烯醇化酶特異性抗體及其於癌症治療之應用

<130> 17787/016001

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<170> PatentIn 3.5版

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Claims

一種結合人類α-烯醇化酶(ENO1)蛋白之抗體或其scFvc或Fab片段，包含：一或多種選自由HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQ ID NO：3)、HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQ ID NO：4)、HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQ ID NO：5)、LCDR1(RASENIYSYLT；SEQ ID NO：6)、LCDR2(NAKTLPE；SEQ ID NO：7)及LCDR3(QHHYGTPYT；SEQ ID NO：8)所組成之群組的序列。
如請求項1所述之抗體或其scFvc或Fab片段，包含一重鏈，其中該重鏈包含HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQ ID NO：3)、HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQ ID NO：4)及HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQ ID NO：5)序列。
如請求項2所述之抗體或其scFvc或Fab片段，其中該重鏈包含SEQ ID NO：1之序列。
如請求項1所述之抗體或其scFvc或Fab片段，包含一輕鏈，其中該輕鏈包含LCDR1(RASENIYSYLT；SEQ ID NO：6)、LCDR2(NAKTLPE；SEQ ID NO：7)及LCDR3(QHHYGTPYT；SEQ ID NO：8)序列。
如請求項所述之抗體或其抗體scFvc或Fab片段，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：2之序列。
如請求項1所述之抗體或其抗體scFvc或Fab片段，包含一含有HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQ ID NO：3)、HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQ ID NO：4)與HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQ ID NO：5)序列之重鏈，及一含有LCDR1(RASENIYSYLT；SEQ ID NO：6)、LCDR2(NAKTLPE；SEQ ID NO：7)與LCDR3(QHHYGTPYT；SEQ ID NO：8)序列之輕鏈。
如請求項6所述之抗體或其scFvc或Fab片段，其中該重鏈包含SEQ ID NO：1之序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：2之序列。
一種抗體，或其scFvc或Fab片段，其中該抗體或其scFvc或Fab片段能夠以10nM或更低之解離常數(K_d)與一包含FDQDDWGA WQKFTA(SEQ ID NO：9)或KRIAKAVNEKS(SEQ ID NO：10)序列之人類ENO1蛋白或胜肽結合。
如請求項8所述之抗體或其scFvc或Fab片段，其中該人類ENO1蛋白或胜肽包含FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS(SEQ ID NO：49)序列。
如請求項1-9中任一項所述之抗體或其scFvc或Fab片段，其中該抗體為單株抗體。
一種用於治療肺癌、乳癌、胰臟癌、肝癌、結腸直腸癌或前列腺癌之醫藥組合物，其包含如請求項1-10中任一項所述之抗體或其scFvc或Fab片段。
一種用於診斷癌症之診斷套組，包含：如請求項1-10中任一項所述之抗體或其scFvc或Fab片段，用於與一取自受檢個體之樣本反應；及檢測該抗體與該樣本結合程度之試劑。
一用於抑制癌症侵襲之組合物，其包含如請求項1-10中任一項所述之抗體或其scFvc或Fab片段。