WO2006022281A1

WO2006022281A1 - コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防剤および治療剤

Info

Publication number: WO2006022281A1
Application number: PCT/JP2005/015323
Authority: WO
Inventors: Koichi Yoshimura; Hiroki Aoki; Masunori Matsuzaki
Original assignee: Yamaguchi University
Priority date: 2004-08-24
Filing date: 2005-08-24
Publication date: 2006-03-02
Also published as: JP2006089455A; EP1797899A1; US7750033B2; US20070248944A1; JP4686704B2; EP1797899A4

Abstract

　本発明は、ＪＮＫ阻害活性を有する物質を有効成分とするコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防および治療剤に関する。

Description

明細書

コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防剤および治療剤技術分野

[0001] 本発明は、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患、特に動脈瘤の予防剤および治療剤、ならびにコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリ一二ングする方法に関する。

背景技術

[0002] コラーゲンおよびエラスチンは、皮膚、骨'軟骨または関節、血管に主に分布し、その他、歯、腱、消化管、肺、子宮などにも広く分布している。そのため、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常は分布する各臓器で種々の疾患を引き起こすことが知られている。特にコラーゲンは、その 40%が皮膚に、 20%は骨や軟骨に存在し、その他血管や内臓にも広く分布している。先天性疾患 Ehlers— Danlos症候群に代表されるように、コラーゲン合成に必須の酵素の異常により、皮膚の過伸展と脆弱性、関節の過可動性と脱臼ならびに血管の脆弱性と出血などの症状を呈することがよく知られている。さらに心臓弁膜症、動脈解離、血管瘤 (動脈瘤または静脈瘤)などの心血管系、変形性関節症、脊柱変形、ヘルニアなどの骨軟骨系、腸管破裂、子宮破裂、膀胱破裂、気胸、肺気腫などの内臓系、眼球破裂、網膜剥離などの眼系または歯牙欠損、歯根膜炎などの歯系でも合併症を併発することがある。古くからよく知られているものでは、ビタミン C不足によりコラーゲン合成に異常をきたす壊血病がある。壊血病では、血管がもろくなつて、皮下出血、歯肉出血や内臓出血をきたすとともに、骨や皮膚がもろくなるなど全身症状を伴う。

[0003] 近年の研究で、骨や軟骨の形成に足場としてコラーゲンが必要なことが判明し、コラーゲンの代謝異常による骨軟骨症状の病態が裏づけされた。実際、コラーゲンまたはコラーゲンペプチドの投与により変形性関節症や慢性関節リウマチの症状が改善したとの臨床試験結果が報告されている他、動物実験ではコラーゲンペプチド投与が骨粗鬆症を改善することが報告されている。この他、創傷治癒においてもコラーゲンは必須の因子であり、コラーゲンの分解が合成を上回ると治癒過程に支障をきたし、潰瘍をきたす原因となる。

[0004] また、コラーゲンおよびエラスチンは皮膚の特に真皮に多く分布し、それぞれ皮膚の柔軟性と弾力性の保持に必須と考えられて、る。コラーゲンおよびエラスチンの代謝異常、すなわち分解が合成を上回ることで総量が減少すると、その結果としてしわやたるみ、しみと言ったいわゆる皮膚の老化が発症する。日焼けなどの紫外線照射により皮膚の老化症状が増加するが、その病態にぉ、てもコラーゲンおよびエラスチンの代謝異常を伴っていることが近年明らかになった。

[0005] さらに、コラーゲンおよびエラスチンは、血管壁の強度と弾性を保っために重要である。コラーゲンおよびエラスチンやその合成に必要な酵素の遺伝子異常が原因の先天性疾患 (Ehlers— Danlos症候群など)では、動脈の瘤化、解離、破裂をきたすことが知られている。同様に、コラーゲンおよびエラスチンの両方の合成に必要な酵素であるリジン酸化酵素 (LOX)の遺伝子欠損マウスや I型または III型コラーゲン遺伝子改変マウスにおいても動脈の瘤化、解離、破裂をきたすことが報告されている。また、急性冠症候群 (急性心筋梗塞、不安定狭心症、突然死)の発症は、冠動脈粥状硬化巣 (プラーク)の破綻が原因とされているが、破綻しやすい不安定なプラークの病態には、コラーゲンおよびエラスチンの分解亢進とそれによる線維性被膜の菲薄化、脆弱化が深く関わっている。

[0006] 動脈瘤は、動脈硬化、炎症、感染、先天異常など様々なものがその一次的な原因として知られているが、いずれもコラーゲンおよびエラスチンの代謝異常が直接的な原因となって動脈壁が脆弱化することにより形成される大動脈や末梢動脈の膨らみである。動脈瘤には、壁全層が拡大する真性動脈瘤と血管壁が裂けて血管壁内に血液が流入することによって発生する解離性動脈瘤とが知られて、る。、ずれも進行とともに瘤径が拡大し、放置すればいず; ίτ¾裂して死に至る疾患である。動脈瘤は、このように臨床上重要な疾患であるにもかかわらず、その生命予後の改善のためにでき得る現在唯一の治療方法は外科的治療 (外科的切除またはステントグラフト留置等)である。しかしながら、手術自体患者への負担が大きぐ手術の危険性が動脈瘤破裂の危険性を上回る場合もまれではないため、新たな動脈瘤低侵襲治療、特に薬物療法が望まれていた。 [0007] 上記のように動脈瘤は、動脈壁を構成して、る細胞外基質、特にコラーゲンおよびエラスチンの分解亢進または合成異常により動脈壁が脆弱化することによって発症し、進展、そして破裂に至ると考えられている。実際、細胞外基質分解に関わる種々の

、て亢進して 1、ることが観察されてきた。その中でも特に細胞外基質分解酵素の一群であるマトリックスメタ口プロテアーゼ (MMP)は、それらの遺伝子欠損マウスにおいて実験的動脈瘤の発生が予防されることから、動脈瘤の発生進展に必須であるとされ、注目されてきた。さらに、 MMP阻害活性をもつ薬物を用いてモデル動物における実験的動脈瘤の発生予防を示した報告がある。しかしながら欧米において、小径腹部大動脈瘤の瘤径拡大予防を目的とした MMP活性阻害剤の治験が実施されたが、現在までに明らかな瘤の進展防止効果は報告されていない (非特許文献 1)。

非特許文献 1 :J. Vascular Surgery 36 : 1— 12 (2002)

発明の開示

[0008] コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常によって発症する疾患は、皮膚、心血管、骨軟骨、内臓、眼または歯といった全身の諸臓器でみられ、動脈瘤もまた、コラーゲンおよびエラスチンの分解亢進と合成低下または合成異常による代謝異常が直接的な原因で発症、進展する。したがって、これらの疾患は、その直接的原因であるコラ一ゲンまたはエラスチンの代謝異常を改善することで理想的に治療することができると考えられる。しカゝしながら、コラーゲンまたはエラスチン分解抑制活性と合成増強活性を合わせ持ち、統合的にコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常を改善する薬剤の報告はなかった。

[0009] 動脈瘤は、放置すると次第に拡大し、やがて破裂して死に至る病気であり、破裂以前にはほとんど無症状である。実際、発見時にはすでに破裂の危険性がある大きさに達していることが大半である。また、破裂の危険性は瘤径が大きくなるほど高まってくる。このため瘤破裂の可能性がほとんどない小径動脈瘤に対しては、それ以上拡大しないような「拡大予防」でも、十分な治療効果をもっと考えられる。しかしながら、径が大きく瘤破裂の可能性がある動脈瘤に対しては、「拡大予防」のみでは破裂の危険性を軽減してヽなヽため治療効果をもっとは言えず、瘤を退縮させ破裂死の危険性を回避できてこそはじめて「有効かつ有意義な治療」といえる。し力しながら、これまで瘤を薬物的に退縮することは非現実的とされ、薬物的な瘤退縮治療の報告は概念的にも実験的にも皆無である。

[0010] そこで、本発明は、コラーゲンまたはエラスチン分解抑制活性と合成増強活性を合わせ持ち、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常を改善する薬剤を提供することを目的とする。本発明はまた、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の一種である動脈瘤の予防および治療剤を提供すること、より詳細には、動脈瘤の発生または拡大を予防、または動脈瘤の退縮治癒によって破裂を阻止することができる動脈瘤の予防剤および治療剤を提供することを目的とする。

[0011] 本発明者らは、培養実験系において JNK依存性遺伝子群を網羅的に検索した結果、コラーゲンまたはエラスチンをはじめとする細胞外基質分解に関わる遺伝子群が JNK依存的に発現亢進すること、ならびにコラーゲンまたはエラスチンの合成に必須の酵素群 (プロリン水酸化酵素（P4H)、リジン水酸化酵素（PLOD)およびリジン酸化酵素 (LOX) )が JNK依存的に発現低下することを見出した。本発明者らはこの知見を基にして、 JNK阻害剤がコラーゲンまたはエラスチン代謝に及ぼす効果を培養実験系にお、て検討した結果、 JNK阻害活性を有する物質がコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防剤および治療剤として有効であること、 JNK阻害剤がコラーゲンまたはエラスチン代謝を総合的に是正することによって動脈瘤壁の再構築を促進し、動脈瘤を退縮せしめることを見出し、本発明を完成するに至った。

[0012] すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。

[0013] (l)JNK阻害活性を有する物質を有効成分とするコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防剤または治療剤。

[0014] (2)コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が、皮膚疾患、骨もしくは軟骨疾患

、心血管疾患または肺もしくは消化管の内臓疾患の少なくとも一種である（1)に記載の予防剤または治療剤。

[0015] (3)JNK阻害活性を有する物質が、コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質である（1)または（2)に記載の予防剤または治療剤。

[0016] (4)コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、リジン酸化酵素を活性化させる物質である（3)に記載の予防剤または治療剤。

[0017] (5)コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、プロリン水酸化酵素を活性化させる物質である (3)に記載の予防剤または治療剤。

[0018] (6)コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、リジン水酸化酵素を活性化させる物質である（3)に記載の予防剤または治療剤。

[0019] (7)コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が、動脈瘤である（1)〜（6)のいずれかに記載の予防剤または治療剤。

[0020] (8)JNK阻害活性を有する物質が、薬物的な瘤拡大抑制作用を有する物質である（

7)に記載の予防剤。

[0021] (9)JNK阻害活性を有する物質が、薬物的な瘤退縮作用を有する物質である（7)に記載の治療剤。

[0022] (10)動脈瘤が、真性大動脈瘤と解離性大動脈瘤とを含む大動脈瘤である（7)〜（9

)の、ずれかに記載の予防剤または治療剤。

[0023] (11)動脈瘤が、腹部大動脈瘤と胸部大動脈瘤を含む大動脈瘤である（7)〜（9)の

V、ずれかに記載の予防剤または治療剤。

[0024] (12)JNK阻害活性を有する物質が、 JNK阻害活性を有する化合物またはその薬学上許容される塩である（1)〜（11)の!、ずれか〖こ記載の予防剤または治療剤。

[0025] ( 13) JNK阻害活性を有する化合物が、ピラゾ口アントロンまたはその誘導体である（

12)に記載の予防剤または治療剤。

[0026] ( 14) JNK阻害活性を有する物質が、 JNK阻害活性を有するペプチドまたは核酸である（1)〜（11)のいずれかに記載の予防剤または治療剤。

[0027] ( 15) JNK阻害活性を有する物質力ペプチドが c Jun N—末端キナーゼぺプチドインヒビター 1 D体 (D— JNKI1)である（14)に記載の予防剤または治療剤。

[0028] (16)注射剤の形態である（1)〜（15)の、ずれかに記載の予防剤または治療剤。

[0029] (17)経口剤の形態である（1)〜（15)のいずれかに記載の予防剤または治療剤。

[0030] (18)外用薬の形態である（1)〜（15)のいずれかに記載の予防剤または治療剤。

[0031] (19)被検物質の JNK阻害活性を測定することを含む、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリーニングする方法。

[0032] (20)被検物質のコラーゲンまたはエラスチン分解抑制活性および合成促進活性の両方を測定することを含む、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリーニングする方法。

[0033] JNKの活性ィ匕によりコラーゲンまたはエラスチンの分解促進と再生阻害が同時に生ずるという病態機序に基づき、 JNK阻害剤によりこれらの諸因子を統合的に是正、すなわちコラーゲンまたはエラスチンの崩壊を防止するとともに組織再構築能を積極的に回復させることにより、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患、特に動脈瘤の発生や拡大を予防し、或いは瘤を退縮治癒させることができる。そして、本発明により動脈瘤の破裂が根本的に防止でき、進んで動脈瘤患者の生命予後の改善を図ることがでさる。

図面の簡単な説明

[0034] [図 1]塩ィ匕カルシウム処置マウス動脈瘤モデルにおける JNK阻害剤による動脈瘤治療 ·退縮実験の結果を示すグラフである。

[図 2]アポ Eノックアウトマウス動脈瘤モデルにおける JNK阻害剤による動脈瘤治療 · 退縮実験の結果を示すグラフである。

[図 3]培養細胞における JNK阻害ペプチドによるコラーゲンまたはエラスチンの分解酵素 MMP— 9の抑制効果を示すグラフである。

[図 4]ヒト動脈瘤壁培養系における JNK阻害ペプチドによるコラーゲン合成能の回復促進効果を示すグラフである。

[図 5]培養細胞における JNK阻害ペプチドによるコラーゲン合成能の促進効果を示すグラフである。

[図 6]培養細胞における JNK阻害剤によるプロリン水酸ィ匕酵素の発現増強効果を示すグラフである。

[図 7]培養細胞において JNK阻害ペプチドによるリジン酸ィ匕酵素の発現増強効果を示すグラフである。

[図 8]培養細胞において JNK2特異的阻害によるコラーゲンまたはエラスチンの合成促進効果を示すグラフである。 [図 9]塩ィ匕カルシウム処置マウス動脈瘤モデルにおける JNK2阻害による動脈瘤治療実験の結果を示すグラフである。

[0035] 本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第 2004— 244316号および第 2005 035769号の明細書および Zまたは図面に記載された内容を包含する。

発明を実施するための最良の形態

[0036] 本発明者らは、上記の技術的背景に鑑み、基礎的研究を重ねた結果、コラーゲンおよびエラスチンを含む細胞外基質の代謝バランスを分解の方向に統合的に制御し、組織の脆弱化をもたらす鍵因子として JNKを見出した。

[0037] JNKは、 c Junのァミノ末端をリン酸化する酵素で、 MAPキナーゼの一種であり、インターロイキン 1 (IL 1)、腫瘍壊死因子 a (TNF ひ）等のサイト力インや紫外線照射、熱ショック、高浸透圧等の物理化学的なストレス刺激で活性化される酵素の一種である。 JNKはまた、 c Junを構成遺伝子とする転写因子 AP— 1をリン酸化し、炎症に関与する遺伝子 Cox— 2等の発現をも誘導することが知られ、またアポトーシスに関与するとも考えられていた。しかしながら、 JNKの細胞外基質代謝バランスにおける役割とコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患、特に動脈瘤の病態における役割については不明であった。

[0038] 一方、動脈瘤は、細胞外基質、特にコラーゲンまたはエラスチンの分解亢進によつて動脈壁が脆弱化し、動脈圧を支えきれなくなって拡大し始めるので、初期の段階で分解系を抑止できれば動脈瘤の発生は予防できると考えられる。実際に細胞外基質分解系の因子を阻害することによって実験的動脈瘤の発生を予防した報告はすでに知られている。

[0039] し力臨床における動脈瘤は、発見時にはすでに瘤径が拡大し、壁は脆弱なため、たとえそれ以上の細胞外基質分解機転が完全に阻止されたとしても、その破壊された組織構築を回復しな!、限りはヽずれ動脈圧を支えきれなくなって破裂することになる。し力も径の拡大した壁には、正常径動脈壁以上に圧力が負荷されることが、 La placeの法則として知られている。したがって、すでに拡大した動脈瘤を退縮せしめるためには、コラーゲンまたはエラスチンの分解亢進を抑制すると同時に、それらの合成系を回復もしくは亢進させ組織構築の再生を積極的に促すことが必要不可欠である。

[0040] 本発明者らは、 JNKが活性化すると、複数の MMP酵素群、リポカリン 2、誘導性一酸化窒素合成酵素 (iNOS)や IL 1等の発現が亢進され、その結果、主たる細胞外基質分解酵素 MMP— 9活性が著しく亢進し、 MMP抑制因子 (TIMP— 3)が減少することを培養実験系の検討から見出した。さらに、複数の培養実験系において、 JN K阻害剤が MMP— 9の活性阻害効果を示すのみならず、コラーゲンおよびエラスチン合成に必須な酵素リジン酸化酵素およびプロリン水酸化酵素の発現量と活性を亢進することを見出した。さらに、ヒト動脈瘤壁の培養実験系において JNK阻害剤がコラーゲンまたはエラスチンを分解する蛋白分解酵素群 MMPの活性を統合的に阻害することに着目し、まず JNK阻害剤がマウス実験的大動脈瘤の発生をほぼ完全に予防することを証明した。それのみならず、本発明者ら WNK阻害活性を有する物質力 Sコラーゲンまたはエラスチンの分解阻害と同時にコラーゲンまたはエラスチンの合成増強活性を有するという新たな発見を合目的に利用して、一旦作製したマウス実験的大動脈瘤を JNK阻害剤投与により退縮治癒することに成功した。既にある動脈瘤を薬物的に退縮治癒することは本発明者らによって世界で初めて達成されたことで、これまでに概念的にも全く知られていなかった。

[0041] 一般に組織の構造の破壊には MMPを始めとする多くの蛋白分解酵素が関与しているとされ、動脈瘤の場合、特に MMP— 9が重要であることが Pyoらの実験 (J. clin . Invest. 105 : 1641— 1649 (2000) )【こより示されて! /、る。また、臨床サンプノレを用いた Thompsonらの実験結果 (J. clin. Invest. 96 : 318— 326 (1995) )や Mc Millanらの解析結果（Circulation 96 : 2228— 2232 (1997) )力ら、ヒトの動脈瘤組識にも多くの MMP— 9が認められることが明ら力となっている。一方、細胞外基質、特にコラーゲンおよびエラスチンの分解系のみならず、合成系の異常が動脈瘤の病態に関与していることも考えられる。 O' Donnellらによると高脂血症マウスにリジン酸ィ匕酵素阻害剤を投与して合成系を抑制すると大動脈瘤が発症した (Circulation 108 : (supplement IV) , IV— 252 (2003) )。また本発明者らが、動脈瘤モデルマウスにリジン酸化酵素を遺伝子導入して合成系を回復すると大動脈瘤の拡大が抑制された。

[0042] 一実施形態において本発明は、 JNKの活性阻害により、前記のとおりリポカリン 2、 i NOS、IL- lあるいは MMP-9など組織 (特に動脈壁）を構成する細胞外基質の崩壊を助長する因子の働きを統合的に阻害し、且つプロコラーゲン (コラーゲン前駆体）の発現および細胞外基質合成に必須な酵素群 (リジン水酸化酵素、プロリン水酸ィ匕酵素およびリジン酸化酵素）の発現の是正により細胞外基質合成能を回復させ、組織 (特に動脈壁)の構築を再生治癒するものである。

[0043] したがって本発明の一実施形態においては、 JNKの活性を阻害することが直接的に組織 (特に動脈壁)の細胞外基質、特にコラーゲンまたはエラスチン代謝バランスを改善し、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患、特に動脈瘤の予防または治療に有効であり、注射投与、経口投与または外用等により、生体内で有効に JNKの活性を阻害する物質を用いる力ぎり、薬物的お NK阻害手段は特に制限されない。

[0044] 本発明でいう JNKは、 JNK1、 JNK2および JNK3を含み、これら JNK1、 JNK2および JNK3の 3種類の遺伝子には、それぞれコードされたいくつかのアイソフォームが存在することが知られている。本発明における JNK阻害とは、これらァイソフォームに特異的な阻害と非特異的な阻害の両方を含むものである。

[0045] 特に動脈瘤に関して、本発明者らはァイソフォーム非特異的な薬物的 JNK阻害によってマウス動脈瘤の拡大抑制効果を示したが、同等の動脈瘤抑制効果が JNK2の特異的阻害によっても示されることを見い出して、る。

[0046] コラーゲンまたはエラスチンの代 f異常疾患は、その代表的な Ehlers— Danlos症候群でみられるように皮膚の過伸展と脆弱性、関節の過可動性と脱臼ならびに血管の脆弱性と出血など、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常によって引き起こされた組織の脆弱化あるいは組織構築の崩壊に伴う諸症状を特徴とする疾患群である。より具体的には、心臓弁膜症、動脈解離、血管瘤、急性冠症候群などの心血管系疾患、変形性関節症、脊柱変形、ヘルニアなどの骨軟骨系疾患、腸管破裂、子宮破裂、膀胱破裂、気胸、肺気腫などの内臓系疾患、眼球破裂、網膜剥離などの眼系疾患、歯牙欠損、歯根膜炎などの歯系疾患、ビタミン C不足によりコラーゲン合成に異常をきたす壊血病、ならびに皮膚の老化などが挙げられる。 [0047] JNK阻害剤は、コラーゲンまたはエラスチンの病的代謝を細胞レベルおよび組織レベルで改善し正常化する効果を持つので、これらのコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患に対して合理的な予防剤または治療剤であると考えられる。本発明の予防剤または治療剤は、動脈瘤の予防または治療に特に好適に用いられる。

[0048] 本発明でヽぅ動脈瘤は、通常、動脈瘤と!/、われる病態を全て含むものである。

[0049] 動脈瘤はその発生部位、その原因、またはその形状により様々に分類される。例えば、発生部位による分類としては、胸部大動脈瘤や腹部大動脈瘤を含む大動脈瘤、脳動脈瘤ゃ腎動脈瘤などの内臓動脈瘤または末梢動脈に発生する瘤等が挙げられる。壁構造によっては、真性動脈瘤、解離性動脈瘤、仮性動脈瘤等に分類される。原因による分類としては、動脈硬化性動脈瘤、炎症性動脈瘤、先天性動脈瘤、外傷性動脈瘤または細菌性動脈瘤、真菌性動脈瘤、梅毒性動脈瘤に代表される感染性動脈瘤等が挙げられる。形状による分類としては、嚢状動脈瘤と紡錘状動脈瘤等が挙げられるが、本発明は特に限定されない。

[0050] 本発明で、う動脈瘤の予防とは、動脈瘤径のそれ以上の拡大を阻止する「拡大予防」のほかに、血管壁の脆弱化を防ぎ動脈瘤の発生を防ぐこともその予防に含まれる。さらには、発生予防または拡大予防によって達成される破裂の予防も含まれる。「拡大予防」は、特に発見時に瘤の破裂の危険性がほとんどない小径動脈瘤を対象とした場合にはそれのみで動脈瘤治療の目標である破裂防止効果があり、「破裂予防」とともに意義がある。したがって、広義の動脈瘤治療には予防も含まれる。し力しながら、すでに瘤が存在する場合「発生予防」には治療的意義はなぐ同様にすでに破裂の可能性を有する大きな瘤の場合には「拡大予防」のみでは破裂を防止することにならず治療的意義は少ない。なぜなら動脈瘤に対する最大の治療目標は、動脈瘤破裂による出血死を防ぎ、患者の生命予後を改善することだからである。本発明で V、う動脈瘤治療は、すでに破裂の可能性を有する動脈瘤を退縮または消失させることにより破裂の危険性を回避する動脈瘤の根本的治療を包含する。

[0051] 本発明は、コラーゲンまたはエラスチン分解抑制活性と合成増強活性を合わせ持つ、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患 (特に動脈瘤)の予防剤および治療剤を提供するものであるが、同時に本発明は、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患 (特に動脈瘤）に対し予防活性または治療活性を有する物質を選択または同定 (スクリーニング)する時の有用な評価指標を提供する。

[0052] 第一の指標は、 JNK活性の阻害能である。すなわち一実施形態にお!、て本発明は、被検物質の JNK阻害活性を測定することを含む、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患、特に動脈瘤に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリーユングする方法に関する。より具体的には、被検物質の JNK阻害活性は、 JNK1、 JN K2および JNK3による基質 c Junリン酸ィ匕の抑制効果を検出する無細胞キナーゼアツセィ等で試験しうる。そして、 JNK阻害活性を有する被検物質を、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患に対し予防活性または治療活性を有する物質として同定できる。

[0053] 第二の指標は、コラーゲンまたはエラスチンの分解抑制能である。すなわち一実施形態において本発明は、被検物質のコラーゲンまたはエラスチン分解抑制活性を測定することを含む、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患、特に動脈瘤に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。より具体的には、被検物質のコラーゲンまたはエラスチン分解抑制活性は、培養細胞系でコラーゲンまたはエラスチンの代表的分解酵素である MMP活性の抑制効果を免疫ァッセィ法やザィモグラフィ一法等で試験することにより測定できる。そして、コラーゲンまたはエラスチン分解抑制活性を有する被検物質を、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患に対し予防活性または治療活性を有する物質として同定できる。

[0054] 第三の指標は、コラーゲンまたはエラスチンの合成促進能である。すなわち一実施形態において本発明は、被検物質のコラーゲンまたはエラスチン合成促進活性を測定することを含む、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患、特に動脈瘤に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。より具体的には、被検物質のコラーゲンまたはエラスチン合成促進活性は、培養細胞系でコラーゲンまたはエラスチンの必須合成酵素であるプロリン水酸ィ匕酵素（P4H)、リジン水酸化酵素 (PLOD)およびリジン酸化酵素 (LOX)の増強または回復効果を特異的基質を用いたアツセィにより活性レベルで検出する方法または PCRにより発現レべルで検出する方法等で測定しうる。そして、コラーゲンまたはエラスチン合成促進活性を有する被検物質を、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患に対し予防活性または治療活性を有する物質として同定できる。

[0055] コラーゲンまたはエラスチンの合成促進能および分解抑制活性の両方を指標としてスクリーニングすることが特に有効である。すなわち一実施形態において本発明は

、被検物質のコラーゲンまたはエラスチン合成促進能および分解抑制活性の両方を測定することを含む、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患、特に動脈瘤に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。

[0056] これらの指標により段階的に物質が選択され、その結果、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患、特に動脈瘤に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリー-ングすることができる。被検物質としては、特に制限されず、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、ペプチドなどの単一化合物、ならびに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。

[0057] 本発明にお、て、 JNK阻害活性を有する物質 CFNK阻害剤と称する場合もある）としては、既知の JNK阻害活性を有する化合物（Nat Rev Drug Discov 2 : 554 - 565 (2003) , Curr Drug Targets CNS Neurol Disord 1 : 31—49 (200 2) , Trends Pharmacol Sci 23 :40-45 (2002) , Circulation 109 : 1196— 1205 (2004) , Curr Opin Pharmacol 3 :420— 425 (2003) , Biochim Biop hys Acta 1697 : 89— 101 (2004) , Drug Discov Today 9 : 932— 939 (20 04) )またはその薬学上許容される塩、既知の JNK活性を阻害するペプチドまたは核酸が例示される。

[0058] 上記の JNK阻害活性を有する化合物は次の一般式（ 1)〜（ 13)で示される化合物からなる群から選択される少なくとも一の化合物が例示される。

[0059] 一般式（1)

[化 1]

(1)

[0060] [但し、上記式中、 Rと Rは、それぞれ同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子

1 2

、アルキル基、ニトロ基、三フッ化メチル基、スルホ-ル基、カルボキシル基、アルコキシカルボ-ル基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールォキシ基、ァリールアルキルォキシ基、ァリールアルキル基、シクロアルキルアルキルォキシ基、シクロアルキルォキシ基、アルコキシアルキル基、アルコキシアルコキシ基、アミノアルコキシ基、モノまたはジアルキルアミノアルコキシ基、または次の（a)、（b)、（c)、または（d)の式で示されるグノレープの!/、ずれかである。

[化 2]

— N — NH— (R)-N — _N, ⁵ 。 ^R s

R \ 、 ~ N

⁴ R 4 H 、H

(^a) (b) (c) 【_d)

[0061] (上記 Rはアルキレン基、 Rと Rは末端が連結したアルキレンまたはへテロ原子を含

3 4

むアルキレン、或いは、それぞれ同一または異なり、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、ァリール基、ァリールアルキル基、シクロアルキルアルキル基、ァリールォキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アルコキシァミノ基、またはアルコキシ（モノまたはジーアルキルァミノ）基を表し、 Rは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル

5

基、ァリール基、ァリールアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、モノまたはジ一アルキルアミノ基、ァリールアミノ基、ァリールアルキルアミノ基、シクロアルキルアミノ基、またはシクロアルキルアルキルアミノ基を表す。）]

一般式 (2)

(2)

[0062] [但し、上記式中、は非置換または置換ィ匕ァリール基またはへテロアリール基であり、 Rおよび Rはそれぞれ同一または異なり、水素原子または、低級アルキル基であ

2 3

り、 Rは、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基および低級アルコ

4

キシ基であり、 Rおよび Rはそれぞれ同一または異なり、水素原子または、アルキル

5 6

基、非置換または置換ィ匕ァリール基である。 ]

一般式 (3)

[化 4]

(3)

[0063] [但し、上記式中、 R、 Rは水素原子、低級アルキル基および低級アルコキシ基、 X

1 2

は、 0、 S、または NHであり、 Gは、非置換または置換ィ匕ピリミジニル基である。 ] 一般式 (4)

[化 5]

[0064] [但し、上記式中、 Arおよび Arは、互いに独立して、非置換または置換ィ匕ァリール基またはへテロアリール基であり、は水素原子または低級アルキル基であり、 nは、 0から 5の整数であり、 Xは Oまたは Sであり、 Yは、少なくとも一のへテロ原子を含む非置換もしくは置換化 4 8員へテロ環、非置換または置換ィ匕ァリール基またはへテロアリール基である。 ]

一般式 (5)

[化 6]

[但し、上記式中、 R、 Rは互いに独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基

1 2

、低級アルキル基および低級アルコキシ基である。 ]

一般式 (6)

[化 7]

(6)

[0066] [但し、上記式中、 X—Y—Zは以下の式のいずれかから選択される;

[化 8]

Nゝ C O^CR, ^^Ν¾ °-c^ ^{H CR}2

[0067] R、 R、および Rは、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、非置換または置換ィ匕ァリール基、ァリールアルキル基であり、 Gは非置換または置換ィ匕ァリール基、ヘテロァリール基であり、 Q— NHは下記の式である；

[化 9]

(上記式中、 Aは Nであり、 Uは 0、 S、または NHである）]

式 (7)

[化 10]

(7) 一般式 (8)

[化 11]

[但し、上記式中、 R、 Rおよび Rは独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基

1 2 3

、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換ィヒアリール基またはへテロァリール基であり、 Xは Nまたは CHである。 ]

一般式 (9) [化 12]

(9)

[0071] [但し、上記式中、は、非置換または置換ィ匕ァリール基、ァリールォキシ基、ヘテロァリール基、ヘテロァリールォキシ基、または置換されたへテロァリールォキシで置換された低級アルキルであり、 Rおよび Rは、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、

2 3

低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換ィヒアリール基またはへテロァリール基であり、 Xは、 Nまたは CHであり、 zで示した点線の結合は随意である。 ] 一般式 (10)

[化 13]

(10)

[0072] [但し、上記式中、 R、 R、 Rおよび Rは独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキ

1 2 4 5

シ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換ィ匕ァリール基またはへテロアリール基であり、 L— X— Yは NH— CO— Rであり、 Rは、非置換または置換ィ匕ァリールアルキル基またはへテロアリールアルキル基である。 ]

一般式 (11)

[化 14]

(11)

[0073] [但し、上記式中、 R、 R、 Rおよび Rは、互いに独立して、水素原子、ハロゲン原

1 2 4 5

子、ヒドロキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換ィ匕ァリール基またはへテロアリール基であり、 Rは、 Xと一緒になつて、完全に飽和した 5〜7員

3

環を形成しており、前記環中の各飽和炭素は、 =oまたは =sで任意に、且つそれぞれ別個にさらに置換されている。 Yは、 CHまたは Nであり、 nは 1である。 ] 一般式 (12)

[化 15]

(12) · (12) - 2

[0074] [但し、上記式中、 R、 R、 R、 Rおよび Rは、互いに独立して、水素原子、ハロゲン

1 2 3 4 5

原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換ィ匕ァリール基、シクロアルカン基またはへテロアリール基であり、 Xは 1から 3個の炭素を有する結合またはアルキル架橋である力、 HETCyと一緒になつて、完全に飽和した 5 〜7員環を形成しており、 Yは NHであり、 HETCyは、少なくとも 1個の N原子を含有して、る 4〜6員のへテロアリール基である] 一般式 (13)

[化 16]

[但し、上記式中、 Rはアルキレンチォアルキル基またはアルキレンアルキルエーテル基、 R 、 Rはそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級ァ

8 9

ルキル基、低級アルコキシ基またはアルコキシアルキル基である。 ]

上記に例示される一般式で示される化合物の内、特に有効な JNK阻害剤となる具体的化合物の例を、それぞれ対応する番号を付して、次の式（1)〜（13)で示す。

[化 17]

(1) (2)

[化 18]

[化 19]

(9) (10)

[化 22]

(13) これらの化合物のうち、一般式（1)で示される化合物は特に効果が優れており、特に予防または治療剤として注射剤の形態とすることが望ま、。前記式 (2)で示されるァ-リノピリミジン誘導体は注射剤としても使用可能である力特に経口剤として有効に使用できるため、本発明において治療用は勿論、予防剤として優れた有用性が期待できる。前記式（3)および式 (4)で示される化合物は、特に経口剤として有効である。

[0077] 式（1)で表されるピラゾ口アントロン骨格を有するアントラピラゾールー 6—オンは、製品名 SP600125として市販されており、 ATPに対する競合的な阻害作用により、 I L- 1で刺激された細胞で、 AP- 1の転写活性の抑制、ヒト末梢血単核細胞で、 Cox- 2、 IL- 2、 IFN- γ、 TNF- αの炎症性遺伝子の発現を阻害する目的や、関節炎モデル動物で、 MMPの発現と骨の破壊を抑制するため或いは LPSで誘導される TN F- αの発現を抑制し、アポトーシス抑制のために使用されている。

[0078] 本発明で使用される化合物は、その薬学上許容される塩であってもよぐ塩基性化合物の場合は例えばカルボン酸、スルホン酸等の有機酸、硫酸、塩酸、鉱酸等との塩が、酸性ィ匕合物の場合は例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属、有機塩基等との塩が挙げられる。カルボン酸、スルホン酸等の有機酸としては、例えば酢酸、アジピン酸、安息香酸、クェン酸、フマール酸、ァスパラギン酸、乳酸、リンゴ酸、パルミチン酸、サリチル酸、酒石酸、ベンゼンスルホン酸、カンファースルホン酸、トルエンスルホン酸が、鉱酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。アル力リ金属、アルカリ土類金属、有機塩基等としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ノリウム、テトラメチルアンモ-ゥム、テトラプチルアンモニゥム等が挙げられる。

[0079] 本発明で使用される化合物は光学活性体、またはラセミ体、ジァステレオマー、またはジァステレオマーの混合物、個々のェナンチォマーからェナンチォマーの混合物までを全て包含するものである。また、置換基の結合位置等は特に限定しない限り、結合可能な位置異性体すベてを含む。更に、水和物等の溶媒和物、溶媒和物の互変異性体等のように様々な多形も本発明で使用される化合物に含まれる。

[0080] 本発明における上記一般式で表される一連の化合物群は、それぞれ引用する公開公報、国際公表公報において開示された製造法によって製造されるが、それらの方法に限定されるものではない。 [0081] 本発明にお、て JNK阻害活性を有する物質として上記一般式で表される一連の化合物が用いられる場合は、単独または溶解剤、増量剤、賦形剤または担体と混合して注射剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、貼付剤、軟膏剤、スプレー剤、溶液剤、徐放剤等の製剤とし、賦形剤または担体等の添加剤としては薬学的に許容されるものが選ばれ、その種類および組成は投与経路や投与方法によって決まる。例えば注射剤の場合、一般に食塩、グルコース、マン-トール等の糖類が望ましい。経口剤の場合、でんぷん、乳糖、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム等が望ましい。

[0082] 投与経路は、経口もしくは注射により、または外用剤等により非経口により全身に投与する方法の他、軟膏剤、溶液剤、貼付剤やスプレー剤等により病変部または病変部近傍局所に直接投与する方法、カテーテル等により病変部または病変部近傍に遠隔的に投与する方法等が選ばれる。動脈瘤予防剤としては、特に経口投与が好ましい。動脈瘤治療剤としては、その破裂の危険度によって、経口剤のみならず注射剤または薬剤結合ステントグラフト等も望ましい。より具体的には、ステントゃグラフトまたは一体化させたステントグラフトに薬剤を結合させ血管病変部または病変部近傍に留置することにより徐放性に投与する方法等である。現在のステントグラフトを用いた低侵襲血管内治療は、動脈瘤自体の解剖学的所見にステントグラフトの形状が適合する場合に良好な成績が期待されるが、うまく適合しない場合には治療効果は期待できないため、その適応は動脈瘤自体の解剖学的所見によって制限されているのが現状である。本発明における動脈瘤治療剤はその瘤退縮効果により動脈瘤自体の解剖学的異常所見を改善しうるので、動脈瘤治療剤を組み合わせたステントグラフト治療は、より多くの動脈瘤患者に適用されることが期待できる。また、皮膚、骨'軟骨または関節におけるコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患に対する治療剤としては、経口剤または注射剤のみならず貼付剤、軟膏剤、スプレー剤等の外用剤も望ましい。

[0083] 本発明の予防剤および治療剤中における本ィ匕合物の含量は製剤により種々異なるが通常 0. 001〜100重量％、好ましくは 0. 01〜98重量％である。例えば注射剤の場合には、通常 0. 001〜30重量％、好ましくは 0. 01〜10重量％の有効成分を含むようにすることがよい。経口剤の場合には、添加剤とともに錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態で用いられる。カプセル剤、錠剤、顆粒

、散剤は一般に 0. 1〜： L00重量％、好ましくは 1〜98重量％の有効成分を含む。投与量は、患者の年令、体重、症状等により決定される力治療量は一般に、非経口投与で 0. 001〜10mgZkgZ曰、経口投与で 0. 01〜： LOOmgZkgZ曰である。溶液で用いる場合は、 1〜： LOOOnMの濃度で用いる。

[0084] 本発明にお、て、 JNK阻害剤を有効成分とする動脈瘤の予防剤または治療剤を注射剤とする場合には、人体に無害な溶液として用いればよいが、好ましい一態様は、ポリエチレングリコール（分子量 300〜500程度） 30%、プロピレングリコール 20 %、 15%クレモフォルイ一エル、 5%エタノール、 30%生理食塩水のェマルジヨン化溶液として用いることができる。

[0085] また、本発明は、 JNK阻害剤として、 JNK活性を阻害するペプチドまたは核酸等を用!/、ることができる。

[0086] 具体的には、以下が挙げられる：例えば、（i)JNKインヒビターペプチドならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログの任意の 1つ以上；（ii)JNKインヒビターペプチドならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログをコードする核酸；（iii)JNKに対して指向される抗体のすべてまたは抗原認識部位を含むフラグメントまたはこれらをコードする核酸、（iv)JNKをコードする配列に対するアンチセンス核酸または干渉 RNAおよびこれらをコードする核酸、ならびに（V)モジュレーター（すなわち、インヒビター、ァゴニストおよびアンタゴニスト）。

[0087] 上言 6JNK活性を阻害するペプチドまたは核酸の具体例として、例えば、 c-Jun N —terminal Kinase Peptide Inhibitor 丄, L— stereoisomer (L—JNKI 1, ALEXIS社， Nat. Med. 9 : 1180— 1186 (2003) )、 c— Jun N— terminal Kin ase Peptide Inhibitor 1, D— stereoisomer (D—JNKI 1, ALEXIS社， Nat . Med. 9 : 1180— 1186 (2003) )JNKアンチセンスオリゴヌクレオチド (J. Biol. Ch em. 272 : 33422— 33429 (1997) )、 JNK干渉 RNA (J. Biol. Chem. 279 :401 12— 40121 (2004) )、ドミナントネガティブ JNK (J. Biol. Chem. 274 : 32580— 3 2587 (1999 および JNKinteracting protein- 1 (JIP- 1, Science. 277 : 69 3— 696 (1997) )等を挙げることができる。

[0088] 本発明の JNKインヒビター、ペプチド、融合ペプチドおよび核酸は、薬学的組成物中で処方され得る。これらの組成物は、上記の物質のひとつにカ卩えて、薬学的に受容可能な賦型剤、キャリア、緩衝剤、安定化剤または当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、そして活性成分の効力に干渉すべきではない。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し得る（例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内等)。

[0089] 経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、散剤または液体形態であり得る。錠剤は、固形キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）を含み得る。液状薬学的組成物は、概して、液体キャリア (例えば、水、動物油、植物油または合成油）を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖溶液もしくはグリコール (例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール)もまた含まれ得る。

[0090] 静脈内、皮膚または皮下の注射、または罹患部位への注射のために、活性成分は、非経口的に受容可能な水溶液またはェマルジヨン液の形態であり、これは、発熱物質を含まず、そして適切な pH、等張性および安定性を有する。関連分野の当業者は、例えば、等張性ビヒクル (例えば、生理食塩注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液)を用いて適切な溶液を調製し得る。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および Zまたは他の添加物もまた、必要に応じて含まれ得る。

[0091] 本発明におヽて〖お NK阻害活性を有する物質を有効成分とする薬剤を用いることにより、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防または治療、特に動脈瘤の予防または治療が可能になる。該薬剤〖お NK阻害活性を有する物質を、製薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせてなる組成物、またはより多くの他の作用剤をさらに含む組成物の形態であってよぐその使用の態様は特に問題とはならず、該薬剤は注射や内服など体内に取り込む手段は特に制限されない。

[0092] 以下に、前記式（1)で表されるピラゾ口アントロン骨格を有するアントラピラゾールー 6—オン化合物（SP600125 (トクリス社:ピラゾールアントロン））等についての実施例を示す。実施例

[0093] [実施例 1]

塩ィ匕カルシウム処置マウス動脈瘤モデルによる JNK阻害実験

[方法] Longoらの方法 (J. Clin. Invest. 110 : 625— 632 (2002) )に準じてマウスにおいて塩ィ匕カルシウム処置による腹部大動脈瘤モデルを作製した。即ち、 7週齢の C57BLZ6雄マウスを開腹し、腎動脈下腹部大動脈を、 0. 5M塩ィ匕カルシウムを浸透させた綿花で 15分間処理した後に閉腹した。この処置により 10週目までに徐々に拡大する瘤が作成される。シャム手術群は、生理食塩水で処置した。塩ィ匕カルシゥム処置後のマウスには、 JNK阻害剤 SP600125 (トクリス社：ピラゾールアントロン）（S P群)または溶解液のみ (対照群）を連日皮下注射した。 SP600125は、 Bennettらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 : 13681— 13686 (2001) )に準じて、溶解液（30%ポリエチレングリコール- 400、 20%ポリプロピレングリコール、 15%タレモフォルイ一エル、 5%エタノール、 30%生理食塩水）で最終濃度 4. 2mgZmlに用事調整し、 60mg/kg/日の投与量を一日二回連日皮下注射した。術後 10週間飼育した後に犠牲死させ、腎動脈下腹部大動脈の最大径を計測するとともに大動脈を摘出し組織学的に解析した。

[0094] [結果]術後 10週目の大動脈径は、シャム手術群（8匹）；0. 68±0. 12mm,対照群（9匹）； 1. 10±0. 24mm, SP群（8匹）； 0. 74±0. 16mmであった。塩化カルシゥムで処理された対照群の大動脈径はシャム手術群に比べ有意に増カロしており動脈瘤が形成されていた。 JNK阻害剤である SP600125を連日投与した SP群では、投与しな力つた対照群と比べて有意に大動脈径カ、さぐシャム手術群と同等であり、動脈瘤形成が著しく抑制された (フィッシャー検定により Pく 0. 01)。また、塩化カルシゥムで処理された対照群の大動脈壁では、中膜の菲薄化、弾性線維の破壊といつたヒトの腹部動脈瘤に特徴的な所見が組織学的に観察された。一方、 SP群では、壁構造がシャム手術群と同等によく保たれており組織学的にも動脈瘤形成が阻止されていた。

[0095] [実施例 2]

アポ Eノックアウトマウス動脈瘤モデルによる JNK阻害実験 [方法] Daughertyらの方法 (J. Clin. Invest. 105 : 1605— 1612 (2000) )に準じてアポリポ蛋白 E (アポ E)ノックアウトマウスにアンジォテンシン IIを持続投与することにより腹部大動脈モデルを作製した。即ち、 24週齢のアポ Eノックアウト雄マウスにミ二浸透圧ポンプ (Alzet社）を植え込み、アンジォテンシン II (1 μ g/min/kg)を持続注入した。このモデルマウスは高脂血症、高血圧とさらに大動脈の著明な動脈硬化を伴っており、 4週間のアンジォテンシン Π注入により主に腎動脈上大動脈に瘤形成がみられ、一部のマウスは動脈瘤破裂を来して死亡することから、臨床でみられるヒトの動脈瘤に極めて良く似た病状を示すモデルである。アンジォテンシン II持続注入開始と同時に、 JNK阻害剤 SP600125 (SP群 8匹)また ¾JNK阻害剤なしの溶解液のみ (対照群 16匹）の連日皮下注射を開始した。 SP600125の投与方法は上記実施例 1と同様とした。 4週間目に、超音波診断装置を用いて腹部大動脈の最大径を計測した。

[0096] [結果]アンジォテンシン Π注入 4週目の大動脈径は、対照群； 1. 55 ±0. 19mm, S P群； 1. 29±0. 18mmであった。 JNK阻害剤 SP600125を連日投与した SP群では、投与しな力つた対照群と比べて大動脈径が小さぐ動脈瘤形成が有意に抑制された (t検定により pく 0. 05)。また、アンジォテンシン Π注入開始後 5週目までに一部のマウスは腹部大動脈瘤破裂や解離性大動脈瘤を発症して死亡し、累積生存率は対照群； 62. 5%に対し SP群； 87. 5%であり SP群の方が高い生存率を示した。

[0097] [実施例 3]

塩ィ匕カルシウム処置マウス動脈瘤モデルにおける JNK阻害剤による動脈瘤治療' 退縮実験

[方法] Longoらの方法 (J. Clin. Invest. 110 : 625— 632 (2002) )に準じて塩ィ匕カルシウム処置によるマウス腹部大動脈瘤モデルを作製した。即ち、 7週齢の C57B LZ6雄マウスを開腹し、腎動脈下腹部大動脈を 0. 5M塩化カルシウムを浸透させた綿花で 15分間処理した後に閉腹した。カルシウム処置後 6週目まで飼育した後、ランダムに 3群に分けた。 6週群は、カルシウム処置後 6週目に犠牲死させ、腹部大動脈の最大径を計測した。他の 2群では、カルシウム処置後 6週目から JNK阻害剤 SP60 0125 (SP群）または溶解液のみ（対照群）を連日皮下注射した。 SP600125および溶解液の投与方法は上記実施例 1と同様とした。 SP群と対照群はカルシウム処置後 12週目（注射開始後 6週目）に犠牲死させ、腹部大動脈の最大径を計測した。

[0098] [結果] 6週群（9匹）の腹部大動脈最大径は、 1. 29±0. 16mmで正常径の 2倍程度に拡大した瘤の形成が確認された。対照群（9匹）と SP群（9匹)の大動脈最大径は、それぞれ 1. 18±0. 19mm, 0. 85±0. 18mmであり、 SP群では、対照群と it ベて有意に大動脈径が小さかった (t検定により pく 0. 01)。（図 1参照）

このことから、 JNK阻害剤である SP600125の治療効果力瘤が形成された後からの投与において証明された。さらに、 SP群の径は、 6週群よりも有意に小さ力つた (t 検定により p< 0. 01)。このこと力、カルシウム処置動脈瘤モデルにおける JNK阻害剤 SP600125の瘤退縮効果が証明された。

[0099] [実施例 4]

アポ Eノックアウトマウス動脈瘤モデルにおける JNK阻害剤による動脈瘤治療 ·退縮実験

[方法] Daughertyらの方法 (J. Clin. Invest. 105 : 1605— 1612 (2000) )に準じてアポ Eノックアウトマウスにアンジォテンシン IIを持続投与して腹部大動脈瘤モデルを作製した。即ち、 24週齢のアポ Eノックアウト雄マウスにミニ浸透圧ポンプ (Alzet社 )を植え込み、アンジォテンシン II (1 μ g/min/kg)を 4週間持続注入した。このモデルマウスは高脂血症、高血圧とさらに大動脈の著明な動脈硬化を伴っており、アンジォテンシン Π注入により腹部大動脈に瘤形成がみられ、一部のマウスは動脈瘤破裂を来して死亡することから、臨床でみられるヒトの動脈瘤に極めて良く似た病状を示すモデルである。 4週間のアンジォテンシン II注入終了後に超音波診断装置を用いて腹部大動脈瘤の内腔径を計測し、この計測値力も均等に 2群に分けた。群分け後直ちに、 JNK阻害剤 SP600125 (SP群)または溶解液のみ (対照群）の連日皮下注射を開始した。 SP600125および溶解液の投与方法は上記実施例 1と同様とした。注射開始後 8週間目に、超音波診断装置を用いて腹部大動脈瘤の瘤径を再計測した。

[0100] [結果]アンジォテンシン II注入終了後、注射開始前に計測した大動脈瘤径は、対照群（5匹）； 1. 14±0. 17mm, SP群； 1. 18±0. 16mmであり、 2群間に同等の瘤が存在していた。 JNK阻害剤 SP600125を連日投与した SP群（6匹）では、 8週間の注射後の瘤径が 0. 98 ±0. 16mmとなり、注射開始前に比べて有意に縮小していた (t 検定により Pく 0. 05)。注射前後での縮小率は、 SP群で 17 ± 10%であった力対照群では 0± 13%であり、 2群間に有意差が確認された (t検定により p< 0. 05)。（図 2参照）

以上の結果から、ヒトの動脈瘤により近いアポ Eノックアウトマウス動脈瘤モデルにおいても JNK阻害剤 SP600125の瘤治療'退縮効果が証明された。

[0101] [実施例 5]

培養細胞における JNK阻害ペプチドの効果

[方法] JNK阻害ペプチドの効果を検証するため、動脈瘤の病態において重要と考えられている MMP- 9を指標として、培養細胞系実験を行った。細胞は、ヒト動脈瘤で主に MMP- 9を発現するマクロファージ細胞 (THP- 1)を用いた。即ち、培養 THP - 1細胞にあらかじめ異なる濃度（0、 1、 2、 5 _iu M)のJNK阻害ぺプチドD-JNKIl (A LEXIS社）を投与した。コントロールペプチドとして D-TAT (ALEXIS社）を用いた。ペプチド投与後 24時間目に炎症性サイト力インである TNF- a (50ngZml)で刺激し、さらに 48時間後に培養液を回収して、培養液中に分泌された MMP- 9量をゼラチンザィモグラフィ一法で定量解析した。

[0102] [結果]培養 THP- 1細胞は、 TNF- a刺激によって顕著な MMP- 9分泌を示した。 D -JNKI1は、 TNF- aによる MMP- 9分泌を濃度依存性に抑制した。同濃度のコントロールペプチド D-TATでは、 MMP- 9の抑制効果は認められなかった。この結果から、 JNK阻害ペプチド D-JNKI1がコラーゲンまたはエラスチンの分解抑制効果を持つことが示された。（図 3参照）

[実施例 6]

ヒト動脈瘤壁培養系における JNK阻害ペプチドの効果

[方法]ヒト腹部大動脈瘤の手術時に摘出された瘤壁組織を細断し、組織培養を行つた。 Kidwellらの方法（Methods in Enzymology. 147 : 407— 414 (1987) )に準じ、コラーゲンに多く含まれるプロリンを 3H標識したものを用いて、瘤壁におけるコラーゲンの新規合成能を解析した。即ち、培地に 3H標識プロリン (3 CiZml)を添加し、培養を開始した。培養開始直後に JNK阻害ペプチド (D-JNKI1、 5mM、 ALE XIS社）を投与し、対照ペプチドとして、 D-TAT (5mM、 ALEXIS社）を用いた。ぺプチド投与後 12時間目に TNF- a (R&D Systems社、 lOOngZml)で刺激した。 TNF- aは、ヒト大動脈瘤で増加している炎症性サイト力インで、 JNKを活性ィ匕することが知られている。さらに 48時間後に、培養上清中の蛋白を回収し、新規合成のために取込まれた 3H標識プロリンをシンチレーシヨンカウンターで計測した。

[0103] [結果]培養動脈瘤組織では、 TNF- a刺激により 3Hプロリンの取込みが減少した。

これは、コラーゲンの新規合成が炎症性刺激によって抑制されたことを意味する。 D- JNKI1は、 TNF- aによる 3Hプロリン取込み減少を有意に回復させた (pく 0. 05)。即ち、 D-JNKI1は、その JNK阻害活性によりヒト瘤壁におけるコラーゲン合成能を回復せしめる効果を持つことが示された。（図 4参照）

[実施例 7]

コラーゲン合成能に対する JNK阻害ペプチドの効果

[方法]ラット大動脈より分離した血管平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行つた。 Kidwellらの方法（Methods in Enzymology. 147 : 407— 414 (1987) )に準じ、 3H標識プロリンが取込まれる新規合成蛋白の内、コラーゲン分解酵素によつて特異的に分解を受ける分画を定量解析した。無血清培地に 3H標識プロリン (3 CiZml)を添加し、培養を開始した。培養開始直後に JNK阻害ペプチド (D-JNKI1 、 0, 1, 2, 5mM、 ALEXIS社)を投与した。ペプチド投与後 72時間目に培養上清中の蛋白を回収した。さらに、コラーゲン分解酵素で可溶ィ匕した分画のみ回収し、コラーゲン新規合成のために取込まれた 3H標識プロリンをシンチレーシヨンカウンターで計測した。

[0104] [結果] JNK阻害ペプチド D-JNKI1は、培養平滑筋細胞におけるコラーゲン合成能を濃度依存性に促進した（5mMで OmMの 1. 6 ±0. 1倍、 p< 0. 01)。（図 5参照） [実施例 8]

プロリン水酸ィ匕酵素に対する JNK阻害剤の効果

[方法]ラット大動脈より分離した血管平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行つた。無血清培地に JNK阻害剤 SP600125 (SP, 50mM)添カ卩し、 SP添加後 1時間目に、 TNF- a (R&D Systems, lOngZml)で刺激した。 TNF- α刺激後 24時間目に、細胞を回収し、ノーザンプロット法を用いてプロリン水酸ィ匕酵素の発現を mR NAレベルで定量解析した。プロリン水酸化酵素（P4H)は、コラーゲン合成に必須の重要な酵素の一つであり、その低下はコラーゲン合成能の低下を意味する。

[0105] [結果]培養平滑筋細胞におけるプロリン水酸ィ匕酵素の発現は、 TNF- aによる炎症性サイト力イン刺激によって減少するが、 JNK阻害剤 SP600125は、このプロリン水酸ィ匕酵素発現低下を阻止し、コラーゲン合成能を回復した (Pく 0. 05)。（図 6参照） [実施例 9]

リジン酸化酵素に対する JNK阻害ペプチドの効果

[方法]ラット大動脈より分離した血管平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行つた。実験開始時に血清欠乏状態とし、血清欠乏ストレスにより培養細胞の JNKを活性化した。実験開始直後に JNK阻害ペプチド (D-JNKI1、 5mM、 ALEXIS社)を投与し、対照ペプチドとして、 D-TAT(5mM、 ALEXIS社）を用いた。ペプチド投与後 6 日目に細胞を回収し、 real time PCR法を用いてリジン酸化酵素の発現を mRNA レベルで定量解析した。リジン酸化酵素 (LOX)は、コラーゲン線維またはエラスチン線維の成熟に必須の酵素であり、その低下はコラーゲンまたはエラスチンの合成能低下を意味する。

[0106] [結果]培養平滑筋細胞におけるリジン酸化酵素の発現は、血清欠乏ストレス刺激によって減少するが、 JNK阻害ペプチド D-JNKI1は、このリジン酸化酵素発現低下を阻止し、コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復した (pく 0. 01)。（図 7参照） [実施例 10]

JNK2遺伝子欠損細胞における細胞外基質合成能の解析

[方法]大動脈構成細胞で発現する JNKに〖お NK1^JNK2のアイソファームがある。このうち JNK2遺伝子欠損マウス CFNK2— Z—）の大動脈より分離した血管平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行った。対照としては、同じ遺伝的背景を持つ野生型マウス力分離した細胞を用いた。それぞれの細胞を無刺激の状態で回収し、 r eal time PCR法を用いてリジン酸化酵素（LOX)の発現を mRNAレベルで定量解析した。または、リジン酸ィ匕酵素の酵素活性を測定した。リジン酸化酵素は、コラーゲン線維またはエラスチン線維の成熟に必須の酵素であり、その低下はこれらコラーゲンまたはエラスチンの合成能低下を意味する。さらに、細胞外基質合成を統合的に促進するとされるサイト力イン TGF— bを ELISA法を用いて、蛋白発現レベルで定量解析した。

[0107] [結果]リジン酸ィ匕酵素の発現とその酵素活性は、 JNK2欠損細胞において有意に増加していた (p< 0. 01)。さらに TGF— bもま^ JNK2欠損細胞において有意に増加していた (p< 0. 01)。すなわち、 JNK2特異的阻害によりコラーゲンまたはエラスチンの合成能が促進された。（図 8参照）

[実施例 11]

コラーゲン合成系に対する抑制 ¾JNK変異体の効果

[方法]ラット大動脈より分離した血管平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行つた。 JNKを活性ィ匕するために、過酸ィ匕水素 (H O , 200mM)による酸化ストレス刺激

2 2

を用いた。また、 JNKを特異的に抑制するために抑制型（ドミナントネガティブ) JNK 変異体を発現する組換えアデノウイルス (Ad-JNK (APF) )を作製し、対照としては GFPを発現する組換えアデノウイルス (Ad-GFP)を使用した。まず培養細胞を H

2

Oで刺激し、 24時間後に細胞を回収した (H O群)。 H O刺激なしを比較対照とし

2 2 2 2 2

た（コントロール群）。次に、あら力じめ Ad— JNK(APF)または Ad— GFPを感染させた培養細胞を H Oで刺激し、 24時間後の細胞を回収した (それぞれ H O +APF

2 2 2 2 群、 H O +GFP群)。 H O刺激で発現が変化する遺伝子群ならびに抑制 ¾JNK

2 2 2 2

変異体の効果で発現が変化する遺伝子群を、オリゴ DNAマイクロアレイ (Affymetri X社 RG— U34)によって網羅的に解析した。

[0108] [結果]網羅的解析結果の中から、コラーゲン線維合成に必須の酵素であるプロリン水酸化酵素（P4H)、リジン水酸化酵素（PLOD)とリジン酸化酵素 (LOX)が、 H O

2 2 刺激による JNK活性ィ匕で発現が低下し、かつ JNK変異体による JNK抑制効果によつてその発現が増加するものとして同定された。すなわち、プロリン水酸化酵素発現レベルは、 H O刺激により 0. 62倍 (H O群のコントロール群に対する比）に低下した

2 2 2 2

力 Ad— JNK(APF)による JNK抑制により 1· 32倍（H O +APF群の H O +GF

2 2 2 2

P群に対する比）に増加した。またリジン水酸化酵素発現レベルは、 H O刺激により 0. 76倍 (H O群のコントロール群に対する比）に低下した力 Ad— JNK(APF)に

2 2

よる JNK抑制により 1. 41倍 (H O +APF群の H O +GFP群に対する比）に増加

2 2 2 2

した。さらに、リジン酸化酵素発現レベルは、 H O刺激により 0. 87倍 (H O群のコ

2 2 2 2 ントロール群に対する比）に低下した力 Ad-JNK(APF)による JNK抑制により 1. 23倍 (H O +APF群の H O +GFP群に対する比）に増加した。これらの結果から

2 2 2 2

、抑制 ¾JNK変異体が、コラーゲン線維合成に必須のプロリン水酸化酵素、リジン水酸化酵素ならびにリジン酸化酵素の発現を増強することが明らかになった。特に、リジン酸ィ匕酵素はエラスチン線維合成にも必須である。すなわち、抑制 ¾JNK変異体は、コラーゲンならびにエラスチン線維の合成系を増強することが示された。

[0109] [実施例 12]

塩ィ匕カルシウム処置マウス動脈瘤モデルによる JNK2特異的抑制実験

[方法] Longoらの方法 (J. Clin. Invest. 110 : 625— 632 (2002) )に準じて塩ィ匕カルシウム処置によるマウス腹部大動脈瘤モデルを作製した。即ち、 7週齢の C57B LZ6雄マウスを開腹し、腎動脈下腹部大動脈を 0. 5M塩ィ匕カルシウムで 15分間刺激処理した後に閉腹した (Ca群、 11匹)。この処置により 6週目までに徐々に拡大する瘤が作成される。シャム手術 (Na群、 5匹）は、 C57BLZ6雄マウスの大動脈を生理食塩水で処置した。さらに、この動脈瘤モデルにおける JNK2特異的阻害の効果を検証するため、 JNK2遺伝子欠損マウス (JNK2— Z—、 7週齢、雄)の大動脈を 0 . 5M塩ィヒカルシウムで同様に浸透処理した (JNK2— Z—群、 6匹)。処置後のマウスは、 6週間飼育した後に犠牲死させ、腎動脈下腹部大動脈の最大径と腹腔動脈上でカルシウム処置の及ばない部分の大動脈径を計測した。

[0110] [結果]術後 6週目の腎動脈下腹部大動脈径は、 Na群; 0. 67 ±0. 06mm, Ca群； 1 . 15±0. 17mm, JNK2— /—群； 0. 62±0. 08mmであった。塩化カルシウムで処理された対照群の大動脈径はシャム手術群に比べ有意に増カロしており動脈瘤が形成されて、た。 JNK2— Z—マウスと Na群および Ca群のマウスの個体差の影響を除くために、腹腔動脈上大動脈径に対する腎動脈下大動脈最大径の比を算出したところ、 Na群； 0. 92±0. 06, Ca群； 1. 55±0. 23, JNK2— Z—群； 0. 90±0. 0 6であった。すなわち、塩ィ匕カルシウムで刺激誘導される動脈瘤の形成は、 JNK2— Z—群でほぼ完全に抑制された (フィッシャー検定により pく o. οι)。以上の結果から、塩ィ匕カルシウム処置マウスにおける動脈瘤形成は、 JNK2の特異的な抑制によつて阻止されることが証明された。（図 9参照）

産業上の利用可能性

[0111] 本発明により、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防および治療が可能になる。本発明の薬剤は、特に動脈瘤拡大抑制のための予防用薬剤、または動脈瘤退縮のための治療用薬剤として内服または注射等の全身的投薬またはステントダラフト等を利用した局所投与に用ヽる薬剤として利用できる。

[0112] 本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。

Claims

請求の範囲

[I] JNK阻害活性を有する物質を有効成分とするコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防剤または治療剤。

[2] コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が、皮膚疾患、骨もしくは軟骨疾患、心血管疾患または肺もしくは消化管の内臓疾患の少なくとも一種である請求項 1に記載の予防剤または治療剤。

[3] JNK阻害活性を有する物質が、コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質である請求項 1または 2に記載の予防剤または治療剤。

[4] コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、リジン酸化酵素を活性化させる物質である請求項 3に記載の予防剤または治療剤。

[5] コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、プロリン水酸化酵素を活性化させる物質である請求項 3に記載の予防剤または治療剤。

[6] コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、リジン水酸化酵素を活性化させる物質である請求項 3に記載の予防剤または治療剤。

[7] コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が、動脈瘤である請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の予防剤または治療剤。

[8] JNK阻害活性を有する物質が、薬物的な瘤拡大抑制作用を有する物質である請求項 7に記載の予防剤。

[9] JNK阻害活性を有する物質が、薬物的な瘤退縮作用を有する物質である請求項 7 に記載の治療剤。

[10] 動脈瘤が、真性大動脈瘤と解離性大動脈瘤とを含む大動脈瘤である請求項 7〜9 のいずれか 1項に記載の予防剤または治療剤。

[II] 動脈瘤が、腹部大動脈瘤と胸部大動脈瘤を含む大動脈瘤である請求項 7〜9のいずれ力 1項に記載の予防剤または治療剤。

[12] JNK阻害活性を有する物質が、 JNK阻害活性を有する化合物またはその薬学上許容される塩である請求項 1〜11の、ずれか 1項に記載の予防剤または治療剤。

[13] JNK阻害活性を有する化合物が、ピラゾ口アントロンまたはその誘導体である請求項 12に記載の予防剤または治療剤。

[14] JNK阻害活性を有する物質が、 JNK阻害活性を有するペプチドまたは核酸である請求項 1〜11のいずれか 1項に記載の予防剤または治療剤。

[15] JNK阻害活性を有する物質力ペプチドカ^ー Jun N—末端キナーゼペプチドィンヒビター 1 D体 (D— JNKI1)である請求項 14に記載の予防剤または治療剤。

[16] 注射剤の形態である請求項 1〜15のいずれか 1項に記載の予防剤または治療剤。

[17] 経口剤の形態である請求項 1〜15のいずれか 1項に記載の予防剤または治療剤。

[18] 外用薬の形態である請求項 1〜15のいずれか 1項に記載の予防剤または治療剤。

[19] 被検物質の JNK阻害活性を測定することを含む、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリーニングする方法

[20] 被検物質のコラーゲンまたはエラスチン分解抑制活性および合成促進活性の両方を測定することを含む、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患に対し予防活性または治療活性を有する物質をスクリーニングする方法。