TW202333790A - α-烯醇酶拮抗劑治療血管新生相關疾病之用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供治療血管新生相關疾病的方法,該方法包含向有需要的個體施用有效量的α-烯醇酶(enolase-1,ENO-1)拮抗劑。
Description
本文揭示涉及血管新生的醫學領域。更特定而言,本文揭示涉及α-烯醇酶(enolase-1,ENO-1)拮抗劑的用途,其係用於抑制血管新生及其治療及/或預防血管新生相關疾病,更具體而言為老年性黃斑部病變與糖尿病視網膜病變。
血管新生是從預先存在的血管形成新的毛細管。當失調時,新血管的形成會導致許多惡性、局部缺血、發炎、感染以及免疫病症。這些血管新生相關疾病包括但不限於癌症、血管腫瘤與畸形(血管纖維瘤、動靜脈畸形、血管瘤)、心血管、肺與中樞神經系統疾病(動脈粥狀硬化、血管黏附、血管性失智症、再狹窄/再灌注損傷、肺纖維化、阿茲海默症)、眼部病症(角膜血管新生疾病、視網膜血管新生疾病、視網膜血管瘤增殖、息肉狀脈絡膜血管病變、血管新生老年性黃斑部病變、糖尿病視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、血管新生青光眼、局部缺血視網膜病變、晶狀體後纖維增生症、或早產兒視網膜病變)、或慢性發炎疾病(克隆氏症、糖尿病、乾癬、化膿性肉芽腫、牙周病、類風濕性關節炎、或全身性硬化症)。
血管新生是由複雜的多步驟過程所促成,該過程包含一系列導致血管新生的細胞事件。血管新生因子,諸如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors,VEGF),會引起血管內皮細胞的增殖與遷移增加。內皮細胞侵犯鄰近組織的間質需要基底膜的蛋白水解,其中存在血纖維蛋白溶解酶原活化劑系統與基質金屬蛋白酶的協作活性。因此,VEGF抑制劑在血管新生依存疾病的治療中具有相當大的價值。例如,抗VEGF療法可誘導腫瘤消退,或預防與血管新生老年性黃斑部病變或增生性糖尿病視網膜病變相關的失明。然而,當使用抗VEGF療法時,會發生原發與繼發不反應性(primary and secondary non-responsiveness),故仍需要新的抗血管新生策略。
缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)可感知組織缺氧並以多種方式影響血管新生。HIF-1α為調控糖解酶、VEGF、與其它維持氧氣平衡重要蛋白的主要基因轉錄因子。糖解作用則經由HIF-1α控制血管內皮細胞的增殖與遷移。
ENO-1為多功能蛋白,其最初在細胞溶質中被發現作為糖解作用的酵素之一。三磷酸腺苷(ATP)參與血管內皮細胞的生長與增殖。在缺氧的情況下,糖解作用可做為能量代謝的代償性適應過程,以獲得生命活動所必需的能量。已證實在HIF-1α控制的低氧條件下ENO-1被正調控。活化經ENO-1媒介的糖解途徑可改善缺氧細胞的能量失衡、促進轉錄、增殖並抑制細胞凋亡,從而導致促進血管新生。
ENO-1也被發現可在細胞表面上表現,作為血纖維蛋白溶解酶原受體。已知血纖維蛋白溶解酶原受體蛋白的正調控可誘導尿激酶血纖維蛋白溶解酶原活化劑系統的級聯反應,並導致血管新生中所需的細胞外基質降解。
本申請要求2022年1月26日提交的美國臨時申請案第63/303,421號的權益,其在此以引用的方式併入本文以用於所有目的。
本發明涉及靶向ENO-1的α-烯醇酶(enolase-1,ENO-1)拮抗劑及其用途,其中ENO-1拮抗劑(例如人類ENO-1抗體)具有作為抗原結合結構域與ENO-1結合的能力,從而中和ENO-1的生物學效應。ENO-1拮抗劑能與游離的ENO-1蛋白及細胞表面上的ENO-1蛋白結合,且在血管新生相關疾病的治療中具有重要的應用前景。
根據本文揭示的某些具體實施例,血管新生相關疾病或病症可為由ENO-1蛋白的異常活化或表現所引起的任何病況。
根據本文揭示的某些具體實施例,血管新生相關疾病或病症可包括:(1)眼部血管新生疾病(諸如視網膜血管新生疾病、血管新生老年性黃斑部病變、糖尿病視網膜病變、及早產兒視網膜病變),為一種新血管侵犯視網膜或角膜的疾病,導致不可逆的視覺暫時損傷;(2)類風濕性關節炎與骨關節炎;軟骨下空間與血管通道內的細胞及軟骨細胞分泌誘導血管新生的各種生長因子,其可導致滑膜炎的發病與隨後關節軟骨的破壞;(3)發炎與發炎疾病;在發炎期間,促炎性細胞因子(諸如環氧合酶2、前列腺素E2與凝血脂素A2)、發炎細胞(諸如巨噬細胞、T細胞與肥大細胞)、以及缺氧誘導因子(HIF)會引起促血管新生因子的表現,該促血管新生因子會導致血管新生;新血管分布進而增強發炎細胞的浸潤,進一步使發炎惡化;(4)遺傳性疾病,諸如Osler-Weber-Rendu疾病或遺傳性出血性毛細血管擴張症,其與血管新生的異常有關,其中多元系統血管異常增生(angiodysplasia )為嚴重出血的原因;以及(5)腫瘤形成與轉移;腫瘤細胞分泌各種促血管新生因子,這些因子經由血管新生過程促進新血管的形成;由於新血管為腫瘤細胞提供充足的營養與氧氣,因此在腫瘤生長中很重要,且由於提供腫瘤遷移與侵犯之途徑而與腫瘤轉移相關。
根據本文揭示的某些具體實施例,藉由以下來施用:口服、腸胃外、口頰、陰道、直腸、吸入、吹入、舌下、肌內、皮下、局部、鼻內、腹膜內、胸腔內、靜脈內、硬膜外、鞘內、腦室內、眼內、或玻璃體內途徑。
根據本文揭示的某些實施例,個體為哺乳動物。在一個較佳的具體實施例中,個體為人類。
根據本文揭示的某些具體實施例,ENO-1拮抗劑可為核酸,例如DNA或RNA,其經設計而被遞送到細胞中並表現為肽或蛋白。例如,ENO-1拮抗劑可為能被轉錄與轉譯成例如抗ENO-1抗體或其結合片段的核酸。另外,核酸可具有或不具有分泌訊號肽,以便從核酸轉錄與轉譯的蛋白或肽可為分泌型、非分泌型、或其組合。根據本文揭示的某些具體實施例,可經由任何已知的方法或介質,例如病毒載體、聚合物或脂質體使核酸遞送到個體。根據本文揭示的某些具體實施例,可用已知的經修飾核苷酸,例如假UTP、1-甲基假UTP、5-甲氧基UTP、N1-乙基假UTP、5-甲基CTP或N4-乙醯基-CTP來取代核酸,從而增強表現效率。
與先前技術相比,本發明具有以下有益效果。根據本文揭示,體外實驗證實ENO-1拮抗劑(例如ENO-1單株抗體)的抗血管新生功效。也就是說,經由抑制血纖維蛋白溶解酶活化與糖解重編程的新機轉,ENO-1拮抗劑為血管新生相關疾病,例如血管新生老年性黃斑部病變的潛在療法。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解到,醫藥有效量取決於許多因素,諸如患者病況、年齡、疾病狀態、施用途徑等,且其可基於日常實踐中的該些因素且無需過度實驗而決定。
藉由以下描述,所揭示的發明的其他方面將變得顯而易見。
一般定義
除非另有說明,否則本發明的實施將使用分子生物學、微生物學、重組DNA及免疫學的常規技術,這些技術在本領域的技術範圍內。這些技術在文獻中有充分的解釋。請例如參見:Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版,Sambrook、Fritsch與Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989);DNA Cloning,第1卷與第2卷(D. N. Glover編輯,1985);Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney,Alan R. Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller與M. P. Calos編輯,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Methods In Enzymology, 第154卷與第155卷(Wu等人編輯),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer與Walker編輯,Academic Press,London,1987);Antibodies: A Laboratory Manual,Harlow與Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988);以及Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D. M. Weir與C. C. Blackwell編輯,1986)。
「ENO-1拮抗劑(antagonist)」乙詞涉及具有作為抗原結合結構域與ENO-1結合的能力以中和ENO-1的生物學效應的分子。
「抗體」及「免疫球蛋白」等詞在最廣泛的意義上可互換使用,且包括單株抗體(例如全長或完整單株抗體)、多株抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體,只要其表現出所需的生物活性即可),且也可包括某些抗體片段(如本文更詳細描述的)。抗體可為嵌合的、人類的、人源化的、及/或親和力成熟的。
「可變(variable)」乙詞涉及如此事實,即可變結構域的某些部分在抗體之間的序列差異很大,且用於每個特定抗體對其特定抗原的結合與特異性。然而,可變性並非均勻分佈在抗體的整個可變結構域。其集中在輕鏈及重鏈可變結構域中稱作互補決定區(CDR)或高度變異區的三個區段中。可變結構域的更高度保守的部分稱作框架(FR)。天然重鏈及輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區,主要採用由三個CDR連接的β接摺疊構型,該等CDR形成環連接,且在一些情況下形成β-摺疊結構的一部分。每條鏈中的CDR由FR區緊密地連接在一起,且與來自另一條鏈的CDR一起促成抗體的抗原結合位點的形成(請參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定結構域不直接參與抗體與抗原的結合,但表現出各種效應物功能,諸如抗體參與抗體依存細胞毒性。
抗體可為全長的,或可包含具有抗原結合部分的抗體片段,包括但不限於Fab、F(ab’)2、Fab’、F(ab)’、Fv、單鏈Fv(scFv)、二價scFv(bi-scFv)、三價scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段(例如Ward等人,Nature,341: 544-546(1989))、CDR、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、及由抗體片段形成的多特異性抗體。本發明也涵蓋藉由使用重組方法或合成連接子連接抗體片段而產生的單鏈抗體。Bird等人,Science,1988,242:423-426。Huston等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1988,85:5879-5883。
如本文所用,「治療(treatment)」或「治療(treating)」涉及試圖改變被治療的個體或細胞的自然過程的臨床介入,且可為了預防或在臨床病理學期間進行。治療的期望效果包括預防疾病的發生或復發、減輕症狀、減弱疾病的任何直接或間接病理後果、預防或減少發炎及/或組織/器官損傷、降低疾病惡化的速度、改善或減輕疾病狀態、以及緩解或改善預後。在一些具體實施例中,本文揭示的抗體用於延遲疾病或病症的發展。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為脊椎動物。在某些具體實施例中,脊椎動物為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於農場動物(諸如牛)、運動動物、寵物(諸如貓、狗與馬)、靈長類動物、小鼠及大鼠。在某些具體實施例中,脊椎動物為人類。
「有效量」涉及在必要的劑量及時間段內有效實現期望的治療或預防結果的量。然而,本文揭示的物質/分子的「治療有效量」可根據諸如個體的疾病狀態、年齡、性別與體重,以及物質/分子在個體中引起期望反應的能力等因素而變化。有效量也是物質/分子的任何毒性或有害作用被治療有益作用超過的量。在一個具體實施例中,抗ENO-1抗體的有效量範圍為1至1000 mg/kg,較佳5至100 mg/kg,更佳10至50 mg/kg,例如5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100 mg/kg。
本文所用的「血管新生」乙詞是指涉及從預先存在的血管發芽並在疾病發展與惡化中扮演關鍵角色的生物過程(Folkman J.,
N Engl J Med1995,333:1757-1763)。血管新生為複雜的過程,其中內皮細胞作為血管擴張的構成單元。其藉由促血管新生分子和抗血管新生分子之間的精細平衡來調節。
在某些疾病中,血管新生的控制發生改變。許多這樣的疾病涉及病理性血管新生(也就是不適當、過度或不期望的血管形成),以維持疾病狀態,且在許多情況下促成與這樣的疾病相關的細胞與組織損傷。血管新生相關疾病(也就是涉及病理性血管新生的疾病)無數且多樣。其包括但不限於各種形式的腫瘤、慢性發炎疾病與血管新生疾病。在一個具體實施例中,血管新生相關疾病可包括視網膜血管新生疾病、血管新生老年性黃斑部病變、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變、或癌症。
關於血管新生在血管新生相關疾病中的作用的一般性討論,請參見以下參考文獻:Moses等人,1991,BioTechol. 9:630-633;Leek等人,1994,J. Leuko. Biol. 56:423-435;及Beck等人,1997,FASEB J. 11:365-373。
在一個具體實施例中,ENO-1拮抗劑可與抗血管新生劑一同施用以治療血管新生相關疾病。許多抗血管新生劑已被開發使用。其包括軟骨衍生因子(Moses等人,1990,248:1408-1410;Oikawa等人,1990,Cancer Lett. 51:181-186);血管抑制類固醇(Folkman等人,1983,Science 221:719-725;Crum等人,1985,Science 230:1375-1378;Oikawa等人,1988,Cancer Lett. 43:85-92);及血管抑制性維生素D類似物(Oikawa等人,1989,Cancer Lett. 48:157-162;Oikawa等人,1990,Eur. J. Pharmacol. 178:247-50)、血管抑制素(O'Reilly等人,1994,Cell 79:315-328)、內皮抑制素(O'Reilly等人,1997,Cell 88:277-285)與verostatin(Pike等人,1998,J. Exp. Med. 88:230978:24)。與病理性血管新生為血管新生相關疾病的基礎的觀點一致,許多抗血管新生劑已被證實對這樣的疾病具有有益的治療活性。
本文揭示的藥劑可局部或全身性給予。本文揭示的藥劑也可以組合或與輔因子(cofactors)一同提供。若本文揭示的藥劑以常態存在於標靶位置,則本文揭示的藥劑可以足以恢復正常程度的量施用,或者可以使其程度升高到高於標靶位置的正常程度的量施用。
本文揭示的藥劑可從外源供應到標靶位置,或者其可由標靶位置中的細胞、或標靶位置所在的生物體的細胞在體內製備。
本文揭示的藥劑可為任何生理上合適的製劑。其可以藉由注射、局部、吸入、口服或任何其他有效方式施用到生物體。
上述相同的藥劑與方法可用於抑制或制止病理性血管新生。例如,其可治療或預防發在肝、腎、肺、心臟及心包、眼、皮膚、口、胰臟、胃腸道、腦、乳房、骨髓、骨、泌尿生殖器、腫瘤、或傷口中發生的病況。
治療血管新生相關疾病的方法
本文揭示提供治療血管新生相關疾病的方法,該等疾病例如為視網膜血管新生疾病、血管新生老年性黃斑部病變、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變、或癌症。該等方法一般涉及向有需要的個體施用有效量的α-烯醇酶(enolase-1,ENO-1)拮抗劑。另一方面,本發明進一步提供該ENO-1拮抗劑在製備用於治療血管新生相關疾病的藥劑中的用途。
在一些具體實施例中,用於該方法的ENO-1拮抗劑可包括但不限於:
(1) 抗ENO-1抗體或其結合片段;或
(2) 抗ENO-1抗體或其結合片段的核酸,其被遞送到細胞中並表現為細胞內抗ENO-1抗體或其結合片段。
本文揭示的實例將用以下具體實施例來說明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解,這些實例僅用於說明,且在不脫離本文揭示範圍的情況下可進行其他修改與變化。
實例
實例
1
:抗
ENO-1
抗體的製備
根據本文揭示的具體實施例,產生抗ENO-1抗體的一般方法包括獲得產生抗ENO-1的單株抗體的融合瘤。產生單株抗體的方法為本領域所習知,本文不再詳細描述。簡而言之,以抗原(ENO-1)及適當佐劑施予小鼠。接著,收集免疫小鼠的脾細胞並與融合瘤融合。可使用任何已知的方法,諸如ELISA,根據其結合ENO-1抗原的能力來識別陽性株。
在一個具體實施例中,本文揭示的抗ENO-1抗體可為小鼠或人源化抗ENO-1抗體,或其scFv或Fab片段。一種示例性抗ENO-1抗體包含具有三個互補區的重鏈可變結構域,其包括HCDR1(GYTFTSCVMN;SEQ ID NO: 1)、HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG;SEQ ID NO: 2)及HCDR3(EGFYYGNFDN;SEQ ID NO: 3),以及具有三個互補區的輕鏈可變結構域,其包括LCDR1(RASENIYSYLT;SEQ ID NO: 4)、LCDR2(NAKTLPE;SEQ ID NO: 5)及LCDR3(QHHYGTPYT;SEQ ID NO: 6)。
根據本文揭示的具體實施例,抗體可為小鼠抗體。或者,抗體可為嵌合抗體(例如,與小鼠可變區偶聯的人類恆定區)或人源化抗體(例如,移植到人類免疫球蛋白框架區上的小鼠CDR)或完全人類抗體。
藉由從融合瘤獲得CDR序列並使CDR序列選殖到人類構架序列中以產生人源化抗體,可使單株抗體人源化。可使用本領域已知用於識別CDR序列的任何常見方法。本發明中的CDR區以Kabat編號方案識別。首先,產生抗ENO-1的融合瘤(例如小鼠融合瘤)。可用標準方案產生單株抗體來產生這種融合瘤。接著,例如使用TRIzol
®試劑來分離融合瘤的總RNA。接著,從總RNA合成cDNA,例如使用第一股cDNA合成試劑盒(Superscript III)與寡核苷酸(dT20)引子或Ig-3’恆定區引子。
接著從cDNA選殖免疫球蛋白基因的重鏈及輕鏈可變區。例如,使用小鼠Ig-5’引子組(Novagen),藉由PCR從小鼠融合瘤cDNA擴增抗ENO-1 mAb的VH與VL可變區。可使用CloneJet
TMPCR選殖試劑盒(Ferments)使PCR產物直接選殖到合適的載體(例如pJET1.2載體)中。pJET1.2載體含有致死性插入片段,且僅當所需基因選殖到該致死區中時才能在選擇條件下存活。這有利於重組菌落的選擇。最後,從重組菌落中篩選所需株,分離這些株的DNA並定序。可在國際免疫基因體學資訊系統(IGMT)網站分析免疫球蛋白(IG)核苷酸序列。
抗體表現與純化
對於抗體生產,分離株可在任何合適的細胞中表現。例如,以表現抗ENO-1單株的質體轉染F293細胞(Life Technologies)並培養7天。使用蛋白A親和管柱(GE)從培養基中純化抗ENO-1抗體。可用Bio-Rad蛋白質試驗試劑盒來測定蛋白濃度,並使用本領域已知的方法或根據製造商的操作說明以12% SDS-PAGE進行分析。
實例
2
:
ENO-1
拮抗劑對
VEGF-A
刺激的內皮細胞的體外作用
生長在4孔載玻片上的原代人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)以血管內皮生長因子A(VEGF-A)處理4小時,並以固定液(BioLegend)在4℃下固定15分鐘,在0.1%牛血清白蛋白中封閉1小時,並以抗ENO1初級抗體(Abnova)培養1小時。以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)簡單清洗後,使載玻片與和Alexa Fluor 488共軛的山羊抗小鼠IgG二級抗體(Invitrogen)一同培養1小時。以PBS簡單清洗後,以DAPI(Sigma)染色細胞核5到10分鐘,並以Fluorosmount-G螢光封片膠(Southern Biotech)進行封片。使用Nikon顯微鏡獲取影像。圖1顯示VEGF-A處理增加HUVEC上的ENO-1表面表現,以免疫螢光染色來檢測。
以PBS清洗經VEGF-A(PeproTech)刺激4小時的HUVEC細胞兩次,以10
6細胞/ml重新懸浮在PBS中,並在不存在或存在各種濃度的ENO-1抗體或控制組抗體人類IgG1的情況下,與30 μM人類麩胺酸-血纖維蛋白溶解酶原(Sigma)在37℃下預培養1小時。在培養後,以PBS清洗細胞3次並重新懸浮在PBS中,接著與1.5 nM組織血纖維蛋白溶解酶原活化劑(Sigma)及0.1 mM血纖維蛋白溶解酶基質Chromogenix S-2251(Diapharma)在37℃下培養2.5小時。藉由測量405 nm處的吸光度來測定血纖維蛋白溶解酶活性。圖2A顯示ENO-1抗體劑量依存地降低經VEGF-A誘導的血纖維蛋白溶解酶活化。傳明酸(TXA),一種被用作陽性控制組的離胺酸類似物,其經開發用於使血纖維蛋白溶解酶原的結合位點飽和,從而防止血纖維蛋白溶解酶形成。對於遷移試驗,將900 μl含有10%胎牛血清(FBS)的培養基加入底孔後,使無塗覆的transwell(Corning)置於底孔中。將經VEGF-A處理4小時的HUVEC細胞重新懸浮在補充有2% FBS的培養基中,並在不存在或存在各種濃度的ENO-1抗體、控制組抗體人類IgG1或TXA的情況下接種到transwell中。使細胞在37℃下遷移18小時。以棉花棒輕輕擦拭去除transwell薄膜上部的剩餘細胞。以甲醇固定transwell薄膜下側細胞10分鐘,接著再以1%結晶紫染色2小時。以PBS輕輕清洗transwell並乾燥。以33%乙酸溶解結合的結晶紫,並測量590 nm波長的吸光度。由於已知血纖維蛋白溶解酶能調節細胞遷移,因此圖2B顯示ENO-1抗體劑量依存地降低經VEGF-A誘導的HUVEC細胞遷移,這與圖2A中的結果一致。
HUVEC細胞在基質膠塗覆的96孔盤上生長,並在不存在或存在各種濃度的ENO-1抗體、控制組人類IgG1或TXA的情況下,以VEGF-A刺激24小時。觀察毛細管狀管的形成,並以人工計數毛細管狀管形成節點。圖3證實,在VEGF-A刺激的HUVEC中,ENO-1抗體劑量依存地降低管形成。這些結果表明ENO-1拮抗性抗體在活化的內皮細胞,具有抗血管新生作用。
實例
3
:
ENO-1
拮抗劑對
VEGF-A
刺激的血管發芽的作用。
為了檢驗ENO-1拮抗劑的抗血管新生作用,使用離體大鼠主動脈環發芽試驗。以VEGF-A或VEGF-A與各種劑量的ENO-1抗體的組合,處理浸沒在基質膠中的分離胸主動脈環節段(thoracic aortic ring segments)(1 mm)4天。分別使用人類IgG1(hIgG1)與VEGF單株抗體(貝伐單抗)(Bevacizumab)作為陰性與陽性控制組。如圖4所示,與控制組相比,VEGF-A顯著增加發芽微血管,尤其是在環內,在VEGF-A處理後形成複雜的網路。新微血管的生長在ENO-1抗體或貝伐單抗組中都受到顯著抑制。
ENO-1
拮抗劑的體內抗血管新生作用。
以腫瘤細胞引發的血管新生基質膠塞試驗(tumor-cells-elicited angiogenesis Matrigel plug assay)來驗證ENO-1拮抗劑在生物體內的抗血管新生作用。在BALB/c裸鼠(Lasco公司)的右側腹皮下植入混有RPMI 8226(BCRC60384號)人類骨髓瘤細胞(1:1)的基質膠,並伴有/不伴有ENO-1抗體。在處理7天後,取出基質膠塞,藉由使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測量基質膠塞中的血紅素濃度來定量血管新生反應。圖5中的結果顯示,與控制組相比,ENO-1拮抗劑顯著降低基質膠塞中的血紅素含量。
使用雄激素非依存人類前列腺癌細胞株PC-3(ATCC編號CRL-1435)在雄性BALB/c裸鼠(Lasco公司)中建立皮下異種移植模型。在接種前,以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗PC-3細胞,以PBS重新懸浮,再與基質膠 1:1 混合,使最終濃度為10
7細胞/ml。將細胞(10
6細胞/100 μL)皮下植入小鼠的右側腹。在PC-3細胞植入後三天,隨機分配小鼠,並藉由每週兩次腹腔內注射ENO-1抗體(30 mg/kg)。在第23天,收集腫瘤,藉由CD31表現的免疫螢光染色測量腫瘤內血管新生。圖6顯示CD31表現降低的趨勢,其表明ENO-1拮抗劑的體內抗血管新生活性。
總之,在體外或體內,ENO-1拮抗劑經由降低血纖維蛋白溶解酶活性、細胞遷移、管形成及血管發芽而顯著減弱血管新生。因此,ENO-1拮抗劑係可用於抑制血管新生及其治療及/或預防血管新生相關疾病。
除非另有定義,否則本文所用的所有技術和科學術語以及任何首字母縮略詞具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的相同含義。儘管用於傳達與本文所述之類似或等同的資訊的任何組合物、方法、試劑盒及手段可用於實施本發明,但本文所述為較佳的用於傳達資訊的組合物、方法、試劑盒及手段。
本文引用的所有參考文獻均以法律允許的最大程度引入本文作為參考。對這些參考文獻的討論僅僅是為了概括其作者的主張。不承認任何參考文獻(或任何參考文獻的一部分)為相關先前技術。申請人保留質疑任何引用參考文獻的準確性及相關性的權利。
無
圖 1為一組照片,顯示經VEGF-A刺激的原代人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞表面ENO-1表現的增加。
圖 2顯示ENO-1抗體在VEGF-A刺激的HUVEC中降低血纖維蛋白溶解酶活性與細胞遷移。
圖 3顯示ENO-1抗體在VEGF-A刺激的HUVEC中減少管形成(tube formation)。
圖 4顯示ENO-1抗體在大鼠主動脈環血管新生模型中減少血管發芽(sprouting)。
圖 5顯示ENO-1抗體在基質膠塞試驗(Matrigel plug assay)中減少體內血管新生。
圖 6顯示ENO-1抗體在前列腺癌皮下異種移植模型中體內減少體內血管新生。
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Claims (10)
- 一種治療血管新生相關疾病之方法,其包含: 向有需要的個體施用有效量的α-烯醇酶(enolase-1,ENO-1)拮抗劑。
- 如請求項1之方法,其中該ENO-1拮抗劑是抗ENO-1抗體或其結合片段。
- 如請求項2之方法,其中該抗體是單株抗體。
- 如請求項2之方法,其中該抗體或其結合片段包含: 具有三個互補區的重鏈可變域,其包括: HCDR1(GYTFTSCVMN;SEQ ID NO: 1)、HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG;SEQ ID NO: 2)及HCDR3(EGFYYGNFDN;SEQ ID NO: 3);以及 具有三個互補區的輕鏈可變結構域,其包括:LCDR1(RASENIYSYLT;SEQ ID NO: 4)、LCDR2(NAKTLPE;SEQ ID NO: 5)及LCDR3(QHHYGTPYT;SEQ ID NO: 6)。
- 如請求項2之方法,其中該抗體或其結合片段為小鼠抗體、人類抗體、嵌合抗體、人源化抗體、或其抗體片段。
- 如請求項1之方法,其中該ENO-1拮抗劑為待遞送到細胞內並表現為細胞內蛋白或肽的核酸。
- 如請求項6之方法,其中該ENO-1拮抗劑為分泌型、非分泌型、或其組合。
- 如請求項6之方法,其中該ENO-1拮抗劑經由病毒載體、聚合物及/或脂質體遞送。
- 如請求項1之方法,其中該等血管新生相關疾病包含視網膜血管新生疾病、血管新生老年性黃斑部病變、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變、或癌症。
- 一種如請求項1到8中任一項的ENO-1拮抗劑之用途,其係用於製造用於治療血管新生相關疾病的藥劑。
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