CN108721269A - 一种epa与dha混合剂在防治焦虑和快感缺乏方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种EPA与DHA的混合剂在制备预防和/或治疗因神经发炎引起或恶化的焦虑、快感缺乏制剂中的应用，其中，EPA与DHA的质量比为1：0.25～1.5。本发明阐明该质量比的EPA与DHA混合剂能有效改善个体因神经发炎而引起或恶化的精神症状如焦虑与快感缺乏，以及实际生理变化如压力水平提高、体重减轻等影响，提供实际应用在临床上如忧郁症或多种因神经发炎而引起或恶化的神经退化性疾病如失智症之辅助治疗参考，同时在相关疾病的预防与治疗上具有应用前景。

Description

一种EPA与DHA混合剂在防治焦虑和快感缺乏方面的应用
技术领域
本发明涉及神经发炎的防治技术领域，更具体地，涉及一种EPA与DHA混合剂在防治焦虑和快感缺乏方面的应用。
背景技术
EPA与DHA可以从外周通过血脑屏障而到达中枢神经系统，直接调控神经传导、免疫反应、荷尔蒙释放，透过改变细胞膜特性而影响多种信息传递，产生抗炎、神经保护与神经新生效果。而鱼油与海洋产物富含 EPA与DHA，临床上也证实对于情绪疾患如忧郁症、神经退化性疾病如失智症、多发性硬化症等具有辅助治疗作用。
DHA虽然是EPA的下游产物，但是两者在实际抗炎、神经保护的效果与机制却不尽相同。现今市场上充斥着各类EPA与DHA的保健产品，皆宣称具有预防或辅助治疗之效果，但实际纯度与混合比例之差异非常大，更缺乏可信的科学证据支持确实能有效改善个体的焦虑、快感缺乏，以及实际在抗炎、神经保护等方面之改善效果。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种EPA与DHA的混合物在制备预防和/或治疗因神经发炎引起或恶化的抑郁焦虑、快感缺乏中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
对于C57/BL6J小鼠：将EPA或DHA以单一或不同比例的EPA与DHA混合于饲料中，喂食小鼠持续8周，接着进行脑室埋管手术，待恢复期一周之后，中枢给予单次5µg LPS作用24小时刺激发炎反应之后，进行体重与行为检测，待行为测试全部完成之后，隔天牺牲小鼠并取出下丘脑与海马回，保存于-80℃，待后续进行多种生化分析。
通过C57/BL6J小鼠的研究结果更进一步发现 EPA:DHA 1:1混合比例对于改善因神经发炎而引起的体重减轻、焦虑、快感缺乏等行为，效果更优于单一比例的EPA或DHA。生化分析也证实EPA与DHA的质量比为1：0.25～1.5（尤其是1:1）的混合剂可以分别降低压力应激激素如CRF与炎症指标如CD11b、CD206等蛋白表现量，证实了特定比例的EPA与DHA混合剂确实可以预防并改善因神经发炎而引起或恶化的精神症状与生理变化。
发明人发现EPA与DHA的质量比为1：0.25～1.5（尤其是1:1）的混合物对于改善神经发炎对糖水偏好度（快感缺乏）和焦虑（高架迷宫time ratio数据）有显著的效果。
因此，本发明要求保护一种EPA与DHA的混合物在制备预防和/或治疗因神经发炎引起或恶化的焦虑、快感缺乏制剂中的应用。
优选地，EPA与DHA的质量比为1：0.25～1.5
优选地，EPA与DHA的质量比为1：1。
优选地，所述制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、混和悬浮液剂或乳剂。
优选地，所述应用为压力水平降低、减少体重减轻、抑制因子大量增加的一种或几种实际生理变化。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明阐明上述特定比例的EPA与DHA混合剂能有效改善个体因神经发炎而引起或恶化的精神症状如忧郁、焦虑与动机低落，以及实际生理变化如压力水平提高、体重减轻、促炎因子大量增加等影响，提供实际应用在临床上如忧郁症或多种因神经发炎而引起或恶化的神经退化性疾病如失智症之辅助治疗参考，同时在相关疾病的预防与治疗上具有应用前景。
附图说明
图1为EPA与DHA及其比例对体重与行为的改善效果。
图2为EPA与DHA及其比例对神经营养及炎症相关蛋白表达的改善效果。
图3为EPA与DHA及其比例对神经营养及炎症相关基因表达的改善效果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
药物
脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），为细菌外壳主要成份购自美国Sigma-Aldrich公司，分别以无菌的生理食盐水、无水酒精与DMSO溶解后分装，密封冻入-20℃保存。在动物实验中，实验组所喂食的EPA与DHA则是购自韩国AK&MN BioFarm公司，纯度经检测皆达95%以上。
实验统计方法
实验数据以统计套装软件Sigma Plot或SPSS进行单因子/二因子变异数分析或无母数分析，进一步以Fisher’s LSD或Dunn-Bonferroni等事后比较方式，找出p值小于0.05，即差异达到显著水平的组别，方才具有实际解释或应用之意义。
实施例1 EPA与DHA的比例筛选
一、对于由中枢神经发炎所引起的焦虑、快感缺乏的改善效果
1. 实验操作
将1% 椰子油、EPA或DHA以单一或不同比例的EPA与DHA混合于饲料中，喂食C57/BL6J小鼠持续8周。接着进行脑室埋管手术，待恢复期一周之后，中枢给予单次LPS(5 µg)作用24小时刺激发炎反应之后，进行体重与行为检测。
其中，EPA和DHA的比例为EPA:DHA= 1:1、1:4、2:1、4:1（重量比），分别记为ED1-1，ED1-4，ED2-1，ED4-1。
（1）单侧脑室埋管手术
在小鼠年龄约12周大时，以zoletil(50mg/ml) 稀释5 倍后（即1mL zoletil + 0.1mLrompun+3.9mL 无菌生理食盐水）根据每10gm体重0.05-0.06mL进行深度麻醉，将头部固定在立体定位仪，暴露颅骨并在上方钻一小洞(位于前囟点前/后方-0.6 mm，内/外侧1.2 mm，深度为1.8 mm)放入内、外管套件，底座以螺丝与牙科粉固定于颅骨。经过7天的恢复期后，于实验开始当天早上鼠房灯亮后一小时，以异氟烷(isoflurane)麻醉小鼠，将总量为1μL无菌生理食盐水或LPS（5μg）以每分钟0.1μL的速度注射至单侧脑室，静候2分钟后才将针头取出，避免因迅速压力变化而使尚未扩散的药物涌出，干扰实验结果解释。
（2）体重检测
脑室埋管手术恢复一周，中枢给予单次LPS(5 µg)作用24小时刺激发炎反应之后，进行体重检测。
（3）行为检测
十字迷宫测试 （Elevated plus maze）
将迷宫置于距离地面40-70公分高的位置，将小鼠个别放入迷宫的正中央，在五分钟的测量时间内，纪录小鼠进入开放臂区（6*30cm）以及封闭臂区（6*30cm）的次数与时间。个别计算进入两个开放臂区相对于四个手臂总次数与总时间的百分比值，作为动物焦虑状态的行为指标。
糖水偏好测试 （Sucrose preference test）
于实验前两天没有限制饮水的情况下，进行双管习惯化，目的在于让小鼠习惯两侧都有放置管子喂水，同时确认小鼠对于双侧管子是否有不同偏好，以作为后续糖水位置安排之参考。于实验前一天剥夺6小时饮水后，放置双管水，其中一管为1% 蔗糖水（置于小鼠较不偏好的一侧）、另一管为一般饮用水，分别记录24小时之后的饮量，作为注射LPS之前，小鼠是否有正常的糖水偏好之参考。于实验开始第二天剥夺6小时饮水后，再次放置双管水，分别纪录4小时与24小时的两管饮量，个别计算糖水饮量相对于双管总饮量的百分比值，作为糖水偏好的行为指标。
2. 实验结果
结果显示（图1），长期喂食ED1-1比单一剂量EPA或DHA更能有效避免小鼠在注射LPS之后体重减轻、糖水饮用偏好降低（快感缺乏）、焦虑等状态。此外，这两组与单一剂量DHA组皆能有效改善小鼠因中枢神经发炎而增加的焦虑行为，即增加在开放手臂行走的时间百分比。
这说明EPA:DHA= 1:1的混合剂比例最能有效改善由于中枢神经发炎所引起个体在心理层面的焦虑、快感缺乏。
二、对于由中枢神经发炎所引起的促炎、抗炎不平衡状态之改善效果
进一步将上一步小鼠的下视丘与海马回取出，进行蛋白质分析和基因表达分析。
1. 实验操作
（1）蛋白质电泳（西方点墨法 Western blot）进行蛋白质分析
将适量RIPA溶液加入脑组织后，透过超音波震碎并静置冰上30分钟后，取其上清液，利用BSA 套组检测总蛋白质浓度，并冻于-80℃保存。电泳前取出样品，加入总体机1/4量的染剂，以70℃加热10分钟，目的在于打断蛋白质键结后，即可加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，再以不同电流条件将胶体上的蛋白质转移至0.22μm PVDF膜，利用兔或鼠多株抗体与膜上蛋白质进行键结，最后以化学冷光试剂（chemiluminescence, ECL）分别侦测各组在BDNF/proBDNF (14/28 KDa, N-20)、 CD11b (160 KDa, ab75476)、CD206(166-190 kDa,ab 64693)、PPARr(54/57 kDa, E-8)、CRF(25 kDa, abb901)的冷光强度，即为各组蛋白质的相对表现量。进一步以肌动蛋白（beta-Actin）或GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase)作为内参蛋白选择，以校正特定蛋白的相对表现量。
（2）实时聚合酶连锁反应 (Real-time qPCR)进行基因表达分析
将TRIzol reagent加入脑组织，以超音波震碎、裂解后，根据操作手册纯化得到总RNA，透过反转录试剂合成cDNA后冻于-20℃保存。PCR反应使用SYBR Green master mix与StepOnePlus，以95℃ 15秒、60℃ 1分钟，共40个循环完成，并参考解离曲线分析（meltingcurve）确认引子专一性后，以肌动蛋白作为内参基因选择，计算△△CT值以校正目标基因的相对表现量。Real-time qPCR引物见表1。
表1：
2. 实验结果
结果显示（图2），EPA组与ED4-1组的海马回具有大量的BDNF以及较少量的M1蛋白标记(CD11b)，而EPA组更同时降低了微小胶细胞的M2蛋白标记(CD206)。这说明高剂量的EPA能够有效抑制中枢神经的发炎状态，并且透过增加神经营养因子来提高神经细胞的活性。此外，ED1-1组则是与EPA组一样，能够显著降低下视丘的压力反应指标(CRF)。
这说明ED1-1组对于改善上述个体的焦虑、快感缺乏可能分别透过降低压力激素与抑制发炎反应等不同途径达到最终的治疗效果。
基因分析的结果显示（图3），EPA组、DHA组、ED1-1组与控制组（未发炎）皆在BDNF基因表现量上明显偏低，即ΔΔCT增加。这说明此四组此时的BDNF蛋白表现量可能已足够因应当下中枢神经发炎的状态，其中又以ED1-1组的行为改善效果与此推论完全一致。此外，控制组（未发炎）在CRF基因表现量上明显偏低，即ΔΔCT增加。这说明不同于控制组，由LPS所引发中枢神经发炎的压力是持续存在于其他各组的，即使当下CRF基因表现量并没有显著差异，反而更加凸显ED1-1组降低CRF蛋白表现量之重要性。其余与蛋白表现量不一致之基因，多数是因为同一时间点取脑组织，造成基因表现与蛋白表现未达稳定一致的状态，无法合并参考，故不在此说明。
整体而言，单一剂量EPA与DHA对于抗炎、神经保护等方面各有一定的改善效果，本发明更明确指出，不同比例的EPA与DHA混合剂效果更优于单一剂量的EPA与DHA，特别是EPA:DHA= 1:1能有效改善个体因神经发炎而引起或恶化的焦虑、快感缺乏，以及神经退化性疾病如失智症，对于未来在预防保健与临床药物治疗等应用方面，深具备发展潜力。

Claims (5)

1.一种EPA与DHA的混合剂在制备预防和/或治疗因神经发炎引起或恶化的焦虑、快感缺乏制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EPA与DHA的质量比为1：0.25～1.5。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于， EPA与DHA的质量比为1：1。
4.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、混和悬浮液剂或乳剂。
5.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述应用为压力水平降低、减少体重减轻、抑制因子大量增加的一种或几种实际生理变化。
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