KR100615560B1 - 담즙산 및 담즙산 유도체의 지방산 유도체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트(conjugate)(이하 "BAFAC" 라 칭한다), 담즙 중에 콜레스테롤 담석을 용해시키고, 그의 발생 또는 재발을 예방하는 그의 용도, 동맥경화증을 감소시키거나 예방하는 그의 용도 및 상기 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
화학식 II 의 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트(conjugate):
[화학식 II]
W-X-G
상기식에서,
G 는 담즙산 또는 담즙염 라디칼이고,
W 는 1 또는 2 개의 포화 지방산 라디칼을 나타내며,
X 는 상기 담즙산 또는 담즙염 라디칼 및 지방산 라디칼(들) 사이의 결합 원(bonding member)이다.
컨주게이트화는 담즙산 또는 담즙염 핵의 3번, 6번, 7번 12번 및 14번 중에서 선택되는 위치에서 수행하는 것이 유리하다. 지방산은 바람직하게는 14-22 개의 탄소 원자를 갖는 포화 지방산이다.
Description
본 발명은 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트(conjugate)(이하 "BAFAC" 라 칭한다), 담즙 중에 콜레스테롤 담석을 용해시키고, 담석의 발생 또는 재발을 예방하는 그의 용도, 동맥경화증을 감소시키거나 예방하는 그의 용도 및 상기 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
용어 담즙산 및 담즙염은 유사하고, 서로 교환하여 사용됨을 유의해야 한다.
담석은 산업화된 국가의 국민 중 약 15%에서 발견된다. 대부분의 담석은 콜레스테롤 담석이다. 즉, 콜레스테롤이 그의 주성분이다. 따라서, 콜레스테롤 담석은 주요 건강 문제를 대표한다. 담즙은 종종 결정화 경향이 있는 콜레스테롤로 과포화된다. 담즙 중 콜레스테롤 결정화의 예방이 콜레스테롤 담석의 형성, 또는 쇄석술(lithotripsy), 용해 또는 담석 추출과 같은 조치 후의 재발을 예방할 것이다. 담낭 중에 새로이 분비된 담즙의 체류 시간은 짧다(12-24시간 미만). 그러한 기간 동안 담즙 중의 콜레스테롤 결정화의 예방은 담석 형성을 예방할 수 있다.
어떤 담즙염, 예를 들어, 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid) 또는 우르소데옥시콜산을 사용하여 콜레스테롤 담석이 의학적으로 용해될 수 있고, 그의 재 발이 예방될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 담즙염 치료는 효능이 낮고, 매우 많은 시간이 소요되며, 대부분 포기하게 된다. 따라서, 더욱 효과적인 치료가 필요하다.
최근의 연구는 담즙 중 콜레스테롤 용해에 있어서 인지질의 주요 역할을 증명하였다(T. Gilat et al. Biochimica et Biophysica Acta 1286, (1996), 95-115; Y. Ringel et al. Biochimica et Biophysica Acta 1390, (1988), 293-300; 및 J. Hepatology, 28, (1998), 1008-1014). 인지질은 담즙 중 콜레스테롤 용해 지질 덩어리의 주요하거나 유일한 성분이다. 인지질의 담즙에의 순차적인 첨가는 담즙 중의 콜레스테롤의 응집(nucleation) 시간을 점진적으로 연장시킨다는 것이 증명되었다[Z. Halpern et al. Gut 34 (1933) 110-115).
인간 또는 모형 담즙에서의 콜레스테롤 결정화 억제 능력에 있어서, 어떤 인지질 분자 종류 사이의 주요한 차이가 입증되었다. 인지질은 주로 입체특이적 번호 sn-1 및/또는 sn-2 위치 및 그들의 헤드 그룹(head group)에 존재하는 지방산에서 서로 차이가 난다. 응집 시간에 있어서 주된 지연 및 콜레스테롤 결정 성장률과 전체 콜레스테롤 결정 양(mass)에 있어서 주된 감소가 인지질의 절대적 또는 상대적 양의 변화 없이 인지질의 분자 종류의 변화로 이루어짐이 입증되었다. 콜레스테롤 결정화는 sn-2 지방산이 포화된 경우, 헤드 그룹이 콜린 등 대신에 세린인 경우, 뚜렷하게 지연되었다[Y. Ringel et al. above].
또한, (전체 인지질 분자가 아닌) 다양한 인지질 성분 자체, 예를 들어, 포화 지방산, 예컨대, 팔미트산 또는 스테아르산; 또는 포스파티딜 글리세롤이 강력 한 콜레스테롤 결정화 억제 능력을 갖는 것으로 나타났다.
따라서, 일반적인 인지질, 또는 특정 인지질 또는 그 성분, 예를 들어, 지방산이 풍부한 인간의 담즙이 담즙 중의 콜레스테롤 결정화를 뚜렷하게 지연시키고, 목적하는 결과를 이룰 것이다.
문제는 인간의 생체내 담즙을 어떻게 인지질 또는 그의 성분으로 풍부하게 할 수 있는가이다. 담즙염이 인간에게 공급되는 경우, 이들은 매우 효과적으로 흡수되고, 간에 의해 흡수되며, 담즙에 의해 분비된다. 이것은 또한 합성 담즙염 유사체에도 적용된다. 이러한 목적을 위해 신체에는 특이적이고, 매우 효과적인 수송 기전이 있다. 따라서, (인간의 담즙에 소량으로 통상 존재하는) 우르소데옥시콜산이 규칙적으로 공급되는 경우, 이것은 흡수되고, 담즙에 분비되며, 결국 담즙의 담즙산의 30-50%를 구성한다. 그러나, 상기 지적한 바와 같이, 콜레스테롤 담석의 용해를 위한 담즙염 치료법은 만족스럽지 못하다.
인지질 및 그의 성분은 잘 흡수되고, 간에 의해 흡수된다. 그러나, 인지질의 담즙에의 분비는 간에 의해 엄격하게 조절되고, 담즙염 및 콜레스테롤의 분비와 관련하여 단지 제한된 양 및 종류의 인지질이 담즙에 분비된다. 현재, 정량적으로 또는 정성적으로 인간의 담즙의 인지질 조성을 다른 고려할만한 정도로 조절하기 위한 효과적인 방법이 없다. 식이적 인지질이 간에 도달하는 경우, 이들은 대사되어, 혈액 중에 분비되거나 간에 저장될 것이다. 단지 소량의 예정된 종류만이 담즙에 분비되어 최소한의 조절 가능성이 있다.
따라서, 담즙 콜레스테롤의 용해를 개선하고, 콜레스테를 담석의 형성을 예 방하거나, 존재하는 담석을 용해하는 인지질 또는 그 성분 중의 하나를 담즙에 수송하기 위한 만족할만한 방법을 발견하는 것이 바람직하다.
이스라엘 특허 명세서 제95668호 및 대응하는 미국 명세서로부터 공지된 화학식 I 의 담즙산 유도체가 존재한다:
[화학식 I]
W-X-G
상기식에서,
G 는 담즙산 라디칼이고,
W 는 의약의 활성 화합물 부분이며,
X 는 상기 담즙산 라디칼 및 활성 화합물 사이의 직접 결합 또는 결합 요소(bonding element)이다.
상기 명세서에서, 긴 목록의 치환기가 주어지지만, 그것은 W 를 구체적으로 지방산 라디칼을 나타내는 것으로서 포화된 것 또는 불포화된 것 어느 것으로도 언급하지 않는다. 즉, 상기 명세서는 BAFAC 에 대해서 아무것도 언급하지 않는다.
또한, 상기 화합물의 모든 목적 중에, 상기 화합물 중 어느 것이라도 담즙 콜레스테롤의 용해를 증가시키고, 콜레스테롤 담석의 형성을 예방하며, 존재하는 콜레스테롤 담석을 용해시키고, 동맥경화증을 감소시키거나 예방하는데 이용될 수 있다는 암시조차 발견할 수 없다.
이제, (포화 또는 불포화) 지방산과 연결 결합 X 를 통하여 컨주게이트된 담즙산 또는 염(이하에서, BAFAC)이, 담즙산 및 염의 매우 효과적인 장간 순환을 사용하여 지방산을 담즙에 수송하기 위한 담체로서 사용될 수 있음을 발견하였다. 지방산(들) 및 담즙산 사이의 에스테르 결합은 이것이 소화액 및 장 박테리아에 의하여 깨져 BAFAC 의 분해 및 그 성분의 분리 흡수를 야기시킬 수 있기 때문에 부적합하다. 또한, BAFAC 가 장으로부터 흡수되고, 간에 의해 흡수되며, 담즙으로 분비되는 것으로 나타났다. 상기 BAFAC 는 콜레스테롤의 담즙 중 용해를 개선하고, 뚜렷하게 그의 결정화를 지연시켰다. 따라서, 상기 BAFAC 는 콜레스테롤 담석의 형성 또는 재발을 예방하고, 콜레스테롤 담석을 용해하기 위한 유용한 제제이다.
또한, BAFAC 의 투여는 혈관에서의 콜레스테롤 결정화에 대한 억제 효과를 갖는다. 생리학적 상황에서, 섭취된 담즙산 또는 염은 장에서 흡수되고, 문맥을 통하여 간에 수송되며, 담즙을 통하여 장에 분비된다. 따라서, 이들은 장간 순환에서 재순환하여 소량만으로도 전신 순환(혈관)에 도달한다. BAFAC 는 더욱 지질처럼 행동하여, 이는 장 흡수 후 림프를 통하여 전신 순환으로 수송된다. BAFAC 는 림프 및 문맥을 모두 통하여 수송되는 것으로 나타났다. 두가지 경로에 의하여, 이들은 간에 의하여 흡수되고, 담즙에 분비된다. 각각의 장관 순환에서, 이들은 장에 분비되고, 다시 부분적으로 림프를 통하여 재흡수되며, 간 흡수 이전에 혈관으로 재순환환다. 매일 10-12 주기의 장관 순환이 있기 때문에, 순수 효과는 혈관에서의 BAFAC 의 재순환일 것이다.
하루 동안에 BAFAC 의 경구 분할 투여는 이러한 효과를 증가시킬 것이다. BAFAC 의 콜레스테롤 결정화에 대한 억제 효과 및 존재하는 콜레스테롤 결정을 용해시킬 수 있는 가능성은 증명된 바 있다. 따라서, 또한 혈관에서의 콜레스테롤 결정화, 즉 동맥경화증을 감소시키고/거나 예방하는데 있어서, 이들의 가치가 있다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 II 의 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트에 존재한다:
W-X-G
상기식에서,
G 는 화학식 I 에서의 의미와 동일하고,
W 는 1 또는 2 개의 지방산 라디칼을 나타내며,
X 는 상기 담즙산 또는 담즙염 라디칼 및 지방산 라디칼(들) 사이의 결합 원(member)이다.
X 는 상기 담즙산 또는 담즙염 라디칼 및 지방산 라디칼(들) 사이의 결합 원(member)이다.
적합한 담즙산으로서, 예를 들어, 콜산, 케노데옥시콜산, 우르소데옥시콜산 및 데옥시콜산을 언급할 수 있다. 이용되는 담즙산은 컨주게이트되지 않거나, 담즙 중에서와 같이, 글리신, 타우린 또는 적합한 아미노산과 컨주게이트될 수 있다. 이러한 가능성은 담즙산의 정의 내에 포함되고, 따라서, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 지방산 라디칼과의 컨주게이트는 사용되는 담즙산에 따라 대부분 핵의 3번 위치에서 수행된다. 또한, 상이한 위치, 예를 들어, 6번, 7번, 12번 및 24 번에서 지방산 라디칼과의 컨주게이트를 수행할 가능성이 있다. 담즙산이 글리신 또는 타우린과 컨주게이트된 경우, 지방산 라디칼과의 컨주게이트는 24 번 위치에서 수행될 수 없다. 지방산 라디칼 및 담즙산 사이의 컨주게이트는 α 또는 β 배열(configuration)로 존재할 수 있다.
결합 요소 X 는 -NH- 기 또는 -O- 기가 유리하다.
바람직한 지방산은 적합하게는 6-26개의 탄소 원자를 갖는 포화된 것이고, 14 내지 22 개의 탄소 원자를 갖는 것이 유리하다. 바람직한 포화 지방산은 베헤닐산(behenylic acid), 아라키딜산, 스테아르산, 팔미트산 및 미리스틸산이다.
W 가 두 개의 지방산을 나타내는 경우, 이들은 적합하게는 3번 및 7번 위치에서 컨주게이트된다.
본 발명은 또한 담즙 중에 콜레스테롤 담석의 용해가 가능하고, 그의 형성을 예방하며; 동맥경화증의 예방 및/또는 감소를 가능하게 하는, 활성 성분으로서 화학식 II 의 담즙산 지방산 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 존재한다.
상기 조성물은 정제, 캅셀제, 액제, 유화제 등의 형태를 가질 수 있다.
상기 조성물은 추가의 화합물, 예를 들어, 담체, 용매, 유화제(emulgator), 흡수증강제, 콜레스테롤 합성 또는 담즙에의 분비 억제제 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 0.1-1.5g의 활성 성분을 포함하는 것이 유리하다.
조성물은 매일 1회 바람직하게는 취침시간에 적합하게 섭취한다. 이것은 또한 하루에 분할 용량으로 섭취될 수 있다.
또한, 본 발명은 담즙 중의 콜레스테롤 담석의 용해 및 그의 형성의 예방을 위한 화학식 II 의 담즙산 지방산 유도체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 용도에 존재한다.
또한, 본 발명은 동맥경화증의 예방 및/또는 감소를 위한 화학식 II 의 담즙산 지방산 유도체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 용도에 존재한다.
또한, 본 발명은 화학식 II 의 담즙산 지방산 유도체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하여, 담즙 중에 콜레스테롤 담석을 용해시키고, 그의 형성을 예방하는 방법에 존재한다.
또한, 본 발명은 화학식 II 의 담즙산 지방산 유도체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하여 동맥경화증을 예방 및/또는 감소시키는 방법에 존재한다.
이제, 본 발명은 수반하는 실시예 및 도면과 관련하여 예증되지만, 이들에 의하여 제한되는 것은 아니다.
도 1 은 결정 관찰 시간을 나타낸다. 모형 담즙 용액. 팔미토일-콜레이트 (PalC)의 효과.
A-대조 용액. B, C-각각 동등몰량의 PalC 에 의한 10% 및 20%의 Na 타우로콜레이트(NaTC) 대체. D-PalC 에 의한 20%의 인지질의 대체. E F 용액에 각각 10mM 및 20mM PalC 첨가.
도 2 는 콜레스테롤 결정 양(mass)을 나타낸다. 모형 담즙 용액. PalC 의 효과. A, B, C, D, E 및 F 는 도 1 에서와 같다.
도 3 은 결정 성장률을 나타낸다. 모형 담즙 용액. PalC 의 효과. A, B, C, D, E 및 F 는 도 1에서와 같다.
도 4 는 박층 크로마토그래피를 나타낸다. A-순수 용액(좌측) 및 햄스터 담즙 중에서의 PalC 표준. B-대조 동물(좌측)의 햄스터 담즙 및 PalC 공급 햄스터의 담즙.
도 5A 는 콜산(C-3 위치)과 베헤닐산(C-22), 아라키드산(C-20), 스테아르산(C-18), 팔미트산(C-16), 미리스트산(C-14), 라우르산(C-12) 및 카프로산(C-6)과의 컨주게이트의 단계를 나타낸다.
도 5B 는 글리신 컨주게이트된 스테아로일-콜레이트의 합성 단계를 나타낸다.
도 5C 는 올레오일-콜레이트의 컨주게이트를 나타낸다.
도 5D 는 담즙산 핵의 C-3 및 C-7 위치에서의 콜산과 2분자의 스테아르산의 컨주게이트를 나타낸다.
도 6 은 콜레스테롤 결정 양을 나타낸다. 모형 담즙 용액. 콜산(C-3위치)과 컨주게이트된 미리스트산(C-14), 팔미트산(C-16), 스테아르산(C-18) 및 아라키드산(C-20)의 효과. 시험 화합물이 대조 용액 중의 NaTC 20 mole%을 대체하였다.
도 7 은 응집 시간을 나타낸다. 모형 담즙 용액. 도 6에서 사용된 화합물의 효과.
도 8 은 22 일의 인큐베이션 후 풍부한 인간 담즙의 콜레스테롤 결정 양을 나타낸다. 대조 담즙 및 5mM 콜산을 가한 담즙과 비교하여 담즙에 첨가된 5mM 팔미토일(C-16) 콜레이트, 스테아로일(C-18) 콜레이트 및 아라키딜(C-20) 콜레이트의 효과.
도 9 는 응집 시간, 모형 담즙을 나타낸다. 모형 담즙 및 20% NaTC를 콜산과 대체하지 않은 것과 비교하여 동등몰량의 카프로일(C-6) 콜레이트, 라우릴(C-12) 콜레이트, 스테아로일(C-18) 콜레이트, 아라키딜(C-20) 콜레이트 및 디-스테아로일 우르소데옥시콜레이트가 20 mole%의 NaTC를 대체한 효과.
도 10 은 30mg의 섭취 후 1, 2 및 3 시간에 햄스터에서의 스테아로일(C-18) 콜레이트 농도를 나타낸다. 심장 혈액, 문맥 혈액 및 담낭 담즙 중의 농도.
실시예 I
3β-베헤닐아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-3)
(a) 1.15g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-1)[Fr Patent 1017756 Dec. 18 1952, Chem. Abstr. 52:1293c]를 30㎖ 의 건조 디메틸포름아마이드에 용해시키고, 교반 하에 15㎖의 트리에틸 아민으로 처리하였다. 10㎖ 의 디메틸 포름아마이드 중의 1.13g의 베헤노일 클로라이드를 생성된 용액에 적가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 이후 유기 분획을 소듐 설페이트로 건조시키고, 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물(6:4 및 8:2)로 실리카겔 크로마토그래피하여 0.8g의 3β-베헤닐아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸 에스테르(도 5A-2)를 수득하였다.
(b) 상기 메틸 에스테르 0.45g을 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 24시간 실온에서 방치하였다. 메탄올을 증류시키고, 10㎖ 의 물을 가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 물 분획을 묽은 염산으로 산성화하여, 0.41g의 순수한 3β-베헤닐아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-3)을 수득하였다.
실시예 II
3β-아라키딜아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-5)
(a) 1.0g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-1)[실시예 1 참조]를 30㎖ 의 건조 디메틸 포름아마이드에 용해시키고, 교반 하에 15㎖의 트리에틸 아민으로 처리하였다. 10㎖ 의 디메틸 포름아마이드 중의 1.0g의 아라키도일 클로라이드를 생성된 용액에 적가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 이후 유기 분획을 소듐 설페이트로 건조시키고, 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물(6:4 및 8:2)로 실리카겔 크로마토그래피하여 0.6g의 3β-아라키딜아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-4)를 수득하였다.
(b) 0.5g의 3β-아라키딜아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸 에스테르(도 5A-4)를 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 24시간 실온에서 방치하였다. 메탄올을 증류시키고, 10㎖ 의 물을 가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 물 분획을 묽은 염산으로 산성화하여, 백색 침전물로 생성시키고, 물로 세척하여 0.7g의 순수한 3β-아라키딜아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-5)을 수득하였다.
실시예 III
3β-스테아릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-7)
방법 1
(a) 1.15g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-1)[실시예 1 참조]를 30㎖ 의 건조 디메틸 포름아마이드에 용해시키고, 교반 하에 15㎖의 트리에틸 아민으로 처리하였다. 10㎖ 의 디메틸 포름아마이드 중의 1.13g의 스테아로일 클로라이드를 생성된 용액에 적가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 이후 유기 분획을 소듐 설페이트로 건조시키고, 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물(6:4 및 8:2)로 실리카겔 크로마토그래피하여 0.68g의 3β-스테아릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-6)를 수득하였다.
(b) 0.45g의 3β-스테아릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸 에스테르(도 5A-6)를 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 24시간 실온에서 방치하였다. 메탄올을 증류시키고, 10㎖ 의 물을 가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 물 분획을 묽은 염산으로 산성화하여, 백색 침전물로 생성시키고, 물로 세척하여 0.41g의 3β-스테아릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-7)을 수득하였다. mp 63-65℃.
방법 2
2.5g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(문헌 Kramer et al., J. of Lipid Research 24, 910, 1983 에 따라 제조)을 아세토니트릴에 용해시키고, 동일한 용매 중의 1.2g의 스테아르산 및 3.6g의 N-하이드록시 숙신아마이드의 교반된 용액에 가하였다. 8시간 후, 침전을 여과하고, 용매로 세척하고, 증발 건조시켰다. 잔사를 10㎖ N-메틸 몰포린 및 N,N'-디메틸 포름아마이드(1:3) 중의 1.2g의 스테아르산 용액에 가하였다. 실온에서 밤새 보존한 후, 용액을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하여, 방법 1 의 것과 동일한 0.6g의 산(도 5A-7)을 수득하였다.
방법 3
6g의 스테아로일 클로라이드 용액을 0°에서 톨루엔 중의 1.6g의 아민(도 5B-18)의 교반된 용액에 적가하고, 동일 온도에서 1시간 방치하였다. 생성된 용액을 50°에서 1시간 더 가열하고, 3N-염산으로 산성화하고, 여과하였다. 고체 물질을 물로 세척하고, 45°에서 건조하여 상기한 것과 동일한 산(도 5A-7)을 수득하였다.
실시예 IV
3β-팔미틸아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-9)
방법 1
(a) 1.0g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-1)[실시예 1 참조]를 30㎖ 의 건조 디메틸 포름아마이드에 용해시키고, 교반 하에 15㎖의 트리에틸 아민으로 처리하였다. 10㎖ 의 디메틸 포름아마이드 중의 0.8g의 팔미토일 클로라이드를 생성된 용액에 적가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 이후 유기 분획을 소듐 설페이트로 건조시키고, 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물(6:4 및 8:2)로 실리카겔 크로마토그래피하여 0.5g의 3β-팔미틸아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-8)를 수득하였다.
(b) 상기 메틸 에스테르 0.45g을 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 24시간 실온에서 방치하였다. 메탄올을 증류시키고, 10㎖ 의 물을 가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 물 분획을 묽은 염산으로 산성화하여, 백색 침전물로 생성시키고, 물로 세척하여 0.4g의 순수한 3β-팔미틸아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-9)을 수득하였다.
방법 2
2.5g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5B-18)(문헌 Kramer et al., J. of Lipid Research 24, 910, 1983 에 따라 제조)을 아세토니트릴에 용해시키고, 동일한 용매 중의 1.2g의 팔미트산 및 3.6g의 N-하이드록시 숙신아마이드의 교반된 용액에 가하였다. 8시간 후, 침전을 여과하고, 용매로 세척하고, 증발 건조시켰다. 잔사를 10㎖ N-메틸 몰포린 및 N,N'-디메틸 포름아마이드(1:3) 중의 1.2g의 팔미트산 용액에 가하였다. 실온에서 밤새 보존한 후, 용액을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하여, 방법 1 의 것과 동일한 0.6g의 산(도 5A-9)을 수득하였다.
실시예 V
3β-미리스틸아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-11)
(a) 0.5g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르 (1)[실시예 1 참조]를 30㎖ 의 건조 디메틸 포름아마이드에 용해시키고, 교반 하에 15㎖의 트리에틸 아민으로 처리하였다. 10㎖ 의 디메틸 포름아마이드 중의 0.4g의 팔미토일 클로라이드를 생성된 용액에 적가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 이후 유기 분획을 소듐 설페이트로 건조시키고, 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물(6:4 및 8:2)로 실리카겔 크로마토그래피하여 0.4g의 3β-미리스틸아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-10)를 수득하였다.
(b) 0.45g의 3β-미리스틸아마이드-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-10)를 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 24시간 실온에서 방치하였다. 메탄올을 증류시키고, 10㎖ 의 물을 가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 물 분획을 묽은 염산으로 산성화하여, 백색 침전물로 생성시키고, 물로 세척하여 0.26g의 순수한 산(도 5A-11)을 수득하였다.
실시예 VI
3β-라우릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-13)
(a) 0.6g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-1)[실시예 1 참조]를 30㎖ 의 건조 디메틸 포름아마이드에 용해시키고, 교반 하에 15㎖의 트리에틸 아민으로 처리하였다. 10㎖ 의 디메틸 포름아마이드 중의 0.6g의 라우릴 클로라이드를 생성된 용액에 적가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 이후 유기 분획을 소듐 설페이트로 건조시키고, 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물(6:4 및 8:2)로 실리카겔 크로마토그래피하여 0.5g의 3β-라우릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-12)를 수득하였다.
(b) 0.45g의 3β-라우릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-12)를 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 24시간 실온에서 방치하였다. 메탄올을 증류시키고, 10㎖ 의 물을 가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 물 분획을 묽은 염산으로 산성화하여, 백색 침전물로 생성시키고, 물로 세척하여 0.41g의 순수한 산(도 5A-13)을 수득하였다. mp. 82-88
실시예 VII
3β-카프릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5A-15)
(a) 1.0g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-1)[실시예 1 참조]를 30㎖ 의 건조 메틸렌 클로라이드에 용해시키고, 교반 하에 15㎖의 트리에틸 아민으로 처리하였다. 10㎖ 의 메틸렌 클로라이드 중의 1.2g의 카프로일 클로라이드 산을 생성된 용액에 적가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 이후 유기 분획을 소듐 설페이트로 건조시키고, 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물(6:4 및 8:2)로 실리카겔 크로마토그래피하여 0.7g의 3β-카프릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-14)를 수득하였다.
(b) 0.5g의 3β-라우릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-14)를 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 24시간 실온에서 방치하였다. 메탄올을 증류시키고, 10㎖ 의 물을 가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 물 분획을 묽은 염산으로 산성화하여, 백색 침전물로 생성시키고, 물로 세척하여 0.4g의 순수한 산(도 5A-15)을 수득하였다.
실시예 VIII
N-(-카복시메틸)-3β-스테아릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5B-17)
(a) 0.5g의 3β-스테아릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란오산(도 5A-7)을 25㎖ 의 건조 1,4-디옥산에 용해시키고, -10°로 냉각시켰다. 교반된 용액을 0.5㎖의 트리에틸 아민으로 처리하고, 이후, 0.085㎖의 클로로에틸 포르메이트로 처리하고, 동일 온도에서 15분간 교반하였다. 용액을 실온으로 방치하고, 0.1㎖ 의 트리에틸아민으로 처리하고, 14g의 에틸 글리신 하이드로클로라이드로 처리하고, 밤새 방치하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 물로 세척하였다. 추출물을 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트 : 헥산 60 : 40 의 혼합믈, 순수한 에틸 아세테이트 및 이후 에틸 아세테이트 : 메탄올 9 : 1 을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피하여 0.27g의 생성물(도 5B-16)를 수득하였다.
(b) 0.27g의 상기 화합물을 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하였다. 24시간 후, 메탄올을 증발 건조시키고, 물에 용해시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 분획을 1N의 HCl로 산성화하였다. 수득한 침전물을 물로 세척하고, 건조시켜 0.24g의 건조 물질(도 5B-17)을 수득하였다.
실시예 IX
3β-올레일아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5C-20)
(a) 1.6g의 3β-아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오 메틸에스테르(도 5A-1)을 30㎖ 의 건조 디메틸 포름아마이드에 용해시키고, 교반 하에 3㎖의 트리에틸 아민으로 처리하였다. 10㎖ 의 건조 DMF 중의 1.38g의 올레일 클로라이드 용액을 적가하고, 생성된 용액을 실온에서 밤새 방치하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 분획을 묽은 염산, 중탄산나트륨 및 이후 물로 세척하여 정제하였다. 진공에서 증발 건조시켜 3.1g을 생성시키고, 에틸 아세테이트/헥산의 혼합물(4:6 및 10:8)로 실리카겔 크로마토그래피하여 1.8g의 메틸 에스테르(도 5C-19)를 수득하였다.
(b) 20㎖ 의 메탄올 중의 1.2g 의 메틸 에스테르 용액을 실온에서 5㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 48시간 실온에서 보존하고, 이후, 증발 건조시켰다. 잔사를 20㎖ 의 물에 용해시키고, 25㎖ 의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 물 추출물을 염산 용액으로 산성화하여, 침전물을 수득하고, 여과하였다. 이 잔사를 에틸 아세테이트 : 헥산 : 아세트산 (10 : 4 : 0.3) 의 혼합물로 실리카겔 크로마토그래피하여 0.3g의 3β-올레일아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(도 5C-20)을 수득하였다.
실시예 X
3β,7α-디스테아릴아미도-5β-우르소데옥시콜란-24-오산(도 5D-26)
(a) 20g의 우르소데옥시-콜란-24-오산을 200㎖ 의 무수 메탄올에 용해시키고, 1㎖ 의 진한 황산으로 처리하고, 24시간 교반하였다. 대부분의 용매를 증류시키고, 잔사를 물에 붓고, 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기 추출물을 중탄산나트륨 용액 및 염화나트륨 용액으로 세척하고, 증발 건조시켜 19.5g 의 3α,7β-디하이드록시-5β-우르소데옥시콜란-24-오산 메틸 에스테르(도 5D-21)을 수득하였다.
(b) 4.06g 의 메틸 에스테르(도 5D-21)을 30㎖ 의 건조 피리딘에 용해시키고, 0°로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 교반하고, 15분간 5㎖ 피리딘 중의 1.49g 의 메탄-설포닐 클로라이드 용액으로 적가 처리하였다. 동일 온도에서 3시간 방치한 후, 반응 혼합물을 얼음 및 물에 붓고, 이후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 염산, 중탄산나트륨 및 염화나트륨 용액으로 세척하고, 여과하고, 진공에서 증발시켰다. 4 가지 화합물로 구성된 잔사를 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물을 용리액으로 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피하였다. 극성이 더 작은 5.3g 의 화합물은 목적하는 3α,7β-디메실-5β-우르소데옥시콜란오산 24-오 메틸 에스테르(도 5D-22)이었다.
(c) 5.65g 의 디메실 유도체를 50㎖ 의 건조 DMF 에 용해시키고, 건조 소듐 아자이드로 처리하고, 130°로 2시간 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 얼음 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이후, 추출물을 소듐 아세테이트 및 염화나트륨 용액으로 세척하고, 여과하고, 증발 건조시켜, 4.6g 의 3β,7α-디아지도-5β-우르소데옥시콜란-24-오산 메틸 에스테르(도 5D-23)를 수득하였다.
(d) 4.5g 의 디아지도 화합물(도 5D-23)을 120㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 150mg 의 탄소상 5% 팔라듐을 가하고, 대기압에서 4일간 수소화하였다. 수소화를 추가의 150mg 의 탄소상 팔라듐으로 반복하였다. 수소화된 혼합물을 여과하고, 진공에서 증발시켜, 3g 의 3β,7α-디아미노-5β-우르소데옥시콜란-24-오산 메틸 에스테르(도 5D-24)를 수득하였다.
(e) 1.47g 의 3β,7α-디아미노-5β-우르소데옥시콜란-24-오 메틸 에스테르(도 5D-24)를 50㎖ 의 DMSO 및 DMF 의 건조 1 : 1 혼합물에 용해시키고, 2㎖ 의 트리에틸아민 및 30mg 의 디메틸아미노 피리딘 및 5.1g 의 스테아르 무수물로 처리하였다. 반응 혼합물을 50°로 가열하고, 18시간 교반하고, 얼음-물에 붓고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 상을 염산, 중탄산나트륨 및 염화나트륨 용액으로 세척하였다. 유기 용매의 증발 후, 2.05g 의 오일성 잔사를 수득하였다. 에틸 아세테이트 : 헥산을 용리액(1 : 4)으로 사용하여 실리카겔 상에서 분리하여 수많은 분획을 생성시키고, 그 중 80mg 하나는 그의 MS 및 1H-NMR 에 따라 목적하는 3β,7α-디스테아릴아미도-5β-우르소데옥시콜란오산 -24- 메틸 에스테르(도 5D-25)이었다.
(f) 78mg 의 메틸에스테르(도 5D-25)를 20㎖ 의 메탄올에 용해시키고, 2㎖ 의 1N 수산화나트륨으로 처리하고, 48시간 실온에서 방치하였다. 메탄올을 진공에서 증발시키고, 잔사를 25㎖ 의 물에 용해시키고, 여과하고, 이후, 묽은 염산으로 산성화하여 3β,7α-디스테아릴아미도-5β-우르소데옥시콜란-24-오산(도 5D-26y)으로 구성된 침전물을 수득하였다.
실시예 XI
물질 및 방법
콜레스테롤(Sigma, St. Louis, Mo.)을 뜨거운 에탄올로부터 두 번 재결정화하였다; Na-타우로콜레이트(Na-TC; Sigma, St. Louis, Mo.)를 에탄올 및 에테르로부터 두 번 재결정화하였다(J.L Pope, J. Lipid Res. 8, (1067) 146-147); 난황 레시틴(EYL)(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Al.)을 더 이상의 정제 없이 사용하였다. 본 연구에서 사용된 모든 지질은 TLC 표준으로 정제하였다. 실시예 XII 내지 XIV에서 사용된 합성 담즙산 컨주게이트는 (실시예 IV에서 기술한 바와 같이 제조된) 팔미틸아미노-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산(PalC)이었다.
1. 담즙의 제조
A. 모형 담즙
EYL, 콜레스테롤 및 Na-TC 혼합물을 CHCl3/CH3OH (2:1 v/v0 에 용해시키고, N2 하에 실온에서 건조시키고, 밤새 동결 건조하고, 사용할 때까지 -20℃에서 아르곤 하에 방치하였다. 건조 지질을 150mM NaCl, 1.5mM 디소듐 EDTA, 50mM 트리스-HCl pH 8.0 에 현탁시켜 모형 담즙 용액을 제조하고, 현탁액을 55℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 아르곤 하에 밀봉된, 용해된 모형 담즙을 37℃에서 실험 기간동안 인큐베이션하였다. 모형으로부터의 일부를 매일 시험하였다.
모든 모형을 3중으로 제조하고, 동일 조건에서 실험 기간동안 방치하였다.
모형 담즙의 조성물은 콜레스테롤 15mM, EYL 30mM, Na-TC 150mM 이었다.
대조 용액의 제조를 위해 100 % EYL 이 사용되었다. (10-20%) 의 EYL 또는 Na-TC를 가하거나 합성 담즙산 컨주게이트(PalC)로 대체하여 다른 조사되는 모형 담즙 용액을 제조하였다.
B. 천연의 인간 담낭 담즙
천연의 인간 담낭 담즙을 담낭절제술에 있는 콜레스테롤 담석 환자로부터 수득하였다. 여러 환자로부터 모은 담즙은 결정화가 용이하도록 실험에 사용하기 전에 건조 콜레스테롤로 인큐베이션하거나 농축된 모형 담즙과 혼합하여 풍부해진 콜레스테롤이었다.
2. 콜레스테롤 결정 형성 및 성장의 평가
2. 1 결정 관찰 시간 (COT) 분석
COT(또한 "응집 시간"이라 칭한다)을 문헌[Holan et al. in Gastroenterolo효 77, (1979) 611-617]에 기술된 바와 같이 측정하였다. 각각의 모형 담즙의 일부를 편광 현미경으로 매일 시험하였다. 100 배 확대시 현미경 필드(field) 당 적어도 3 개의 콜레스테롤 1수화물 결정의 초기 검출 시간으로서 COT를 측정하였다.
2. 2 결정 성장률(CGR) 분석
마이크로플레이트 리더(microplate reader, SPECTRA-STL, Austria)를 사용하여 분광광도법으로 결정 성장을 모니터하였다(G.J. Somjen, et al., J. Lipid Res. 38, (1977) 1048-1052). 지질 용액의 일부(50㎕)를 마이크로플레이트 웰에서 동등한 부피의 Na-타우로데옥시콜레이트 (200mM) 과 혼합하고, 격렬하기 진탕하였다. 실온에서 60분 후, 마이크로플레이트를 다시 진탕하고, 405nm에서 각각의 웰에서의 흡광도를 측정하였다. 측정을 위하여 각각의 모델을 삼중으로 제조하고, 이중으로 샘플화하였다.
데이터를 모으고, IBM 호환 PC 로 분석하여, 삼중의 표본을 평균한 광학 밀도(OD)를 계산하였다. 각각의 용액에 대하여 평균 OC 변화를 기술하는 그래프를 도시하였다. 적어도 3 개의 측정에 적합한 선형 회귀를 사용하여 곡선에서 가장 경사가 급한 부분의 기울기를 측정하고, CGR을 정의하였다. 각각의 모델에 대하여 0 일 및 14 일 사이의 CGR 및 OD 의 차이를 계산하였다.
2. 3 결정 양의 측정
실험 마지막 날에(14일), 전술한 바와 같이(G.J. Somjen 상기 참조) 각각의 샘플에 대하여 콜레스테롤의 화학 분석을 수행하였다. 샘플을 마이크로 웰로부터 모으고, Airfuge 중에서 70,000 rpm 으로 5분간 원심분리하였다(Beckman). 전체 샘플(원심분리 전) 뿐만 아니라 상등액에 대하여 분리 측정(Separate determination)을 수행하였다. 전체로부터 상등액의 양을 빼서 침전된 펠릿 중의 콜레스테롤의 양을 계산하였다. 편광 현미경으로 펠릿의 결정성 특징을 수행하였다. 또한, 0일 및 14의 인큐베이션 사이의 차이로서 분광광도법으로 결정 양을 측정하였다.
3. 데이타 분석
각각의 지질 분산액을 삼중으로 제조하고, 2개의 일부를 모든 샘플로부터 측정하였다. OD 의 평균치 및 표준편차를 계산하였다. 상기 설명한 결정 성장 곡선의 선형 회귀 분석으로부터 결정 성장률을 계산하였다. 상이한 모델 용액 사이의 차이의 비교를 편차의 원-웨이(one-way) 분석으로 수행하였다.
실시예 XII
실시예 IV에서 제조한 담즙염 지방산 컨주게이트(PalC, 이하에서 "시험 화합물"이라 칭한다)의 모형 및 인간 담즙 중에서 콜레스테롤 결정화 역학에 대한 효과
대체 및 첨가 실험을 수행하였다. 이하의 결과를 수득하였다.
A. 모형 담즙
a. 모형 담즙 용액(조성물: Na 타우로콜레이트 150mM 콜레스테롤 15mM 알(egg) 레시틴 30mM 전체 지질 10.3gm/이) 중에서, 20% 의 Na 타우로콜레이트를 시험 화합물로 대체한 경우, 응집 시간이 167% 지연되었고; 콜레스테롤 결정 성장률은 67% 감소되었으며, 14일의 인큐베이션 후 전체 콜레스테롤 결정 양은 53% 감소하였다.
b. 시험 화합물을 전체 모형 담즙(20% 의 담즙염 농도에서)에 가한 경우, 효과는 다음과 같다:
응집시간이 200% 지연되었고; 콜레스테롤 결정 성장률은 59% 감소되었으며, 14일의 인큐베이션 후 전체 결정 양은 51% 감소하였다.
B. 천연 인간의 담즙
시험 화합물(10mM 의 농도)을 콜레스테롤 담석 환자로부터 모은 천연의 인간 담낭 담즙으로 인큐베이션한 경우, 효과는 다음과 같다:
천연 인간의 담즙 중에, 콜레스테롤 결정을 이전의 2시간의 초원심분리로 제거한 것으로부터 새로운 콜레스테롤 결정을 2일의 인큐베이션으로부터(37℃) 관찰하였다. 결정 수가 점진적으로 증가되어 14일에 현미경 필드 당 150 결정보다 많은 피크에 도달하였다. 10mM 의 시험화합물로 인큐베이션된 동일한 담즙 중에는, 21일간의 인큐베이션을 통하여 어떠한 콜레스테롤 결정도 관찰되지 않았다.
실시예 XIII
모형 담즙 중 콜레스테롤 결정의 응집 연구를 다음과 같이 수행하였다:
PalC를 모형담즙에 하기의 비율(mole %)로 가하였다.
10%, 20% 로 NaTC 대체("B", "C")
20%로 PC 대체("D); 및
10%, 20% 의 전체 NaTC 첨가("E", "F")
실시예 XII 및 XIII 의 실험 결과를 첨부한 도 1 내지 도 3 에 다음과 같이 요약하였다(도 1 내지 3 의 모든 도면에서 "A" 는 PalC 가 없는 대조 모형 담즙을 나타낸다).
도 1 은 결정 관찰 시간 = 응집 시간을 나타낸다. 결과는 3개의 평균으로 주어졌다. 결정 관찰 시간은 C에서 167%, F에서 200% 지연되었다.
도 2 는 콜레스테롤 결정 양을 나타낸다. 14 일의 콜레스테롤 양은 B에서 17%, C에서 53% 감소되었다. F 에서는 51% 감소되었다.
도 3 은 결정 성장률을 나타낸다. 결정 성장률을 B에서 70%, F에서 59% 감소되었다.
이러한 실험 데이터는 담즙염 및 지방산의 컨주게이트가 모형 및 인간의 담즙 중에서 콜레스테롤 결정화를 예방 또는 지연시킴을 확인하였다.
실시예 XIV
A. 동물
수컷, 6-7주령의 무게 79-83g인 햄스터를 동물 사육실에서 물 및 음식에 무제한적으로 접근가능하게 사육하였다.
시험 햄스터에 경구로 1㎖ 의 염수에 용해된 특정의 시린지 10-15mg/동물/일 의 PalC 에 의하여 공급하였다. 대조 동물은 동등 부피의 염수만을 단독으로 공급하였다. 양쪽 그룹은 처리 과정 중에 정상적으로 행동하였다. 각각의 동물에 염수 중의 PalC 적용 후 2일 4시간에 이들을 과량의 클로로포름 증기로 치사시켰다. 복부를 열고, 담관을 묶고, 담당을 절제하고, 염수로 2회 세척하였다. 이들을 원뿔의 플라스틱 튜브 위에 놓고, 절개하였다. 담즙을 모으고, 튜브의 바닥에 모았다.
2. 일련의 동물을 시험하였다:
I. 5 마리의 대조 동물 및 5 마리의 시험 동물은 각각 10mg PalC/일을 공급받았다;
II 3 마리의 대조 동물 및 9 마리의 시험 동물은 각각 15mg PalC/일을 공급받았다.
B. 생화학적 방법
담즙 샘플을 5분간 2000rpm에서 원심분리하였다(Eppendorf 원심분리). 파편(debris)을 버리고, 상등액을 Folch 방법에 따라 추출하였다(클로로포름 : 메탄올 2 : 1). 물로 분배한 후, 지질 상을 실리카겔 60 박층 플레이트(Merck)에서 박층 크로마토그래피로 분석하였다. 용리액은 디클로로메탄:메탄올:아세트산 (100:5:1, v:v:v)이었다. I2 증기로 전개시킨 후, 진정한 표준의 약 0.2 의 레퍼런스 프론드(Reference front)와 비교하였다.
C. 결과
일련의 I 140㎕ 의 대조 및 100㎕의 시험 담즙을 수득하였다. 일련의 II 95㎕ 대조 및 240㎕의 시험 담즙을 수득하였다. 각각의 일련의 대조 담즙 및 시험 담즙을 분리하여 모았다. 추출된 지질의 TLC 분석(도 4에 나타냄)은 시험 동물의 담즙 중의 PalC 의 존재를 나타내었다. 이것은 섭취한 PalC 가 흡수되고 담즙에 분비됨을 증명한다.
도 4 는 실시예 XIV 중에서 수행한 실험의 TLC 비교를 나타낸다.
A. 는 순수 용액(좌측) 및 담즙(우측) 중의 PalC 표준을 나타낸다
B. 는 대조 햄스터(좌측); 및 PalC를 공급한 햄스터(우측)으로부터의 햄스터 담즙을 나타낸다. PalC 밴드는 이 컬럼에서 나타난다.
도 5A, 5B, 도 5C 및 5D 는 실시예 I 내지 X에서 기술한 화합물의 화학식을 각각 나타낸다.
실시예 XV
방법
모형 담즙 용액은 하기의 조성물을 갖는다:
콜레스테롤 15mM, EYL 30㎖, NaTC 150mM. 실시예 XI 에 기술한 바와 같이 제조하였다. 시험 용액에서, 20%의 NaTC를 시험할 동등몰량의 각각의 특정 지방산/담즙산 컨주게이트로 대체하였다. C1 위치에서 콜산과 컨주게이트된 각각 쇄 길이 C14, C16, C18 및 C20 의 포화 지방산의 컨주게이트로 수득한 결과를 도 6 및 7 에 나타내었다.
도 6은 대조 및 시험 용액의 이후 14 일의 인큐베이션 이후 이들 컨주게이트의 콜레스테롤 결정 양에 대한 효과를 나타낸다. 상기 모든 컨주게이트는 최종 결정 양을 대조 용액과 비교하여 감소시켰다. C18 컨주게이트는 대조용의 14% 까지 감소시켰다. C20 컨주게이트는 38% 까지 감소시켰다.
상이한 실험으로 시험한 C20 의 컨주게이트는 C20 의 그것과 유사한 활성을 나타내었다.
도 7 은 대조 용액과 비교한 바와 같은 각종의 시험 용액의 응집 시간(결정 관찰 시간)을 나타낸다. 특정 컨주게이트에 의한 20% 의 담즙염(NaTC)의 대체는 C16, C18 및 C20 컨주게이트의 응집 시간의 지연을 나타내었다. C14 는 응집 시간을 지연시키지 않았다. C20 컨주게이트는 응집 시간을 360% 이상 지연시켰다.
실시예 XVI
수술시 수득하여 모은 인간의 담낭 담즙을 콜레스테롤 결정화를 증가시키기 위한 농축 지질 용액으로 풍부하게 하였다. 첨가된 지질의 담즙 중의 최종 농도는 NaTC 60mM, EYL 18.4mM 및 콜레스테롤 9.2mM 이었다. 풍부한 담즙을 50,000 rpm에서 1 시간 초원심분리하여 콜레스테롤 결정을 제고하고, 5 바이알에 분배하였다. 첫 번째 바이알은 풍부한 바일(대조용)만을 포함하였다. 다른 4 개의 바이알에 하기의 용액을 가하였다(5mM에서):
콜산, C-16(팔미토일) 콜레이트, C-18(스테아로일) 콜레이트 및 C-20(아라키딜) 콜레이트. 37℃에서 22일 인큐베이션 후, 모든 담즙을 70,000rpm에서 5분간 Airfuge 중에서 원심분리하였다. 침전물을 제거하고, 그의 콜레스테롤 함량을 화학적으로 측정하였다. 결과를 도 8 에 침전된 결정 양 중의 콜레스테롤의 μmole 로서 나타내었다. 콜산이 있거나 없는 대조용 담즙과 비교할 때 모든 3 개의 담즙염/지방산 컨주게이트가 매우 뚜렷하게 콜레스테롤 결정화를 감소시킴이 명백하다.
실시예 XVII
실시예 XI 에 기술한 바와 같이, 동일한 지질 조성물로 모형 담즙 용액을 제조하고 대조용으로 사용하였다. 모든 다른 샘플 중에서, 20mole%의 NaTC를 동등몰량의 콜산, C6 콜레이트, C12 콜레이트, C18 콜레이트, C20 콜레이트(모든 이러한 포화 지방산은 콜레이트의 C3 위치에서 컨주게이트화한다), (동등 비율로 담즙산의 C3 위치 및 C7 위치에서 스테아르산 라디칼로 컨주게이트된) 디-스테아로일 우르소데옥시콜레이트로 대체하였다.
실시예 XI 에 기술한 바와 동일한 방법으로 모든 샘플을 37℃에서 인큐베이션하고, 주기광(periodic light) 현미경 관찰로 응집 시간을 측정하였다. 결과를 도 9 에 나타내었다. 결과는 다음과 같다: 1) 대조 모형 담즙 및 동등몰량의 콜산과 비교하여 시험한 모든 컨주게이트(BAFAC)는 콜레스테롤 결정화를 지연시켰다. 2) 장쇄 지방산의 BAFAC는 단쇄 지방산의 그것보다 더욱 효과적이다. 3) 2 개지의 지방산과의 컨주게이트(디-스테아로일 우르소데옥시콜레이트)는 특히 효과적이다.
실시예 XVIII
스테아로일-콜레이트(C-18 콜레이트)의 흡수 및 수송
80-100gm 의 암컷 햄스터에 1회 용량의 30mg C-18 콜레이트를 위내 투여하였다. 단일 동물을 투여 후, 1, 2 및 3 시간에 치사시켰다. 심장 혈액, 문맥 혈액 및 담낭 담즙에서 샘플을 취하였다. 두 그룹의 동물(A 및 B)를 병행하여 연구하였다. 206nm에서 UV 검출기를 사용하여 HPLC 기계(Kontron Switzerland)로 스테아로일 콜레이트 농도를 측정하였다.
결과를 도 10 에 나타내었다.
A 그룹에서: 1, 2 및 3 시간 후의 심장 혈액 농도는 각각 99, 7, 2μM인 반면, 문맥 혈관 농도는 68, 99 및 130μM이었다. 2 및 3 시간 후의 담낭 중 C-18 콜레이트 농도는 각각 540 및 270μM 이었다. B 그룹에서의 결과는 유사하다.
데이터는 다음과 같다: 1) C-18(스테아로일) zfhfpdlxm는 장으로부터 흡수된다. 2) 전신 순화에서(림프를 통하여) 및 문맥에서 수송된다. 3) 담즙으로 활발히 분비되어 그곳에 농축된다.
실시예 XIX
실시예 XI 에 기술한 바와 같은 동일한 방법으로 모형 담즙 용액을 제조하였다. 이것은 동일한 지질 조성물이고, 대조용으로 사용되었다.
시험 용액에서, 콜산, 스테아로일(C-18:0) 콜레이트 및 올레일(C-18:1) 콜레이트를 20mM 농도로 가하였다.
모든 샘플을 37℃에서 100 시간 인큐베이션하였다. 100 시간 및 0 시간 사이의 광학 밀도의 차이(실시예 XI 에 기술한 바와 같이)를 사용하여 100 시간에서의 전체 결정 양을 측정하였다. 대조 용액(100%)과 비교하여, 콜산과의 결정 양은 114%이고, 스테아로일-콜레이트는 62%, 올레오일-콜레이트는 55% 이었다.
이들 화합물은 포화 뿐만 아니라 불포화 (올레) 산과의 BAFAC 모두 대조 담즙 및 동등몰량의 콜산과 비교하여 콜레스테롤 결정화를 감소시킴을 증명한다.
Claims (27)
- 화학식 II 의 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트(conjugate):[화학식 II]W-X-G상기식에서,G 는 담즙산 또는 담즙염 라디칼이고,W 는 6-26개의 탄소 원자를 갖는 1 또는 2 개의 지방산 라디칼을 나타내며,X 는 상기 담즙산 또는 담즙염 라디칼 및 지방산 라디칼(들) 사이의 NH 결합이다.
- 제1항에 있어서, 담즙산이 콜산(cholic acid), 케노데옥시콜산 (chenodeoxycholic acid), 우르소데옥시콜산 및 데옥시콜산 중에서 선택되는 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 지방산 라디칼과의 컨주게이트화가 담즙산 핵의 3번 위치에서 수행되는 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트.
- 제1항에 있어서, 지방산 라디칼(들)과의 컨주게이트화가 담즙산 핵의 6번, 7번, 12번 및 24번 중에서 선택되는 위치에서 수행되는 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트.
- 제1항에 있어서, 지방산 라디칼(들) 및 담즙산 사이의 컨주게이트화가 α 또는 β 배열(configuration) 중에서 선택되는 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 포화 지방산이 베헤닐산(behenylic acid), 아라키딜산, 스테아르산, 팔미트산 및 미리스틸산 중에서 선택되는 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트.
- 3β-베헤닐아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산.
- 3β-아라키딜아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산.
- 3β-스테아릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산.
- 3β-팔미틸아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산.
- 3β-미리스틸아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오산.
- N-(-카복시메틸)-3β-스테아릴아미도-7α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-아마이드.
- 제1항에 있어서, W 가 담즙 핵의 3번 및 7번 위치에서 컨주게이트된 두 개의 지방산을 나타내는 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트.
- 활성 성분으로서 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 또는 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 화학식 II의 담즙산 또는 담즙염 지방산 유도체를 포함하는, 담즙 중에 콜레스테롤 담석의 용해를 가능하게 하고, 그의 형성을 예방하며, 동맥경화증의 예방 및/또는 감소를 가능하게 하는 약제학적 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 형태가 정제, 캅셀제, 액제 및 유제 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 담체, 용매, 유화제(emulgator), 흡수증강제 및 콜레스테롤 합성 또는 담즙에의 분비 억제제 중에서 선택되는 화합물을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 0.1 - 1.5 g 의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 또는 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트를 함유하는, 콜레스테롤 담석을 담즙 중에 용해시키고 그의 형성을 예방하기 위한 약제.
- 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 또는 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트를 함유하는, 동맥경화증의 예방 또는 감소를 위한 약제.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 담즙산 또는 담즙염 라디칼이 24번 위치에서 아미노산과 추가로 컨주게이트되고, 지방산 라디칼은 상기 담즙산 또는 담즙염 라디칼의 24번 위치 이외의 하나 이상의 다른 위치에서 컨주게이트된 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트.
- 제26항에 있어서, 24번 위치의 아미노산이 글리신 및 타우린 중에서 선택되는 담즙산 또는 담즙염 지방산 컨주게이트.
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