JP5888746B2

JP5888746B2 - マトリックスメタロプロテアーゼ活性抑制組成物

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Publication number: JP5888746B2
Application number: JP2012530752A
Authority: JP
Inventors: 敏博鶴田; 和雄北村
Original assignee: University of Miyazaki
Current assignee: University of Miyazaki
Priority date: 2010-08-24
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2016-03-22
Anticipated expiration: 2031-08-24
Also published as: JPWO2012026614A1; WO2012026614A1; US20130211059A1

Description

本発明は、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ活性抑制作用を有する組成物に関する。

腹部大動脈瘤は、動脈硬化を基盤とし、腹部大動脈が限局性に拡張する疾患である。腹部大動脈瘤は、６０歳以上の男性に比較的多く、無症状のうちに発症及び進展し、破裂に至る。腹部大動脈瘤において、高血圧や喫煙が瘤拡大の促進因子と考えられているものの、詳細な発症及び進展機序は明らかではない。これまでのところ、ヒト腹部大動脈瘤壁では平滑筋細胞からなる中膜層が菲薄化ないしは消失していることが病理学的な特徴とされていることから、ヒト腹部大動脈瘤の進展は、平滑筋細胞数が減少することにより血管構築が保てなくなり次第に瘤が拡大すると考えられている。
従来において、腹部大動脈瘤に対して有効な薬物療法がないため、処置としては厳密な血圧コントロール下、定期的に超音波やＣＴ検査で瘤径を測定し、増大傾向である場合には破裂死を予防すべく手術適応とする。しかしながら、腹部大動脈瘤の罹患年齢は高く、また他の疾患を合併する場合もあり、術後の合併症や日常生活の活動性の低下を考慮しなければならない。
このように、腹部大動脈瘤に対して、瘤径の拡大抑制を目指した内科的治療法の開発が望まれている。
一方、解糖系糖代謝阻害剤は、平滑筋細胞の増殖抑制作用を有することが知られている（特許文献１）。例えば、特許文献１は、２−デオキシグルコース等の解糖系糖代謝阻害剤が例えば、平滑筋細胞の異常増殖及び／又は移動を伴う創傷を含む創傷の治癒物質として有用であることを開示する。しかしながら、特許文献１には、解糖系糖代謝阻害剤が腹部大動脈瘤の進展に対して抑制作用を有することは開示されていない。

特表平０８−５１１０４１号公報

上記のように、従来において腹部大動脈瘤に対して有効な薬物療法がなく、瘤径の拡大抑制を目指した内科的治療法の開発が望まれている。
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、腹部大動脈瘤の進展の機序を探索し、且つ当該機序の抑制因子を同定すると共に、腹部大動脈瘤等の疾患の進展に対して抑制作用を有する治療剤を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ヒト腹部大動脈瘤壁で糖代謝が亢進しており、また瘤壁における糖代謝活性は、糖を細胞内へ取り込むのに必要なグルコーストランスポーターのタンパク質発現やマトリックス分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（又はマトリックスメタロプロテイナーゼとも称される：以下、「ＭＭＰ」と称する）−９活性と関連していることを見出した。さらに、グルコーストランスポータータンパク質発現が最も強く亢進している細胞は、瘤壁に浸潤したマクロファージであることを見出した。
そこで、糖代謝又はグルコーストランスポーターの発現・機能を抑制することが可能な解糖系糖代謝阻害剤を培養マクロファージ細胞に投与したところ、ＭＭＰ−９活性が著明に抑制し、また解糖系糖代謝阻害剤の１つである２−デオキシグルコースをマウス動脈瘤モデルに投与したところ、瘤形成が有意に抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下を包含する。
（１）解糖系糖代謝阻害剤を有効成分として含有するＭＭＰ活性抑制組成物。
（２）解糖系糖代謝阻害剤が２−デオキシグルコース及びサイトカラシン並びにこれらの誘導体及び塩から成る群より選択される、（１）記載のＭＭＰ活性抑制組成物。
（３）ＭＭＰがマクロファージにおけるＭＭＰである、（１）又は（２）記載のＭＭＰ活性抑制組成物。
（４）ＭＭＰがＭＭＰ−９である、（１）〜（３）のいずれか１記載のＭＭＰ活性抑制組成物。
（５）（１）〜（４）のいずれか１記載のＭＭＰ活性抑制組成物を有効成分として含有するＭＭＰ活性化関連疾患治療剤。
（６）ＭＭＰ活性化関連疾患が動脈硬化又は腹部大動脈瘤である、（５）記載のＭＭＰ活性化関連疾患治療剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−１８７０７８号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

図１は、（Ａ）ヒト腹部大動脈瘤壁におけるグルコーストランスポーター（ＧＵＬＴ−３）のタンパク質発現とＭＭＰ−９活性との相関関係を示すグラフ及び（Ｂ）ヒト腹部大動脈瘤壁におけるＧＬＵＴ−３の免疫活性がマクロファージに局在することを示す写真である。
図２は、（Ａ）サイトカラシン、（Ｂ）フローレチン（Ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ）及び（Ｃ）２−デオキシグルコースの投与による培養マクロファージにおけるＭＭＰ−９活性の減少を示すグラフ、並びに（Ｄ）２−デオキシグルコースの投与によるヒト腹部大動脈瘤壁の培養におけるＭＭＰ−９活性の減少を示すグラフである。
図３は、マウス動脈瘤モデル（塩化カルシウム塗布誘発性動脈瘤モデルマウス）における２−デオキシグルコース投与による瘤形成抑制を示す（Ａ）写真及び（Ｂ）グラフである。
図４は、マウス動脈瘤モデル（アンジオテンシンＩＩ誘発性アポリポプロテインＥ遺伝子改変マウス）における２−デオキシグルコース投与による瘤形成抑制を示すグラフである。
図５は、２−デオキシグルコースの投与による培養マクロファージにおける催動脈硬化並びに動脈瘤関連遺伝子の発現の減少を示すグラフである。
図６は、２−デオキシグルコースの投与による培養マクロファージにおけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現の増加を示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物は、解糖系糖代謝阻害剤（インヒビター）を有効成分として含有するものである。例えば、本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物をＭＭＰ活性化関連疾患治療剤としてヒト等の動物に投与することによりＭＭＰ活性を抑制し、ＭＭＰ活性化関連疾患を治療、予防又は緩和することができる。
ＭＭＰとしては、例えばマクロファージにおけるＭＭＰが挙げられる。具体的なＭＭＰとしては、例えばＭＭＰ−９が挙げられる。その他のＭＭＰとしては、例えば血管壁を構成する内皮細胞、平滑筋細胞や線維芽細胞由来のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９等が挙げられる。
ここで、「解糖系糖代謝阻害剤」とは、解糖系における糖代謝経路を阻害する物質を意味する。解糖系糖代謝阻害剤としては、例えばグルコーストランスポーター阻害剤である２−デオキシグルコース、サイトカラシン及びフローレチン並びにこれらの誘導体及び薬理上許容される塩が挙げられる。解糖系糖代謝阻害剤は、市販品であってよく、あるいは従来の化学合成法等により製造されたものを使用することができる。
また、「ＭＭＰ活性化」とは、ＭＭＰの前駆体酵素（プロエンザイムと呼ばれ、活性がない状態）のペプチドの一部が切断され、活性（例えば、コラーゲン分解活性）が発現することを意味する。
「ＭＭＰ活性化関連疾患」とは、ＭＭＰ活性化を病因の一つする疾患を意味し、例えば動脈硬化及び腹部大動脈瘤等の大動脈瘤疾患が挙げられる。その他のＭＭＰ活性化関連疾患としては、例えばアテローム性動脈硬化症性斑離断、心筋梗塞、心不全、再狭窄、発作、歯周病、組織潰瘍、創傷、皮膚病、癌転移、腫瘍脈管形成、年齢による黄斑変性、繊維症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、移動性炎症細胞に依る炎症性疾患、骨関節炎、リューマチ性関節炎、敗血症性関節炎、角膜潰瘍、蛋白尿、栄養障害型表皮水泡症、炎症性応答に導く症状、ＭＭＰ活性による骨減少症、顎関節症、神経系の脱髄疾患、腫瘍転移又は外傷性関節傷害に続く退行性軟骨損失、粥状硬化性斑破断に由来する冠状動脈血栓症、受胎制御等（日本国特許第３２７７１７０号及び第３３５４９４１号）が挙げられる。
さらに、「ＭＭＰ活性化関連疾患治療」とは、ＭＭＰ活性化関連疾患の症状を治療、予防又は緩和することを意味する。
本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物において解糖系糖代謝阻害剤と組み合わせることができる医薬用成分としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤及び香料が挙げられる。
賦形剤としては、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、精製白糖及びマクロゴールが挙げられる。
崩壊剤としては、例えば、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム及びトラガントが挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム及びラウロマクロゴールが挙げられる。
滑沢剤としては、例えば、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、タルク、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類、水素添加植物油及びポリエチレングリコールが挙げられる。
流動性促進剤としては、例えば、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム及びケイ酸マグネシウムが挙げられる。
本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物の剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、錠剤、粉剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、スプレー剤、軟膏剤等の非経口剤が挙げられる。
一方、本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物における解糖系糖代謝阻害剤の含有量は、投与目的、投与経路、剤形等によって適宜変更し得るが、例えば０．０１ｍｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ以上であればよい。
本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物の投与回数、投与量及び投与期間は、特に限定されるものではなく、例えば、患者の年齢、性別、体重又は症状の程度、あるいは投与方法などに応じて適宜決定することができる。投与回数は、例えば１日１回〜３回、好ましくは１日１回である。本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物に含まれる有効成分の投与量は、例えば１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上であればよい。また、投与期間は、例えば１〜７日間、好ましくは１〜２日間である。
本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物の投与経路は、剤形や使用目的に応じて、適宜決定することができるが、例えば、経口投与、非経口投与（髄腔内投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与、鼻内投与、舌下投与等）等が挙げられる。
本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物のＭＭＰ活性抑制効果の評価としては、例えばｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ＭＭＰを発現する細胞（例えば、ＭＭＰ−９を発現するマクロファージ）を本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物存在下及び不在下で培養し、当該培養物についてゼラチンザイモグラフィーを用いてＭＭＰ活性を評価する方法が挙げられる。本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物不在下で培養した細胞（陰性対照）と比較して、本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物存在下で培養した細胞においてＭＭＰ活性が有意に抑制された場合には、本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物が良好にＭＭＰ活性を抑制すると判断することができる。
一方、ＭＭＰ活性化関連疾患治療剤としての本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物の薬理評価方法としては、例えばｉｎｖｉｔｒｏにおけるＭＭＰ活性化関連疾患に関連した細胞を使用した方法又はｉｎｖｉｖｏにおけるＭＭＰ活性化関連疾患モデル動物を使用した方法が挙げられる。例えば、腹部大動脈瘤動物モデルとして塩化カルシウム塗布誘発性又はアンジオテンシンＩＩ誘発性アポリポプロテインＥ遺伝子改変マウスを使用することができる。さらにアポリポプロテインＥ遺伝子改変マウスを高脂肪食で飼育した動脈硬化モデルないしは動脈硬化巣（プラーク）不安定化モデルをも用いることができる。本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物をマウス動脈瘤モデルに腹腔内投与する。次いで、本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物を投与していないマウス動脈瘤モデル（陰性対照）と比較して、瘤形成が有意に抑制された場合には、本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物が腹部大動脈瘤に有効であると判断することができる。動脈硬化モデル、プラーク不安定化モデルでは、オイルレッド０染色にて動脈硬化範囲の減少ならびに組織切片にてプラーク被膜の菲薄化の軽減、ＭＭＰ−９活性の低下で治療効果を確認することができる。
また、以上に説明した本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物に準じて、本発明は、ヒトや他の哺乳動物等の動物においてＭＭＰ活性を抑制するための医薬、又はＭＭＰ活性化関連疾患を治療、予防若しくは緩和するための医薬の製造における解糖系糖代謝阻害剤の使用に関する。ここで、医薬における解糖系糖代謝阻害剤の含有量は、上述の本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物における解糖系糖代謝阻害剤の含有量に準じたものとすることができる。
さらに、本発明は、ＭＭＰ活性の抑制を必要とする患者（ヒトや他の哺乳動物等の動物）に有効量の解糖系糖代謝阻害剤を投与することを含む、ＭＭＰ活性を抑制する方法、あるいはＭＭＰ活性化関連疾患を有する又は有するリスクを有する患者（ヒトや他の哺乳動物等の動物）に有効量の解糖系糖代謝阻害剤を投与することを含む、ＭＭＰ活性化関連疾患を治療、予防又は緩和する方法に関する。ここで、当該有効量は、上述の本発明に係るＭＭＰ活性抑制組成物に含まれる解糖系糖代謝阻害剤の投与量に準じたものとすることができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

ヒト腹部大動脈瘤壁におけるグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ−３）の発現及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−９活性の評価
本実施例では、ヒト腹部大動脈瘤壁におけるＧＬＵＴ−３タンパク質の発現とＭＭＰ−９活性を評価した。
ヒト腹部大動脈瘤壁をホモゲナイズした後、得られたサンプルにおいてウエスタンブロットによりＧＬＵＴ−３タンパク質発現を評価し、またザイモグラムでＭＭＰ−９活性を測定した。ウエスタンブロット分析では、１０μｇ定量の抽出タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離した。その後、メンブレンに転写・固定化してブロットを作製した。さらに、ブロットを抗ＧＬＵＴ−３抗体と１時間反応し、引き続き二次抗体と反応させた後、シグナルを検出した。一方、ザイモグラム分析では、ザイモグラムゲルプレート上に５μｇ定量の抽出タンパク質を電気泳動し、タンパク質を分離した。その後の方法はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキットの説明書に従った。２４時間、３７℃での反応後、ザイモグラムゲルをクマッシー青溶液で一晩染色し、その後脱染色して酵素活性を検出した。
さらに、ヒト腹部大動脈瘤壁におけるＧＬＵＴ−３の免疫活性部位を免疫染色法により評価した。免疫染色では、凍結切片を用いて、抗ＧＬＵＴ−３抗体と抗ＣＤ６８抗体を一次抗体として用い、一晩、４℃で反応させた。次いで、凍結切片を、フルオレセインイソチオシアネート及びＣｙ３−で蛍光標識された二次抗体とそれぞれ３０分反応させた後にコンフォーカル顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１）で観察した。
結果を図１に示す。パネルＡは、縦軸にザイモグラムによるＭＭＰ−９活性（ＯＤ）を表し、横軸にＧＬＵＴ−３タンパク質発現（ＯＤ）を表したグラフである。パネルＡにおいて、「ＭＭＰ−９（Ｌ）」は、潜在型のＭＭＰ−９活性を意味する。当該グラフから判るように、ヒト腹部大動脈瘤壁におけるＭＭＰ−９活性とＧＬＵＴ−３タンパク質発現との間に正の相関を認めた（ｒ＝０．４１５，ｐ＝０．０１３）。
一方、パネルＢは、ヒト腹部大動脈瘤壁におけるＧＬＵＴ−３タンパク質の免疫染色の写真である。当該写真から判るように、ＧＬＵＴ−３の免疫活性（赤色）はＣＤ６８陽性のマクロファージ（黄緑色）と一致した（黄色（Ｍｅｒｇｅ））。

２−デオキシグルコース、サイトカラシン又はフローレチンの投与による培養マクロファージ又はヒト腹部大動脈瘤壁におけるＭＭＰ−９活性抑制の評価
本実施例では、２−デオキシグルコース、サイトカラシン又はフローレチンの投与による培養マクロファージ又はヒト腹部大動脈瘤壁におけるＭＭＰ−９活性抑制を評価した。なお、ザイモグラム分析は、実施例１と同様の方法で行った。
培養マクロファージとして、単球系細胞（Ｕ９３７）を１０ｎｍｏｌ／Ｌフォルボールエステル（ＰＭＡ）で刺激してマクロファージへ分化させた。ザイモグラム分析によれば、当該マクロファージにおいてＭＭＰ−９活性が著増した。
一方、グルコーストランスポーター阻害薬であるサイトカラシン又はフローレチンでＵ９３７細胞を前処置し、次いで１０ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡで刺激した。また、２−デオキシグルコースでＵ９３７細胞を前処置し、次いで１０ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡで刺激した。さらに、単離したヒト腹部大動脈瘤壁を２−デオキシグルコースで処置した。
結果を図２に示す。パネルＡ〜Ｃは、それぞれサイトカラシン、フローレチン及び２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）の投与による培養マクロファージにおけるＭＭＰ−９活性を示す。パネルＤは、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）の投与によるヒト腹部大動脈瘤におけるＭＭＰ−９活性を示す。パネルＡ〜Ｄにおいて、「ＭＭＰ−９（Ｌ）」は、潜在型のＭＭＰ−９活性を意味し、「ＭＭＰ−９（Ａ）」は、活性型のＭＭＰ−９活性を意味する。また、パネルＤにおいて、「ＭＭＰ−２（Ｌ）」は、潜在型のＭＭＰ−２活性を意味し、「ＭＭＰ−２（Ａ）」は、活性型のＭＭＰ−２活性を意味する。さらに、パネルＤにおいて、「対照」は、２−ＤＧを含まない水溶媒を意味する。
図２から判るように、グルコーストランスポーター阻害薬であるサイトカラシン（Ａ）やフローレチン（Ｂ）でＵ９３７細胞を前処置しておくと、ＭＭＰ−９活性は減少した。さらに、同細胞に２−デオキシグルコースを投与して細胞内の糖利用を阻害するとＭＭＰ−９活性が減少した（Ｃ）。この２−デオキシグルコースのＭＭＰ−９抑制効果はヒト腹部大動脈瘤壁でも同様に観察された（Ｄ）。

マウス動脈瘤モデルにおける２−デオキシグルコース投与による瘤形成抑制効果の評価
本実施例では、マウス動脈瘤モデルにおける２−デオキシグルコース投与による瘤形成抑制効果を評価した。
マウス動脈瘤モデルは、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスの大動脈周囲に塩化カルシウムを投与し作製した。
マウス動脈瘤モデルに対して、２−デオキシグルコースを１００ｍｇ／ｋｇ体重で、又は１ｇ／ｋｇ体重／日で２８日間にわたり、腹腔内投与した。２８日間後、腹部大動脈を取り出し、当該大動脈の直径を計測した。陰性対照として、塩化カルシウム塗布下で２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）を投与せず代わりに生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与したマウス、及び対照として塩化カルシウムを塗布せずに塩化ナトリウムを塗布したマウスについても同様に腹部大動脈を取り出し、当該大動脈の直径を計測した。
結果を図３に示す。Ａパネルは、各群から取り出した腹部大動脈の代表的な写真である。パネルＢは、各群における取り出した腹部大動脈の直径（ｍｍ）を示すグラフである。
図３から判るように、２−デオキシグルコースの投与により塩化カルシウム塗布による大動脈径の拡大が抑制されていることが分かる。
また、本実施例においては、マウス動脈瘤モデル群では平滑筋を含む中膜層が損傷しているのに対し、２−デオキシグルコース投与群では血管壁の構造が保たれており、細胞保護効果が確認された。
さらに、同様の手法により、マウス動脈瘤モデルであるアンジオテンシンＩＩ誘発性アポリポプロテインＥ遺伝子改変マウスに対しても、２−デオキシグルコースの投与効果を検証した。
当該アンジオテンシンＩＩ誘発性アポリポプロテインＥ遺伝子改変マウスは、１２週齢のアポリポプロテインＥ欠損マウスに昇圧性ペプチドであるアンジオテンシンＩＩ（１０００ｎｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）を浸透圧ポンプで２８日間皮下投与することにより作製した。
浸透圧ポンプ植え込み後から、２−デオキシグルコースを１ｇ／ｋｇ体重／日で２８日間にわたり、腹腔内投与した（マウス数（ｎ）＝１４）。２８日間投与後、腹部大動脈を取り出し、当該大動脈の直径を計測した。陰性対照として、上記マウスに２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）を投与せず代わりに生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与したマウス（マウス数（ｎ）＝１４）についても同様に腹部大動脈を取り出し、当該大動脈の直径を計測した。
各群における取り出した腹部大動脈の直径（ｍｍ）を、図４に示す。
図４から判るように、本モデルにおいても、２−デオキシグルコースの投与により大動脈径の瘤形成が抑制されていることが分かる。

２−デオキシグルコースの投与による培養マクロファージにおける催動脈硬化・動脈瘤関連遺伝子の発現の評価
本実施例では、２−デオキシグルコースの投与による培養マクロファージにおける催動脈硬化・動脈瘤関連遺伝子の発現を、ＤＮＡマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）により評価した。評価した催動脈硬化・動脈瘤関連遺伝子は、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−９、ケモカイン（ＣＣＬ−２及びＣＣＬ−８）並びに炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α及びＩＬ−６）であった（ＬｉｂｂｙＰ．，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００２，４２０（６９１７）：８６８−８７４及びＴｕｎｇＷＳ，ＬｅｅＪＫ，ＴｈｏｍｐｓｏｎＲＷ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１１７６ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎａｏｒｔａａｎｄａｂｄｏｍｉｎａｌａｏｒｔｉｃａｎｅｕｒｙｓｍｓｕｓｉｎｇａｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂａｓｅｄｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｒｒａｙ．ＪＶａｓｃＳｕｒｇ．２００１，３４（１）：１４３−１５０）。
単球系細胞（Ｕ９３７）を１０ｎｍｏｌ／Ｌフォルボールエステル（ＰＭＡ）で刺激してマクロファージへ分化させた。一部の細胞は２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）でＵ９３７細胞を前処置した後に、次いで１０ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡで刺激した。対照として、フォルボールエステルも２−デオキシグルコースも投与しなかった単球系細胞（Ｕ９３７）を用いた。刺激２４時間後に細胞を採取してＲＮＡを抽出し、さらにＲＮＡよりｃＤＮＡを作製してアレイを行った。アレイの結果はＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ１０ソフトウエアで解析し、各細胞サンプル間における催動脈硬化・動脈瘤関連遺伝子の発現レベルを評価した。
各細胞サンプルにおける各催動脈硬化・動脈瘤関連遺伝子の発現レベルの結果を図５に示す。パネルＡ〜Ｆは、それぞれ各細胞サンプルにおけるＭＭＰ−１、ＣＣＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＭＰ−９、ＣＣＬ−８及びＩＬ−６のｍＲＮＡレベルでの発現を示すグラフである。縦軸の数値は、遺伝子発現レベルである。横軸は、各細胞サンプルを示す。
図５から判るように、フォルボールエステル（ＰＭＡ）は、各催動脈硬化・動脈瘤関連遺伝子の発現を上昇させた。一方、２−デオキシグルコースの投与により各催動脈硬化・動脈瘤関連遺伝子の発現が減少した。従って、２−デオキシグルコースは動脈硬化・動脈瘤抑制薬として有効である可能性がある。

２−デオキシグルコースの投与による培養マクロファージにおけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現の評価
本実施例では、２−デオキシグルコースの投与による培養マクロファージにおけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現を評価した。ＳＩＲＴ１遺伝子は、細胞保護・長寿効果に関連する遺伝子ともいわれる遺伝子である（ＢｒａｃｈｍａｎｎＣＢ，ＳｈｅｒｍａｎＪＭ，ＤｅｖｉｎｅＳＥ，ＣａｍｅｒｏｎＥＥ，ＰｉｌｌｕｓＬ，ＢｏｅｋｅＪＤ．ＴｈｅＳＩＲ２ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ，ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉａｔｏｈｕｍａｎｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ｃｅｌｌｃｙｃｌｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｔａｂｉｌｉｔｙ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１９９５；９：２８８８−２９０２．）。また、遺伝子発現は、実施例４と同様にｍＲＮＡレベルで評価した。
単球系細胞（Ｕ９３７）のＳＩＲＴ１遺伝子をＲＮＡ干渉法により発現を抑制すると、コントロール（対照）下においてＳＩＲＴ１遺伝子の発現が抑制されることが確認された。また、単球系細胞（Ｕ９３７）を１０ｎｍｏｌ／Ｌフォルボールエステル（ＰＭＡ）で刺激してマクロファージへ分化させた場合においても、ＲＮＡ干渉法によりＳＩＲＴ１遺伝子の発現が抑制されることが確認された（図６のパネルＡ）。なお、図６のパネルＡ及びＢにおいて、「対照（ＲＮＡ−）」は、ｓｉＲＮＡを含まない、溶媒のみを加えたものを意味し、「対照ｓｉＲＮＡ」は、スクランブルｓｉＲＮＡ（標的ＲＮＡ（ＳＩＲＴ１ＲＮＡ）を抑制するためのｓｉＲＮＡ（ＳＩＲＴ１ｓｉＲＮＡ）と同じヌクレオチド構成比を有し、どの遺伝子とも異なる遺伝子配列から成るＲＮＡ）を意味する。
図６のパネルＢには、同条件における、ＰＭＡ刺激により誘導されたマクロファージ中のＭＭＰ−９遺伝子の発現を示す。これから分かるように、ＳＩＲＴ１遺伝子の発現が抑制されると、ＭＭＰ−９遺伝子の発現が顕著に増加する。
一方、単球系細胞（Ｕ９３７）をフォルボールエステル（ＰＭＡ）で刺激してマクロファージへ分化させる際に、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）２ｍｇ／ｍＬをＵ９３７細胞培養液に添加した。対照として、フォルボールエステルも２−デオキシグルコースも投与しなかった単球系細胞（Ｕ９３７）、及びフォルボールエステルのみ投与した単球系細胞（Ｕ９３７）を用いた。刺激２４時間後のＳＩＲＴ１遺伝子発現を比較した結果を図６のパネルＣに示す。
図６のパネルＣから判るように、２−デオキシグルコースの投与によりＳＩＲＴ１遺伝子の発現が顕著に増加した。
これらの結果を総合して考察すると、２−デオキシグルコースはＳＩＲＴ１遺伝子の発現を誘導し、このことによっても、マクロファージ中のＭＭＰ−９の活性を抑制することに有効である可能性がある。

本発明によれば、ＭＭＰ活性を抑制でき、ＭＭＰ活性化関連疾患の治療、緩和及び予防に有効な組成物が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

マトリックスメタロプロテアーゼ-9活性抑制組成物を有効成分として含有する腹部大動脈瘤治療剤であって、該マトリックスメタロプロテアーゼ-9活性抑制組成物が2-デオキシグルコース及びその塩から成る群より選択される解糖系糖代謝阻害剤を有効成分とするものであることを特徴とする、前記腹部大動脈瘤治療剤。