CN106488932A

CN106488932A - α‑烯醇化酶特异性抗体及其在癌症治疗中的使用方法

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Publication number: CN106488932A
Application number: CN201380082061.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡士昌; 施能耀; 阮大同; 刘柯俊; 曾世祺; 胡智湧; 王欣韵; 陈立宗
Original assignee: Development Center for Biotechnology; National Health Research Institutes; DCB USA LLC
Current assignee: Institute of Health; Development Center for Biotechnology
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: CA2949045C; RU2656153C1; WO2015094330A1; RU2016129166A; EP3083697A4; AU2013408259A1; CA2949045A1; EP3083697A1; TW201529603A; EP3083697B1; TWI549967B; ES2729797T3; CN106488932B; AU2013408259B2

Abstract

本发明公开了一种抗人α‑烯醇化酶(ENO1)抗体，其可结合含人ENO1蛋白(Genbank：AAH50642.1)的氨基酸序列²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTA³⁰⁹(SEQ ID NO:9)和/或³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶(SEQ ID NO:10)的肽，具有良好的结合活性(结合亲和力约为2.19×10^‑10mol/L)和显著的抑制各种肿瘤的细胞侵袭和肿瘤转移的能力。本发明鉴别的肽和抗体可用于已报道在细胞表面表达ENO1的癌症(如，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌和实体瘤)的诊断、预后和治疗。

Description

α-烯醇化酶特异性抗体及其在癌症治疗中的使用方法

发明领域

本发明涉及特异性结合人α-烯醇化酶蛋白(ENO1)的抗体的生产和使用方法。

发明背景

肿瘤产生于单个细胞的异常、无限制增殖产生的转化细胞繁殖系。肿瘤细胞可表达独特的可被免疫系统识别的抗原。肿瘤相关的抗原包括突变的致癌基因、突变的正常细胞蛋白，异常表达的细胞蛋白，异常的细胞表面蛋白，以及致癌性病毒蛋白。免疫系统将这些肿瘤相关的抗原识别为非自身抗原，并可产生抗体以清除携带这些外源抗原的肿瘤细胞，同时留下健康细胞。因此，鉴别出免疫原性肿瘤相关抗原，可用作癌症治疗中临床预后或治疗应用的靶标。

可由肺与胸壁之间的过量体液，即胸腔积液来鉴别某些恶性肿瘤。肺癌、乳腺癌以及淋巴瘤引起的恶性胸腔积液约占全部恶性胸腔积液的75％。恶性胸腔积液可能富含有淋巴细胞浸润物和肿瘤细胞。已在积液中发现了肿瘤相关免疫复合物或自身抗体，如抗p53抗体、抗核抗体和抗L-Myc抗体，且已发现这些复合物或自身抗体与差的预后有关。还已在恶性积液中鉴别到几种肺部肿瘤相关的抗原，包括细胞角蛋白19的片段，神经元特异性烯醇化酶(ENO2)，鳞状细胞癌抗原以及可溶性HLA-I等。

α-烯醇化酶(烯醇化酶-1，ENO1)是个多功能蛋白，最初发现是糖酵解通路中的一个关键的酶。在正常条件下，ENO1表达在细胞溶质中。但是，也发现ENO1表达在许多癌细胞的细胞表面上，作为血纤维蛋白溶酶原的受体，以及表达在活化的造血细胞如中性白细胞、淋巴细胞和单核细胞上。已知血纤维蛋白溶酶原受体蛋白的上调可诱导尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化系统(uPAS)的级联反应。

尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化系统(uPAS)由尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、其同源受体(uPAR)以及两个特异性抑制剂(血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂1(PAI-1)与血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂2(PAI-2))组成。尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化因子将血纤维蛋白溶酶原转换成一种活化的丝氨酸蛋白酶，即血纤维蛋白溶酶。血纤维蛋白溶酶参与许多组织重塑过程，例如基底膜(BM)和胞外基质(ECM)重塑，这些都是肿瘤生长和移转所需要的。此外，已显示uPAS可能会参与到肿瘤发展，影响肿瘤血管生成，恶性肿瘤细胞增生、黏附与迁移，内部的血管形成以及在转移部位的生长。

具体而言，血纤维蛋白溶酶原的活化可导致胞外基质降解，这反过来会引起癌细胞转移增加以及免疫细胞的浸润。换言之，表达在癌细胞表面上的作为血纤维蛋白溶酶原受体的ENO1可增加癌细胞的侵袭活性。因此，ENO1是潜在的癌治疗靶标。

发明内容

本发明的实施方案涉及特异性结合人ENO1，从而抑制配体(如血纤维蛋白溶酶原)结合ENO1的靶向结合剂。通过抑制血纤维蛋白溶酶原与ENO1的结合，本发明的靶向结合剂能抑制血纤维蛋白溶酶原活化，引起减少的胞外基质降解，这反过来能预防或降低癌细胞从胞外基质脱离。因此，本发明各实施方案中的靶向结合剂可用于抑制肿瘤生长和转移。可实现上述作用的机制可包括但不限于抑制配体(如血纤维蛋白溶酶原)与其受体ENO1的结合，或消除受体ENO1与其配体之间的相互作用，从而减少ENO1的有效浓度。

根据本发明的一个实施方案，靶向结合剂是可结合人ENO1以阻止其配体(如血纤维蛋白溶酶原)与ENO1结合的抗体。阻止血纤维蛋白溶酶原与其受体的结合可预防血纤维蛋白溶酶原活化。这导致癌细胞的胞外基质中的尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化系统(uPAS)被抑制。

根据本发明的某些实施方案，抗体可以高亲和力结合ENO1，如以低于0.3nM的K_d结合。这类紧密结合剂可高效抑制ENO1。

根据本发明的某些实施方案，靶向结合剂是可结合人ENO1并高效抑制(例如80％、90％或100％抑制)癌细胞上诱导的血纤维蛋白溶酶活性的抗体。可使用10微克/mL脂多糖(LPS)处理癌细胞(如U937人淋巴瘤细胞)5小时，诱导该癌细胞中ENO1表达，从而进行抑制分析。可使用合适浓度的抗体检测这种诱导的血纤维蛋白溶酶活性抑制。使用本发明的抗体，可在低至20微克/ml甚至更低的抗体浓度检测到这种抑制效果。

根据本发明的某些实施方案，靶向结合剂是可结合人ENO1的抗体。这种抗体可用于抑制癌细胞的侵袭活性。例如，本发明抗体可在其浓度低至50微克/毫升或更低时抑制人非小细胞肺癌CL1-5细胞50％、60％或70％以上的侵袭活性。

根据本发明的某些实施方案，靶向结合剂是能结合人ENO1以抑制胞外基质降解，进而抑制癌细胞从细胞外基质脱离的抗体。例如，本发明抗体可在其浓度低至50微克/毫升或更低时抑制40％、50％或60％以上的血纤维蛋白溶酶原介导的CL1-5细胞与胶原蛋白或纤连蛋白的脱离。

根据本发明的实施方案，靶向结合剂(如抗体)可包含具有互补决定区(CDR)的重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列含有序列1中所含CDR序列中的一条CDR序列。

根据本发明的某些实施方案，靶向结合剂(如抗体)可包含具有互补决定区(CDR)的轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列含有序列2中所含的CDR序列中的一条CDR序列。

根据本发明的某些实施方案，靶向结合剂是抗体，该抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。

根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个。

根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意两个，即LCDR1与LCDR2、LCDR1与LCDR3或LCDR2与LCDR3。

根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。根据本发明的某些实施方案，抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。

根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列含有序列1所含的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个。

根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列含有序列1中所含的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意两个，即HCDR1与HCDR2、HCDR1与HCDR3或HCDR2与HCDR3。

根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列含有序列1中所含的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。根据本发明的某些实施方案，抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。

根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有具有CDR的轻链氨基酸序列，该CDR含有序列2所含CDR序列中的一个CDR。根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有具有CDR的重链氨基酸序列，该CDR含有序列1所含CDR序列中的一个CDR。根据本发明的某些实施方案，抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。

根据本发明的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有具有序列1所含CDR序列中的一条CDR序列的重链氨基酸序列和具有序列2所含CDR序列中的一条CDR序列的轻链氨基酸序列。根据本发明的某些实施方案，抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。

根据本发明的某些实施方案，靶向结合剂(如抗体)可与血纤维蛋白溶酶原竞争结合人ENO1蛋白。根据本发明的某些实施方案，所述靶向结合剂含有具有序列1所含CDR序列中的至少一条CDR序列的重链氨基酸序列和具有序列2所含CDR序列中的至少一条CDR序列的轻链氨基酸序列。

根据本发明的某些实施方案，靶向结合剂可结合含人ENO1蛋白(Genbank：AAH50642.1)的氨基酸序列²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTA³⁰⁹(SEQ ID NO:9)或³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶(SEQID NO:10)的表位。根据本发明的某些实施方案，所述靶向结合剂含有具有序列1所含CDR序列中的至少一条CDR序列的重链氨基酸序列和具有序列2所含CDR序列中的至少一条CDR序列的轻链氨基酸序列。

根据本发明的某些实施方案，本发明的结合剂可含有位于非抗体分子中的抗原结合位点。例如，这类结合剂可含有一个或多个CDR，如下文将详述的非抗体蛋白骨架中的一组CDR。

本发明的某些实施方案涉及检测患者或患者样品中人ENO1蛋白的水平的方法。本发明的方法包括使抗ENO1抗体与患者的生物学样品接触，检测所述抗体与所述样品中人ENO1蛋白之间的结合水平。在某些具体实施方案中，生物样品是血液或血浆。

本发明其它实施方案涉及含有靶向结合剂的组合物，该组合物可含有抗体或其功能性片段以及药学上可接受的运载体。

本发明其它实施方案涉及有效治疗患有ENO1疾病或病症的对象(如人或动物)的方法。该方法可包括选择需要治疗肿瘤性疾病或非肿瘤性疾病的对象，给予该对象治疗有效剂量的特异性结合ENO1蛋白的抗体(可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体)。

本发明的抗体可用于治疗人ENO1蛋白相关的疾病或病症。人ENO1蛋白相关的疾病或病症可以是任何产生自人ENO1蛋白的异常活化或表达的疾病。这类疾病的例子包括人ENO1蛋白与其配体异常反应，从而改变细胞粘附或细胞信号特征的疾病。细胞粘附或细胞信号特征的这种改变可导致肿瘤性疾病或某些免疫疾病。

例如，人ENO1蛋白相关的疾病可以是肿瘤性疾病，如肺癌、乳腺癌、胰腺癌肝癌、结直肠癌和前列腺癌。

根据本发明的某些实施方案，靶向结合剂(如抗体)可结合含人ENO1蛋白(Genbank：AAH50642.1)的氨基酸序列²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTA³⁰⁸(SEQ ID NO:9)或³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶(SEQ ID NO:10)的肽，并可用于治疗前文所述的人ENO1蛋白相关的疾病或病症。

本发明的其它实施方案涉及抑制对象中ENO1诱导的细胞从癌细胞的胞外基质中脱离的方法。这些方法可包括选择需要治疗ENO1诱导的细胞脱离的对象(如人或动物)，和给予所述对象治疗有效剂量的抗体，其中所述抗体特异性结合ENO1。所述抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。

本发明的其它实施方案涉及抗体在制备用于治疗对象(如人或动物)中ENO1相关的疾病或病症的药剂中的应用，其中，所述抗体特异性结合ENO1。所述抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。

根据本发明的某些实施方案，本文所述的靶向结合剂可用于制备用于治疗动物中ENO1蛋白诱导的细胞从胞外基质的脱离的药剂，其中，所述抗体特异性结合ENO1。所述抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。

本文所述的本发明某些实施方案涉及结合人ENO1并影响人ENO1功能的单克隆抗体。本发明的其它实施方案涉及具有治疗应用所需特性的抗ENO1抗体制剂。这些特性可包括对ENO1的高结合亲和力，体外和体内中和ENO1活性的能力，以及抑制ENO1诱导的肿瘤细胞脱离、生长和转移的能力。

在某些实施方案中，本发明涉及可以非常高的亲和力(即，K_d低)结合人ENO1的抗体。例如，该抗体可以是能以低于约10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10或约10^-11M或介于这些端点之间的任意范围或数值的K_d结合ENO1的人、兔、小鼠、嵌合型或人源化抗体。可使用本文所述或本领域已知的技术，用ELISA和/或BIACORE测量亲和力和/或结合性。

应理解，本发明实施方案并不限于任何特定形式的抗体或其生产或制备方法。例如，抗ENO1抗体可以是全长抗体(如具有完整的人Fc区)或抗体片段(如Fab、Fab’或F(ab’)₂、FV或Dab(Dab是人抗体最小的功能性结合单元))。此外，抗体可以采用分泌该抗体的杂交瘤制备，或由已转化或转染有编码该抗体的基因的重组产生的细胞制备。

本发明其它实施方案涉及编码本文所述任一抗体的分离的核酸分子，具有所述编码抗ENO1抗体的分离的核酸分子的载体，或转化了任意一种这类核酸分子的宿主细胞。

此外，本发明的某些实施方案涉及制备抗ENO1抗体的方法，通过在核酸分子表达产生抗体的条件下培养宿主细胞，之后回收该抗体。应认识到，本发明的实施方案还可包括编码本发明抗体或抗体片段的任意核酸分子，该核酸分子可包括经优化以在转化到宿主细胞中进行抗体生产时提高抗体或其片段的产率的核酸序列。

本发明的其它实施方案可涉及通过用人ENO1蛋白、其片段和一种或多种直系同源序列或其片段免疫动物而生产针对人ENO1的高亲和力抗体的方法。

其它实施方案涉及可特异性结合人ENO1的分离抗体的产生和鉴别。可通过这些抗体实现ENO1生物学活性的抑制，从而预防ENO1诱导的细胞脱离、侵袭和其它期望的对癌症的作用。

本发明其它实施方案涉及含有有效量的抗ENO1抗体的药物组合物。该组合物还可含有药学上可接受的运载体或稀释剂。在其它实施方案中，所述抗ENO1抗体或其片段与治疗剂偶联。治疗剂可以是如毒素或放射性同位素。

本发明的其它实施方案涉及治疗患者中与ENO1表达相关的疾病或病症的方法。这些方法可包括给予患者有效量的抗ENO1抗体。所述抗ENO1抗体可单独给予，或可与其它抗体或化疗药或放疗组合给予。例如，阻断细胞脱离的ENO1抗体的单克隆抗体、寡克隆抗体或多克隆抗体混合物可直接与能抑制肿瘤细胞增殖的药物一同给予。该方法可以体内实施，患者优选是人患者。在优选实施方案中，该方法涉及治疗ENO1相关的疾病或病症，包括但不限于肿瘤性疾病，如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌和/或实体瘤。

本发明的某些实施方案涉及监控癌症发展的方法。该方法可包括测定样品(如癌细胞)中α-烯醇化酶蛋白(ENO1)的丰度，其中提高的ENO1水平与癌症的严重程度相关。根据本发明的实施方案，可通过测量ENO1特异性抗体与ENO1蛋白的结合而测量该丰度。

本发明的某些实施方案涉及检测癌症的方法。这种方法可包括测定血清样品中ENO1特异性抗体的丰度，其中，低水平的ENO1特异性抗体表明存在恶性肿瘤。

附图简述

图1A和1B分别显示使用流式细胞术(图1A)和免疫染色法(图1B)检测恶性肿瘤细胞中ENO1在细胞表面的位置所获得的结果。详细的方法如实施例1所述实施。数据显示ENO1位于恶性肿瘤细胞(NHRI-L89和CA926)的细胞表面上，但在不存在于正常肺上皮细胞(NHBE和SAEC)中。

图2显示抗细胞表面ENO1的多克隆抗体对高侵入性CL1-5肺癌细胞侵袭活性的抑制。详细的方法如实施例2所述实施。数据显示给予抗ENO1多克隆抗体减弱CL1-5的侵袭。

图3显示抗人ENO1多克隆抗体减弱CL1-5F4细胞在肺中的组织侵袭能力。给予动物抗体，并在使用IVIS系统进行肿瘤注射后第12和19天监测肺转移性群落的形成。详细的方法如实施例3所述实施。数据显示ENO1多克隆抗体体内抑制CL1-5F4向肺迁移。

图4显示抗ENO1抗体杂交瘤的产生及采用流式细胞术检验各单克隆抗体克隆。免疫小鼠和产生杂交瘤，以及各抗体的产生和经流式细胞术检验抗体的方法如实施例4所述。数据显示所有5个杂交瘤抗体识别CL1-5F4肺癌细胞上的表面ENO1。

图5A显示利用ELISA方法检测的从单个杂交瘤的腹水中分离的5种抗体对ENO1的结合。硫酸铵纯化、蛋白A柱纯化以及SDS-PAGE纯化如实施例5所述实施。图5B的数据显示5种不同的抗人ENO1抗体的K_d值。

图6显示从单个杂交瘤的腹水中分离的5种抗体各自的U937血纤维蛋白检测结果。人U937淋巴瘤细胞系中LPS诱导的ENO1表达以及血纤维蛋白溶酶活性检测如实施例6所述实施。这些数据还显示5种不同的抗ENO1抗体对ENO1的血纤维蛋白溶酶受体具有不同的抑制活性，且该抑制活性与K_d值相关。

图7显示分别用从单个杂交瘤的腹水中分离的5种不同抗体处理的CL1-5细胞其侵袭活性的抑制结果。详细的方法如实施例7所述。这些数据显示所有5种不同的抗ENO1抗体可抑制CL1-5细胞的侵袭活性。有意思的是，虽然克隆8的K_d值高于克隆10约7.2倍，克隆8对CL1-5侵袭活性的抑制与克隆10类似。

图8A显示用分离自杂交瘤的不同浓度的EN10mAb处理的CL1-5细胞的侵袭活性。详细的方法如实施例8所述实施。这些数据显示EN10mAb抗体以剂量依赖性的方式抑制CL1-5的侵袭活性。

图8B显示经LPS诱导细胞表面表达ENO1之后，经分离自杂交瘤的不同浓度的EN10mAb处理的U937细胞的侵袭活性。详细的方法如实施例8所述实施。这些数据显示EN10mAb抗体以剂量依赖性的方式抑制U937细胞的侵袭活性。

图9显示EN10mAb识别LPS处理的U937上的细胞表面ENO1。详细的方法如实施例9所述所述。

图10A显示CL1-5肺癌细胞对基质蛋白的粘附活性。粘附试验如实施例10所述实施。这些数据显示CL1-5细胞对胶原蛋白和纤连蛋白具有较高的粘附活性。

图10B显示用EN10mAb处理对CL1-5细胞从纤连蛋白的脱离的抑制效果。与细胞相关的粘附试验如实施例10所述实施。这些数据显示EN10mAb以剂量依赖性的方式抑制CL1-5从纤连蛋白脱离的活性。

图10C显示显示用EN10mAb处理对CL1-5细胞从胶原蛋白的脱离的抑制效果。与细胞相关的粘附试验如实施例10所述实施。这些数据显示EN10mAb以剂量依赖性的方式抑制CL1-5从纤连蛋白脱离的活性。

图11A描述EN10mAb的可变重链区域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。指示了框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)。如实施例11所述进行EN10mAb的克隆。

图11B描述EN10mAb的可变轻链区域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。指示了框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。如实施例11所述进行EN10mAb的克隆。

图12A显示EN10mAb对ENO1的缺失突变体的结合活性。EN10mAb的结合表位位于人ENO1蛋白的氨基酸残基293和434之间。如实施例12所述使ENO1大部分缺失，以测定EN10mAb的结合区域。

图12B显示纯化自大肠杆菌的ENO1的6种C末端缺失突变蛋白的12％SDS PAGE。详细的纯化ENO1缺失突变体的方法如实施例12所述。

图12C显示EN10mAB对ENO1的6种C末端缺失突变体的结合活性。EN10mAb的结合表位位于人ENO1蛋白的氨基酸残基296和336之间。如实施例12所述使ENO1的大部分缺失，以测定EN10mAb的结合区域。

图13A描述人ENO1氨基酸残基296和336之间的晶体结构和表面暴露。结构预测如实施例13所述。

图13B显示纯化自大肠杆菌的ENO1的11种丙氨酸扫描突变蛋白的12％SDS PAGE。详细的纯化ENO1突变蛋白的方法如实施例13所述。

图13C显示11种丙氨酸扫描突变体对EN10mAb的ENO1结合ELISA和K_d值。结果表明位于人ENO1氨基酸残基296和336之间的ENO1肽1的序列(FDQDDWGAWQKFTA，SEQ ID NO:9)和肽2的序列(KRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:10)参与了EN10mAb结合。丙氨酸扫描如实施例13所述进行。

图13D显示位于人ENO1(SEQ ID NO:49)氨基酸残基296和336之间的ENO1肽1的序列(FDQDDWGAWQKFTA，SEQ ID NO:9)和肽2的序列(KRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:10)，它们参与了人ENO1与EN10mAb的结合。

图14A显示人ENO1蛋白的3D结构。图14B描述与人的ENO1蛋白的血纤维蛋白溶酶原结合区域结复合的EN10mAb Fab的推定的结构(以条带-螺旋的方式显示，轻链为灰色，重链为黑色)。ENO1蛋白和EN10mAb的晶体结构预测如实施例14所述实施。

图15A显示用于产生小鼠-人嵌合EN10mAb的表达载体。纯化该EN10mAb嵌合抗体的详述过程如实施例15所述。

图15B描述使用嵌合抗体测定EN10mAb的结合亲和力和动力学常数的结果。嵌合抗体表达、纯化以及K_d分析的详细过程如实施例15所述。

图16显示EN10mAb对补体存在下肺部肿瘤生长的抑制效果。EN10mAb的给予以及抗体处理导致的肿瘤生长延迟如实施例16所述实施。数据显示，在CL1-5异种移植小鼠模型中，每周给予EN10mAb和补体两次，产生的疗效与相同剂量的市售药物ErbituxTM的疗效类似。

图17A、17B和17C显示脾脏-肝脏转移群落形成试验中EN10mAb阻断胰腺癌肿瘤扩散的结果。EN10mAb的给予和抗体处理以抑制转移性肿瘤的生长如实施例17所述实施。此研究结果表明，在脾脏-肝脏转移小鼠模型中，与给予相同剂量的对照IgG的小鼠相比，每周给予10mpk(mg/kg)的EN10mAb两次能降低小鼠中转移的肿瘤结节数量，肿瘤体积以及肿瘤重量。

定义

除非另有定义，否则本文所用的科技术语应具有本领域普通技术人员所惯常理解的含义。此外，除非文中另有要求，否则单数术语应包括其复数形式，而复数术语应包括其单数形式。通常，与本文所述细胞和组织培养、分子生物学和蛋白、寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的术语及其技术均为本领域所周知并惯常使用的术语和技术。

本发明采用标准的重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(如电穿孔、脂质转染)技术。根据制造商的说明书或本领域惯常使用的技术或根据本文所述实施酶反应和纯化技术。根据本领域周知或本说明书引用和讨论的各一般及具体文献中所述的常规方法实施前述各技术和方法。可参见例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(第3版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，2001)，本文将其以引用的方式纳入本文。与本文所述的分析化学、有机合成化学以及医学和药学化学结合使用的术语和实验室方法和技术是本领域周知和惯常使用的术语、实验室方法和技术。采用标准的技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂、递送以及患者治疗。

如本公开所用，除非另有说明，下述术语应被理解为具有以下含义。本文所用术语“和/或”应理解为具体公开了两个指定特征或组分中的每一个或其组合。例如，“A和/或B”应理解为具体公开了(i)A，(ii)B和(iii)A和B，就如它们各自在文中被单独列出的那样。

拮抗剂可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分化合物、寡核苷酸、寡肽、干扰RNA(RNAi)、反义分子、重组蛋白、抗体或其偶联物或融合蛋白。对于RNAi的综述，可参见Milhavet O、Gary D S、Mattson M P(Pharmacol Rev.，2003年12月，55(4)：629-48；综述)；和对于反义方案的综述，可参见Opalinska J B、Gewirtz A M(Sci STKE，2003年10月28日，2003(206)：pe47)。

疾病相关的“ENO1”的异常活化或表达可以是任何异常的、不需要的或病理性细胞粘附，如肿瘤相关的细胞粘附。细胞粘附相关的疾病包括但不限于非实体瘤，如白血病或淋巴瘤，以及实体瘤，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞(肝)癌、胃癌、头颈癌、肝系统的癌症、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肺癌、子宫癌、外阴癌、结直肠癌和胰腺癌。

术语ENO1指由ENO1与ENO2或ENO3组成的杂二聚烯醇化酶分子。

本文所用术语“抗体”广义上泛指免疫球蛋白、自身抗体、单克隆抗体和多克隆抗体，及其活性片段。片段的活性可体现在其能结合同类抗原，或其具有生物学功能。本发明的抗体可以是采用本领域周知的技术制得的嵌合型，人源化或者是人抗体。

本文所用术语“单克隆抗体”指化学和免疫学均质的通常由杂交瘤产生的抗体。参见《实验室手册》，Harlow和Lane编，冷泉港，纽约(1988)。

本文所用术语“多克隆抗体”指一种以上合成抗体的血浆细胞(B淋巴细胞)克隆响应相同抗原产生的抗体。它们通常在用该抗原免疫动物后用该动物产生。

本文所用术语“嵌合抗体”指含来自一个以上来源的序列的抗体。例如，这类抗体可含有来自非人来源的序列，该序列随后通过引入人序列而被修饰。本文所用术语“人源化抗体”指非人抗体的最小部分引入了不同的人抗体而获得的抗体。本文所用术语“人抗体”指蛋白基本上每个部分在人中基本上都无免疫原性，且仅具有少数序列变化或变异的抗体。

本文所用术语“α-烯醇化酶特异性抗体”指对哺乳动物ENO1而非对ENO2或ENO3具有高特异性的抗体。类似的，术语“ENO1特异性抗体”指结合α-烯醇化酶蛋白的抗体。

当针对靶向结合剂如抗体时，术语“中和性”涉及所述靶向结合剂消除或明显降低靶抗原活性的能力。因此，“中和性”ENO1抗体能消除或明显降低ENO1的活性。中和性ENO1抗体可通过例如阻断ENO1与血纤维蛋白溶酶原的结合而起作用。通过阻断这种结合，血纤维蛋白溶酶原介导的细胞脱离明显或完全被消除。理想的是，抗ENO1的中和性抗体提高细胞粘附。

本文所用术语“多肽”为一泛指术语，指多肽序列的天然蛋白质、片段或类似物。因此，天然蛋白质、片段和类似物是多肽的具体种类。本发明优选的多肽含有人免疫球蛋白分子的重链和人免疫球蛋白分子的κ轻链，以及由含免疫球蛋白分子的重链和免疫球蛋白分子的轻链(如免疫球蛋白分子的κ或λ轻链)及其片段或类似物的组合形成的抗体分子，反之亦然。本发明优选的多肽还可仅含有人免疫球蛋白分子的重链或其片段。

术语“多核苷酸”在本文中指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型的核苷酸的修饰形式，或者是RNA-DNA杂双链体。该术语包括单链或双链形式的DNA。

术语“CDR区”或“CDR”意指如Kabat等1991年(Kabat,E.A.等，1991，“免疫学感兴趣的蛋白的序列”，第5版，美国卫生和人类服务部，公共服务，NIH，华盛顿)及之后版本中所定义的免疫球蛋白的重链或轻链的超变区。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。术语CDR用于此(依据不同情况)是为了指这些区域中的一个或几个甚至全部，其含有大部分的负责该抗体依亲和力与其识别的抗原或表位的结合的氨基酸残基。

在6条短CDR序列当中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有较大的长度可变性(主要是由于产生该CDR的基因的排列机制而具有较大多样性)。该CDR可短至2个氨基酸，虽然已知最长的长度是26个。CDR长度还可根据被特定基本骨架容纳的长度而变化。功能上，HCDR3的作用在某种程度上是确定该抗体的特异性(Segal等，PNAS，71：4298-4302，1974)。

术语“一组CDR”在本文中包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3(HCDR指重链可变区CDR)，和一组LCDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3(LCDR指轻链可变区CDR)。除非另有说明，“一组CDR”包括HCDR和LCDR。

术语“对应于”在本文中用于指多核苷酸序列与参比多核苷酸序列的全部或部分同源，即相同但进化上并不严格相关；或者指多肽序列与参比多肽序列相同。

对比上，术语“互补于”在本文中用于指互补序列与参比多核苷酸序列的全部或一部分同源。出于说明目的，核苷酸序列“TATAC”对应于参比序列“TATAC”，并与参比序列“GTATA”互补。

术语“序列相同性”指两条多核苷酸序列或氨基酸序列在比较窗口中(以核苷酸对核苷酸或残基对残基的方式对比)是相同的。术语“序列相同性百分比”如下计算：在比较窗口中比较两条最优比对的序列，测定两条序列中出现了相同核酸碱基(如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基的位置的数量以获得匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以对比窗口的总位置数量(即窗口大小)，并将所得结果乘与100，以获得序列相同性百分比。

术语“基本上相同”或“基本上一致”在本文中指多核苷酸序列或氨基酸序列的一种特征，其中该多核苷酸序列或氨基酸序列含有的序列与参比序列相比，在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比对窗口中(通常是在至少24－48个核苷酸(8－16个氨基酸)位置的比对窗口中)具有至少85％的序列相同性，优选至少90％到95％的序列相同性，更优选至少99％的序列相同性，其中所述序列相同性百分比如下计算：将参比序列与可能包括总共占该参比序列20％或以下的删除或添加的该序列通过比对窗口进行比对。参比序列可以是较大序列的子集。

如本文所用，二十个常规的氨基酸以及它们的缩写依照常规的方法使用。二十个常规氨基酸的立体异构体(如D-氨基酸)，非天然氨基酸如α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸与其他类似的氨基酸，及亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。本文所使用的多肽表示法中，根据标准用法及成规，左边方向为氨基端方向，而右边方向为羧基端方向。

类似的，除非另有说明，单链多核苷酸序列的左手端为5’端，双链多核苷酸序列的左手端为5’方向。新生RNA转录物的5’到3’添加方向为转录方向，位于具有与RNA相同序列的DNA链上，且在RNA转录物的5'末端的5’侧的序列区称为“上游序列”；位于具有与RNA相同序列的DNA链上，且在RNA转录产物的3'末端的3’侧的序列区称为“下游序列”。

应用于多肽时，术语“基本上相同”指当最优比对时(例如采用GAP或BESTFIT程序，并采用默认的空隙加权)两条多肽序列具有至少80％的序列相同性，优选至少90％的序列相同性，更优选至少95％的序列相同性，最优选至少99％的序列相同性。优选地，不相同的残基位置是保守的氨基酸取代导致的不同。

如本文所述，本发明也包括抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的次要变化，前提是氨基酸序列中的该变化维持了与本文所述抗体或免疫球蛋白分子至少约75％，优选至少80％、90％、95％，和最优选约99％的序列相同性。尤其考虑的是保守性氨基酸的置换。

可容易地通过检测多肽衍生物的比活性而确定氨基酸变化是否产生功能性肽。本文详细描述了该检测方法。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域技术人员容易制备得到。片段或类似物的优选氨基或羧基末端位于接近功能性结构域的边界处。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私人序列数据库比对而鉴别出结构性或功能性的结构域。鉴别折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等，1991，Science，253：164。因此，前述实施例证明本领域技术人员能识别出可用来定义本文所述抗体的结构性和功能性结构域的序列基序和结构构象。

本发明的另一方面是含与序列1、附带的序列表、本文所述抗体的VH结构域或与序列1所示的HCDR(如HCDR1、HCDR2或HCDR3)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的氨基酸序列相同性的VH结构域的靶向结合剂或抗体分子。所述靶向结合剂或抗体分子可任选地还含有与序列2、附带的序列表、本文所述抗体的VL结构域或与序列2的LCDR(如LCDR1、LCDR2或LCDR3)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的氨基酸序列相同性的VL结构域。可用于计算两条氨基酸序列的相同性百分比的算法包括，如BALST(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215：405-410)，FASTA(Pearson和Lipman，1988，PNAS USA，85：2444-2448)，或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman，1981，J.Mol.Biol.，147：195-197)，使用例如默认参数。在某些实施方案中，具有上述氨基酸序列相同性的所述靶向结合剂或抗体与参比的抗体具有基本上相同的活性。例如，所述基本上相同的活性包括至少一种与参比抗体活性的差异不超过约50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％或更低的活性。

抗原结合位点通常由免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成，其抗原结合界面由6个称为互补决定区(CDR)的表面多肽环形成。各VH和各VL中各含有框架区(FR)和3个CDR，分别为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。

典型地，VH结构域与VL结构域配对，提供抗体的抗原结合位点，但单独的VH结构域或VL结构域也可用于结合抗原。VH结构域(如来自序列1)可与VL结构域(如来自序列2)配对，这样形成的抗体的抗原结合位点同时含有VH结构域和VL结构域。针对本文公开的其它VH和VL结构域提供了类似的实施方案。在其它实施方案中，序列1中的VH链与异源VL结构域配对。本领域已建立了轻链杂交。同样地，本发明针对本文所述的其它VH结构域和VL结构域提供了类似的实施方案。因此，序列2上的任意抗体链或母本的VH可与序列1和2的任意抗体或其它抗体或母本上的VL配对。

抗原结合位点可含有一组来自序列1和2的任意抗体或母本抗体的HCDR和/或LCDR，在所公开的HCDR和/或LCDR组中具有至多20、16、10、9或更少(如1、2、3、4或5)个氨基酸添加、取代、缺失或插入。这些修饰可在该组CDR内的任意残基中进行。

优选的氨基酸取代包括那些：(1)降低蛋白质水解易感性，(2)降低氧化易感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或改变这些类似物的生理化学或功能特性的取代。类似物可包括一序列除其天然产生的肽序列之外的各种突变蛋白。例如，可在天然产生的序列中(优选在该多肽的形成分子间接触的结构域之外的部分)进行单个或多个氨基酸取代(优选是保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代不应实质改变母本序列的结构特征(如用来取代的氨基酸不应破坏母本序列中产生的螺旋，或破坏其它类型的表征该母本序列的二级结构)。

本发明另一方面是含与序列1、所附序列表或本文所述的任意抗体的VH结构域或与序列1所示的HCDR(如HCDR1、HCDR2或HCDR3)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的氨基酸序列相同性的VH结构域的抗体分子。该抗体分子可任选地还包含与序列2、附带的序列表或本文所述任一抗体的VL结构域或与序列2的LCDR(如LCDR1、LCDR2或LCDR3)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的氨基酸序列相同性的VL结构域。可用于计算两条氨基酸序列的相同性百分比的算法包括，如BLAST、FASTA或Smith-Waterman算法。

本发明VH、VL结构域以及CDR的变体，包括本文公开了其氨基酸序列的那些变体以及可用于人ENO1蛋白的靶向试剂和抗体的那些变体，可采用序列改变或突变并筛选具有所需的抗原靶向特性的方法获得。所需特性的例子包括但不限于：对抗原的结合亲和力相对于对该抗原具有特异性的已知抗体增加；对抗原活性的中和相对于对该抗原具有特异性的已知抗体(如其活性已知)增加；特定摩尔比时与已知抗体或配体对抗原有特异性竞争的能力；形成免疫沉淀复合物的能力；结合特定表位的能力；线性表位，如使用本文所述的肽结合扫描鉴定的肽序列，如使用在线性和/或受限构象中筛选得到的肽；由不连续的残基形成的构象表位；调节人ENO1蛋白或其下游分子的新生物学活性的能力。本文也提供了这些方法。

本发明另一方面涉及一种靶向结合剂(即抗体)，其包括的氨基酸序列与含与人ENO1蛋白上的序列9或10所列的氨基酸序列具有至少约60％、70％、80％、85％、90％或约92％的氨基酸序列相同性的表位肽结合，并能用于治疗人ENO1蛋白疾病或病症。人ENO1蛋白相关疾病或病症可以是由人ENO1蛋白的异常活化或表达引起的任何病症。在一个实施例中，人ENO1蛋白相关的疾病是肿瘤性疾病，如非小细胞肺癌，肝细胞(肝)癌，胃癌，乳腺癌，胰腺导管腺癌。

抗体的由VH结构域和VL结构域组成的抗原结合位点通常由多肽的6个环形成：其中三个来自轻链可变区结构域(VL)，另三个来自重链可变区结构域(VH)。对具有已知原子结构的抗体进行的分析已阐明了抗体结合位点的序列与三维结构之间的关系。这些关系提示，除了VH结构域的第三个区域(环)外，结合位点的环具有少数主链构象(即正则结构)中的一种。已知在特定环中形成的正则结构由其大小以及在该环和框架区中的关键位置上都存在的某些残基决定。

用于在CDR、抗体VH或VL结构域和/或结合剂的氨基酸序列中进行取代的技术一般可从现有技术中获得。可制备具有可预期或不可预期会对活性具有最小或有益影响的取代的变体序列，并针对其结合能力和/或中和能力和/或任何其它所需特性进行测试。如所讨论的，可根据本发明使用本文已具体公开其序列的任意VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列的变体。

本文所用术语“多肽片段”指氨基末端和/或羧基末端删除、且所保留的氨基酸序列与由例如全长cDNA序列推导得到的天然产生的序列的相应位置相同的多肽。片段通常至少长约5、6、8或10个氨基酸，优选至少长约14个氨基酸，更优选至少长约20个氨基酸，通常至少长约50个氨基酸，更优选至少长约70个氨基酸。本文所用术语“类似物”指含有至少约25个氨基酸的节段的多肽，该节段与推导的氨基酸序列的一部分基本上相同，并具有下述特性中的至少一种：(1)合适结合条件下特异性结合人ENO1蛋白，(2)具有阻断合适配体/ENO1蛋白结合的能力，或(3)具有抑制ENO1蛋白活性的能力。通常，多肽类似物包含相对于天然产生序列的保守性氨基酸取代(或添加或删除)。类似物通常长至少20个氨基酸，优选至少50个氨基酸或更长，且通常可与全长的天然产生的多肽一样长。

本文中，“靶向结合剂”是一种制剂，如抗体或其结合片段，该制剂优先结合靶位点。在一个实施方案中，靶向结合剂仅对一个靶位点特异。在其它实施方案中，靶向结合剂对一个以上靶位点特异。在一个实施方案中，靶向结合剂可以是单克隆抗体，靶位点可以是表位。如下文所述，靶向结合剂可含有抗体的至少一个抗原结合结构域，其中，所述结构域与异源蛋白融合，或含于异源蛋白中。

抗体可以是寡克隆抗体，多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，CDR移植抗体，多特异性抗体，双特异性抗体，催化性抗体，嵌合抗体，人源化抗体，完全人抗体，抗独特型抗体和可被标记呈可溶或结合形式的抗体，以及其片段、变体或衍生物，可单独存在或与采用已知技术提供的其它氨基酸序列组合。抗体可来自任何物种。术语抗体还包括本发明抗体的结合片段。示例性的片段包括Fv、Fab、Fab’、单链抗体(svFC)、二聚可变区(双特异抗体，Diabody)和二硫键稳定化可变区(dsFv)。抗体的“结合片段”可以采用重组DNA技术制备，或者可通过对完整抗体实施酶法或化学切割而制备。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv和单链抗体。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，也称为“Fab”片段，和不具有抗原结合活性但能结晶的“Fc”片段。用胃蛋白酶消化抗体产生抗体分子的两个臂保持连接并含有两个抗原结合位点的F(ab’)₂片段。F(ab’)₂片段能与抗原交联。本文使用的“Fv”指抗体保留了抗原识别和抗原结合位点的最小片段。本文所用“Fab”指含有轻链恒定结构域和重链CH1结构域的抗体片段。术语“mAb”指单克隆抗体。

术语“表位”包括能特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性表面基团的分子如氨基酸或糖侧链组成，且可能但不一定具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。当抗体的解离常数≤1μM，优选≤100nM，更优选≤10nM时，可认为该抗体特异性结合抗原。

当指ENO1多肽时，“具活性”或“活性”指ENO1多肽的一部分具有天然ENO1多肽的生物学或免疫学活性。本文中，“生物学的”指产生自天然ENO1多肽的活性的生物学功能。优选的ENO1生物学活性包括如ENO1诱导的血纤维蛋白溶酶原活性。

本文中，“哺乳动物”指任何被认为是哺乳动物的动物。优选的，哺乳动物是人。术语“对象”包括人和兽类对象。

本文所用术语“药物制剂或药剂”指当正确给予患者时能产生所需治疗效果的化学化合物或组合物。本文中的其它化学术语根据本领域常规用法使用，如McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker,S.编，麦格劳-希尔教育出版集团，旧金山，1985)。

本文中，“基本上纯的”指标的物为所存在的优势物，即以摩尔计，该标的物比组合物中任何其它物质的存在量高；优选地，基本上纯的组分是一组合物，该组合物中标的物占所存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)。通常，基本上纯的组合物将含有该组合物中存在的所有大分子物质的约80％以上，优选约85％、90％、95％和99％以上。最佳的，标的物被纯化到基本上均质(采用常规检测方法检测组合物时检测不到污染物)，其中该组合物基本上由单种大分子物质组成。

本文中，术语“监测”指通过测量癌细胞中ENO1蛋白的丰度而检测和/或观察癌症发展的过程。

测量ENO1丰度的方法包括但不限于测量ENO1蛋白与ENO1特异性抗体之间的结合，Western印迹法，流式细胞术，免疫组化(IHC)，RT-PCR，和/或微阵列分析。

实施例

本发明的实施将使用细胞生物学、细胞培养、抗体技术和遗传工程中的各种常规技术，这些都是本领域技术所熟知的。这些技术在文献中有详尽的解释。

下述实施例阐述ENO1特异性抗体的开发和应用，以通过诱导抗ENO1免疫反应而抑制肿瘤生长。

实施例1

恶性肿瘤细胞中ENO1的细胞表面定位

为了分析ENO1在恶性肿瘤细胞上的细胞定位，进行流式细胞术，以确定ENO1在细胞表位上的定位。从17位肺癌患者的胸腔积液中获得肿瘤细胞。其中，从2位癌症患者获得的肿瘤细胞NHRI-L89和CA926积液肿瘤细胞是本文所示的代表性案例。NHBE和SAEC细胞是正常的人肺原代细胞。完整全细胞用或未用ENO1抗血清染色，并经由流式细胞术用ENO1蛋白的特异性抗体分析ENO1的表面分布(如图1A所示)。经由免疫组织学进一步证实肺癌细胞系NHRI-L89的ENO1细胞定位(图1B)。简言之，在涂敷有纤连蛋白的腔室载玻片上在含10％FCS的DMEM中培养1×10⁴个NHRI-L89细胞。过夜培养后，用PBS冲洗载玻片，并用山羊血清封阻1小时。经对照(CTL)和针对表面ENO1的ENO1抗体对NHRI-L89完整全细胞进行染色，接着进行PI染色以进行核检测。在共聚焦显微镜下观察染色(400×，图1B)。

此研究的结果显示在图1A(流式细胞术)和1B(免疫染色)中。与与对照抗体孵育相比，NHRI-L89和CA926与ENO1抗体孵育的曲线向右移。正常人肺原代细胞NHBE和SAEC未显示明显偏移(图1A)。此结果提示，ENO1蛋白在肺癌细胞上表达，而在正常原代细胞上不表达(图1A)。当采用免疫组织学进一步分析ENO1的细胞定位时，经ENO1抗体染色的NHRI-L89细胞在细胞表面上显示出信号(图1B)。此结果表明，ENO1在肺癌和一些癌症细胞表面上表达，因此，可用作免疫治疗的潜力靶标。

实施例2

抗ENO1抗体抑制人肺癌细胞的侵袭能力

为了研究ENO1抗体对肺癌细胞侵袭的影响，通过将ENO1抗体添加到生长在包涂有胞外基质(基质胶Matrigel，贝克顿-迪金森公司)的微孔过滤器(贝克顿-迪金森公司，富兰克林湖，纽约州)上的CL1-5细胞经由细胞迁移侵袭试验(Transwell assay)评估CL1-5细胞的侵袭活性。在分别与1：20、1：100和1：500稀释倍数的抗ENO1多克隆抗体混合后，将2×10⁴个CL1-5细胞接种到两室分析系统中具有含2％FBS的培养基的上层腔室中，培育24小时，其中下层腔室内具有含10％FBS的培养基。使用抗GST小鼠多克隆抗体作为阴性对照组。两个室经包涂基质胶Matrigel的微孔过滤器(孔径为12微米)隔开。培养期后，将基质胶包涂过滤器染色，并在显微镜下计算侵入该基质胶包涂的过滤器的细胞数量。重复此研究三次。数据以平均值±SD提供。本测试用于比较各组之间的活性。P值<0.05时被认为是统计学显著。

结果显示在图2中。在未处理组(160±8；N＝3)和抗GST多克隆处理组(168±12；N＝3)之间未发现明显的细胞数量差异。但是，当给予CL1-5细胞不同稀释度的ENO1多克隆抗体时，CL1-5的细胞数量减少，从1：20稀释度的52±12(N＝3)到1：500稀释度的156±30(N＝3)；减少与ENO1多克隆抗体的浓度成比例。1：20稀释度的ENO1多克隆抗体组和1：20稀释度的抗GST多克隆抗体组之间的细胞数量存在统计学差异(P<0.05)。这些结果表明，给予CL1-5癌细胞ENO1抗体能体外抑制该细胞的侵袭活性。

实施例3

ENO1多克隆抗体减弱肺中CL1-5F4细胞的组织侵袭能力。

为了研究给予ENO1抗体对肺癌细胞转移的影响，并评估癌症治疗中抗ENO1抗体的潜力，将带有荧光素酶报道基因的高度侵袭性CL1-5F4细胞静脉内注射到NOD-SCID小鼠中(1×10⁶个细胞/小鼠)，同时给予ENO1抗体或对照(CTL)抗血清，每周两次。肿瘤注射后第12天和第19天，使用IVIS系统监测肺转移性集落的形成。使用注射了ENO1基因敲除的CL1-5F4细胞的小鼠作为阴性对照。第12和19天杀死小鼠后，观察转移性集落和肿瘤大小，并计数。

结果如图3所示。当给予携带具有荧光素酶报道基因的CL1-5F4细胞的小鼠对照抗体时，小鼠的肺在第12天开始显示出荧光信号。另一方面，经ENO1多克隆抗体处理的小鼠或携带敲除了ENO1基因的CL1-5F4细胞的小鼠中未检测到信号。第19天，经对照抗体处理的小鼠中的信号变得更强，表明存在更多的细胞侵袭或肿瘤生长。同一天，经ENO1多克隆抗体处理的小鼠或携带敲除了ENO1基因的CL1-5F4细胞的小鼠中仍未检测到信号。这些结果表明CL1-5F4细胞的转移受到ENO1抗体或ENO1基因敲除的阻抑(图3，上图)。12天和19天后，获取各处理组的肺，测定肿瘤结节。结果显示在图3的底图中。对照抗体处理组的小鼠中有不少的肿瘤结节，并具有清晰的肿瘤尺寸。但ENO1多克隆抗体处理的小鼠或携带具有ENO1敲除的CL1-5F4的小鼠无清晰的肿瘤结节，表明这两组小鼠中肿瘤转移被延迟。本研究的结果表明，体内给予ENO1抗体对癌细胞的转移或增殖具有抑制效果，ENO1抗体在癌症治疗中具有潜在的应用。

实施例4

抗人ENO1单克隆抗体的生产

从实施例2和3可知，ENO1抗体能减弱癌细胞的侵袭和转移。因此，ENO1抗体可潜在地开发成治疗性抗体。为了产生针对人ENO1的单克隆抗体，用纯化的重组人ENO1抗原免疫BALB/c小鼠(50μg/小鼠)，接着用乳化的CpG佐剂强化ENO1体液应答。收集脾细胞，使其与Fo细胞融合，然后根据标准的方案稀释。采用基于抗原的ELISA筛选出分泌识别ENO1抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞。然后如实施例1所述进行完整全细胞染色，经流式细胞分析检测抗体对CL1-5F4肺腺癌细胞上的细胞表面ENO1的结合活性，从而核实所选的克隆。

结果显示在图4中。如曲线向右偏移所证明的，与对照抗体相比，分离所得的所有5种抗体克隆都识别CL1-5F4上的细胞表面ENO1。

实施例5

分离的5种抗体克隆的ENO1结合ELISA

为了研究上述分离得到的5种抗体克隆的ENO1结合亲和力，使单个杂交瘤在含10％FCS的RPMI中生长。培养1周后，收集1×10⁶个细胞，用PBS洗涤，在200微升RPMI培养基中重悬浮，然后经由IP注射注入SCID小鼠。3周后，收集小鼠腹水并稀释到15毫升。用40％硫酸铵沉淀和蛋白A柱(Montage抗体纯化试剂盒，密理博公司)进一步纯化抗体。用AmicoUltra-15离心过滤设备依照制造商(密理博公司)提供的方案进一步浓缩纯化的抗体。用SDS PAGE分析抗体的纯度。将人ENO1蛋白(400ng)包涂在96孔ELISA板上，用PBS洗涤该板两次。将每种抗体从1×10^-11到1×10^-7M的系列稀释物加到该板上，然后将该板置于37℃孵育1小时。加入与HPRT偶联的山羊抗小鼠IgG，孵育1小时后，加入TMB。读取OD405，计算活性。每个研究重复三次，数据以平均值±SD表示。使用Sigmaplot^TM将OD读数和抗体浓度制作多重分散曲线。由四个参数的逻辑拟合预测各克隆的K_d值。

此实验的结果显示在图5中。所有抗体杂交瘤的产量是20.4mg-4.6mg/小鼠。抗体的K_d值为1.77×10^-10±0.12到1.6×10^-5±0.2M(N＝3)。这些结果表明这5个抗体克隆识别人ENO1蛋白，且克隆10具有最佳的亲和力，其Kd值为约1.77×10^-10±0.12M(N＝3)。

实施例6

所分离的5种抗体克隆的血纤维蛋白溶酶原受体拮抗活性

为了研究分离的抗人ENO1抗体的ENO1拮抗活性，使U937人淋巴瘤细胞系在含10％FCS的RPMI中生长。用10微克/毫升的LPS处理细胞6小时，以诱导ENO1蛋白在细胞表面表达。分别用1微克/毫升的人Lys-血纤维蛋白溶酶原和10微克/毫升的不同抗ENO1抗体克隆预孵育PBS中的细胞(1.5×10⁶个细胞/毫升)1小时。用PBS洗涤样品2次，然后加入3nM的组织特异性血纤维蛋白溶酶原激活剂和0.5mM的生色底物S-2251。在37℃孵育1小时后，读取OD405，计算活性。各研究重复三次，分析拮抗活性。数据以平均值±SD表示。采用T-检验比较各组之间的活性。P值<0.05被视为统计学显著。

本研究的结果显示在图6中。所有5种抗体克隆具有血纤维蛋白溶酶原受体拮抗活性，其抑制的LPS诱导的ENO1比活性达52％到100％。这些研究表明，血纤维蛋白溶酶原受体拮抗活性与各克隆的K_d值成比例，克隆10具有最佳的抑制活性，对LPS诱导的ENO1比活性的抑制接近100％。

实施例7

ENO1单克隆抗体抑制人肺癌细胞的侵袭能力

使用细胞迁移侵袭试验(Transwell assay)评估各抗体克隆对CL1-5细胞侵袭能力的抑制，该试验使用包涂有胞外基质(基质胶Matrigel，贝克顿-迪金森公司)的微孔过滤器(贝克顿-迪金森公司，富兰克林湖，纽约州)。分别与5种抗体克隆中的任一种(10微克/毫升)混合后，将2×10⁴个细胞接种到两室分析系统中的上层腔室中培养24小时，其中下层腔室内具有含10％FBS的培养基。抗小鼠IgG和5-叠氮-2-脱氧胞苷(5ADC)分别用作阴性对照和阳性对照。两个室经包涂基质胶Matrigel的微孔过滤器(孔径为12微米)隔开。培养期后，将基质胶包涂过滤器染色，并在显微镜下计算侵入该基质胶包涂的过滤器的细胞数量。重复此研究三次。数据以平均值±SD表示。采用T-检验比较各组之间的活性。P值<0.05时被认为是统计学显著。

由这些实验得到的结果显示在图7中。这些结果显示，所有抗人ENO1抗体克隆具有抑制CL1-5的侵袭能力的活性，克隆10具有最佳的抑制活性，约为对照IgG组的65.5±0.3％(N＝3)。

结合实施例5、6和7的结果，选用抗人ENO1抗体克隆10进行进一步的开发，并在本说明书中称为EN10mAb。

实施例8

EN10mAb抑制人肺癌细胞和淋巴瘤细胞的侵袭能力

使用细胞迁移侵袭试验(Transwell assay)评估EN10mAb对CL1-5细胞侵袭能力的抑制，该试验使用包涂有胞外基质(基质胶Matrigel，贝克顿-迪金森公司)的微孔过滤器(贝克顿-迪金森公司，富兰克林湖，纽约州)。分别与10、50和100微克/毫升的EN10mAb混合后，将2×10⁴个细胞接种到两室分析系统具有含2％FBS的培养基的上层腔室中，培养24小时，其中下层腔室内具有含10％FBS的培养基。抗小鼠IgG用作阴性对照。两个室经包涂基质胶Matrigel的微孔过滤器(孔径为12微米)隔开。培养期后，将基质胶包涂过滤器染色，并在显微镜下计算侵入该基质胶包涂的过滤器的细胞数量。重复此研究三次。数据以平均值±SD表示。采用T-检验比较各组之间的活性。P值<0.05时被认为是统计学显著。结果显示在图8A中。

类似的，使用细胞迁移侵袭试验(Transwell assay)评估EN10mAb对U937细胞侵袭能力的抑制，该试验使用包涂有胞外基质(基质胶Matrigel，贝克顿-迪金森公司)的微孔过滤器(贝克顿-迪金森公司，富兰克林湖，纽约州)。使人淋巴瘤U937细胞在含10％FCS的RPMI中生长。细胞用10微克/毫升的LPS处理6小时，以诱导ENO1蛋白在细胞表面上表达。分别与10、50和100微克/毫升的EN10mAb混合后，将2×10⁴个细胞接种到两室分析系统的上层腔室中，培养24小时，其中下层腔室内具有含10％FBS和10nM MCP-1的培养基。抗小鼠IgG用作阴性对照。两个室经包涂基质胶Matrigel的微孔过滤器(孔径为8微米)隔开。培养期后，在显微镜下使用血球计计算下层腔室内的细胞数量。重复各研究三次。数据以平均值±SD表示。采用T-检验比较各组之间的活性。P值<0.05时被认为是统计学显著。

结果显示在图8A和8B中。当以10微克/毫升到100微克/毫升的浓度给予细胞EN10mAb时，其将CL1-5的侵袭活性抑制至对照IgG的31±2到77±1％(N＝3)(图8A)。这些结果与实施例4的结果类似，且抑制与EN10mAb的浓度成比例，EC₅₀估算约为30微克/毫升。

为了研究该对侵袭的抑制是否适用于其它癌细胞，以类似的方式用5微克/毫升到50微克/毫升的EN10mAb处理U937细胞。U937的侵袭活性被抑制至对照IgG的91.2±2到49.1±1％(N＝3)(图8B)。这些结果表明，CL1-5和U937的侵袭活性被EN10mAb以剂量依赖性的方式抑制，可能是经由抑制ENO1的血纤维蛋白溶酶原受体活性而实现。

实施例9

EN10mAb识别淋巴瘤细胞中LPS诱导的表面ENO1

使人淋巴瘤U937细胞系在含10％FCS的RPMI中生长。用1微克/毫升的LPS处理细胞6小时，以诱导ENO1蛋白在细胞表面表达。对于流式细胞术分析，用或不用EN10mAb(1：300的稀释度)染色完整的全细胞，用FITC-偶联的山羊抗小鼠IgG(杰克逊实验室)使其呈色，并用FACScan流式细胞仪(贝克顿-迪金森公司)分析。由所得荧光强度计算ENO1表达。

从这些实验获得的结果显示在图9中。与未经LPS处理但用EN10mAb处理的细胞相比，将U937与LPS孵育并用EN10mAb处理使曲线向右偏移，表明U937细胞在其细胞表面上表达ENO1。这些数据支持EN10mAb识别淋巴瘤细胞上表面LPS诱导的ENO1。

实施例10

EN10mAb抑制CL-5细胞从胶原蛋白和纤连蛋白中脱离

为了评估ENO1血纤维蛋白溶酶原受体-血纤维蛋白溶酶胞外底物之间的信号传导通路，分别用1mg/ml的凝胶、100微克/毫升的血纤蛋白原、10微克/毫升的胶原蛋白和10微克/毫升的纤连蛋白过夜包涂未处理ELISA平板。将CL1-5细胞(4×10⁴个细胞)接种到该平板上，将50微克/毫升的EN10mAb加到200μL含10％FCS的DMEM中。37℃孵育细胞24小时，然后用PBS洗涤2次。加入10％WST，37℃孵育反应混合物4小时。经由OD450读数估算平板中相对细胞数量。各研究重复3次。数据以平均值±SD表示。采用T-检验比较各组之间的活性。P值<0.05时被认为是统计学显著。

这些实验的结果显示在图10A中。这些数据显示，纤连蛋白和胶原蛋白包涂的平板的OD450读数分别是2.45±0.37(N＝3)和1.83±0.44(N＝3)。这些读数远远高于凝胶和血纤蛋白原平板的读数，后两者与背景读数无明显区别。EN10mAb处理组和未处理组之间无统计学差异。这些结果表明CL1-5细胞喜好结合纤连蛋白和胶原蛋白，当细胞在不含有下游蛋白酶(如血纤维蛋白溶酶原和tPA)的培养基中培养时EN10mAb不参与到细胞脱离通路。图10A的数据提示，ENO1血纤维蛋白溶酶原受体活性未参与到胞外基质中的细胞脱离通路。

我们进一步测试ENO1是否参与到胞外基质中的细胞脱离通路。分别用1微克/毫升的纤连蛋白和10微克/毫升的胶原蛋白过夜包涂未处理ELISA平板。将CL1-5细胞(4×10⁴个细胞)接种到该平板上，分别将0、6.25、12.5、25和50微克/毫升的EN10mAb加到200微升含10％FCS的DMEM中。此外，加入10微克/毫升的Glu-血纤维蛋白溶酶原和2nM的tPA。37℃培养细胞24小时，用PBS洗涤2次。然后加入10％WST，37℃孵育反应混合物4小时。经由OD450读数估算平板中相对细胞数量。各研究重复3次。数据以平均值±SD表示。采用T-检验比较各组之间的活性。P值<0.05时被认为是统计学显著。

这些实验的结果显示在图10B和10C中。这些数据表明，当培养基含有ENO1受体下游蛋白酶血纤维蛋白溶酶原和tPA时，细胞数量直接与两种胞外基质中处理的EN10mAb的浓度成比例。两种胞外基质中，50微克EN10mAb处理组和对照IgG组之间存在明显差异(P<0.05)。这些结果表明，ENO1可能通过提高血纤维蛋白酶和tPA的蛋白酶活性而参与了CL1-5细胞从胞外基质的脱离。作为ENO1拮抗剂的EN10mAb阻断了ENO1的受体活性，导致血纤维蛋白溶酶和tPA活化被抑制，从而抑制CL1-5细胞从胞外基质的脱离活性和侵袭。

实施例11

编码单克隆抗体的基因的制备

根据下文所述方法克隆编码抗体EN10mAb的基因。

(1)抗体基因的cDNA克隆及制备

在含10％FCS的RPMI培养基(吉科(Gibco)制造)中培养杂交瘤。细胞数量达约10×10⁶个/毫升后，离心收集细胞，然后加入(英杰公司(Invitrogen)制备)，并根据指导手册抽提总RNA。使用小鼠Ig-引物组(诺维根公司(Novagen)制造)并根据所附指导手册进行抗体可变区cDNA的克隆。

(a)根据III第一链合成系统(英杰公司制造)的指导手册进行第1链cDNA的合成。

使用5微克总RNA作为模板制备第1链cDNA。在200微升的PCR管中混合5微克总杂交瘤RNA，1微升浓度为50ng/微升的随机引物，以及1微升浓度为10mM的dNTP，加入DEPC处理的水至10微升。65℃孵育反应混合物5分钟，然后置于冰上至少1分钟。加入10微升的cDNA合成混合物，其含2微升10×RT缓冲液、4微升25mM的MgCl2、2微升DTT、1微升4单位的RNA酶(OUT^TM)以及1微升200单位III RT，温和地搅拌，粗离心收集。反应管在25℃孵育10分钟，接着在50℃孵育50分钟。85℃终止反应5分钟，冰上冷却。粗离心该管，收集反应物，加入1微升RNA酶H，37℃孵育20分钟。

(b)采用PCR扩增重链基因和轻链基因

制备含5微升cDNA、5微升10×反应缓冲液、1微升浓度为10mM的dNTP混合物、1微升2.5单位的Taq聚合酶、及由引物组所提供的1微升正向引物1与1微升反向引物2的反应溶液，以二次蒸馏水使其最终体积为50微升，将其进行PCR反应。

为了扩增抗体的轻链和重链，进行一轮94℃、10分钟的反应，然后进行94℃、1分钟，52℃、1分钟和72℃、1分钟的反应，重复35轮，最后72℃孵育10分钟。将反应溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳，分析反应产物。根据所附指导手册，将具有正确分子量的产物(重链约为463bp，轻链约为451bp)连接到pCR 2.1-TOPO载体(英杰公司制造)，进行亚克隆。然后使用M13正向引物(5'-GTAAACAAC GACGGCGAG-3'，SEQ ID NO:11)和M13反向引物(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，SEQ ID NO:12)测定核苷酸序列。采用ExPASY-翻译工具基于序列信息将抗体序列翻译成蛋白质序列。所得的EN10mAb序列含有具有互补决定区(CDR)的轻链序列和重链氨基酸序列，其根据Kabat等公开的方法(《免疫学感兴趣的蛋白的序列》，第5版，NIH出版91-3242，贝塞斯达，马里兰，1991，第1－3卷)测定。

图11A描述了EN10mAb重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。其中标出了框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(HCDR1(SEQ ID NO:3)，HCDR2(SEQ ID NO:4)和HCDR3(SEQ IDNO:5))。

图11B描述了EN10mAb轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。其中标出了框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(LCDR1(SEQ ID NO:6)，LCDR2(SEQ ID NO:7)和LCDR3(SEQ IDNO:8))。

实施例12：表位作图

抗体表位作图

为测定EN10Mab针对人ENO1蛋白的表位，设计两条正向引物，其核苷酸序列为5’-GGATCCGCAGCAAACTTCAGGGAAGCCATG-3’(SEQ ID NO:13)和5’-GGATCCTCGAAGATCCCTTTGACCAGGATG-3’(SEQ ID NO:14)，和反向引物(5’-TCAGGCTGAAAATCTCTCATCCGC-3，SEQ ID NO:15)。使用含人ENO1cDNA基因的大肠杆菌表达质粒pTRC-HIS ENO1作为模板扩增ENO1缺失突变体。使用SEQ ID NO:13和14作为正向引物，使用SEQ ID NO:15作为反向引物，分别扩增缺失突变体Δ1-189(图12A)和Δ1-297(图12A)。使用其它组引物(序列为5’-GGATCCTATCTATTCTCAAGATCCATGCC-3’，SEQ ID NO:16，和’-CTCGAGGTCATGGTGTCTCATCGTTCGCTCGAG-3’，SEQ ID NO:17)扩增缺失突变体Δ297-434。对于各突变体的扩增，制备含1微升1：1000稀释度的模板DNA(约0.1ng)、5微升10×反应缓冲液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5单位的Taq聚合酶、1微升正向引物和1微升反向引物的反应溶液，并用二次蒸馏的水使其最终体积为50微升，进行PCR。进行一轮94℃、10分钟的反应，然后进行94℃、1分钟，52℃、1分钟和72℃、1分钟的反应，重复35轮，最后72℃孵育10分钟。将反应溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳，分析反应产物。根据所附指导手册，将具有正确分子量的反应产物连接到pCR2.1-TOPO载体(英杰公司制造)，进行亚克隆。使用M13正向引物(5'-GTAAACAACGACGGCGAG-3'，SEQ ID NO:11)和M13反向引物(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，SEQ ID NO:12)测定核苷酸序列。使用限制性内切酶BamHI和XhoI消化具有正确序列的每个突变克隆，将消化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶切下各突变体的插入片段，使用Gene Clean试剂盒，根据所附的制造商(BIO101)提供的指导手册纯化。将各突变体的BamHI和XhoI DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pTRC His A(英杰公司)的BamHI和XhoI位点。将所得质粒转化到大肠杆菌BL21Rosseta中。经IPTG诱导使ENO1突变蛋白在大肠杆菌中表达，超声处理细菌沉淀物后，根据制造商(恰根)提供的附带指导手册采用Ni-琼脂糖进行纯化。采用12％SDS PAGE分析各突变体的纯度。为了测定各突变蛋白的结合活性，将400ng的人ENO1蛋白包被到96孔ELISA板上，用PBS洗涤该板。将10微克EN10mAb加到该板上，在37℃孵育1小时。用PBS洗涤结合复合物2次后，加入偶联HPRT的山羊抗小鼠IgG。孵育1小时后，加入TMB。根据OD405的读数测定结合亲和力。各研究重复3次。数据以平均值±SD表示。采用T-检验比较各组之间的活性。P值<0.05时被认为是统计学显著。

结果显示在图12A中。ENO1突变体Δ1-189和Δ1-297的OD405读数约为1.43±0.18和1.56±0.08(N＝3)(在图12A中显示为1.43和1.56)，分别约为野生型ENO1(2.87±0.08，N＝3)的42％和39％。但是，当删除氨基酸残基297到434时，与BSA背景相比，此突变的ENO1对EN10mAb的结合活性丧失。这些结果表明氨基酸残基297到434是ENO1蛋白结合EN10mAb所需，突变体Δ1-182和Δ1-297结合活性的下降可能是这些突变蛋白的不稳定或构象变化所致。

为了进一步研究ENO1蛋白中EN10mAb的表位，设计5条反向引物，分别具有以下序列：5’-CTCGAGAGGGATCTTCGATAGACACCACTGGG-3’(SEQ ID NO:18)，5’-CTCGAGCTACCTGGATTCCTGCACTGGCTG-3’(SEQ ID NO:19)，5’-CTCGAGACTTCTCGTTCACGGCCTTGGCGATC-3’(SEQ ID NO:20)，5’-CTCGAGACTTCTCGTTCACGGCCTTGGCGATCC-3’(SEQ ID NO:21)，5’-CTCGAGCAGTCTCCCCCGAACGATGAGACACC-3’(SEQ ID NO:22)和5’-CTCGAGCACCAGTCTTGATCTGCCCAGTGCAC-3’(SEQ ID NO:23)。使用含人ENO1cDNA基因的大肠杆菌表达质粒pTRC-HIS ENO1作为模板扩增ENO1缺失突变体。SEQ ID NO:16用作正向引物，分别与引物SEQ ID NO:18、SEQ ID：19、SEQ ID：20、SEQ ID：21、SEQ ID：22、SEQ ID：23扩增缺失突变体296-434、316-434、336-434、376-434和396-434。对于各突变体的扩增，制备含1微升1：1000稀释度的模板DNA(约0.1ng)、5微升10×反应缓冲液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5单位的Taq聚合酶、1微升正向引物和1微升反向引物的反应溶液，并用二次蒸馏的水使其最终体积为50微升，进行PCR。进行一轮94℃、10分钟的反应，然后进行94℃、1分钟，52℃、1分钟和72℃、1分钟的反应，重复35轮，最后72℃孵育10分钟。将反应溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳，分析反应产物。根据所附指导手册，将具有正确分子量的反应产物连接到pCR 2.1-TOPO载体(英杰公司制造)，进行亚克隆。使用M13正向引物(5'-GTAAACAACGACGGCGAG-3'，SEQ ID NO:11)和M13反向引物(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，SEQ ID NO:12)测定核苷酸序列。使用限制性内切酶BamHI和XhoI消化具有正确序列的每个突变克隆，将消化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶切下各突变体的DNA片段，使用Gene Clean试剂盒，根据所附的制造商(BIO101)提供的指导手册纯化。将各突变体的BamHI和XhoI DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pTRC His A(英杰公司)的BamHI和XhoI位点。将所得质粒转化到大肠杆菌BL21Rosseta中。经IPTG诱导使ENO1突变蛋白在大肠杆菌中表达，超声处理细菌沉淀物后，根据制造商(恰根)提供的附带指导手册采用Ni-琼脂糖进行纯化。采用12％SDS PAGE分析各突变体的纯度。为了测定各突变蛋白的结合活性，将400ng的人ENO1蛋白或突变蛋白包被到96孔ELISA板上，用PBS洗涤该板。将10微克EN10mAb加到该板上，在37℃孵育1小时。用PBS洗涤结合复合物2次后，加入偶联HPRT的山羊抗小鼠IgG。孵育1小时后，加入TMB。根据OD405读数测定结合亲和力。各研究重复3次。数据以平均值±SD表示。采用T-检验比较各组之间的活性。P值<0.05时被认为是统计学显著。

各突变体和野生型蛋白的12％SDS PAGE显示在图12B中。各突变体的分子量从突变体296-343增加到野生型。此结果表明我们可从各突变体获得完整蛋白，即便发现突变体336-434和376-434有一些降解。如图12C所示，EN10mAb对野生型ENO1的结合亲和力与对突变体336-434、376-434和369-343的结合亲和力之间无显著差异。但是，当缺失氨基酸残基296-316和317-336时，与大肠杆菌细胞裂解物背景相比，这两种ENO1突变体的EN10mAb结合活性丧失。这些结果表明，氨基酸残基296-336(FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:49)对ENO1蛋白与EN10mAb的结合起重要作用。

实施例13：丙氨酸扫描

为了进一步研究人ENO1的残基296到336中哪些残基对EN10mAb结合而言起重要作用，从蛋白质数据库(pdb登陆号：2PSN)下载ENO1的晶体结构。经结构分析后，预测氨基酸残基D300、W301、G302、Q305、K306、A309、K326、K330、N333、E334和K335暴露在蛋白表面，作为突变的候选位点，用于分析它们是否确实对EN10mAb结合起重要作用。使用QuickChange II定点突变试剂盒，根据制造商(安捷伦科技有限公色)提供的附带指导手册，将这11个残基中的10个突变为丙氨酸，A309被突变成甘氨酸。由基因组学生物科技有限公司产生下述用于丙氨酸扫描的突变寡核苷酸(表1)。

表1：寡序列

5’-GATCCCTTTGACCAGGATGCCTGGGGAGCTTGGCAG-3’(SEQ ID NO:24)

5’-CTGCCAAGCTCCCCAGGCATCCTGGTCAAAGGGATC-3’(SEQ ID NO:25)

5’-CCCTTTGACCAGGATGACGCGGGAGCTTGGCAGAAG-3’(SEQ ID NO:26)

5’-CTTCTGCCAAGCTCCCGCGTCATCCTGGTCAAAGGG-3’(SEQ ID NO:27)

5’-CTTTGACCAGGATGACTGGGCAGCTTGGCAGAAGTTC-3’(SEQ ID NO:28)

5’-GAACTTCTGCCAAGCTGCCCAGTCATCCTGGTCAAAG-3’(SEQ ID NO:29)

5’-GACTGGGGAGCTTGGGCGAAGTTCACAGCCAGTGCA-3’(SEQ ID NO:30)

5’-TGCACTGGCTGTGAACTTCGCCCAAGCTCCCCAGTC-3’(SEQ ID NO:31)

5’-GGGGAGCTTGGCAGGCGTTCACAGCCAGTGCAGG-3’(SEQ ID NO:32)

5’-CCTGCACTGGCTGTGAACGCCTGCCAAGCTCCCC-3’(SEQ ID NO:33)

5’-GGCAGAAGTTCACAGGCAGTGCAGGAATCCAGGTAG-3’(SEQ ID NO:34)

5’-CTACCTGGATTCCTGCACTGCCTGTGAACTTCTGCC-3’(SEQ ID NO:35)

C5’-TCACAGTGACCAACCCAGCGAGGATCGCCAAGGCC-3’(SEQ ID NO:36)

5’-GCCTTGGCGATCCTCGCTGGGTTGGTCACTGTGAG-3’(SEQ ID NO:37)

5’-CAACCCAAAGAGGATCGCCGCGGCCGTGAACGAGAAG-3’(SEQ ID NO:38)

5’-CTTCTCGTTCACGGCCGCGGCGATCCTCTTTGGGTTG-3’(SEQ ID NO:39)

5’-GAGGATCGCCAAGGCCGTGGCCGAGAAGTCCTGCAAC-3’(SEQ ID O：40)

5’-GTTGCAGGACTTCTCGGCCACGGCCTTGGCGATCCTC-3’(SEQ ID NO:41)

5’-GATCGCCAAGGCCGTGAACGCGAAGTCCTGCAACTG-3’C(SEQ ID NO:42)

5’-GCAGTTGCAGGACTTCGCGTTCACGGCCTTGGCGATC-3’(SEQ ID NO:43)

5’-GCCAAGGCCGTGAACGAGGCGTCCTGCAACTGCCTC-3’(SEQ ID NO:44)

5’-GAGGCAGTTGCAGGACGCCTCGTTCACGGCCTTGGC-3’(SEQ ID NO:45)

5’-CAAGGCCGTGAACGCGGCGTCCTGCAACTGCCTCCTG-3’(SEQ ID NO:46)

5’-CAGGAGGCAGTTGCAGGACGCCGCGTTCACGGCCTTG-3’(SEQ ID NO:47)

对于各突变体的扩增，制备含3微升模板DNA(约30ng)、5微升10×反应缓冲液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5单位的pfu聚合酶、12.5微升125ng正向引物和12.5微升125ng反向引物的反应溶液，并用二次蒸馏的水使其最终体积为50微升，进行PCR。进行一轮95℃、10分钟的反应，然后进行95℃、30秒，55℃、30秒和68℃、6分钟的反应，重复16轮。PCR反应结束后，将1微升DpnI加到各PCR试管中，37℃孵育1小时，然后加热DpnI至80℃20分钟，使其失活。根据所附指导手册(英杰公司制备)用反应产物转化50微升的XL-1蓝感受态细胞。使用ENO1R400-420引物(5'-GCAAGGGGCACCAGTCTTGATCTG-3'，SEQ ID NO:48)测定核苷酸序列。将每个具有正确序列的突变克隆质粒转化大肠杆菌BL21Rosseta。经IPTG诱导使ENO1突变蛋白在大肠杆菌中表达，超声处理细菌沉淀物后，根据制造商(恰根)提供的附带指导手册采用Ni-琼脂糖进行纯化。采用12％SDS PAGE分析各突变蛋白的纯度。

为了测定各突变蛋白的结合活性，将400ng/100微升的人ENO1蛋白或突变ENO1蛋白包被到96孔ELISA板上，4℃过夜，然后用PBS洗涤该板。室温用含1％BSA(w/v)的PBS溶液封阻该板1小时，然后用1x PBS再次清洗。一抗(EN10mAb)经2倍系列稀释，获得15个不同的浓度，然后加到各板中，37℃放置1小时。反应完成后，用1x PBS洗涤板三次。加入1/8000稀释度的山羊抗-小鼠-HRP抗体，37℃孵育1小时，然后用1x PBS洗涤板三次。然后加入TMB底物，允许反应在室温下进行30分钟。加入1N HCl结束反应，读取OD450测定活性。各研究重复3次。数据以平均值±SD表示。使用Sigmaplot^TM将OD读数和抗体浓度制作多重分散曲线。由四个参数的逻辑拟合预测K_d值。

根据实施例9所示的ENO1大部分删除研究结果，残基296-336的肽序列(FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:49)是ENO1蛋白与EN10mAb紧密结合所需。“紧密结合”在本文中指特异性结合剂(如抗体，scFv或Fab片段)与配体/靶标(如肽、蛋白或细胞)结合时解离常数(Kd)为10nM或以下，优选为1.0nM或以下。

上述删除实验鉴定了ENO1的残基296-336是抗体结合的区域。为了进一步表征实际的结合位点(如表位)，从蛋白质数据库(pdb登陆号：2PSN)下载ENO1的晶体结构，分析此区域的残基位置。在蛋白表面暴露有以下11个氨基酸残基：D300、W301、G302、Q305、K306、A309、K326、K330、N333、E334和K335(图13A，推定的表位)。通过定点诱变，将这11个氨基酸突变，在大肠杆菌中分别表达所得突变蛋白，并纯化(图13B)。使用ELISA分析每个纯化的ENO1突变蛋白的任何Kd变化(与ENO1结合相比)。

结果显示，这些突变体中存在3种功能类别的氨基酸残基。氨基酸残基W301和K330对ENO1蛋白与EN10mAb的结合是重要的。如果这两个氨基酸残基分别被突变成丙氨酸，这两个ENO1突变体对EN10mAb的结合活性明显被削弱。第二类氨基酸残基包括A309、E334、K335和D300。如果E334、K335和D300分别被突变成丙氨酸或A309被突变成甘氨酸，这些ENO1突变体对EN10mAb的结合活性被削弱。余下的氨基酸残基，包括G302、Q305、K306、N333和K326，属于对ENO1蛋白与EN10mAB的结合无明显结合影响的氨基酸残基组(图13C和表2)。这些结果表明，W301、K330、A309、E334、K335和D300对ENO1和EN10mAb之间的蛋白-蛋白结合是重要的。这些氨基酸残基属于ENO1肽1²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTA³⁰⁹(图13D，SEQ ID NO:9)和肽2³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶(图13D，SEQ ID NO:10)的序列，它们可能是人ENO1氨基酸残基296-335(图13D，SEQ ID NO:49)中EN10mAb的结合表位。

表2：突变体的K_d值

实施例14

ENO1和EN10mAb结构分析

从蛋白数据库(pdb-登陆号：2PSN)下载α-烯醇化酶的晶体结构。通过同源模型构建EN10mAb的Fab片段结构。第一步是寻找与EN10mAb具有高序列相似性的模板结构。检索NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)，发现许多高度同源的序列。选择相同性为89％的重链框架(pdb-登陆号：3DGG)和相同性为95％的轻链框架(pdb-登陆号：1F6L)。使用程序Accelrys Discovery Studio构建EN10mAb的抗体同源模型。使用ENO1和抗体结构进行对接。为了减轻电脑负荷，仅将抗体可变结构域的CDR环与ENO1对接。固定抗体的框架。由于对接程序检测到在起始位置周围有较大的区域，因此不需要非常小心的对对接伙伴进行初始定位。当使用ZDock时，结构会受到x-y-z轴移动干扰(沿着中心线扰动，垂直于中心线的平面的埃度微扰，埃度-旋转微扰，以度计)，且每次对接回合产生大约5000种态势。以与截断值对ZDock结果进行聚类分析。选择ENO1的相互作用的残基进行表位作图。

人ENO1蛋白的3D结构如图14A所示。标记了氨基酸残基W301、K330、300D、E334和K335。标出了Wang等公开的ENO1蛋白的血纤维蛋白溶酶原结合位置上的关键残基(250-FFRSGKY-256)。图14B显示，预测ENO1与EN10mAb的结合复合物离ENO1的血纤维蛋白溶酶原结合位点约到血纤维蛋白溶酶原结合位点与EN10mAb之间的间隔远低于人血纤维蛋白溶酶原的分子大小本研究表明，ENO1和EN10mAb的结合遮蔽了ENO1的血纤维蛋白溶酶原结合位点，阻止了血纤维蛋白溶酶原与ENO1接触，导致ENO1的血纤维蛋白溶酶原受体活性被削弱，并阻止细胞从胞外基质脱离。

实施例15

Biacore分析

使可溶性ENO1蛋白结合固定在CM5芯片上的抗体，进行EN10mAb的Biacore分析，以评估它们对可溶性抗原的亲和力。

将图15A所示的小鼠可变区和人Fc嵌合抗体表达载体pTCAE8-ENO1转入宿主细胞中，制备表达重组抗体的细胞。使用FreeStyle 293细胞(英杰公司制造)作为用于表达的宿主细胞。使用lipofectamine 2000，根据所附指导手册(英杰公司制备)将载体转入宿主细胞中。用限制性内切酶将约2.5微克的抗体表达载体线性化，然后将基因转入4×10⁶个细胞中，在6孔培养板中培育细胞。加入对应于表达载体的选择标记的试剂，连续培养细胞，直至形成稳定的细胞群。

采用下文所述方法制备含人IgG抗体的培养上清。使生产抗体的细胞在Freestyle^TM 293表达培养基(吉科(Gibco))中驯养。细胞在组织培养烧瓶中培养，当细胞的存活率为90％时收集培养上清。使收集的上清通过10微米和0.2微米的过滤器(密理博公司制造)过滤，除去污染物。使用蛋白A(密理博公司制造)对含抗体的培养上清进行亲和纯化，使用PBS作为吸附缓冲液，使用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)作为洗脱缓冲液。向洗脱部分中加入50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)而将其pH调整为约6.0。使用透析膜(分子量截留值为10000，光谱实验室(Spectrum Laboratories)制造)将制备得到的抗体以PBS替换，并通过孔径为0.22微米的膜过滤器(密理博公司制造)进行过滤灭菌，获得纯化的抗体。通过测量280nm的吸光度并将基于每1.45光密度对应于1mg/ml而换算该测量值，从而测定纯化的抗体的浓度。

对于结合动力学，如先前所述(Karlsson&Falt，(1997)J.Immunol Methods，200：121-133)使用BIAcore 2000(生物核心有限公司(BIAcore,Inc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州)进行表面等离子共振技术(SPR)测量。根据供应者的指导，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，生物核心有限公司)。使用10mM醋酸钠(pH 4.8)将嵌合E10mAb稀释到5微克/毫升，然后以20微升/分钟的流速注射，以达到约100响应单位(RU)的偶联蛋白，接着注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以25微升/分钟的流速将两倍系列稀释的ENO1(0.3125nM至40nM)注射于制造商(生物核心有限公司，皮斯卡塔韦，新泽西州)所提供的HBS-PBiacore跑胶缓冲液中，并通过减去空白流动池上获得的响应校正对于EN10mAb的结合响应。使用单纯一对一Langmuir结合模型(其中，kon与koff分别进行拟合)，计算结合速率(kon或ka)与解离速率(koff或kd)。(BIAcore.TM.估算软件3.2版)。

表3

结果显示在图15B和表3中。EN10mAb结合ENO1的kon和koff值分别为3.57×10⁵和8.271×10^-5，K_d为2.311±0.003x10^-10mol/L。采用SPR分析获得的K_d与实施例2采用结合ELISA获得的K_d非常接近。

实施例16

补体存在下EN10抗体对肿瘤生长的抑制作用

EN10mAb具有良好的亲和力，其K_d约为2.311±0.003x10^-10mol/L，具有进一步开发的潜力。使用CL1-5小鼠异种移植模型评估EN10mAb的治疗效果。第0天皮下接种CL1-5F4肺腺癌细胞(1×10⁶个细胞/小鼠，每组5只小鼠)。肿瘤接种14天后，每周给予10mpk(mg/Kg)的同种型对照(CTL)、EN10mAb或Erbitux^TM抗体两次，开始治疗过程。注射2小时后给予兔仔血清。每周测量每只小鼠的肿瘤体积和体重。每组的数据都以平均值±SD表示。

结果显示在图16中。14天后，携带CL1-5的小鼠的肿瘤大小约为30－100mm³，第25天后对照组、EN10mAb和Erbitux处理组之间的肿瘤大小无显著差异。第29天后，对照组小鼠的肿瘤开始以指数方式生长，而Eribitux^TM和EN10mAb处理组小鼠中的肿瘤无明显生长。第36天后，对照组小鼠的平均肿瘤大小为4330±990mm³(N＝5)，经10mpk的EN10mAb和Erbitux处理的小鼠的平均肿瘤大小分别为358.6±240mm³(N＝5)和219±98mm³(N＝5)。与对照组相比，EN10mAb和Erbitux^TM处理组的平均肿瘤大小明显较小，P值分别为0.004和0.003。EN10mAb和Erbitux^TM处理组的肿瘤大小间无显著差异(P＝0.41)。此结果表明，当与小鼠异种移植模型中的补体C3结合时，EN10mAb和Erbitux对CL1-5细胞具有肿瘤生长抑制活性，EN10mAb作为癌症治疗的试剂具有良好的疗效。

实施例17

脾脏-肝脏转移集落形成实验中胰腺癌肿瘤扩散的阻断

实施例2和3的结果表明给予ENO1抗体能减弱癌细胞的侵袭和转移；并且实施例16的结果表明，当与补体结合时，ENO1mAb具有抑制肿瘤生长的疗效。使用脾脏-肝脏转移实验评估EN10mAb对癌细胞的体内抗转移活性。将PDAC1胰腺癌细胞(1×10⁶个细胞/小鼠，每组5只小鼠)注射入脾脏。然后，以IP的方式分别给予小鼠10mpk的EN10mAb和IgG对照。肿瘤接种后6周杀死小鼠。分别计算并测量每只小鼠肝脏中肿瘤结节的数量和包括肺、脾、肝、胰腺和肾在内的各器官的重量。各小组的数据以平均值±SD表示。

结果显示在图17A、17B和17C中。当比较肝的肿瘤结节和体积时，对照IgG处理组的平均肿瘤结节和体积分别为34±10(N＝3)和8500±3500(N＝5)。但是，用10mpk的EN10mAb处理相同背景的小鼠时，处理小鼠的平均肿瘤结节和体积则分别为10±4(N＝3)和500±120(N＝5)。10mpk的ENO1和对照IgG处理组之间的肿瘤结节数量和体积存在显著差异(P<0.05)(图17A和17B)。当比较10mpk的ENO1和对照IgG处理组的器官平均重量时，包括肺、脾、胰腺和肾在内的器官重量无显著差异。但是，10mpk的IgG处理的小鼠的平均肝脏重量约为7.2±3g(N＝5)，与10mpk EN10mAb处理的小鼠的平均肝脏重量(1.6±0.2g(N＝5))具有统计学差异(P<0.05)。这些结果表明，给予EN10mAb能抑制PDAC1细胞从原发肿瘤位点转移到肝脏中。

总而言之，EN10mAb利用其ENO1血纤维蛋白溶酶原受体拮抗活性抑制血纤维蛋白溶酶原的活化，从而诱导下调细胞表面上的蛋白酶活性，这反过来抑制癌细胞从胞外基质脱离。结果，抗ENO1抗体能抑制癌细胞的侵袭活性。这些数据支持ENO1抗体(如EN10mAb)具有较佳的亲和力、疗效和可用作癌症治疗的治疗性抗体的潜力。

除了抑制癌从胞外基质脱离并因此抑制癌侵袭外，本发明的抗体还可用于诊断癌性疾病。如前文所述，并如图1A和1B所示，癌细胞在其细胞表面上表达ENO1，而正常细胞不表达。因此，可检测结合到细胞表面上的ENO1的抗体，作为癌性疾病的指标。

例如，根据本发明的实施方案，可使测试样品与抗ENO1抗体(如EN10mAb)反应并测定(例如利用ELISA、荧光细胞分选、荧光显微镜或本领域已知的其它合适方法)该抗体与该样品的结合。如果检测到结合，或结合高于阈值(如正常样品的参比值)，则可得出该样品含癌细胞的结论。

虽然本发明已描述其有限的具体实施例，但本领域技术人员可借助本公开而了解，在不偏离本文所公开的本发明范围的情况下可设计出其它实施方案。因此，本发明的范围应仅受限于所附的权利要求书。

Claims

1.一种抗体或其scFv或Fab片段，包含一条或多条选自下组的序列：HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQ ID NO:3),HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQ ID NO:4),HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQ ID NO:5),LCDR1(RASENIYSYLT；SEQ ID NO:6),LCDR2(NAKTLPE；SEQ IDNO:7),和LCDR3(QHHYGTPYT；SEQ ID NO:8)。

2.如权利要求1所述的抗体或其scFv或Fab片段，包含重链，所述重链含有HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQ ID NO:3),HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQ ID NO:4),和HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQ ID NO:5)的序列。

3.如权利要求2所述的抗体或其scFv或Fab片段，其中所述重链含有SEQ ID NO:1的序列。

4.如权利要求1所述的抗体或其scFv或Fab片段，包含轻链，所述轻链含有LCDR1(RASENIYSYLT；SEQ ID NO:6),LCDR2(NAKTLPE；SEQ ID NO:7),和LCDR3(QHHYGTPYT；SEQ IDNO:8)的序列。

5.如权利要求4所述的抗体或其scFv或Fab片段，其中所述轻链含有SEQ ID NO:2的序列。

6.如权利要求1所述的抗体或其scFv或Fab片段，含有重链和轻链，所述重链含有HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQ ID NO:3),HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQ ID NO:4),和HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQ ID NO:5)的序列，所述轻链含有LCDR1(RASENIYSYLT；SEQ ID NO:6),LCDR2(NAKTLPE；SEQ ID NO:7),和LCDR3(QHHYGTPYT；SEQ ID NO:8)的序列。

7.如权利要求6所述的抗体或其scFv或Fab片段，其中所述重链含有SEQ ID NO:1的序列，其中所述轻链含有SEQ ID NO:2的序列。

8.一种抗体或其scFv或Fab片段，其中所述抗体或其scFv或Fab片段可结合含序列FDQDDWGAWQKFTA(SEQ ID NO:9)或KRIAKAVNEKS(SEQ ID NO:10)的肽或蛋白，解离常数(K_d)为10nM或更低。

9.权利要求8所述的抗体或其scFv或Fab片段，其中所述肽或蛋白含有序列FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS(SEQ ID NO:49)。

10.权利要求1-9中任一项所述的抗体或其scFv或Fab片段，其中所述抗体是单克隆抗体。

11.用于治疗肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌或前列腺癌的药物组合物，包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其scFv或Fab片段。

12.一种诊断癌症的方法，包括：使来自受试者的样品与权利要求1-10中任一项所述的抗体或其scFv或Fab片段接触，以测定结合程度；其中所述结合程度大于参比值指示癌性病症。

13.一种抑制癌症侵袭的方法，包括：给予有需要的对象权利要求1-10中任一项所述的抗体或其scFv或Fab片段。