KR101331658B1 - 오메가-3 및 오메가-6 지방산을 함유하는 글리세로인지질 - Google Patents

Abstract

글리세로인지질 또는 그들의 염, 공액화물 및 유도체, 특히 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜-이노시톨(PI), 포스파티딜글리세롤(PG) 및 포스파티드산(PA), 및 고도불포화 지방산(PUFA) 아실기, 특히 장쇄 고도불포화 지방산(LC-PUFA) 아실기, 예를 들면 오메가-3 및(또는) 오메가-6 아실기를 포함하는 지질 제제가 개시되며, 여기서 상기 PUFA는 상기 글리세로인지질에 공유 결합된다. 개시된 제제는 개선된 생활성을 갖고, 다양한 인지 및 정신 상태 및 장애의 치료 및 뇌 관련 시스템 및 과정, 예를 들면 ADHD의 정상 기능의 유지에 유용하다.

오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산, 글리세로인지질

Description

오메가-3 및 오메가-6 지방산을 함유하는 글리세로인지질{GLYCEROPHOSPHOLIPIDS CONTAINING OMEGA-3 AND OMEGA-6 FATTY ACIDS}

본 발명은 지질 골격에 공유 부착된 오메가-3 및(또는) 오메가-6 지방산이 풍부한 인지질 및 극성 지질 제제에 관한 것이다. 본 발명의 인지질 제제는 다양한 상태, 특히 인지 기능 관련 상태의 치료에 기능식품, 식품 첨가제 및(또는) 제약 제제로서 특히 유용하다.

지질, 특히 극성 지질, 질소 함유 지질 및 탄수화물 함유 지질(인지질, 스핑고신, 당지질, 세라미드, 스핑고미엘린(sphingomyelin))은 세포막, 조직 등의 주요 구성 단위이다. 또한, 이들은 신호 전달 과정 및 다양한 생화학적 및 생합성 경로에서 중요한 역할을 한다.

글리세롤 골격에 기초하고 포스페이트 헤드 기를 함유하는 지질인 글리세로인지질은 세포막의 주 구성 단위이다. 전부는 아니라도 대부분의 생화학적 과정은 세포막을 포함하기 때문에, 다양한 조직에서 막의 구조적 및 물리적 성질은 모든 생화학적 과정에서 막이 정상적인 유효한 기능을 하는 데 중요하다.

식이 지질 분야에서의 신흥 기능성 식품 카테고리 면에서, 특정한 지방산의 소비로 인해 많은 건강상 이익들이 생겨났다. 예를 들면, 많은 연구들에서, 타입 오메가-3 및 오메가-6의 고도불포화 지방산(PUFA)이 심혈관 질환, 면역 장애 및 염증, 신장 장애, 알레르기, 당뇨 및 암에 몇몇 건강상 이익을 갖는 것으로 보고되었다. 이러한 타입의 지방산은 주로 어류 및 조류(algae)에서 천연 발생하고, 이 경우 이들은 트리글리세리드의 글리세롤 골격의 sn-1, sn-2 및 sn-3 위치에 랜덤하게 분포된다.

전문 문헌은 오메가-3 지방산을 함유하는 적합한 식이요법의 중요성을 강조한다. 뇌에서 가장 중요한 오메가-3 지방산 중 하나인 도코사헥사엔산(DHA)의 중요성을 조사하는 광범위한 임상 연구들은 DHA의 낮은 수치가 우울증, 기억 상실, 치매 및 시력 문제와 관련되어 있다는 것을 발견하였다. 모든 연구들은 중장년층의 뇌 기능에서 혈중 DHA 수치를 증가시키는 극적인 개선을 보여주었다.

DHA의 다른 공지된 이익은 부정맥 위험 감소, 심장 돌연사의 위험 감소, 혈장 트리글리세리드 수치 감소 및 혈액 응고 경향 감소를 포함한다. 더욱이, DHA는 뇌 기능 강화, 이유식 강화, 당뇨 및 암 분야에 중요할 수 있다. 뇌중 DHA의 중요성을 조사하는 영양 연구에서는 DHA의 낮은 수치가 우울증, 기억 상실, 인지 결함, 치매 및 시력 문제와 관련되어 있다는 것을 발견하였다.

인체는 DHA를 적합하게 합성하지 못한다. 따라서, 식사로부터 이를 얻는 것이 필요하다. 인간은 먼저 태반을 통해, 그 다음 모유로부터, 후에는 식이원, 예를 들면 어류, 붉은 고기, 동물 내장육 및 달걀을 통해 그들의 식사로부터 DHA를 얻는다. 참치, 연어 및 정어리와 같은 대중적인 어류가 풍부한 공급원이다. 최근까지는, DHA 식이 보충제의 주 공급원은 어유였다. 리놀레산 및 알파-리놀렌산의 생성물 중 오메가-6 및 오메가-3 족을 생성하는 효소의 능력은 노화에 따라 감소한다. DHA 합성은 나이가 들면서 감소하기 때문에, 노화에 따라 식이요법으로부터 DHA를 직접 얻거나 또는 보충할 필요성이 증가한다. 사실상, 몇몇 최근 공보들은 DHA를 필수 지방산으로 볼 것을 제안하였다(예를 들면, 문헌[Muskiet, F. et al. (2004) J Nutr. 134(1):183-6] 참조).

DHA가 뇌, 안구 및 신경계에서 신호 전달에 중요하기 때문에, 정신 명료도의 유지를 염려하는 많은 소비자들은 그들의 DHA량을 보충하는 순수하고 안전한 방법을 찾고 있다.

특히, 장쇄의 고도불포화 산, 예를 들면 오메가-3 및 6이 사람들에게 많은 가치있는 건강상 이익을 선사하는 것으로 나타났다. 식품 부분을 비롯한 장쇄 PUFAs의 세계적인 시장이 빠르게 성장하고 있다.

그러나, 산업상 노력의 대다수는 PUFA 가공 기술의 개선 및 식이 보충제 및 기능성 식품 수요를 맞추기 위해 고농축된 등급의 PUFA 유도체 생성에 투자되고 있다.

학계 및 업계는 PUFA의 공지된 다양한 건강상 이익 면에서 그들의 생체이용률 및 효능을 강화시키기 위한 상이한 전달 접근의 평가에 관해서는 관심이 적었다. 이러한 이익들은 CVD, 당뇨, 인지 장애 및(또는) 저하, 시력 장애, 피부 상태, 학습 장애 등을 예방 및 치료한다. 또한, PUFAs는 유아의 인지 및 시력 개발을 보조하는 것으로 밝혀졌다.

PUFA-지질

PS-PUFA

또한, PS로도 공지된 포스파티딜세린은 뇌 영양 분야에서 가장 촉망받는 식이 보충제 중 하나이게 하는 생리활성을 갖는 천연 인지질이다. PS 및 그의 건강상 이익은 1970년대부터 과학계 및 영양학계에 알려졌다. 다양한 인지 및 정신 기능에서의 효능을 정립하기 위해 다수의 연구들이 행해졌다. 이러한 연구들은 PS가 불과 두세 가지만 언급하면, 예를 들면 기억력을 개선시키고, 치매에 대항하고, 조기 알츠하이머 질환에 대항하고, 스트레스 및 긴장을 감소시키고, 주의지속 시간을 개선시키고, 기분을 향상시키고 우울증에 대항할 수 있다는 것을 밝혀냈다.

PS는 뇌 세포막의 가장 중요한 구성 단위 중 하나이다. 따라서, 뇌 세포막 중 PS 수치는 이들 막의 유동성 및 구조를 보장한다. 정상 수치는 정상의 효율적인 신호 전달 과정, 효율적인 글루코오스 소비, 및 정상 인지 및 정신 기능을 일으키는 다른 생물학적 경로를 보장한다.

PS는 인간 영양물 중에서 풍부하지 않고, 많은 사람들, 특히 중장년층에서는 PS의 생산을 담당하는 생합성 경로에 기능이상이 있기 때문에, 신체 및 뇌 중 PS 수치는 낮다. 이는 다양한 인지 및 정신 장애, 예를 들면 우울증, 기억 상실, 짧은 주의지속 시간, 학습 곤란 등을 일으킨다.

이러한 장애를 갖는 노인들의 식사에 PS를 보충한 경우 많은 경우, 이 장애들을 극적으로 개선시켰다. 최근 수년간, 연구들은 심지어 젊은 사람들에게도 PS 식이 보충제가 이롭다는 것을 밝혀냈다. PS는 학생의 학습 능력, 기억력 및 주의지속 시간 등을 개선시키는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 목적은 주로 영양약학 제품 및 기능성 식품 첨가제로 사용하기 위한 PS의 특수 제제를 제공하는 것이다.

PC-PUFA

앞서 언급한 바와 같이, 인지질은 모든 세포막 및 아세포막의 필수 성분이다. 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민이 양적으로 우세하며, 실질적으로 전형적인 2층 형상을 구성한다. 인지질은 수용성 및 지용성 성분을 갖는 양친매성 분자에 속한다. 2층 형상에서, 친수성 기는 주위 매질을 향해 막의 외측 및 내측에 배열되며, 반대로 친지성 기는 2층 형상부의 내측에서 서로 마주한다.

생물학적 막의 다른 중요한 구성성분으로는 콜레스테롤, 당지질, 및 외재 및 내재 단백질이 있다. 따라서, 생물학적 막의 기본 구조는 지질-단백질 착물로 된 일련의 순환 단일체이다. 막은 비대칭적이다. 외부(세포) 및 내부(아세포) 막 시스템의 기능은 그들의 조성 및 그들의 인지질 구조의 일체성에 따라 좌우된다. 인지질은 세포막 중 그들의 존재 외에도 계면활성제 및 지단백질의 표면 단층의 구조적 기능 요소를 구성한다.

생물학적 막의 기능에 대한 최대 중요성은 인지질에 의해 결정적으로 영향을 받는 그들의 유동성에 있다. 시스템 중 인지질의 콜레스테롤 및 단백질 함량 및 극성 헤드 기의 특성 및 전하 외에도, 막 유동성은 인지질 분자 내 지방산 잔기의 쇄 길이, 뿐만 아니라 그들의 이중 결합쌍의 수 및 타입에 따라 좌우된다.

고도불포화 지방산을 함유하는 인지질은 생체에 막 유동성을 개선시키는 중요한 구성 단위를 공급한다.

PUFA 함유 인지질을 사용하여 수행된 연구는 하기를 밝혀내었다:

1. 이들은 모든 생물학적 막, 예를 들면 세포, 혈구, 지단백질, 및 계면활성제의 고 에너지, 기초적 구조적 기능 요소이다.

2. 이들은 세포 분화, 증식 및 재생에 필수불가결하다.

3. 이들은 많은 막 결합 단백질 및 수용체의 생물학적 활성을 유지시키고 촉진시킨다.

4. 이들은 다수의 막 위치 효소, 예를 들면 나트륨-칼륨-ATPase, 아데닐레이트 시클라아제 및 지단백질 리파아제의 활성 및 활성화에 중요한 역할을 한다.

5. 이들은 막을 통한 분자의 수송에 중요하다.

6. 이들은 세포내 공간과 세포간 공간 사이의 막 의존성 대사 과정을 조절한다.

7. 이들 중에 함유된 고도불포화 지방산, 예를 들면 리놀레산은 세포보호(cytoprotective) 프로스타글란딘 및 다른 에이코사노이드의 전구체이다.

8. 이들은 콜린 및 지방산 공여체로서 특정한 신경학적 과정에 영향을 미친다.

9. 이들은 위장관에서 지방을 유화시킨다.

10. 이들은 쓸개에서 중요한 유화제이다.

11. 이들은 적혈구 및 혈소판 응집을 함께 결정한다.

12. 이들은 세포 수준에 대한 면역학적 반응에 영향을 미친다.

이론적으로, PUFA 함유 인지질은 손상된 막 구조, 감소된 인지질 수치 및(또는) 저하된 막 유동성이 존재하는 모든 질환에 중요하다. 이 가설은 다양한 막 관련 장애 및 질병의 실험적 임상 조사에 의해 뒷받침된다.

막 손상과 관련된 다양한 교란 및 질환에 대한 활성 원리, 뿐만 아니라 약리학적 임상 시험에 대한 연구가 이용가능하다. 예를 들면, 간 질환에서 간세포 구조는 예를 들면, 바이러스, 유기 용매, 알코올, 의약, 약물 또는 지방 식품에 의해 손상된다. 그 결과, 막 유동성 및 투과성이 교란될 수 있고, 막 의존성 대사 과정, 뿐만 아니라 막 관련 효소 활성이 손상될 수 있다. 이는 간 대사를 상당히 억제한다.

다른 예들은 혈소판 및 적혈구 세포의 막, 신경학적 질환, 위염, 신장 질환 및 다양한 노화 증상에서 상승된 콜레스테롤/인지질 비를 갖는 혈류학적 교란, 죽상동맥경화를 갖거나 갖지 않는 고지단백혈증을 포함한다.

이러한 모든 매우 다양한 질환들은 통상의 동등한 막 장애를 갖는다. 고도불포화 포스파티딜콜린 분자의 경우, 고도불포화 지방산 고 함량으로 인해 이러한 장애는 호전되거나, 제거되거나, 심지어 정상치를 넘어 개선될 수 있다. 하기는 이 현상을 매개하는 기전의 일부 예이다:

1. PUFA 함유-포스파티딜콜린이 풍부한 HDL 입자는 저밀도 지단백질(LDL) 및 조직으로부터 더 많은 콜레스테롤을 취할 수 있다. 더 많은 콜레스테롤이 간으로 다시 수송될 수 있다. 이러한 콜레스테롤 역 수송에 대한 작용은 유니크하다. 기타의 지질 저하제들은 신체의 콜레스테롤 흡수 또는 간에서의 콜레스테롤 합성 및 그의 말초로의 분포를 감소시킨다. 그러나, 이러한 물질들은 이미 말초에 존재하는 콜레스테롤을 생리학적으로 동원하지 못한다.

2. 막, 혈소판 및 적혈구 세포에서 콜레스테롤/인지질 비는 감소하고, 막 기능은 정상 상태로 개선된다.

3. 과산화 반응은 감소되고, 손상된 간세포 막 구조는 복원되고, 막 유동성 및 기능이 안정화되고, 면역 조절 및 세포 보호가 개선되고, 막 관련 간 기능이 강화된다.

4. 콜레스테롤/인지질 비의 정상화로, 담즙도 안정화된다.

5. PUFA 함유-포스파티딜콜린은 표면 활성 유화제로서의 특수한 성질로 인해 지방을 가용화시키고, 지방 색전증의 위험을 감소시키고 치료하는 데 사용된다.

6. 고도불포화-지방산 및 콜린을 사용한 치환은 뇌중 세포보호 효과를 가질 수 있고 신경세포 과정을 활성화시킬 수 있다.

7. 고도불포화 포스파티딜콜린 분자를 갖는 리포좀은 예를 들면, 비타민 E의 약물 담체로 사용될 수 있다.

간 질환

실험 및 임상 결과들은 PUFA 함유-포스파티딜콜린의 치료적 적용이 정맥동 내피 세포 및 간세포의 생물학적 막에 보호 및 심지어 치유 및 재생 효과를 갖는다는 가정을 뒷받침한다. PUFA 함유-포스파티딜콜린의 세포보호 효과는 5가지 상이한 동물 종을 사용한 20가지 상이한 모델을 사용한 55가지 생체내 실험 및 7가지 시험관내 실험에서 확증되었다. 간 질환의 병인에 역할을 담당하는 것으로 공지된 타입의 중독은 대개 화학 물질, 의약, 알코올, 담즙 분비 중지, 면역학적 현상, 방사선 노출 등에 적용되었다.

PUFA 함유-포스파티딜콜린의 간보호 효과는 확인되었고, 더 확실할수록 일찍 PUFA 함유-포스파티딜콜린을 투여하였다:

1. 막의 구조는 정상이거나 대부분 정상화되었다.

2. 지방 침윤 및 간세포 괴사가 감소되거나 심지어 제거될 수 있었다.

3. 지질 과산화, 트란스아미나아제 및 콜린스테라아제 활성 및 혈청 지질에 대한 대응하는 데이터가 관측되었고, 간 세포 대사는 증가하였다.

4. RNA 및 단백질 합성의 증가 및 간 세포 글리코겐 함량의 증가는 간 세포의 자극을 시사하였다.

5. 감소된 콜라겐 생산, 콜라겐/DNA 비, 및 간 히드록시프폴린 함량은 결합 조직의 형성 감소를 시사하였다.

PUFA 함유-포스파티딜콜린의 투여량은 경구 투여된 경우 일일 525 내지 2,700 mg 범위이고, 정맥내 적용시 일일 500 내지 3,000 mg 범위였다. 치료 기간은 수주 내지 30 개월 이하로 지속되었다. 주요한 간 적응증은 급성 간염, 만성 간염, 지방 간, 독성 간 손상, 간경화 및 간성 혼수였다.

일반적으로, PUFA 함유-포스파티딜콜린의 유효성을 보여주는 임상적 발견은 다음과 같이 요약될 수 있다:

1. 주관적 호소, 임상적 발견, 및 몇몇 생화학적 값의 가속화된 개선 또는 정상화

2. 대조군에 비해 우수한 조직학적 결과

3. 입원 기간 감소.

또한, 신장 장애, 만성 복막투석, 고지단백혈증/죽상동맥경화, 위염, 건선 등에서 전도유망한 결과를 얻을 수 있다.

최근 학술 연구는 송어 배아로부터 단리된 PUFA 풍부 인지질이 신규한 건강상 이익을 갖는다는 점을 밝혀냈다. 이러한 이익 중 일부는 종양 세포의 치료, 5-리폭시게나아제 활성의 억제, 중성 지방 수치(예를 들면, 콜레스테롤)의 감소를 포함한다.

영양학적으로 풍부한 인지질을 투여받은 사람의 경우, 이 인지질이 장 장벽 및 혈액-뇌 장벽을 횡단하여 뇌에 도달한다는 증거가 있다. 최근, 폰로이 라보라토리즈(Ponroy Laboratories)로부터의 연구자들은 LC-PUFA에 대한 유일한 공급원으로 작용하는 필수 지방산, 즉 리놀레산(18:2 n-6) 및 α-리놀렌산(18:3 n-3) 결핍 마우스에게 대뇌 인지질 및 측정되는 뇌의 일부 각각에 소정의 인지질을 공급하는 실험을 기재하였다. 이러한 인지질은 세포질, 스냅스 및 다른 뇌 부분에서 발견되었다(문헌[Carrie et al.,(2000) J. Lipid Res. 41, 465-472] 참조).

PUFA가 풍부한 인지질의 사용은 임상 면으로부터의 많은 잠재적 이점들을 보유한다. 인지질은 필수 지방산을 특수 기관 또는 신체 일부, 예를 들면 뇌로 전달할 수 있고, 막 중 이러한 지방산의 혼입을 보조할 수 있다. 다른 이점들은 PUFA가 풍부한 인지질이 예를 들면, 현재 주요 영양약학 제품 공급원인 어유에서 발견되는 냄새 문제를 갖지 않는다는 사실로부터 발생할 수 있다. 더욱이, 일부 예비 임상 연구들은 인지질 중에 혼입된 PUFA가 트리글리세리드에 의해 운반되는 PUFA보다 우수한 효능을 갖는다는 점을 밝혀냈다(문헌[Song et al. (2001) Atherosclerosis, 155, 9-18] 참조).

추가 연구들은 DHA 풍부 인지질의 활성이 자연발생 고혈압증 쥐에서의 DHA 풍부 트리아실글리세롤의 경우와 상이하다는 점을 밝혀냈다(문헌[Irukayama-Tomobe et al. (2001) Journal of Oleo Science, 50(12), 945-950] 참조). 어란으로부터 추출한 30 ％ 도코사헥사엔산(DHA) 인지질(DHA-PL) 또는 30 ％ DHA 어유(DHA-TG)를 함유하는 자연발생 고혈압증 쥐(SHR)에게 시험 지질 식이를 공급하였다. 대조군 식이는 시험 지질의 존재 하에서 옥수수유를 함유하였다. 공급 후, DHA-TG 및 DHA-PL 식이군에서의 혈압은 대조군에 비해 상당히 낮은 것으로 관측되었다. DHA-PL 식이군의 디호모-리놀레산(DHLnA) 및 아라키돈산(AA)의 혈청 지방산 함량은 대조군 또는 DHA-TG 식이군보다 상당히 낮았다. DHA-TG 및 DHA-PL 식이군 중 혈청 트리아실글리세롤, 인지질 및 총 콜레스테롤은 대조군보다 상당히 낮았다. DHA-PL에서의 총 간 콜레스테롤은 DHA-TG 식이군 및 대조군의 두배였다. 따라서, DH-PL에 의해 혈액으로부터 콜레스테롤을 제거하는 기전은 DHA-TG에 의한 것과는 다른 것으로 보였다. DHA-TG 및 DHA-PL 식이군에서의 혈청 지질 과산화물(LPO)은 본질적으로 대조군과 동일하였다.

많은 PUFA 함유제는 고도불포화 지방산의 고도의 산화로 인해 안정성 및 품질 문제를 겪고 있다. 이러한 문제는 항산화제의 혼입, 뿐만 아니라 이 산화를 감소시키기 위한 특수 조치의 사용을 필요로 한다. PUFA의 담체로서 인지질을 사용한 경우 인지질의 항산화 성질로 인해 이러한 생성물의 안정성을 강화시킬 수 있다.

이러한 필수 지방산에 대한 가장 유효한 수송 기전 중 하나는 이들 기를 인지질 분자에 부착시키는 것으로 보인다. 인지질은 혈액-뇌 장벽을 통과하고, 필요한 경우 DHA를 수송하는 것으로 밝혀졌다.

관능성 문제

종래, PUFAs는 한류 어류로부터 추출되었다. 건강 이미지에도 불구하고, 소비자 용인의 문제점 중 하나는 강한 비린 맛이 있다는 것이다. 이를 위해, 지난 15년 동안 미세캡슐화된 형태의 오메가-3가 개발되었다. 추가의 단계는 에그 함유 생성물, 예를 들면 DHA 풍부 마요네즈 및 파스타를 개발하는 것이다. 또한, DHA 풍부 요거트, 베이킹 상품 및 브로일러도 고안되었다.

PUFA 전달제로 간주되는 다른 영양 생성물 또는 성분은 존재하지 않는다. 모든 현재 시판되는 제품들은 캡슐화된 형태의 지방산 자체 또는 특수 동물/작물 공급물을 통한 PUFA가 풍부한 식품에 기초한다.

따라서, 본 발명의 목적은 주로 영양약학 제품 및 기능성 식품 첨가제로 사용되는 오메가-3 또는 오메가-6 지방산이 풍부한 지질 제제를 제공하는 것이다. 이 제제의 조성은 PUFAs의 생체이용률을 강화시키는 성질을 갖는 제제를 제공하도록 이루어진다. 따라서, 소비시, 바람직하게는 기능식품, 식품 첨가제 또는 제약 조성물 형태에서, 생체는 가장 효율적인 방식으로 하기 상술되는 상기 제제에 의해 제공되는 이익을 향유할 수 있다.

본 발명의 이러한 목적 및 다른 목적들은 하기 설명에 의해 더욱 명확해질 것이다.

발명의 개요

제 1 측면에서, 본 발명은 지질이 상기 제제의 총 지방산 함량의 5 ％(w/w) 이상, 바람직하게는 10 ％(w/w) 초과, 더욱 바람직하게는 20-50 ％(w/w)의 농도로 글리세로인지질 및 그들의 염, 공액화물, 및 유도체 및 그의 임의의 혼합물, 및 고도불포화 지방산(PUFA) 아실기, 특히 장쇄 고도불포화 지방산(LC-PUFA) 아실기, 바람직하게는 오메가-3 및(또는) 오메가-6 아실기로부터 선택되며, 상기 PUFA는 상기 지질에 공유 결합되어 있는 지질 제제를 제공한다.

상기 지질은 천연 지질 또는 합성 지질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 지질은 sn-1 또는 sn-2 기의 글리세롤 골격 중 적어도 일부가 상기 고도불포화 지방산(PUFA) 아실기로 치환되어 있는 글리세로인지질이다.

한 특정 실시양태에서, 상기 지질은 하기 화학식 I의 글리세로인지질이다.

상기 식 중, R"는 세린(PS), 콜린(PC), 에탄올아민(PE), 이노시톨(PI), 글리세롤(PG) 및 수소(포스파티드산-PA)로부터 선택된 잔기를 나타내고, R 및 R'는 동일하거나 상이할 수 있고 독립적으로 수소 또는 아실기를 나타내며, 이 아실기는 포화되거나 일불포화되거나 고도불포화된 아실기(PUFA), 특히 장쇄 고도불포화 지방산(LC-PUFA), 더욱 바람직하게는 오메가-3 및(또는) 오메가-6 아실기, 및 그의 염으로부터 선택되되, 단 R 및 R'는 동시에 수소를 나타낼 수 없고, 상기 고도불포화 아실기는 총 지질 지방산의 5 ％(w/w) 이상, 바람직하게는 10 ％(w/w) 초과, 특히 20-50 ％(w/w)를 차지한다.

상기 제제의 하나 이상의 특정 실시양태에서, R은 수소를 나타내고 R'는 아실기를 나타낸다. 별법으로, R'는 수소를 나타내고 R은 아실기를 나타낸다.

상기 후자의 실시양태를 고려할 때, 상기 아실기는 바람직하게는 오메가-3 아실기일 경우, 에이코사펜타에노일(EPA), 도코사헥사에노일(DHA) 기, 또는 리놀렌산 오메가-3기일 수 있다. 또한, 상기 아실기는 바람직하게는 오메가-6 아실기일 경우, 아라키도노일(ARA)기, 또는 리놀레산 오메가-6 기일 수 있다. 또한, 상기 아실기가 리놀레노일(18:3)기일 수 있는 가능성도 있다.

또한, 본 발명의 제제의 추가의 실시양태에서, R"는 세린, 콜린, 에탄올아민, 이노시톨 또는 글리세롤 중 하나일 수 있다.

추가의 특정 실시양태에서, R 및 R'의 실체 및 함량을 미리 정한다.

R"가 세린인 화학식 I의 화합물을 포함하는 본 발명의 제제는 R"가 세린인 화학식 I의 화합물의 조성을 모사한다.

그럼에도 불구하고, 또한, 본 발명은 인간 뇌 PS와는 상이하지만, 특히 대두-PS에 비해 여전히 개선된 생활성을 갖는 R"가 세린인 화학식 I의 화합물을 포함하는 제제에 관한 것이다. 이 개선된 생활성은 노인 집단, 특히 알츠하이머 질환과 같은 콜린성 손상 상태에서 학습 및 기억력 양쪽 모두에 유리한 효과를 제공한다.

또한, 본 발명은 대두-PS에 비해 유사하거나 개선된 생활성을 가지면서 대두-PS에 비해 낮은 투여량(2-3배)에서 유효한 인간 뇌 PS를 모사하는 PS 제제의 제형화에 관한 것이다.

PS는 식물, 동물 또는 미생물 공급원으로 될 수 있고, PS는 R"가 세린 잔기를 나타내는 화학식 I 중에 풍부하다.

또한, 본 발명의 제제는 어류 관련 관능 효과가 감소되거나 없는 것을 특징으로 하는 화학식 I 중 PS가 풍부할 수 있다. 이러한 제제는 초콜릿 함유 제품 또는 유제품(농축유 포함)에 혼입되기에 특히 적합할 수 있다.

본 발명의 제제는 인지 및 정신 상태 및 장애의 개선 및 치료, 뿐만 아니라 뇌 관련 시스템 및 과정, 바람직하게는 ADHD, 노화, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 다발경화증(MS), 읽기장애, 우울증, 학습 능력, 뇌파 강도, 스트레스, 불안, 정신 및 정신과 장애, 집중력 및 주의력, 기분, 뇌 글루코오스 사용도, 일반적 인지 및 정신적 안녕, 신경학적 장애 및 호르몬 장애의 정상 기능의 유지에 사용될 수 있다.

본 발명의 제제는 오메가-3 및 오메가-6 지방산의 생체이용률을 강화시키는 데 특히 유용하다.

본 발명의 제제는 인지 및 정신 기능의 조합 개선과 함께 추가적인 건강 장애 또는 상태의 개선에 사용될 수 있다. 이러한 추가적인 건강 장애 또는 상태는 적어도 혈중 높은 콜레스테롤 수치, 혈중 높은 트리글리세리드 수치, 혈중 높은 피 브리노겐 수치, HDL/LDL 비, 당뇨, 대사 증후군, 폐경 또는 폐경후 상태, 호르몬 관련 장애, 시력 장애, 염증 장애, 면역 장애, 간 질환, 만성 간염, 지방증, 인지질 결핍, 지질 과산화, 세포 재생의 리듬장애, 세포막의 탈안정화, 관상동맥 질환, 고혈압, 암, 고혈압증, 노화, 신장 질환, 피부 질환, 부종, 위장 질환, 말초 혈관계 질환, 알레르기, 신경퇴행 및 정신과 질환일 수 있다.

또한, 본 발명의 제제는 죽상동맥경화, 심혈관 장애 및(또는) 관상동맥 심질환을 일으키는 혈청 산화 스트레스의 감소 및(또는) 예방에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 지질 제제를 포함하는 영양약학 조성물에 관한 것이다. 영양약학 조성물은 연질겔 캡슐, 정제, 시럽 또는 기타 통상의 식이 보충 전달 시스템의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 지질 제제를 포함하는 기능성 식품에 관한 것이다. 이러한 기능성 식품은 유제품, 우유류, 아이스크림, 베이커리 제품, 과자제품, 비스켓, 콩제품, 페이스트리 및 빵, 소스, 조미료, 오일 및 지방, 마가린, 스프레드, 시리얼, 음료 및 쉐이크, 오일 및 지방, 유아 이유식, 유아 식품(비스켓, 메쉬드(meshed)) 채소 및 과일, 시리얼), 바, 스낵, 캔디 및 초콜릿 제품으로부터 선택될 수 있다.

또한, 추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 지질 제제를 포함하고, 임의적으로 하나 이상의 제약상 허용되는 첨가제, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 임의적으로, 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 활성제를 추가로 포함한다.

도 1A-D: 쥐의 공간 모리스(Morris) 미로 시험 습득 행동.

3 개월 동안 이하 상술하는 다양한 보충물로 보충된 노화된 쥐의 플랫폼에 대한 3 일 습득(일일 2 회기)에서 잠복기를 1 mg/kg의 스코폴라민으로 예비처리(개방 정사각형)하거나 또는 예비처리하지 않은(막힌 원) 경우에 대해 비디오 카메라를 사용하여 분석하였다.

도 1A: MCT로 보충된 쥐, P < 0.007.

도 1B: PS-ω3으로 보충된 쥐, P < 0.07.

도 1C: SB-PS로 보충된 쥐, P < 0.02.

도 1D: LC-PUFA로 보충된 쥐, P < 0.03.

값들은 보충물 당 4마리 내지 5 마리의 쥐의 평균 ± S.E.M을 나타낸다.

약어: Lat. T., 잠복기; sec., 초.

도 2. 공간 탐침 시험 중 모리스 물 미로 시험시 스코폴라민 처리 쥐의 행동.

이 그래프는 3 개월 동안 MCT(개방형 막대), PS-ω3(민무늬 막대), SB-PS(점 막대) 또는 LC-PUFA(줄무늬 막대)로 보충된 노화된 쥐가 플랫폼이 제거된 후 상이한 구역에서 보낸 시간(T.)를 1 mg/kg의 스코폴라민을 예비처리한 후 비디오 카메라를 사용하여 분석한 것을 나타낸다. 값들은 보충물 당 4마리 내지 5 마리의 쥐의 평균 ± S.E.M을 나타낸다. 대조군(MCT)에 비한 유의성 * P < 0.02 및 ** P < 0.08

도 3A-D: 플랫폼의 재위치 후 플랫폼 위치시 스코폴라민 유도 쥐의 행동.

3 개월 동안 이하 특정된 다양한 보충물로 보충된 노화된 쥐의 플랫폼에 대한 물 미로 시험에 대한 잠복기를 1 mg/kg의 스코폴라민으로 예비처리(개방 정사각형)하거나 또는 예비처리하지 않은(막힌 원) 경우에 대해 비디오 카메라를 사용하여 분석하였다.

도 3A: MCT로 보충된 쥐.

도 3B: PS-ω3으로 보충된 쥐.

도 3C: SB-PS로 보충된 쥐.

도 3D: LC-PUFA로 보충된 쥐.

값들은 보충물 당 4마리 내지 5 마리의 쥐의 평균 ± S.E.M을 나타낸다.

약어: Lat. T., 잠복기; sec., 초; tr., 시험.

도 4A-B: ³¹P-NMR을 사용하여 측정된 쥐 조직 중 인지질 수치

3 개월 동안 MCT(개방형 막대), PS-ω3(민무늬 막대), SB-PS(점 막대) 또는 LC-PUFA(줄무늬 막대)로 보충된 노화된 쥐의 조직으로부터 지질을 추출하였다. ³¹P-NMR 기기를 사용하여 인지질 수치를 분석하였고, 상이하게 처리한 포스파티딜콜린의 상대적 수치를 제공한다.

도 4A: 간으로부터 추출된 지질의 분석.

도 4B: 뇌(피질 영역)로부터 추출된 지질의 분석.

값들은 보충물 당 4 내지 5 개의 쥐 조직의 평균 ± S.D.를 나타낸다.

대조군(MCT)에 비한 유의성 *P < 0.05 및 **P < 0.1.

약어: Tot. Pl., 총 인지질.

도 5: 행동 척도(rating scale)에 따른 ADHD 어린이에 대한 부모 점수.

그래프는 캐놀라 오일(개방형 막대), DHA(민무늬 막대) 또는 PS-ω3(평행선 무늬 막대)으로 2 개월 동안 보충한 후 부모가 관찰한 개선을 나타내거나 또는 개선되지 않은 ADHD 어린이의 ％를 나타낸다. 등급화는 형제 또는 친구들 및 교사의 의견과 함께 집, 학교에서의 행동 성향에 관한 평가를 포함한다. 값들은 보충물 당 20 내지 25명의 ADHD 어린이 점수의 ％를 나타낸다. 12 명의 부모는 질의자에 응답하기를 거부했고, 6 명의 어린이들은 입맛이 떨어지거나(poor taste) 또는 심한 훈련 문제로 인해 보충 기간을 완결하지 못했다(대부분 대조군).

약어: Improv., 개선; Marg. Improve., 적은 개선; n.c., 변화 없음; Deter., 저하.

도 6: 혈청 산화 스트레스에 대한 PC-DHA의 영향.

10주 동안 위약(개방형 막대) 또는 PC-DHA(민무늬 막대)을 Apo E° 마우스에 공급하였다. 혈청 지질 과산화물(Ser. per.) 수치를 분광광도 분석시험을 사용하여 측정하였다. 값들은 처리 당 5마리 마우스의 평균 ± S.D.를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

제 1 측면에서, 본 발명은 제제의 총 지방산 함량의 5 ％(w/w) 이상, 바람직하게는 10 ％(w/w) 초과, 더욱 바람직하게는 20-50 ％(w/w)의 농도로 지질이 글리세로인지질, 염, 공액화물, 및 그의 유도체 및 그의 임의의 혼합물, 및 고도불포화 지방산(PUFA) 아실기, 특히 장쇄 고도불포화 지방산(LC-PUFA) 아실기, 바람직하게는 오메가-3 및(또는) 오메가-6 아실기이고 상기 PUFA는 상기 글리세로인지질에 공유 결합되어 있는 지질 제제를 제공한다.

상기 지질은 천연 지질, 또는 합성 지질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 지질은 sn-1 또는 sn-2 기의 글리세롤 골격 중 적어도 일부가 상기 고도불포화 지방산(PUFA) 아실기로 치환되어 있는 글리세로인지질이다.

한 특정 실시양태에서, 상기 지질은 하기 화학식 I의 글리세로인지질이다.

<화학식 I>

상기 식 중, R"는 세린(PS), 콜린(PC), 에탄올아민(PE), 이노시톨(PI), 글리세롤(PG) 및 수소(포스파티드산-PA)로부터 선택된 잔기를 나타내고, R 및 R'는 동일하거나 상이할 수 있고 독립적으로 수소 또는 아실기를 나타내며, 이 아실기는 포화되거나 일불포화되거나 고도불포화된 아실기(PUFA), 특히 장쇄 고도불포화 지방산(LC-PUFA), 더욱 바람직하게는 오메가-3 및(또는) 오메가-6 아실기, 및 그의 염으로부터 선택되되, 단 R 및 R'는 동시에 수소를 나타낼 수 없고, 상기 고도불포화 아실기는 총 지질 지방산의 5 ％(w/w) 이상, 바람직하게는 10 ％(w/w) 초과, 특히 20-50 ％(w/w)를 차지한다.

상기 제제의 하나 이상의 특정 실시양태에서, R은 수소를 나타내고 R'는 아 실기를 나타낸다. 별법으로, R'는 수소를 나타내고 R은 아실기를 나타낸다.

상기 후자의 실시양태를 고려할 때, 아실기는 바람직하게는 오메가-3 아실기일 경우, 에이코사펜타에노일(EPA), 도코사헥사에노일(DHA) 기, 또는 리놀렌산 오메가-3기일 수 있다. 또한, 아실기는 바람직하게는 오메가-6 아실기일 경우, 아라키도노일(ARA)기, 또는 리놀레산 오메가-6 기일 수 있다. 또한, 상기 아실기가 리놀레노일(18:3)기일 수 있는 가능성도 있다.

또한, 본 발명의 제제의 추가의 실시양태에서, R"는 세린, 콜린, 에탄올아민, 이노시톨 또는 글리세롤 중 하나일 수 있다.

추가의 특정 실시양태에서, R 및 R'의 실체 및 함량을 미리 정한다.

R"가 세린인 화학식 I의 화합물을 포함하는 본 발명의 제제는 인간 뇌 PS로 된 조성물을 모사한다.

그럼에도 불구하고, 또한, 본 발명은 인간 뇌 PS와는 상이하지만, 특히 대두-PS에 비해 여전히 개선된 생활성을 갖는 R"가 세린인 화학식 I의 화합물을 포함하는 제제에 관한 것이다.

종래, 식이 보충제로 사용되는 PS 활성 성분은 동물 뇌, 특히 소 뇌 추출에 의해 생산된다. 인간 뇌 PS에 유사한 동물 뇌 조직으로부터 추출된 PS는 인지질에서 발견되는 오메가-3의 양에 비해 오메가-3 잔기량이 상대적으로 높은 것으로 특성화되는 지방산 조성을 갖는다.

PS는 하기 화학식 II의 구조를 갖는다.

인간 뇌 PS는 바람직하게는, 글리세롤 잔기, 및 주로 DHA 또는 EPA의 sn-2 위치에서 오메가-3 지방 아실을 함유하는 20-30 ％ 초과의 PS에 의해 특성화된다. 앞서 언급한 바와 같이, 인지질, 특히 PS는 막 구조 및 물리적 성질을 담당한다. 인지질에 의해 지배되는 주요 물리적 성질 중 하나는 막의 유동성이다. 또한, 오메가-3 지방산, 특히 DHA 및 EPA는 그들의 유니크한 3D 구조에서 막 유동성에 중대한 역할을 한다. 따라서, 오메가-3 지방 아실 잔기, 특히 DHA 및 EPA를 갖는 PS는 이러한 인지질의 단순한 기초 인지질 골격으로부터는 유래될 수 없는 유니크한 생리활성을 갖는다.

프리온 질환, 특히 소 해면상 뇌증(BSE)과 관련된 위험, 뿐만 아니라 동물 공급원으로부터 얻는 성분과 관련된 다른 단점들을 고려하여, PS 보충물은 대개 대두 레시틴으로부터 유래한 PS를 사용하여 제조된다. 이 레시틴은 대개는 효소적으로 PS가 풍부하다. 이 생산 방법은 소량의 오메가-3 지방산이 소량이고, DHA 및 EPA가 거의 없는 것에 의해 특성화되는 대두 인지질의 지방산 프로파일을 갖는 PS를 제공한다. 또한, 이 PS 활성 성분은 대두-PS로도 공지되어 있다.

비록 인지 기능을 개선하는 대두-PS의 생리활성이 소-PS의 경우와 유사한 것 으로 밝혀졌지만, 인간 뇌 PS와는 여전히 상이하다. 본 발명의 목적은 인간 뇌 PS의 지방산 조성을 모사한 지정된 지방산 조성을 갖는 PS 성분을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 특히 대두-PS에 비해 개선된 기능성에 의해 특성화된 천연 뇌 PS와 동일하지 않은 PS 성분을 제공하는 것이다. 이 개선된 PS 성분은 지정된 지방산 조성을 갖는다.

본 발명의 PS 성분은 오메가-3 지방 아실, 바람직하게는 DHA, EPA 또는 리놀렌산 오메가-3가 풍부하다. 더욱이, 본 발명의 PS는 PS 골격 중 글리세롤 잔기의 sn-1 또는 sn-2 위치 중 어느 한 쪽 또는 양쪽 모두에 공유 결합된 오메가-3 지방 아실이 풍부하다.

또한, 본 발명은 인지질의 글리세롤 잔기의 sn-1 또는 sn-2 위치 중 어느 한 쪽 또는 양쪽 모두에 공유 결합된 오메가-3 지방산, 바람직하게는 DHA, EPA, 또는 리놀렌산이 풍부한 다른 인지질, 예를 들면 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜-이노시톨(PI), 포스파티딜글리세롤(PG) 및 포스파티드산(PA)에 관한 것이며 이들도 기재한다. 별법으로, 본 발명의 인지질은 오메가-6 지방산이 풍부하다.

본 명세서에서 PS를 참조할 때, 예를 들면, 앞서 나열한 극성 지질에 한정되지 않는 기타 지질도 의미하는 것으로 고려되어야 한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PS 성분 중 오메가-3(특히 EPA, DHA 또는 리놀렌산) 또는 오메가-6(특히, ARA 및 리놀레산) 지방산의 양은 sn-1 또는 sn-2 위치 중 한쪽 또는 양쪽 모두, 바람직하게는 sn-2 위치에서 10 ％ 초과, 바람직하 게는 20 ％ 초과, 가장 바람직하게는 40 ％ 초과이다.

언급한 바와 같이, 원하는 오메가-3/오메가-6 지방 아실은 sn-1 및 sn-2 위치 중 양쪽 모두 또는 오직 하나에서 결합될 수 있다.

본 발명의 PS 제제 중 지방산 조성은 정상의 건강한 인간 뇌에서 발견되는 지방산 조성과 유사하거나 상이한 지정된 지방산 조성을 가질 수 있으며, 특히 식물 PS, 예를 들면 대두-PS의 활성에 비해 강화된 활성을 갖는다.

본 발명의 오메가-3/오메가-6 풍부 PS 제제의 제형화는 효소적 방법, 화학적 방법 또는 분자생물학적 방법에 의해 이루어질 수 있다. 간략히, PS는 효소적 과정, 예를 들면 효소적 에스테르교환/에스테르화 후, 헤드 기를 세린(PLD 효소 사용)으로 변형시켜 PS-오메가-3/오메가-6 공액화물을 얻는 천연 인지질/레시틴의 오메가-3 지방산 풍부화에 의해 오메가-3 또는 오메가-6 잔기가 풍부해질 수 있다. 또 다른 효소적 경로는 천연적으로 오메가-3 산, 예를 들면 크릴 인지질이 풍부한 레시틴 또는 인지질 공급원을 얻고, 그들의 헤드 기를 세린으로 변형시키는 것이다. 이 방법에 의해 얻어진 PS의 지방산 조성물이 선택원(어류, 크릴, 조류 등)에 의해 지정된 오메가-3 조성물을 갖는다는 점이 주목되어야 한다. 이러한 방법은 IL158553으로부터 우선권을 주장하는 본 출원인의 함께 계류 중인 PCT 출원에 상세하게 기재되었다.

또한, 본 발명의 PS-오메가-3/오메가-6 성분은 sn-1 및 2 위치에 풍부한 오메가-3 또는 오메가-6 아실 잔기를 갖게 되는 화학적 에스테르교환/에스테르화 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 PS-오메가-3 및 PS-오메가-6의 제조 방법은 IL158553으로부터 우선권을 주장하는 본 출원인의 함께 계류 중인 PCT 출원에 기재되었다.

별법으로, 본 발명의 PS 성분은 GMO(유전자 변형 유기체)/생명공학 방법, 예를 들면, 인지질 형성 유기체에 오메가-3 또는 오메가-6 지방산을 제공하여 오메가-3 또는 오메가-6 PS가 풍부한 인지질을 얻는 것에 의해 제조될 수 있다. 동물성 공급원의 사용을 피하기 위해 유전자 변현 식물 또는 미생물을 사용하는 것도 바람직할 수 있다.

본 발명의 PS는 상대적으로 오메가-3 또는 오메가-6 지방산이 풍부한 특수 레시틴 원료의 오메가-3 또는 오메가-6 지방산 조성물을 가지며, 풍부한 PS는 대두-PS에 비해 상승된 오메가-3 또는 오메가-6 지방산 수치를 갖는 PS 성분을 생성한다. 이는 예를 들면, 크릴로부터의 인지질을 상기와 같이 출발 물질로서 사용한 경우이다.

바람직한 실시양태에서, 오메가-3 또는 오메가-6가 풍부한 PS는 식물, 동물, 예를 들면 크릴, 또는 미생물 공급원으로부터의 대두-PS 또는 기타 PS일 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 오메가-3 또는 오메가-6의 풍부화는 레시틴 상에서 수행되어 이로써, 트란스포스파티딜화에 의해 PS가 풍부해진다.

본 발명의 목적은 오메가-3 지방산이 풍부하여 천연 또는 단순히 풍부한 PS를 함유하는 성분에 비해 개선된 효능을 갖는 성분인 신규한 PS 성분을 제공하는 것이다.

본 발명의 개선된 PS 제제는 인지 및 정신 상태 및 장애의 개선 및 치료, 뿐 만 아니라 뇌 관련 시스템 및 과정의 정상 기능의 유지에 강화된 활성을 나타낸다. 이들은 ADHD, 다발경화증(MS), 읽기장애, 우울증, 학습 능력, 뇌파 강도, 스트레스, 정신 및 정신과 장애, 신경학적 장애, 호르몬 장애, 집중력 및 주의력, 기분, 뇌 글루코오스 사용도, 및 일반적 인지 및 정신적 안녕을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 신규한 지질 제제는 이하 상술되는 바와 같이 오메가-3 또는 오메가-6 지질 자체 또는 대두-PS에 비해 인지 기능 개선 강화된 활성을 나타낸다. 더욱이, 특정한 조건 하에서 또는 모든 또는 특수 장애에 대해, 본 발명의 지질 제제는 일일 100 mg 미만의 투여량에서 유효하다. 이는 현재 시장에서 입수가능한 대두-PS(일일 100-300 mg) 또는 오메가-3 지질(대략 일일 1-2 g 이상)의 현재 권장되는 일일 투여량보다 낮다. 그럼에도 불구하고, 일일 100-600 mg의 투여량이 발명의 지질 제제의 강화된 효능에 바람직하다.

본 발명의 PS 제제의 중요한 이점은 다기능성 활성을 나타낸다는 것이다. 이 다기능성은 다른 건강 장애 또는 상태의 개선과 함께 인지 및 정신 기능의 개선에 의해 나타난다.

이 PS 성분의 강화된 활성, 뿐만 아니라 그의 다기능성은 이 성분의 유니크한 구조 및 그의 뇌 세포막 조직, 뿐만 아니라 다른 기관 및 조직의 물리적 및 화학 성질에 대한 영향으로부터 발생할 수 있다.

또한, 이 PS 성분의 강화된 활성, 뿐만 아니라 그의 다기능성은 오메가-3 지방산의 PS 골격 내 혼입으로 인한 강화된 생체이용률로 인한 것일 수 있다. 따라 서, 오메가-3 지방산은 혈액-뇌 장벽을 용이하게 통과하는 PS 분자의 일부로 혈액-뇌 장벽을 통해 뇌로 전달될 수 있다. PS는 다양한 기관 및 조직에 대해 이에 결합된 지방산에 대한 전달 플랫폼으로 기능함으로써 그들의 생체이용률을 강화시킨다.

본 발명의 다기능성 PS 제제에 의해 영향받을 수 있는 추가적인 건강 장애 또는 상태는 혈중 고 콜레스테롤 수치, 고 트리글리세리드 수치, 혈중 고 피브리노겐 수치, HDL/LDL 비, 당뇨, 대사 증후군, 폐경 또는 폐경후 상태, 호르몬 관련 장애, 시력 장애, 염증 장애, 면역 장애, 간 질환, 만성 간염, 지방증, 인지질 결핍, 지질 과산화, 세포 재생의 리듬장애, 세포막의 탈안정화, 관상동맥 질환, 고혈압, 암, 고혈압증, 노화, 신장 질환, 피부 질환, 부종, 위장 질환, 말초 혈관계 질환, 알레르기, 기도 질환, 신경퇴행 및 정신과 질환을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 신규 성분은 전달될 수 있고, 다양한 제품에서 사용될 수 있다. 이러한 제품은 식이 보충제, 기능성 식품, 약제 전달 시스템 등을 포함한다.

제약 조성물의 제형화는 당업계에 공지되어 있으며, 많은 문헌 및 교과서(예를 들면, 문헌[Gennaro A. R. ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, and especially pages 1521-1712 therein] 참조)에 기재되었다.

식이 보충제로서, 본 발명의 제제는 연질 겔 캡슐, 정제, 시럽 및 다른 통상의 식이 보충 전달 시스템의 형태로 사용될 수 있다.

기능성 식품으로서, 본 발명의 제제는 다양한 식품, 예를 들면 유제품, 아이 스크림, 비스켓, 콩제품, 페이스트리 및 빵, 소스, 조미료, 오일 및 지방, 마가린, 스프레드, 시리얼, 음료 및 쉐이크, 유아 이유식, 유아 식품(비스켓, 메쉬드 채소 및 과일, 시리얼), 바, 스낵, 캔디, 초콜릿 제품에 혼입되고 사용될 수 있다.

제약 생성물로서, 본 발명의 제제는 경구, 정맥내, 또는 기타 통상적인 또는 특수 투여 경로에 의해 전달될 수 있다.

본 발명의 신규 제제는 유체 오일, 분말, 과립, 왁스, 페이스트, 오일 또는 수성 에멀션 및 그의 표적 용도를 가능케 하는 기타 형태의 형태일 수 있다.

본 발명의 PS 제제를 포함하는 제약상 또는 영양약학상 제제는 생리학적으로 허용되는 자유 유동제, 다른 첨가제, 부형제, 흡습제 및 희석제, 착색제, 향기 및 풍미 성분, 및 물리적, 관능 및 다른 성질을 조절하는 임의의 성분, 뿐만 아니라 추가적인 활성 성분, 예를 들면 무기질, 비타민, 다른 영양 첨가제를 포함할 수 있다.

다양한 분야에서, 특히 기능성 식품의 성분으로서 오메가-3 지질을 사용하는 것은 그들의 독특한 비린내로 인해 제한된다. 따라서, 본 발명의 오메가-3가 풍부한 인지질 성분의 또 다른 이점은 이들 기가 PS 골격에 공유 결합함으로써 오메가-3 아실 잔기 냄새 또는 풍미가 감소된다는 것이다. 이는 이들 물질의 증기압을 증가시켜 그들의 독특한 향기를 감소시킨다. 따라서, 오메가-3 지방산의 인지질 골격, 특히 PS에 대한 공유 결합은 그들의 풍미 성질을 변화시키고 개선시킨다. 또한, 본 발명의 PS 성분도 산화 감응성 오메가-3 지방산에 강화된 안정성을 제공한다. 일반적으로, 인지질 및 특히, PS은 항산화제 및 안정화제로 작용하는 것으로 공지되어 있다.

이러한 이익은 다양한 분야, 특히 기능성 식품에서 본 발명의 지질 제제를 매우 유리하고 중요하게 하며, 이 경우 안정성, 향기 및 풍미는 근본적인 요건이다.

더욱이, 이들 신규한 성분은 심지어 생리활성 및 효능 강화를 위해 추가적인 지질을 사용하여 제형화될 수 있다.

PUFA의 극성 지질 유도체, 예를 들면 PS-PUFA 유도체는 제제로서 및 또한 본 발명의 임상 시험에서 사용된 몇몇 식품 분야에서 높은 안정성을 나타내었다. 이러한 감응성 화합물의 안정성은 종래 방부제로 사용되는 것으로 공지된 인지질 및 불안정한 PUFA 잔기의 공유 조합으로부터 나타난다.

본 발명의 신규 성분은 전달되고 다양한 제품에서 사용될 수 있다. 이러한 제품은 식이 보충제, 기능성 식품, 약제 전달 시스템 등을 포함한다.

개시되고 기재된 본 발명은 특정 실시예, 방법 단계 및 본 명세서에 개시된 물질에 한정되지 않으며, 이러한 방법 단계 및 물질들이 다소 변화될 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시양태만을 설명하기 위해 사용된 것이고, 본 발명의 범위는 오직 첨부되는 청구 범위 및 그의 등가물에 의해서만 한정되기 때문에 본 발명을 이에 제한하려는 것이 아니라는 점이 이해되어야 한다.

본 명세서 및 첨부되는 청구 범위에서 사용된 단수 형태는 내용상 달리 언급이 없으면 복수도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

내용상 달리 언급이 없으면 하기 본 명세서 및 청구 범위 전체에서, 단어 "포함하다", 그의 변형, 예를 들면 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 완전체 또는 완전체 또는 단계의 단계 또는 군을 포함하지만 기타 완전체 또는 완전체 또는 단계의 단계 또는 군은 제외한다는 점을 내포하는 것으로 이해된다.

하기 실시예는 본 발명의 측면들을 실시하는 데에 본 발명자들이 사용한 기술의 대표예이다. 이러한 기술들은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 실시양태를 예시한 것이라는 점이 이해되어야 하며, 당업자는 본 개시내용에 비추어 본 발명의 실시사상 및 의도된 범위로부터 벗어남이 없이 다수의 변형들이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

실시예 1

방법:

동물 및 식이요법

동일한 콜로니로부터 유래한 수컷 위스터(Wistar) 쥐를 할렌(Harlen)으로부터 얻었다. 50 마리의 쥐를 정상 식이 외에 다음의 5가지 식이 보충 군으로 랜덤하게 나누었다: (i) 0.1 g의 매질-쇄 트리글리세리드(MCT)/1 ml 보충 매트릭스(MCT군) 공급 군; (ii) 0.1 g의 DHA/EPA(총 지방산 조성 20/30, MCT로 희석시켜 30 ％(w/w) LC-PUFA 화합물 생성) 트리글리세리드/1 ml 보충 매트릭스(LC-PUFA 군) 공급 군; (iii) 0.1 g의 대두 레시틴 유도 PS(20 ％ SB-PSw/w)/1 ml 보충 매트릭스(SB-PS군) 공급 군; 및 (iv) 0.1 g의 PS-ω3(20 ％ PS w/w, 및 총 LC-PUFA 조성 30 ％ )/1 ml 보충 매트릭스(PS군) 공급 군. 보충 매트릭스를 - 20 ℃에서 저장하고, 매일 신선한 부분을 쥐에게 공급하였다. 모든 보충물을 지방산의 산화를 최소화하도록 취급하였다. 쥐는 식이 및 물을 임의로 소비하였다. 모든 쥐들을 온도가 24 ± 0.5 ℃에서 유지되고, 상대습도가 65 ± 5 ％에서 유지되며 12 시간의 빛 및 어둠이 제공되는 표준 환경에서 주거하게 하였다. 체중을 치료 기간의 시점 및 종점에서 측정하였다.

이 연구에 사용된 PS-ω3 화합물은 그의 DHA 함량(20 ％)을 기준으로 포유류 뇌 PS의 지방산 조성물을 모사한다. 일반적으로, 동물 세포에서, PS의 지방산 조성물은 조직마다 다르며, 생합성을 위한 특수 분자 종의 선택적 사용 또는 탈아실화-재아실화 반응을 통한 지질의 리모델링으로 인해 전구체 인지질과는 흡사하지 않은 것으로 보인다. 인간 혈장에서, 1-스테아로일-2-올레일 및 1-스테아로일-2-아라키도노일 종이 우세하지만, 뇌 및 많은 다른 관련 조직에서는 1-스테아로일-2-도코사헥사에닐 종이 매우 풍부하다(문헌[O'Brien et al. (1964) J Lipid Res. 5(3): 329-38] 참조). 야부치(Yabuuchi) 등(문헌[Yabuuchi et al. (1968) J Lipid Res. 9 (1): 65-7] 참조)에 의한 초기 연구는 소 회색질 중 DHA 함량이 총 지방산 조성 중 30 ％ 이하이고, DHA 총량의 대부분이 sn-2 위치(60 ％)에 위치했다고 밝혔다. 1980년대 초 토파노(Toffano) 및 브루니(Bruni)가 중추 신경계에서 노화 관련 변화를 중화시키는 약리학상 활성 화합물인 것으로 보고한 것은 소 뇌 PS였다[Toffano et al. (1980) Pharmacol. Res. Commun. 12:829-845].

행동 시험

모리스[Stewart, CA. and Morris, RG. (1993) The water maze. In: Behavioural Neuroscience: A Practical Approach. Vol. 1 (Saghal, A. , ed. ), pp. 107-122. Oxford University Press, New York, NY.]에 의해 개발된 물 미로 시험은 불투명한 백색 플라스틱으로 구성된 원형 탱크(137 cm 직경, 35 cm 깊이)를 사용한다. 이를 깊이 28 cm까지 물(21-22 ℃)로 채우고, 가용성 비독성 백색 라텍스 페인트를 첨가함으로써 물을 불투명하게 한다. 미로의 공간 형식에서, 쥐는 여분 미로 자극(extra-maze cue)의 공간 지도를 개발한 다음, 플랫폼을 위치시키는 데 사용한다. 따라서, 플랫폼까지의 유영 거리 및 시행 시간은 쥐가 플랫폼의 위치를 학습함에 따라 시험 회기(일) 경과에 따라 감소해야 한다. 또한, 쥐가 여분 미로 자극과 관련한 플랫폼의 위치를 학습한 경우, 탐침 시험에 대한 그의 초기 반응은 플랫폼을 찾을 것으로 예측되는 사분면으로 바로 나아갈 것이라는 점이 예상된다. 따라서, 표적 사분면에서의 유영 거리 (및 소비 시간)는 다른 두 개의 사분면(출발 사분면 제외)의 경우보다 커야 한다. 플랫폼까지의 유영 거리, 뿐만 아니라 플랫폼에 도달하기까지의 잠복기를 비디오 기초 트래킹 시스템을 사용하여 모니터링하였다. 행동 시험을 어둠 주기 동안 수행하였고, 이때 쥐는 대개 정상적 활성을 가졌다.

풀을 많은 여분 회로 공간 자극이 존재하는 시험실에 위치시켰다. 처음 3일동안, 쥐에게 물 표면 아래 1 cm 밑에 위치한 숨겨진 플랫폼(15.5 cm x 15.5 cm)을 위치시키도록 요구하였다. 일일 두 번의 습득 시험 회기와 회기 당 4 번의 시험이 있었다. 각각의 시험에서, 쥐를 탱크 중 4 개의 사분면 중 하나에 벽을 마주보게 위치시키고, 최대 60 초 동안 돌아다니게 하였다. 쥐가 플랫폼을 발견한 후, 가열 피드 상에서 따뜻하게 유지되는 우리로 돌려보내기 전에 5 초 동안 그대로 두었다. 쥐가 이 시점에서 플랫폼을 찾지 못한 경우, 우리로 돌려보내기 전에 5 초 동안 그 위에 위치시켰다. 매일 수행된 각각 8 개의 시험을 의사랜덤하게(동일한 사분면으로부터 2번은 아님) 순서를 정하고 매일 바꿔서 상이한 사분면으로부터 출발하였다. 한 시험의 끝으로부터 다음 시험의 개시점까지 센 시험간 간격(ITI)은 120 초였다. 4일째, 상기한 한 회기 후, 플랫폼을 탱크로부터 제거하고, 플랫폼의 반대쪽 사분면에 쥐를 위치시킨 다음, 이들 60 초 동안 돌아다니게 함으로써 탐침 시험을 수행하였다. 탐침 시험 다음날, 쥐를, 미로를 상기와 같이 설정한 회기에서 시험한 후, 플랫폼을 반대쪽 사분면의 중앙에 재위치시킨 회기를 사용하여 시험하였다. 각각의 시험에서 플랫폼을 찾는데 걸린 잠복기를 기록하였다. 상기 시험 전 스코폴라민(1 mg/Kg)을 30 분간 복막내(i.p.) 투여하였다.

지질 추출 및 NMR 분석

행동 시험 말기에, 쥐를 할로탄(Halothane)으로 마취시킨 다음, 무력화시켰다. 간 및 뇌 조직을 신속하게 제거하고, 저장하였다(-80 ℃). 블라이(Bligh) 및 다이어(Dyer) 1959[Bligh and Dyer, (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917]에 의해 설명된 기술의 변형된 형식을 사용하여 쥐 조직 중 지질 분획을 추출하였다. 간략히, 각각 500-700 mg 및 300-1200 mg의 간 및 뇌 조직을 CDCl₃, 메탄올 및 CS-EDTA(1:2:2 v:v:v)의 용액 중에서 균질화하였다. 균질화물을 초음파 배 쓰(10 분, 80 ℃)를 사용하여 추가 교반한 후, 추가적으로 격렬하게 진탕하였다(20 분). 균질화물 중 인지질의 상대비를 121.MHZ에서 고 해상도 ³¹P-NMR을 사용하여 7.06 테슬라 제네랄 일렉트릭(Tesla General Electric) 분광계를 사용하여 측정하였다.

이 균질화물을 그들의 지방산 분포에 대해 추가 분석하였다. 먼저, 지질 추출물을 RP-18 컬럼(문헌[Williams et al. (1980) J. Neurochem.; 35, 266-269] 참조)을 사용하여 역상 크로마토그래피에 의해 탈염시키고, 컬럼에 충전시키기 전 내부 표준으로서 디헵타데카노일 포스파티딜콜린을 첨가하였다. 인지질을 이소헥산:에테르:포름산 80:20:2(v:v:v)으로 발현되는 실리카겔 판(머크(Merck) 60) 상에서 중성 지질, 예를 들면 콜레스테롤로부터 분리하였다. 프리뮤린(primulin) 용액을 분사함으로써 인지질 지점을 가시화하고, 진정한 인지질 표준과 비교하였다. 헤니카소노익(Henicasonoic) 메틸 에스테르(C21:0)를 제 2 내부 표준으로서 첨가하고, 인지질을 밤새 50 ℃에서 1 ％ 메탄올성 H₂SO₄를 사용하여 온화한 산 가수분해 메틸 에스테르로 전환시켰다. 상이한 샘플로 된 지방산 프로파일을 기상-액상 크로마토그래피에 의해 결정하였다.

결과

문헌[Kidd P. (1996) Alt Med Rev. 1(2): 70-84]에 의해 검토된 몇몇 이중 맹검, 위약-대조군 연구에 의해 소 뇌 피질 유도 PS(BC-PS)의 항치매 효과를 입증하였다. 지난 10 년간, BC-PS 및 대두 레시틴 트란스포스파티딜화 PS(SB-PS) 양쪽 모두는 이들 화합물 사이에 지방산 조성이 상당히 상이함에도 불구하고 설치류에서 스코폴라민 유도 기억상실을 회복하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Zanotti A et al. (1986) Psychopharmacology (Berl). 90(2):274-5.; Claro F. et al. (1999) Physiol Behav. 67(4):551-4; Sakai M. (1996) Nutr Sci Vitaminol. (To/eyo) 42(1):47-54; Furushiro M et al. (1997) Jpn J Pharmacol. 75(4):447-50] 참조). 비록 푸루시로(Furushiro) 등은 스코폴라민의 기억상실 효과를 길항하는 SB-PS의 경구 투여도 기재하였지만, 이들 연구에서 PS 투여 수단은 주로 정맥내 또는 복막내였다. 그러나, 후기 연구에서, 연구자들은 60 내지 240 mg/Kg 범위의 상당한 고용량의 SB-PS를 사용하였다.

상기 제공된 연구에서, 쥐 식이를 미로 시험을 수행하기 전 3 개월 동안 상기 치료제로 보충하였다(식이 i, ii, iii, iv 및 v). 습득 단계에서(도 1A-1D), 모든 군에 스코폴라민(1 mg/Kg) 투여 후 플랫폼을 찾는 잠복기가 예측된 현저한 증가가 존재한다. 비록 MCT군 및 PS-ω3군의 잠복 곡선이 유사하지만, 통계적으로는 MCT군에 제공된 잠복기에 비해 PS-ω3군에서 스코폴라민에 의해 유도된 잠복 변화에서 더 적은 차이가 존재하였다(각각 P-값 < 0.07 Vs. P-값 < 0.0007). 유사하게, SB-PS 또는 LC-PUFA로 처리한 군은, MCT군에 비해 그들의 학습 곡선에 대해 감소된 스코폴라민의 효과를 나타내었다(도 1A-1D 참조). 모든 군들이 유사한 속도로 과제를 학습했으므로, 물 미로 시험에서 상이한 공급원들로부터 얻은 PS와 빈 비히클 사이에 차이가 없음을 나타내는 블록랜드(Blokland) 등[Blokland et al. (1999) Nlltrition 15(10):778-83]에 의해 제공된 데이터는 유사하다.

본 시험에 특별한 것은 스코폴라민 진정작용 하에서 과제를 학습하는 데 있어서의 가속화된 속도이다. 이는 종래 입증되지 않았다(문헌[Furushiro et al. (1997) id ibid.; Suzuki et al., (2000) Jpn. J. Pharmacol. 84, 86-8] 참조). 이들 연구에서, 설치류가 상이한 과제(수동 회피)를 직면하였음을 주목하라. 문헌[Suzuki et al. 2001 (J. Nutr. 131:2951-6)]에서, 연구자들은 본 시험에서 시험된 것보다 상당히 노화된 쥐(24-25 개월)를 사용하였다. 습득 단계에서의 잠복기는 시험되는 어린 것들(8 주)에 비해 노화된 쥐의 경우가 상당히 길었다. 흥미롭게도, 비록 진정제 비처리 쥐의 본 시험에서의 잠복기가 스즈키(Suzuki) 등에 의한 문헌[Suzuki et al. (2001) id ibid.]에 의해 시험된 어린 쥐와 다소 동등하였지만, MCT군에서의 스코폴라민 유도 기억상실 잠복기는 노화된 쥐에 대한 기재된 연구에서 얻어지는 것과 유사하다. 결론적으로, 스코폴라민은 대조군(MCT)과 동등한 긴 잠복기를 유도하였다. 이 효과는 PS 또는 LC-PUFA를 사용한 쥐의 장기 치료에 의해 상이한 수준으로 증대되었다.

탐침 시험에서, 과제의 습득(도 2) 동안 플랫폼이 위치한 대역에 존재하는 PS-ω3으로 처리한 쥐들은 MCT 처리군보다 현저히 높은 성향을 나타내었으며(P < 0.085), 이는 쥐들이 플랫폼의 공간 위치를 학습하였음을 시사하였다. 또한, PS-ω3 처리 쥐는 주변 대역에서 돌아다니는 성향이 감소했으며(P < 0.08), 오히려 중앙 대역에서 지냈다. PS-ω3군에 의해 제공된 이러한 후반 적응증은 높은 모험적 특징에 관련되고, 개방 현장 행동 시험과 다소 상관될 수 있었다. 흥미롭게도, 블록랜드 등의 문헌[Blokland et al. (1999) id ibid.]에서, BC-PS 처리 마우스는 중 앙 구역에서 시간을 덜 보냄으로써 개방 현장 행동 시험에서 덜 모험적이라는 크진 않지만 뚜렷한 성향을 나타냈다. PS-ω3으로 처리된 쥐에 의해 나타나는 뛰어난 학습 능력에 대해, 공간 탐침 시험 중 모리스 물 미로 시험에서 그들의 행동을 스즈키 등의 문헌[Suzuki et al(2001) id ibid.]에 의한 SB-PS 처리 동물에 의해 얻어진 것과 비교한 결과는 흥미롭다. 플랫폼이 위치한 사분면에서 소비 시간의 ％가 유사하지만(~45 ％), 본 연구에서의 투여량이 스즈키 등 2001에서의 투여량의 불과 3분의 1이었다는 점이 괄목할만하다(각각 20 mg/kg vs. 60 mg/kg). 실로, 본 연구에서는 MCT 처리군에 의해 얻어진 값에 비해 이 사분면에서 지낸 SB-PS(20 mg/kg) 처리 쥐의 시간상 변화는 크지 않았다[각각 도 1C 및 도 1A 참조]. 요약하면, PS-ω3 처리군 학습 능력은 상당히 낮은 PS 투여량에서 대조군보다 현저히 높았다. 또한, PS-ω3 처리 쥐는 플랫폼의 부재 하에서 미로 연구시 덜 조심스럽고 더 모험적이었다.

최종적으로, 본 연구에서 얻은 가장 탁월하고 두드러진 데이터는 플랫폼의 재위치에 대한 반응이었다. 모든 군은 스코폴라민 진정작용(도 3A-3D) 하에서 제 1 회기에서 플랫폼을 찾는 데 MCT 처리군에 의해 얻어진 것에 비해 짧은 잠복기를 나타내었다. 이들 데이터는 LC-PUFA, 더욱 가능하게는 PS가 종래 다른 연구(상기 선택된 참고문헌 참조)에 의해 제공된 바와 같이 스코폴라민 유도 기억상실을 완화시킬 수 있다는 것을 제시한다.

놀랍게도, 제 2 회기에서, PS-ω3 처리군을 제외한 모든 군에서 플랫폼의 재위치 후 이를 찾는 잠복기에서는 차이가 없었다. 사실상, PS-ω3을 제외한 모든 치료제에서는 플랫폼 위치의 학습 방법이 없는 것으로 보였다. PS-ω3군은 크게 상이한 행동을 제공하였으며, 항무스카린제로 처리한 쥐에서 재위치된 플랫폼의 학습에서는 지체가 없는 것으로 보였다. 재위치 후 플랫폼을 위치시키는 PS-ω3 처리군의 능력은 쥐들이 제 3 사분면에 대한 선호를 나타내는 공간 탐침 시험(도 2)에서 앞서 얻어진 결과와 모순되는 것으로 보였다. 피어스(Pearce) 및 동료들에 의한 문헌[Pearce et al. (1998) Nature 396:75-77]은 특수 공간 위치를 암기시키는 두 수단을 설명함으로써 이 불일치를 해결하려고 시도하였다. 하나는 물체와 몇몇 경계표 사이의 기하 관계에 대한 정보를 코딩하는 인지 지도를 사용하는 것(인지 지도 방법)이고, 다른 하나는 방향 및 한 경계표로부터 물체까지의 거리를 특정하는 헤딩 벡터(heading vector)를 사용하는 것이다(헤딩 벡터 방법). 본 시험에서, 쥐는 상기 자극 및(또는) 벽을 기준한 거리 및 방향으로부터 플랫폼을 위치시킬 수 있었다. 습득 및 공간 탐침 시험에서, 양쪽 방법은 플랫폼을 찾는 점수에 기여하였다. 그러나, 재위치 시험에서, 헤딩 벡터 방법에 관련된 인지 능력 및 단기 기억력(실행가능한 기억력)으로 차이가 생겼다. 헤딩 벡터 방법은 벽으로부터의 거리가 재위치화에(단지 사분면) 의해 영향받지 않기 때문에, 이미 조사된 구역을 암기하는 데에서의 이익으로 인한 실행가능한 기억력은 풀에서 유효한 탐색을 가능케 하였다.

종래, PS가 스코폴라민 효과를 약화시키는 기전이 콜린성 회로에 유리한 효과에 기여할 수 있을 뿐 아니라, PS도 세로토닌 신경세포 시스템에 효과적이라는 점이 보고되었다(문헌[Furushiro et al. (1997) id ibid.] 참조). 본 데이터는 하 나 이상의 신경세포 시스템 변화, 가능하게는 도파민성 변화의 결과일 수 있는 것으로 보인다. 초기 연구(문헌[Drago et al. (1981) Neurobiol Aging, 2 (3):209-13]에서, 대조군에 대한 BC-PS 처리 노화된 쥐 사이에서 얻어진 행동 변화에서의 변화는 상기와 같은 콜린성 및 세로토닌 전달에서의 변화에 기여할 수 있을 뿐만 아니라 카테콜라민(도파민 유사) 시스템에 영향을 미침으로써 기여할 수 있다. 이 연구에서, 셔틀 박스 및 폴 점핑(pole jumping) 시험 상황에서 연구된 능동 회피 행동의 촉진된 습득 및 능동 및 수동 회피 반응의 보유는 PS 처리 쥐에서 개선되었다. 트사키리스(Tsakiris)[Tsakiris, S. (1984) Z Naturforsch [C], 39(11-12): 1196-8]는 막 유동성 기전을 통한 도파민 관련 아데닐일 시클라아제에 대한 PS의 간접적인 효과를 보고하였다. 또한 흥미롭게도, 문헌[Chalon, et al. (1998) J Nutr.; 128(12):2512-9]에서는 많은 양의 (n-3) PUFA가 풍부한 식이요법이 피질 도파민 기능에 효과적일 수 있다고 보고하였다. 인지질의 골격 상의 LC-PUFA의 존재가 이러한 다중-신경 전달 물질 기전의 측면에서 매우 유리한 것으로 생각된다.

본 결과의 간 조직(도 4A)에서의 생화학적 분석은 3 개월 동안 PS로 보충된 쥐(SB-PS 및 PS-ω3)에서 프라이머 인지질, 즉 포스파티딜콜린(PC) 수치의 상당한 증가가 있었음을 보여주었다. 이 데이터는 인지질 섭취 및 대부분의 지방산의 주요 대사에서의 간 및 그의 주요 역할에 관한 초기 관측과 일치한다. 위젠드란(Wijendran) 및 동료들[Wijendran et al. (2002) Pediatr. Res. 51:265-272]은 비비에게 PC 및 트리글리세리드의 골격에 표지된 LC-PUFA를 공급한 연구를 기재하고, 인지질 골격에서 간에 대한 LC-PUFA 혼입 수치가 트리글리세리드 골격에서의 LC- PUFA 혼입 정도보다 높았다는 것을 나타내었다. 또한, 인지질 분포의 피질 조직 분석(도 4B)에서 PS-ω3 처리 쥐의 PS 수치는 MCT에 비해 상승되었다. 흥미롭게도, 이러한 뇌피질의 인지질 지방산 프로파일(표 1)은 PS-ω3 처리 쥐의 DHA 함량의 현저한 상승을 나타내었다(P=0.007). LC-PUFA 공급 쥐에 대해 유사한 상승이 나타났지만 PS-ω3 치료(각각 14.6 대 17.5, P=0.03) 및 MCT(각각 14.6 대 12.3, P=0.02)에 비해 정도가 적었다. 두 오메가-3군 사이의 DHA 수치의 차이는 트리글리세리드 골격이 아닌 인지질의 골격에 에스테르화된 경우 DHA의 강화된 생체이용률을 제시할 수 있다. 레마이트레-델라우나이(Lemaitre-Delaunay) 및 동료들[Lemaitre-Delaunay et al. (1999) J. Lipid Res.; 40:1867-1874]이 트리글리세리드 대 그의 리소프스파이티딜콜린(lysophsphaytidylcholine)에서의 풍부함에 대한 반응속도론 및 표지된 DHA의 대사성 파멸에 대해 연구했을 때와 상기 비비 연구에서 위젠드란 등[Wijendran et al. (2002) id ibid.]에 의해 유사한 결론이 도출되었다.

흥미롭게도, PS-ω3 및 LC-PUFA 공급 쥐 양쪽 모두의 뇌피질에서의 DHA 함량 증가는 인지질 분획에서 다소 낮은 정도의 리놀레산(표 1)으로 올레산 수치의 통계적으로 유의한 감소와 동반되었다. 지방산 프로파일 비의 유사한 변화는 설치류에게 LC-PUFA가 풍부한 식이 지방을 공급함으로써 다른 것들에 의해 나타났다(예를 들면, 문헌[Yamamoto et al. (1987) J. Lipid Res. 28:144-151] 참조). SB-PS군은 MCT군과 매우 유사한 프로파일을 나타내었다.

요약하면, 스코폴라민 진정작용 하에서 PS-ω3 처리 쥐의 모리스 물 미로 시 험에서의 개선된 성능은 항치매제로서의 PS-ω3의 효능 및 노화 관련 기억력 결함 효과를 강하게 뒷받침하였다. 이러한 인지 강화는 간 및 뇌 조직에서 상승된 인지질 수치의 생화학적 증거(도 4A-4B)와 PS-ω3 공급 쥐의 피질로부터 인지질에 부착된 DHA의 상승된 수치에 의해 추가로 뒷받침된다.

하기 표 1은 노화된 위스터 쥐로부터의 대뇌 인지질에서 지방산 프로파일에 대한 상이한 공급원으로부터의 식이 LC-PUFA의 효과를 요약한다. 정제된 인지질 분획으로부터 지방산을 기상-액상 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 주요 지방산을 인지질 중 총 지방산의 ％로 표현한다. 값들은 처리 당 4마리 상이한 쥐들의 평균 ± S. D.로 나타낸다. 상이한 보충군과 MCT군 사이의 통계적 유의성은 다음과 같이 제공된다: * P < 0.05; ** P < 0.01.

실시예 2 - ADHD 어린이의 치료시 PS-오메가-3

주의력 결핍/과잉행동 장애(ADHD)는 광범위한 무리의 행동 및 학습 문제점을 포함하며, 그의 정의 및 진단은 여전히 논의의 여지가 있다(문헌[Kamper (2001) J. Pediatr. 139:173-4; Richardson et al. (2000) Prostaglandius Leukot. Eussent. Fatty Acids, 63 (1-2):79-87] 참조). ADHD의 원인은 복잡하고 다인성인 것으로 인정되고 있다. 통상적으로, ADHD는 주의력이 부족하고, 충동적이고(이거나) 과잉행동성을 갖는 어린이를 설명하는 데 사용되는 진단이다. ADHD를 갖는 어린이 중 대략 20-25 ％가 수학, 읽기 또는 철자에서 하나 이상의 특수 학습 장애를 나타낸다(문헌[Barkley, R. A. (1990) Attention-deficit hyperactivity disorder: a handbook for diagnosis and treatment. New York: Guilford Press] 참조). ADHD를 갖는 어린이는 종종 학업 수행 및 주의력을 기울이는 데 어려움을 겪으며, 혼란스러워지고, 자기 훈련이 떨어지고, 자부심이 떨어질 수 있다. 보수적인 추정으로는 취학 집단 중 3-5 ％가 ADHD를 갖는다고 한다[American Psychiatric Association. Diagnostic 및 statistical manual of mental disorders. 4th ed. (DSM-IV) Washington, DC: American Psychiatric Association, 1994]. ADHD의 치료는 행동 치료 및 의약, 주로 메틸페니데이트(리탈린(Ritalin)^TM)를 포함한다. 종종 각성제 및 항우울제를 사용하여 ADHD를 갖는 어린이를 얌전하게 하며, 이때 효율은 ~75 ％이다(문헌[Swanson et al. Except Child 1993; 60: 154-61] 참조). 이러한 의약 사용으로 인한 이점은 신속한 반응, 사용 용이성, 유효성 및 상대적 안정성을 포함한다. 단점은 식욕 감퇴 및 성장을 비롯한 가능한 부작용, 불면증, 성급함 증가, 및 약물이 떨어진 경우 과잉행동의 복귀를 포함한다(문헌[Ahmann et al. (1993) Pediatrics; 91:1101-6] 참조). 또한, 이러한 의약은 ADHD의 근원적인 원인을 해결하지 못한다. 따라서, ADHD에서 행동 문제에 대한 잠재적 공여체를 밝히고자 하는 연구는 일부 어린이에 대해 더욱 유효한 치료 전략을 제공할 수 있다.

오메가-3 지방산은 중추 신경계 기능을 유지시키는 데에 특이적으로 관련된다. 쥐 및 원숭이에서 n-3 지방산의 결핍은 행동, 감각, 및 신경학적 이상과 관련되어 있었다(문헌[Yehuda et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 90:10345-9; Reisbick et al. (1994) Physiol. Behav. 55:231-9; Enslen et al. (1991) Lipids; 26:203-8] 참조). 몇몇 연구들은 ADHD를 갖는 어린이에서 필수 지방산 대사에 초점을 맞추었다[Colquhoun et al. (1981) Med Hypotheses; 7:673-679]. 과잉행동을 갖는 어린이는 정상 어린이보다 더 많이 갈증을 느끼고, 습진, 천식, 및 다른 알레르기 증상을 갖는 것으로 보고되었다(문헌[Mitchell et al. (1987) Clin. Pediatr.; 26:406-11] 참조). 예를 들면, 중앙 인디아나(Indiana)로부터 모집한 6-12세 소년들의 단면 연구에서, ADHD를 갖는 55 명의 대상이 혈장 극성 지질[아라키돈산(AA; 20:4n-6), 에이코사펜타에노산(EPA; 20:5n-3), 및 도코사헥사엔산(DHA; 22:6n-3)] 및 적혈구 세포 총 지질(20:4n-6 및 22:4n-6)에서 핵심 지방산 비율이 43 명의 대조군 대상에 비해 상당히 낮았다는 점을 보여주었다(문헌[Stevens et al. (1995) Am. J. Clin. Nutr.; 62:761-8] 참조). 그러나, 어떤 DHA 보충물이 ADHD 어린이의 증상을 완화시킬지 조사한 최근 공보들[Hirayama et al. (2004) Eur. J. Clin. Nutr.; 58(3):467-73; Voigt et al. (2001) J Pediatr.; 139(2):189-96]은 지방산(들)을 사용하는 데에 대해 각별한 주의를 기울여야 한다고 제안하였다. 이 연구에서, DHA 보충물은 존재하더라도 근소한 유리한 효과를 나타냈다.

최근, ADHD에서 흔한 영양 결핍에 대한 가능한 해결책 중 하나가 PS 보충일 수 있다는 것이 제안되었다(문헌[Kidd (2000) Altern Med Rev.; 5(5):402-28] 참조).

방법

대상 및 식이요법

DSM-IV에 따라 ADHD로 진단된 90명의 8세 내지 13세 어린이를 자극제 또는 다른 보충물은 복용하지 않으면서 이중 맹검 방식으로 두 달 동안 PS-3(300 mg/d; 총 450 mg/d DHA/EPA 함유), 450 mg/d DHA/EPA 또는 캐놀라 오일(군 당 30)을 투여받도록 랜덤하게 배정하였다. 토바 검사(Test of Variables of Attention)에서 -1.8 미만의 점수를 포함한 대상을 ADHD로 특성화하였다.

데이터 분석

시험 종결시, ADHD 어린이를 부모 행동 척도(Connors' Rating scale)에 따라 점수를 매겼다.

결과 및 논의

보완 요법은 만성, 불치성, 또는 빈발 재발 상태를 갖는 환자들에게 특히 흔히 사용된다. 예를 들면, 보완 및 대체 의학 요법(CAM)은 암, 천식 및 낭성 섬유증을 앓는 어린이에게 통상 사용된다. 전형적으로, 부모 또는 대상은 CAM 요법이 통상적인 치료보다 그들의 가치와 더욱 잘 맞고, 더 효과적이고, 더 천연적이며 덜 위험한 것으로 생각되기 때문에 이를 찾는다. 이들 환자 중 대다수는 주류 요법을 포기하고, 부속 치료로서 허브 및 CAM의 다른 형태를 사용한다. 오직 소수(< 40 ％)만이 소아과 의사에게 그들이 CAM을 사용한다고 말한다. 자극제가 동반하는 증후 및 부작용으로 인해, 많은 가족들이 ADHD 치료를 위해 CAM으로 전향한다. 전형적으로, 오직 70 ％의 어린이만이 자극제, 예를 들면 리탈린^TM에 대해 반응하고, 이들 중 대략 절반이 상기 의약으로부터 부작용을 겪는다고 한다. ADHD에 대한 협진 의료 센터에서 관찰한 호주의 290 가족 조사에서, 64 ％가 하나 이상의 "다른 요법," 가장 흔하게는 식이 제한, 종합비타민 보충 및 직업 치료를 시도했다(문헌[Stubberfield et al. (1999) J Paediatr Child Health; 35:450-3].

본 연구에서, 상이한 보충물을 대중적인 초콜릿 페이스트로 제형화하였다(이하 참조). 이 매트릭스를 사용하여 부모들은 어린이에게 비통상적인 형태로 치료제를 투여할 수 있었고, 해산물 화합물의 감소된 관능 효과 특징을 제공하였다(이하 참조).

치료 기간 말, 부모 등급화 조사는 어린이의 주의력 결핍, 과잉행동 및 충동성을 측정할 뿐만 아니라 부모, 교사, 형제 및 친구들에 의해 공격성도 평가된다. 그 결과는 현저히 큰 위약 효과를 나타내었다. 이 효과는 심한 행동 황폐화로 인해 연구를 완결하지 못한 위약 처리 ADHD 어린이를 고려한 경우 다소 감소되었다. 이 어린이들 중 대부분은 리탈린^TM 투여 재할당을 고집하는 것으로 보였다. 그러나, 또한, 본 데이터는 PS-Eω3가 효과적인 제제임을 명확히 입증한다. 대체로, PS-ω3 처리 ADHD 어린이의 부모 중 ~70 ％가 그들의 어린이의 행동 점수에 약간의 개선이 있음을 시사하고, 이들 부모 중 50 ％는 어린이 행동에 대한 보충물이 다수의 유리한 효과가 있음을 명확히 시사하였다. 이 탁월한 효과는 위약(~30 ％)에 의해 얻어진 개선보다 2.2배 높다. ADHD 어린이 행동에 대한 LC-PUFA의 부모 점수와 PS-ω3 3 개월 투여 후 동시 등급화를 비교한 경우 후자가 점수가 더 높았다. 양쪽 화합물은 유사한 정도의 적은 개선을 나타내지만, PS-ω3은 효과가 가장 낮은 결핍되거나 또는 저하된 쥐(각각 21 ％ & 11 ％ 대 26 ％ 및 17 ％)보다 높은 현저한 실질적인 개선(각각 47 ％ 대 35 ％) 속도를 나타내었다. 이러한 PS-3 보충물의 효과는 오메가-3 지방산의 강화된 생체이용률 및 PS를 통한 기분, 스트레스 및 불안에 대한 우수하게 증명된 효과에 기여할 수 있었다.

실시예 3 - ApoE° 마우스에서 PC-DHA 소비 효과

방법

동물 식이

8 주된 아포지단백질 E 결핍(ApoE°) 마우스(문헌[Hayek T. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 1567-1574] 참조)를 LC-PUFA 풍부한 레시틴(총 지방산 조성물 중 30 ％ 오메가-3; PC-DHA 기) 또는 위약에 랜덤하게(각각 5마리 마우스) 배정하였다. 마우스에게 정규식 외에 3일마다 10 주 동안 경구 위관을 통해 25 ㎕의 PC-DHA 또는 PBS를 공급하였다. 각각의 마우스들은 일일 대략 5 mL의 물 및 5 g의 사료를 소비하였다.

혈청 지질 과산화

혈청을 PBS 중에서 1:4로 희석하였다. 열 분해되어 일정한 속도로 퍼옥실 라디칼을 생산하는 수용성 아조 화합물인 화합물 2'-2'-아조비스 2'-아미디노프로판 히드로클로라이드(AAPH)를 생성하는 100 mM의 자유 라디칼과 혈청 샘플을 인큐베이션함으로써 산화에 대한 혈청 감수성을 결정하였다. 티오바비투르산( thiobarbituric) 반응성 물질(TBARS) 및 지질 과산화물의 형성을 측정하고, AAPH가 없는 것을 제외한 유사한 상태 하에서 인큐베이션된 혈청과 비교하였다.

결과 및 논의:

ApoE° 마우스는 사료식에 대해 심한 고콜레스테롤혈증 및 죽상경화증을 발현하므로 죽상동맥경화에 대한 동물 모델로 널리 사용된다. 또한, 가속화된 죽상동맥경화는 마우스에서 동맥 세포 및 혈장 지단백질의 증가된 지질 과산화와 관련된다(문헌[Hayek T. et al. (1994) id ibid.; Keidar S. (1998) Life Sci. 63:1-11] 참조).

도 6은 ApoE°마우스에 의해 PC-DHA 소비가 얼마나 지연되는지 도시하며, 이는 뚜렷한 성향(P < 0.10)으로 AAPH 유도 산화에 대한 혈청 감수성을 16 ％(위약에 비교시) 감소시킨다.

관능성 문제

다양한 분야에서, 특히 기능성 식품의 성분으로서 오메가-3 지질의 사용은 그들의 독특한 비린내로 인해 제한된다. 따라서, 본 발명의 오메가-3 풍부 인지질 성분의 또 다른 이점들은 PS 골격에 대한 오메가-3 아실 잔기의 공유 결합으로 인해 이 기의 냄새 또는 풍미를 감소시킨다는 점이다. 이는 이 물질의 증기압을 증가시켜 그들의 독특한 향기를 감소시킨다. 따라서, 오메가-3 지방산의 인지질 골격, 특히 PS에 대한 공유 결합은 그들의 풍미 성질을 변화시키고 개선시킨다. 또한, 본 발명의 PS 성분도 산화 감응성 오메가-3 지방산에 강화된 안정성을 제공한다. 일반적으로, 인지질, 특히 PS는 항산화제 및 안정화제로 작용하는 것으로 공지되어 있다.

이러한 이익은 다양한 분야, 특히 안정성, 향기 및 풍미는 근본적인 요건인 기능성 식품에서 본 발명의 지질 제제를 매우 유리하고 중요하게 한다.

더욱이, 이들 신규한 성분은 심지어 생리활성 및 효능 강화를 위해 추가적인 지질을 사용하여 제형화될 수 있다.

ADHD 환자에서 상기 임상 시험에 사용된 출발 화합물은 어유와 혼합된 LC-PUFA 풍부한 PS였다. 본래, 이 생성물 및 대조군 어유는 에너지 바와 같이 식품 제품 중에서 제형화되지만, 숙련된 패널로부터의 반응은 심한 관능 문제가 아주 형편없는 것으로 지적되었다. 이 풍미 장벽을 극복하기 위해, 본 발명의 PS-3 생성물을 탈오일화하였다. 이 방법의 최종 생성물은 불활성 또는 우성 관능성 포화된 지방과 재제형화된 경우 초콜릿 바, 초콜릿 스프레드, 초콜릿 코팅 콘후레이크, 저지방 유제품 또는 농축유 중에 용이하게 제형화될 수 있는 페이스트였다. 각각의 이러한 제제는 숙련된 패널 및 시험 지원자 양쪽 모두로부터의 관능 거부가 명백히 줄었다.

PUFA, 예를 들면 PS-PUFA 유도체의 극성 지질 유도체는 제제로서, 또한 본 발명의 임상 시험에 사용된 몇몇 식품 분야에서 높은 안정성을 나타내었다. 이러한 감응성 화합물의 안정성은 종래 방부제로 사용되는 것으로 공지된 인지질 및 불안정한 PUFA 잔기의 공유 조합으로부터 나타난다.

실험 설치류 식이용으로(문헌[Lytle et al. (1992) Nutr Cancer; 17(2):187-94] 참조) 또는 스프레드성 지방 풍부물로서(문헌[Kolanowski et al. (2001) Irat J Food Sci Nutr.; 52(6): 469-76] 참조) 상업적으로 제조된 어유(오메가-3 지방산)의 안정성은 증가된 LC-PUFA의 유리한 효과에 대한 공공연한 인식으로서 몇몇 연구에 의해 밝혀졌다. 지방산이 빠르게 산화되고(되거나) 광범위하게 산화되고, 가공시 공기, 빛 또는 열에 노출됨으로써 또는 다양한 기간 동안 저장되는 경우 다른 화학적 변화를 받게 되므로 어유의 산화 안정성을 유지하는 데 주력하였다. 이들 연구에서 제공된 통상의 해결책은 어유 매트릭스를 부틸화 히드록시톨루엔, 부틸화 히드록시퀴논 및 알파-토코페롤과 같은 항산화제로 보충하거나, 또는 별법으로, 진한 어유를 포화된 지방 매트릭스 중에서 1 ％ 이하로 희석시키는 것이었다. 그러나, 송(Song) 및 동료들[Song et al. (1997) Biosci Biotechrzol Biochem.; 61(12):2085-8]은 10주 저장기간 동안 벌크상 25 ℃ 어둠 속에서 인지질, 트리글리세리드 및 에틸 에스테르의 DHA 함유 오일 형태의 과산화 안정성을 이미 평가하였다. 이들은 인지질 형태의 DHA 함유 오일이 벌크상에서의 트리글리세리드 및 에틸 에스테르 형태보다 DHA의 산화 분해에 대한 저항성이 강하다는 점을 밝혀냈다.

임상 연구에 사용된 상기 PS-ω3 함유 생성물을 실온에서 그들의 저장 기간 및 안정성에 대해 시험하였다. 농축유(10 ml 우유 당 1 g의 생성물) 중에 제형화된 풍부한 PS-ω3을 1주간 동결-건조 주기에서 안정성에 대해 ³¹P-NMR에 의해 분석하였으며, 안정한 것으로 관측되었다. 제 2 기에서, 초콜릿 페이스트 매트릭스(20 g의 초콜릿 스프레드 당 0.75 g의 생성물)에서 PS-ω3를 실온에서 2주 저장 후 안정성에 대해 시험하였다. 또한, 이 제제는 ³¹P-NMR 분석시 안정한 ％의 PS를 제공하였다. 결론적으로, 본 발명자들은 항산화제 소비 후 빠르게 분해되는 것으로 공지된 ω-3 함유 트리글리세리드에 비해 ω-3 함유 인지질이 실온, 뿐만 아니라 동결-건조 주기에서 매우 안정한 것으로 확정지을 수 있었다.

Claims (39)

1. 에이코사펜타에논산(EPA)을 포함하는 세린 글리세로인지질과 도코사헥사에논산(DHA)을 포함하는 세린 글리세로인지질의 혼합물을 포함하며, 여기서 각각의 EPA를 포함하는 세린 글리세로인지질과 DHA를 포함하는 세린 글리세로인지질은 하기 화학식 I의 구조이고, 상기 세린 글리세로인지질의 혼합물 중에 존재하는 EPA 및 DHA의 합산량은 제제의 세린 글리세로인지질의 총 지방산 함량의 10-50 ％(w/w)를 구성하며, 상기 혼합물은 천연 인간 또는 포유동물 뇌 포스파티딜세린과 동일하지 않은, 학습 장애의 치료를 위한 제제.

   <화학식 I>

   

   상기 식 중, R"는 세린이고,

   R 및 R' 중 하나는 아실 EPA 또는 아실 DHA이고, R 및 R' 중 다른 하나는 수소 또는 아실기이다.
2. 제1항에 있어서, 세린 글리세로인지질의 혼합물 중에 존재하는 EPA 및 DHA의 합산량이 제제 중 세린 글리세로인지질의 총 지방산 함량의 20-50 ％(w/w)를 구성하는 것인 제제.
3. 제2항에 있어서, 상기 학습 장애가 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD)인 제제.
4. 제1항에 있어서, 상기 세린 글리세로인지질의 혼합물이 식물, 동물 또는 미생물 공급원으로부터 선택되는 지질 공급원의 효소적 트란스포스파티딜화에 의해 제조된 것인 제제.
5. 하나 이상의 제약상 허용되는 첨가제, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하고, 제1항의 제제를 포함하는 제약 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 제약 조성물이 하나 이상의 제약상 활성제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 제약 조성물이 경구로 또는 정맥내로 전달되는 것인 조성물.
8. 제1항의 제제를 포함하는 영양약학 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 영양학적 조성물이 연질겔 캡슐, 정제, 시럽, 또는 기타 식이 보충 전달 시스템 형태인 영양약학 조성물.
10. 제1항의 제제를 포함하는 기능성 식품.
11. 제10항에 있어서, 상기 기능성 식품이 유제품, 아이스크림, 비스켓, 콩제품, 베이커리, 페이스트리, 빵, 소스, 수프, 가공 식품, 냉동 식품, 조미료, 과자류, 오일, 지방, 마가린, 스프레드, 소(filling), 시리얼, 인스턴트 식품, 음료, 쉐이크, 유아 이유식, 유아 식품, 바, 스낵, 캔디 또는 초콜릿 제품인 기능성 식품.
12. 제3항에 있어서, 상기 ADHD가 어린이에서 발생한 것인 제제.
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