KR101129767B1

KR101129767B1 - 치료

Info

Publication number: KR101129767B1
Application number: KR1020067007973A
Authority: KR
Inventors: 제이 랄 메타
Original assignee: 아스트라제네카 유케이 리미티드
Priority date: 2003-09-26
Filing date: 2004-09-22
Publication date: 2012-03-26
Also published as: KR20060108623A; AU2004275567B2; IS2729B; BRPI0414724A; HRP20100080T1; JP2007506720A; SG145773A1; DK1673091T3; ATE451103T1; US7932263B2; IS8421A; PT1673091E; IL174536A; CN1886136A; UA90249C2; EP1673091B1; HK1090553A1; CA2540102A1; DE602004024555D1; NO20061744L

Abstract

본 발명은 죽상경화증의 예방 또는 치료 및 심혈관 질환의 예방을 위한 칸데살탄 및 로수바스타틴을 포함하는 조합물에 관한 것이다.

Description

치료 {THERAPEUTIC TREATMENT}

본 발명은 칸데살탄(candesartan) 및 로수바스타틴(rosuvastatin)을 포함하는 조합물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 언급한 조합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 죽상경화증의 예방 또는 치료에 있어서 상기 언급한 조합물의 의 용도에 관한 것이다.

죽상경화증은 동맥 내에 불규칙하게 분포된 지질 침착물을 야기하고 관상동맥성 심장질환의 주요 원인 인자인 복합 병리학적 과정에 의해 매개되는 증상이다. 따라서, 죽상경화증의 감소는 심혈관 질환, 예를 들어 심근경색증, 협심증의 악화, 심장 정지, 졸중, 울혈성 심부전 및 심혈관 사망의 빈도를 감소시키기 위한 주요 목표이다.

이상지혈증, 특히 저밀도 지단백질(LDL)의 증가된 혈장 수준은 죽상경화증의 주요 위험 인자 중 하나이다. 임상 연구는, 스타틴으로서 일반적으로 공지되어 있는 3-히드록시-3-메틸글루타릴 보조효소 A (HMG CoA) 리덕타제 억제제로 혈장 LDL 수준을 감소시키는 것이 심혈관 질환의 위험을 낮춘다는 것을 증명하였다.

레닌-안지오텐신 시스템 (RAS)의 활성화는 죽상경화증의 또다른 중요한 위험 인자로 생각할 수 있다. 안지오텐신 (II) (A (II))의 형성 및 A(II) 수용체와 함께RAS의 활성화는 죽상경화증, 죽상반 파열, 심근허혈 기능장애 및 울혈성 심부전에 관련되어 있다(Singh and Mehta, Arch Intern Med, 2003, vol 163, 1296-1304).

국제 특허 출원 WO 95/26188은 임의로 HMG CoA 리덕타제 억제제와 함께 A(II) 수용체 차단제로 죽상경화증을 치료하는 것을 개시하고 있다. 국체 특허 출원 WO 01/76573은 전술한 증상, 특히 이 중에서 죽상경화증의 진행을 예방하거나 지연시키기 위한, A(II) 길항제, ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제제 및 HMG CoA 리덕타제 억제제 중 2종 이상의 조합물의 용도를 개시하고 있다.

놀랍게도, 본 발명자들은 A(II) 길항제인 칸데살탄과 HMG CoA 리덕타제 억제제인 로수바스타틴의 조합물이 죽상경화증의 감소에 있어서 상승 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다. 이러한 상승 효과는 RAS (예를 들어, CD40, 메탈로프로테이나제 (MMP))에 관여된 수많은 염증 매개체의 발현 및 수용체 LOX-1(내피세포 상의 산화된 LDL에 대한 수용체)의 발현의 상승 억제에 의해 일어나는 것으로 보인다. 이러한 상승 효과는 죽상경화증에 있어서 RAS와 이상지혈증 사이의 상호관계에 대한 뚜렷한 증거를 제공해주는 것이다.

MMP의 활성은 이들의 조직 억제제 (TIMP)에 의해 생체내에서 조절될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명자들은 TIMP-1 및 TIMP-2의 발현이 고-콜레스테롤 식이에 의해 상향조절되고, 칸데살탄과 로수바스타틴의 조합물에 의해 현저하게 약화된다는 것을 증명하였다. 이들 데이타는 MMP와 TIMP 사이의 균형이 고-콜레스테롤 식이에 의해 깨지고, 이러한 불균형은 A(II) 길항제와 지질 강하제의 조합물에 의해 "정상화"될 수 있다는 개념에 신뢰성을 부여해주는 것이다.

본 발명의 한 구체예에서는 죽상경화증의 예방 또는 치료를 위한 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 포함하는 조합물이 제공된다.

본 발명의 한 구체예에서는 심혈관 질환의 예방을 위한 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 포함하는 조합물이 제공된다.

상기 조합물은 이들 매개체와 연관된 기타 질환, 예를 들어 염증성 질환 또는 증상, 예컨대 혀혈-재관류 손상 (심장, 뇌, 신장, 폐 및 간의 손상), 방사선에 의해 유발된 손상, 화상 및 말초혈관 질환의 치료 또는 예방에 있어서도 유용하다.

칸데살탄은 칸데살탄의 형태, 또는 프로드러그 형태인 칸데살탄 실렉세틸(cilextil)인 것이 적합할 것이다. 이들 형태는 추가의 약제, 예컨대 이뇨제, 예컨대 히드로클로로티아지드 (예를 들어, 아타칸드 플라스(Atacand Plus, 상표명)으로서 시판됨)와 함께 제제화될 수 있다.

본원에서 칸데살탄을 언급하는 경우, 이는 칸데살탄 및 칸데살탄 실렉세틸 모두를 포함한다.

바람직하게는, 로수바스타틴으로서 언급될 수 있는, 로수바스타틴의 칼슘 염이 본 발명의 각종 구체예에서 사용된다.

일반적으로, 약학적 허용 염은 산 부가 염, 예컨대 메탄술폰산 염, 토실산 염, α-글리세로인산 염, 푸마르산 염, 염산 염, 구연산 염, 말레인산 염, 주석산 염 및 (덜 바람직하게는) 브롬산 염을 포함한다. 또한, 약학적 허용 염은 일반적으로 인산 및 황산으로 형성된 염을 포함한다. 약학적 허용 염은 일반적으로 염기 염, 예컨대 알칼리금속 염, 예를 들어 나트륨 염, 알칼리토금속 염, 예를 들어 칼슘 염 또는 마그네슘 염, 유기 아민 염, 예를 들어 트리에틸아민, 모르폴린, N-메틸피페리딘, N-에틸피페리딘, 프로카인, 디벤질아민, N,N-디벤질에틸아민, 트리스-(2-히드록시에틸)아민, 트리스(히드록시메틸)메틸암모늄, N-메틸 d-글루카민 및 아미노산, 예컨대 라이신 염을 포함한다. 하전된 작용기의 수 및 양이온 또는 음이온의 원자가에 따라, 하나 이상의 양이온 또는 음이온이 존재할 수 있다.

본원에서, "조합"이라는 용어는 동시 투여, 개별 투여 또는 순차적 투여를 언급하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 한 구체예에서 "조합"은 동시 투여를 말한다. 본 발명의 또다른 구체예에서 "조합"은 개별 투여를 말한다. 본 발명의 추가의 구체예에서 "조합"은 순차적 투여를 말한다. 순차적 투여 또는 개별 투여의 경우, 두번째 성분은 두 성분 모두가 신체 내에 존재하여 조합물의 상승 효과를 일으킬 수 있는 시간 간격을 두고 투여해야 한다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 죽상경화증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 약학적 허용 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 심혈관 질환의 위험을 예방 또는 감소시키는데 사용하기 위한 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 약학적 허용 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본원에서 기재된 조성물은 경구 투여, 예를 들어 정제 또는 캡슐제, 비경구 주사 (정맥내, 피하, 근육내, 혈관내 주사 또는 관주를 포함함), 예를 들어 무균 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 국소 투여, 예를 들어 연고 또는 크림, 직장 투여, 예를 들어 좌약제, 또는 종양 내로의 직접 주사 또는 국부 전달 또는 국소 전달에 의한 투여 경로에 적합한 형태일 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 조합 치료의 화합물은 내시경, 기관내, 병변내, 경피, 정맥내, 피하, 복강내 또는 종양내로 전달될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 기재된 조성물은 종래 기술에서 잘 공지되어 있는 통상의 부형제 또는 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제조할 수 있다.

정제 제형에 적합한 약학적 허용 부형제 또는 담체는, 예를 들어 불활성 부형제, 예컨대 락토오스, 탄산나트륨, 인산칼슘 또는 탄산칼슘; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 젤라틴 또는 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크; 방부제, 예컨대 에틸 또는 프로필 4-히드록시벤조에이트; 및 항산화제, 예컨대 아스코르브산을 포함한다. 정제 제형은 이들의 붕해 후 위장관내 활성 성분의 흡수를 조절하기 위하여, 또는 이들의 안정성 및/또는 외관을 개선하기 위하여 종래기술에서 공지되어 있는 통상의 코팅제 및 코팅 방법을 사용하여 코팅하거나 코팅하지 않을 수 있다.

경구 투여용 조성물은 활성 성분이 불활성 고형 부형제, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐제의 형태이거나, 활성 성분이 물 또는 오일, 예컨대 땅콩유, 액상 파라핀 또는 올리브유와 혼합된 연질 젤라틴 캡슐제의 형태일 수 있다.

칸데살탄은 '아타칸드(Atacand, 상표명)' 및 '아타칸드 플러스(Atacand Plus, 상표명)'로서 시판된다. 로수바스타틴 칼슘은 '크레스토르(Crestor, 상표명)'로서 시판된다. 본 발명에 적절한 제제는 시판되는 것을 포함한다.

조합물의 각 성분의 적절한 투여량은 시판되는 제품의 투여량이다. 대안으로, 성분들 사이의 상승 효과는 사용되는 한 성분 또는 양쪽 성분의 투여량을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 80 ㎎, 40 ㎎, 20 ㎎, 10 ㎎, 5 ㎎ 또는 2.5 ㎎의 로수바스타틴의 투여량과 함께 4 ㎎, 8 ㎎, 16 ㎎, 32 ㎎, 또는 최대 160 ㎎의 칸데살탄의 투여량을 이용할 수 있다. 칸데살탄의 임의의 투여량을 로수바스타틴의 임의의 적절한 투여량과 조합할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

한 구체예에서, 80 ㎎의 로수바스타틴을 사용한다. 또다른 구체예에서, 40 ㎎의 로수바스타틴을 사용한다. 추가의 구체예에서, 20 ㎎의 로수바스타틴을 사용한다. 추가의 구체예에서, 10 ㎎의 로수바스타틴을 사용한다. 추가의 구체예에서, 5 ㎎의 로수바스타틴을 사용한다. 추가의 구체예에서, 2.5 ㎎의 로수바스타틴을 사용한다.

한 구체예에서, 32～160 ㎎, 예컨대 약 64～128 ㎎, 예를 들어 64～112 ㎎, 예컨대 약 64～96 ㎎의 칸데살탄을 사용한다. 편리하게는, 약 72 ㎎의 칸데살탄을 사용한다. 또다른 구체예에서, 32 ㎎의 칸데살탄을 사용한다. 추가의 구체예에서, 16 ㎎의 칸데살탄을 사용한다. 추가의 구체예에서, 8 ㎎의 칸데살탄을 사용한다. 추가의 구체예에서, 4 ㎎의 칸데살탄을 사용한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염 및 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염 및 약학적 허용 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 단일의 경구 제제인 상기 조성물은 죽상경화증의 예방 또는 치료에서 동시 투여하기 위한 본 발명의 치료제 조합물을 편리하게 제공한다.

조합물 중 2개의 성분은 모두 경구 투여되는 것이 바람직하다.

조합물 중 2개의 성분은 단일의 경구 제제로서 투여되는 것이 바람직하다.

조합물은 1일 1회 투약용으로 제제화되는 것이 바람직하다.

편리하게는, 조합물은 단일 정제 또는 캡슐제로서 제제화된다.

앞서 기재된 투여량 및 스케쥴은 환자의 특정 질환의 상태 및 전반적 증상에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 독성을 감소시키기 위하여 상기 조합 치료 성분의 전술한 투여량을 감소시키는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 또한, 투여량 및 스케쥴은 본 발명의 조합 치료제 이외에, 1종 이상의 추가의 화학요법제가 사용되는 경우에 다를 수 있다. 스케쥴은 자신의 전문 기술 및 지식을 이용하여 임의의 특정 환자를 치료하는 숙련된 자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염 및 약학적 허용 부형제 또는 담체를 포함하는 제1 조성물, 및 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염 및 약학적 허용 부형제 또는 담체를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 분리된 조성물도 포함한다. 상기 조성물은 죽상경화증의 상승적 예방 또는 치료에 있어서 순차적 투여 또는 개별 투여를 위한 본 발명의 치료제 조합물을 편리하게 제공하지만, 분리된 조성물을 동시 투여할 수도 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 죽상경화증의 예방 또는 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 포함하는 조합물이 제공된다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 심혈관 질환의 예방을 위한 의약으로서 사용하기 위한 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 포함하는 조합물이 제공된다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 의약의 제조에 사용하기 위한 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 포함하는 조합물이 제공된다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 죽상경화증의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 포함하는 조합물이 제공된다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 심혈관 질환의 예방을 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 칸데살탄, 또는 이의 약학적 허용 염, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약학적 허용 염을 포함하는 조합물이 제공된다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 온혈 동물, 예컨대 인간의 죽상경화증을 예방또는 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염과 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염의 조합물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 온혈 동물, 예컨대 인간의 심혈관 질환을 예방하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염과 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염의 조합물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 구체예에 따르면, 죽상경화증의 예방 또는 치료에 사용 하기 위한, 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염과 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염을 임의로 사용 설명서와 함께 포함하는 키트가 제공된다.

본 발명의 추가의 구체예에 따르면,

a) 제1의 단위 투약 형태인 칸데살탄;

b) 제2의 단위 투약 형태인 로수바스타틴; 및

c) 상기 제1의 투약 형태 및 제2의 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단; 및 임의로

d) 죽상경화증의 예방 또는 치료에 있어서의 사용 설명서

를 포함하는 키트가 제공된다.

본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염과 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염의 조합물을 투여함으로써 CD40 및/또는 메탈로프로테이나제 (MMP)의 발현을 억제하는 방법이 제공된다.

구체적 메탈로프로테이나제는 MMP-1, MMP-2 및 MMP-9이다.

본 발명의 또다른 구체예에 따르면, CD40 및/또는 메탈로프로테이나제 (MMP)의 발현의 억제에 적절한 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염과 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염의 조합물의 일정량을 투여하여 CD40 및/또는 메탈로프로테이나제 (MMP)의 발현을 억제함으로써 죽상경화증 환자를 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가의 구체예에 따르면, 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염과 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염의 조합물의 일정량을 투여함으로써 MMP 와 TIMP 사이의 균형을 정상화시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염과 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염의 조합물을 투여함으로써 LOX-1의 발현을 억제하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 구체예에 따르면, LOX-1의 발현을 억제하는 데 적절한 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염과 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염의 조합물의 일정량을 투여하여 LOX-1의 발현을 억제함으로써 죽상경화증 환자를 치료하는 방법이 제공된다.

재료 및 방법

동물 모델

5쌍의 C57BL/6J 마우스 및 3쌍의 동종접합 아포-E 넉아웃 마우스(C57BL/6J 유래)를 잭슨 러보러토리사 (메인주, 바 하버 소재)로부터 구입하였다. 이들을 형매교배함으로써 번식시켰고 6:00 AM부터 6:00 PM까지 점등되고 21℃에서 유지되는 방에서 키웠다. C57BL/6J 마우스 (n=10)에게는 전 연구 기간 동안 일반식을 계속 공급하였다. 아포-E 넉아웃 마우스를 4개의 군으로 나누었다. 군 1 (n=10)의 동물에게는 6주 이후로 12주 동안 고-콜레스테롤 식이 (1% 콜레스테롤)만을 제공하였고; 군 2 (n=10)의 동물에게는 6주 이후로 12주 동안 칸데살탄 (1 ㎎/㎏/d)과 함께 고-콜레스테롤 식이를 제공하였고; 군 3 (n=10)의 동물에게는 6주 이후로 12주 동 안 로수바스타틴 (1 ㎎/㎏/d)과 함께 고-콜레스테롤 식이를 제공하였으며; 군 4 (n=10)의 동물에게는 6주 이후로 12주 동안 칸데살탄 (1 ㎎/㎏/d) 및 로수바스타틴 (1 ㎎/㎏/d)과 함께 고-콜레스테롤 식이를 제공하였다.

12주 처리의 말기에, 마우스를 희생시켰고 하기에 기재된 연구를 수행하였다. 모든 실험 절차는 아칸사스 대학의 의과학을 위한 제도적 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.

죽상경화반의 정량 분석

12주 처리의 말기에, 각 군으로부터의 5마리의 마우스를 안락사시켰고 대동맥을 주위 조직으로부터 분리하였다. 외막 지방 조직의 제거 이후, 동맥을 동맥궁으로부터 장골 분지점까지 세로로 절개하였고, 10% 포르말린 중에서 24시간 동안 고정시켰다. 그 후, 동맥을 70% 알콜로 간단히 린싱하였고, 수단(Sudan) IV 용액으로 15분 동안 염색하였으며, 80%의 알콜에서 20분 동안 분화시켰고 흐르는 물에 1시간 동안 세정하였다 (Russell L. Techniques for studying atherosclerotic ledion, Lab Invest. 1958; 7:42-47). 대동맥을 슬라이드에 고정시켰고 해부 현미경에 연결된 카메라로 이의 사진을 찍었다. 그 이미지를 소프트웨어로 분석하였다 (Image Pro Plus, Media Cybernetics).

RNA 의 분리 및 RT - PCR 에 의한 분석

12주 처리의 말기에, 각 군으로부터의 5마리의 마우스를 안락사시켰고 대동맥(동맥궁으로부터 장골 분지점까지)을 주위 조직으로부터 분리하였으며 드라이 아이스 상에서 저장하였다. 각 대동맥을 4개의 절편으로 절단하였고, 이 중 2개의 절 편은 앞서 기재 (27)한 바와 같이 1단계의 산-구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법으로 총 RNA를 추출하기 위하여 사용하였다. 1 마이크로그램의 총 RNA를 42℃에서 1시간 동안 올리고-dT (미국 위스콘신주 매디슨의 프로메가) 및 말로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MLV) 역 전사효소(프로메가)로 cDNA로 역전사시켰다. 2 마이크로리터의 역전사(RT) 재료를 Taq DNA 중합효소 (프로메가) 및 마우스 LOX-1, CD40 또는 MMP (MMP-1, -2, -9)에 특이적인 프라이머 쌍으로 증폭시켰다. 마우스 LOX-1에 대하여, 전방향 프라이머: 5'-TTACTCTCCATGGTGGTGCC-3', 역방향 프라이머: 5'-AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC-3'을 사용하였다. 30 주기의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 94℃에서 40초 동안 (변성), 55℃에서 1분 동안 (어닐링), 및 72℃에서 1분 동안 (연장) 수행하였다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 생성물의 크기는 193개의 염기쌍이었다. 마우스 CD40에 대하여, 전방향 프라이머: 5'-GTTTAAAGTCCCGGATGCGA-3' 및 역방향 프라이머: 5'-CTCAAGGCTATGCTGTCTGT-3'을 사용하였다. 35 주기의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 94℃에서 1분 동안 (변성), 55℃에서 1분 동안 (어닐링), 및 72℃에서 1분 동안 (연장) 수행하였다. PCR 생성물의 크기는 408개의 염기쌍이었다. 마우스 MMP-1에 대하여, 전방향 프라이머: 5'-GGACTCTCCCATTCTTAATGAT-3' 및 역방향 프라이머: 5'-CCTCTTTCTGGATAACATCATCAAC-3'을 사용하였다. 마우스 MMP-2에 대하여, 전방향 프라이머: 5'-ATCAAGGGGATCCAGGAGC-3' 및 역방향 프라이머: 5'-GCAGCGATGAAGATGATAG-3'을 사용하였다. 마우스 MMP-9에 대하여, 전방향 프라이머: 5'-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3' 및 역방향 프라이머: 5'-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3'을 사용하였다. 모든 MMP에 대하여, 35 주기의 PCR을 94℃에서 1분 동안 (변성), 58℃에서 1분 동안 (어닐링), 및 75℃에서 1분 동안 (연장) 수행하였다. PCR 생성물의 크기는 각각 627, 718 및 753개의 염기쌍이었다. 마우스 β-액틴에 특이적인 프라이머 쌍을 하우스킵핑(housekeeping) 유전자 (전방향 프라이머: 5'-TTCTACAATGAGCTGCGTTG-3', 역방향 프라이머: 5'-CACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3')로서 사용하였다. 30 주기의 PCR을 94℃에서 30초 동안 (변성), 55℃에서 1분 동안 (어닐링), 및 72℃에서 1분 동안 (연장) 수행하였다. PCR 생성물은 560개의 염기쌍이었다. 역 전사 PCR (RT-PCR)로 증폭된 샘플을 브롬화에티듐을 사용하여 1.5% 아가로스 겔 상에서 가시화하였다.

단백질의 제조 및 웨스턴 블롯에 의한 분석

각 마우스 대동맥을 4개의 절편으로 절단하였다. 이들 중 2개의 절편은 DNA를 추출하기 위하여 사용하였고, 나머지 2개의 절편은 앞서 기재 (14)한 바와 같이 단백질을 추출하기 위하여 사용하였다. 간단하게 설명하면, 대동맥 조직을 균질화시키고 용해 완충제 내에서 용해시킨 후, 4℃에서 10분 동안 4000 rpm에서 원심분리하였다. 대동맥으로부터의 상기 용해된 단백질 (20 ㎍/레인)을 10% SDS-PAGE에 의해 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 블로킹 용액 (5% 탈지유, 시그마) 내에서 인큐베이션한 후, 막을 1/750로 희석된 마우스 LOX-1에 대한 모노클로날 항체, 1/500으로 희석된 마우스 CD40에 대한 폴리클로날 항체 (산타 크루즈), 1 ㎍/㎖로 희석된 마우스 MMP-1에 대한 모노클로날 항체 (온코진), 1 ㎍/㎖로 희석된 마우스 MMP-2에 대한 모노클로날 항체 (온코진), 1 ㎍/㎖로 희석된 마우스 MMP-9에 대한 모노클로날 항체 (온코진), 1/500으로 희석된 마우스 TIMP-1에 대한 폴리클로날 항체 (산타 크루즈), 1/500으로 희석된 마우스 TIMP-2에 대한 폴리클로날 항체 (산타 크루즈) 또는 1/5000으로 희석된 마우스 β-액틴에 대한 모노클로날 항체 (시그마)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 세정한 후 1/5000로 희석된 특이적 2차 항체 (아머샴 라이프 사이언스)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였고, 상기 막을 세정하였으며 ECL 시스템 (아머샴 라이프 사이언스)으로 검출하였다. 단백질 띠의 상대적 강도를 스캔-겔-잇 소프트웨어 (Scan-gel-it software)로 분석하였다 (Li DY, Zhang YC, Sawamura T, Mehta JL. Ciru Res. 1999; 84: 1043-1049).

데이타 분석

모든 데이타는 중복실험 샘플의 평균치를 나타낸다. 데이타를 평균치 ± SD로서 제공하였다. 통계적 유의성은 데이타의 독립적 군 간의 여러회의 비교를 통해 결정하였고, 이때 ANOVA 및 F 검정은 유의차의 존재를 나타낸다. AP 값<0.05를 유의한 것으로 간주하였다.

결과

칸데살탄과 로수바스타틴의 상승적 항-죽상경화증 효과

대조구 마우스 (일반식을 공급한 C57BL/6J 마우스)와 비교시, 고-콜레스테롤 식이를 공급한 아포-E 넉아웃 마우스에서 광범위한 죽상경화증이 발병되었다 (대조구 마우스와 비교하여 P<0.01). 칸데살탄 및 로수바스타틴 모두는 단독으로 사용시에도 죽상경화증의 정도를 감소시켰지만 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.05), 이들의 조합물은 훨씬 큰 정도로 죽상경화증을 감소시켰다 (고- 콜레스테롤 이외에 칸데살탄 또는 로수바스타틴을 단독으로 공급한 식이와 비교하여 P<0.05). 도 1은 상이한 동물 군에 있어서 대표적 실험의 결과 및 죽상경화증의 정도 (평균치 ± SD)를 보여주고 있다.

칸데살탄 및 로수바스타틴을 단독으로 공급하는 경우 각각 약 35% 및 24%만큼 죽상경화증을 감소시켰다. 이들의 조합물은 70%만큼 죽상경화증을 감소시켰고, 이는 상승 효과를 증명해주는 것이다. 이러한 결과는 도 2에서 그래프로 도시되어 있다.

LOX -1의 발현에 대한 칸데살탄과 로수바스타틴의 상승 효과

대조구 C57BL/6J 마우스에 있어서, LOX-1의 발현 (mRNA 및 단백질)은 낮았다. 반대로, 아포-E 넉아웃 마우스에 있어서 고-콜레스테롤 식이에 의해 LOX-1의 발현 (mRNA 및 단백질)은 현저하게 증가하였다 (대조구 마우스와 비교하여 P<0.01). 칸데살탄 및 로수바스타틴 모두는 단독으로 공급시에 약하기는 하지만 LOX-1의 발현 (mRNA 및 단백질)을 감소시켰다 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.05). 아포-E 넉아웃 마우스에 있어서 칸데살탄과 로수바스타틴의 조합물은 LOX-1의 상향조절에 대하여 현저한 억제 효과를 나타내었다 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.01).

CD40 의 발현에 대한 칸데살탄과 로수바스타틴의 상승 효과

대조구 C57BL/6J 마우스에서의 발현과 비교시 CD40의 발현 (mRNA 및 단백질)은 고-콜레스테롤 식이가 공급된 아포-E 넉아웃 마우스에서 현저하게 증가하였다 (대조구 마우스와 비교하여 P<0.01). 아포-E 넉아웃 마우스에 있어서 칸데살탄 및 로수바스타틴을 단독으로 처리시에 CD40의 발현이 약간 감소하였으나 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.05), 칸데살탄과 로수바스타틴의 조합물은 CD40의 발현 (mRNA 및 단백질)의 상향조절에 대하여 현저한 억제 효과를 나타내었다 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.01).

MMP 의 발현에 대한 칸데살탄과 로수바스타틴의 상승 효과

대조구 C57BL/6J 마우스에서의 발현과 비교시, MMP-1, -2, 및 -9의 발현 (mRNA 및 단백질)은 고-콜레스테롤 식이를 공급한 아포-E 넉아웃 마우스에 있어서 현저하게 증가하였다 (대조구 마우스와 비교하여 P<0.01). 칸데살탄 및 로수바스타틴 모두는 단독으로 처리시에 약하지만 MMP-1, -2 및 -9의 발현 (mRNA 및 단백질)을 감소시켰다 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.05). 칸데살탄과 로수바스타틴의 조합물은 이들의 발현에 대하여 현저한 억제 효과를 나타내었다 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.01).

TIMP의 발현에 대한 칸데살탄과 로수바스타틴의 효과

TIMP-1 및 TIMP-2 단백질 발현 역시 고-콜레스테롤 식이를 공급한 아포-E 넉아웃 마우스에 있어서 증가하였으나 (대조구 마우스와 비교하여 P<0.01), 증가의 정도는 MMP의 경우보다 작았다. 칸데살탄 및 로수바스타틴 모두는 단독으로 공급시에 TIMP-1 및 TIMP-2의 발현을 약간 감소시켰으나 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.05), 칸데살탄과 로수바스타틴의 조합물은 이들의 발현에 대하여 더 큰 억제 효과를 나타내었다 (고-콜레스테롤 식이만을 공급한 마우스와 비교하여 P<0.01, 고-콜레스테롤과 칸데살탄 또는 로수바스타틴을 단독으로 공급한 식이와 비교하여 P<0.05).

Claims

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죽상경화증의 예방 또는 치료를 위한, 칸데살탄(candesartan) 또는 이의 약학적 허용 염 및 로수바스타틴(rosuvastatin) 또는 이의 약학적 허용 염을 약학적 허용 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
심혈관 질환의 예방에 사용하기 위한, 칸데살탄 또는 이의 약학적 허용 염 및 로수바스타틴 또는 이의 약학적 허용 염을 약학적 허용 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
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죽상경화증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제2항에 따른 약학 조성물을 설명서와 함께 포함하는 키트.
제2항 또는 제3항에 있어서, 칸데살탄이 칸데살탄 실렉세틸(cilexetil)의 형태인 약학 조성물.