본 발명에 따른 아니스알데히드의 제조방법은 과채즙으로는 사과, 배, 토마토로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상을 수세하고 세절하여 착즙한 후, 여과하고 멸균하여 제조한 과채즙 배지에 큰느타리버섯균을 3∼8%(v/v)의 접종비로 접종한 다음, 20∼30℃의 온도로 10∼20일 동안 삼각플라스크를 이용한 회전진탕배양 또는 바이오리액터에 의한 통기배양의 방법으로 배양한 후 배양물 자체에서 아니스알데히드를 분리하는 것을 특징으로 한다.
한편 본 발명에 의해 분리한 아니스알데히드는 체리향을 발산하므로 본 발명에 의해 분리한 아니스알데히드를 유효성분으로 함유한 착향제로 사용할 수 있다.
사과, 배, 토마토를 수세하고 세절하여 착즙한 후, 여과하고 멸균하여 제조한 과채즙 배지를 제조한다. 전기의 과채중에서 잘 숙성된 사과, 배, 토마토를 선별하여 수세하되 액체 세정제를 사용하여 수세하거나 다수회 반복하여 물로만 세척한 후, 세절기에 투입하여 세절하고 착즙기를 이용하여 착즙한 다음, 여과기로 여과하여 여액을 얻고 오토크레이브를 이용하여 0.5∼0.7kg/cm2(110∼115℃)으로 15∼20분 동안 가열하여 멸균함으로서 과채즙 배지를 얻는다.
배지를 제조함에 있어서 사용되는 세척기, 세절기, 착즙기, 여과기 등의 장치는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 장치는 모두 사용 가능하며, 오토클레이브 대신에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 멸균기를 사용할 수도 있다.
또한 배지의 원료로 사용되는 사과, 배 또는 토마토는 모든 종류의 사과, 배 또는 토마토가 사용될 수 있으나 본 발명에서는 사과로는 후지사과를, 배로는 신고배를, 토마토로는 다니엘 품종을 사용하였다.
본 발명의 배지에는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 첨가물 예를 들어, 당도 향상을 위한 슈크로즈 등과 같은 당, pH 조절제, 무기염류 등을 적절히 첨가할 수도 있으며, 이는 반복실험을 통하여 용이하게 유추할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 균주로는 농촌진흥청에서 분양받은 큰느타리버섯(Pleurotus eryngil)을 사용하였으며, 통상의 방법으로 큰느타리버섯의 자실체에서 조직을 분리한 후, 감자한천배지(PDA : 감자를 파쇄한 것 1kg에 4∼5ℓ의 물을 가하고 당화효소를 첨가하여 당화시킨 것에 한천 2.0∼2.5%를 첨가한 배지)에서 계대배양하고, 상기에서 제조된 사과, 배 또는 토마토 과채즙 배지에 계대배양된 균사체를 무균상자 또는 무균실에서 종배양한 후 접종원으로 사용하였다.
접종비는 3∼8%(v/v)로 하는 것이 바람직하며, 3% 미만일 경우에는 아니스알데히드의 생성량이 미약할 뿐만 아니라 큰느타리버섯 균사체의 성장이 왕성하지 못하여 균사체 배양에 장시간이 소요되며, 8%를 초과할 경우에는 경제적이지 못하고 균사체의 생성만 왕성하고 아니스알데히드의 생성이 저하되는 단점이 있다.
접종을 완료한 후에 20∼30℃의 온도로 10∼20일 동안 삼각플라스크를 이용한 회전진탕배양 또는 바이오리액터에 의한 통기배양의 방법으로 배양한다.
배양온도가 20℃ 미만일 경우에는 균사체의 성장이 미약할 뿐만 아니라 아니스알데히드의 생성도 미약한 단점이 있고, 30℃를 초과할 경우에는 균사체의 생성만 왕성할 뿐 아니스알데히드의 생성이 미약하며 생성된 균사체가 자기 소화되는 문제점이 있을 뿐만 아니라 실온 상승에 필요한 난방비가 상승하여 경제적이지 못하는 단점이 있다.
배양기간이 10일 미만일 경우에는 균사체의 성장 및 아니스알데히드의 생성이 미약하고, 20일을 초과할 경우에는 아니스알데히드의 생성량 증가가 미약하여 경제적이지 못하다.
배양방법에 있어서 회전진탕배양을 행하는 경우에는 삼각플라스크에 사과, 배 또는 토마토 과채즙 배지를 투입한 후, 계대배양된 종배양액을 접종하고 교반속도 100∼200rpm으로 교반하면서 배양하고, 통기배양을 행하는 경우에는 바이오리액터에 사과, 배 또는 토마토 과채즙 배지를 투입한 후, 0.5∼1.5vvm의 통기량으로 통기하면서 배양한다.
배양이 완료된 후에 배양액 자체를 사용하거나 배양액으로부터 아니스알데히드만을 분리하여 사용하였다. 아니스알데히드를 분리하는 방법은 먼저 배양액 전체를 원심분리하여 버섯 균사체를 완전히 분리한 다음, 용매를 이용하여 배양액으로부터 아니스알데히드를 분리하였다.
배양이 진행되면서 체리향이 발생되므로 후각을 통하여도 아니스알데히드가 생성됨을 확인할 수 있으며, 버섯 균사체를 이용하여 아니스알데히드를 제조하므로 식용으로도 사용할 수 있게 된다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 설명하고자 한다. 그러나 이들이 본발명을 한정하는 것은 아니다.
<실시예 1>
잘 숙성된 토마토를 선별하여 수세한 후, 세절기에 투입하여 세절하고 착즙기를 이용하여 착즙한 다음, 여과기로 여과하여 여액을 얻고, 오토크레이브를 이용하여 0.5∼0.7kg/cm2(110∼115℃)으로 15∼20분 동안 가열하여 멸균함으로서 토마토 과채즙 배지 5ℓ를 얻는다.
접종원으로는 농촌진흥청에서 분양받은 큰느타리버섯(Pleurotus eryngil)의 자실체에서 조직을 분리한 후, 감자한천배지(PDA : 감자를 파쇄한 것 1kg에 4∼5ℓ의 물을 가하고 당화효소를 첨가하여 당화시킨 것에 한천 2.0∼2.5%를 첨가한 배지)에서 계대배양하고, 상기에서 제조된 토마토 과채즙 배지에 계대배양된 균사체를 무균상자 또는 무균실에서 종배양한 후 접종원으로 사용하였다.
배양기로는 250㎖ 용량의 삼각플라스크에 100㎖의 토마토 과채즙 배지를 투입하고 접종원을 5%(v/v)의 접종비로 접종한 다음, 25℃에서 교반속도 150rpm으로 하여 15일간 배양하여 배양액을 얻고, 배양액을 정제하여 9.7g의 아니스알데히드를 수득하였으며, 생성물들을 겔크로마토그래프로 확인한 결과 다음의 표 1과 같은 조성임을 알 수 있었다.
표 1. 토마토 과채즙로부터 수득한 아니스알데히드의 조성물
성분 |
함량(%) |
성분 |
함량(%) |
아세트알데히드 |
0.27 |
아니실 알코올 |
8.03 |
에틸 알코올 |
5.19 |
메틸 아니세이트 |
0.77 |
벤즈 알데히드 |
0.02 |
벤젠설포닐콜로라이드 |
2.93 |
2-아세틸-5-메틸퓨란 |
0.46 |
노나코산 |
0.40 |
2-에틸헥사놀 |
1.58 |
에틸 아니세이트 |
0.42 |
벤질 알코올 |
0.02 |
도데카놀 |
1.13 |
벤조티아졸 |
0.57 |
기타 |
4.96 |
아니스알데히드 |
72.95 |
|
|
<실시예 2>
토마토 과채즙 배지와 접종원을 실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 다음에 3ℓ용량의 바이오리액터에 1.5ℓ의 토마토 과채즙 배지를 투입하고 접종원을 5%(v/v)의 접종비로 접종한 다음, 25℃에서 통기량 1vvm으로 15일간 통기배양하여 배양액을 얻고, 배양액을 정제하여 450g의 아니스알데히드를 얻었다.
<실시예 3>
과채즙을 하기의 표 2와 같은 특성을 갖는 사과 과채즙배지, 배 과채즙배지, 포도 과채즙배지로 변경한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 아니스알데히드를 제조하되, 큰느타리버섯의 배양일 수에 따는 향 생선능을 후각으로 평가한 결과를 하기의 표 3에 기재하였다.
표 2.
과채즙종 류 |
수분(%) |
회분(%) |
단백질(%) |
비타민C(㎎%) |
pH |
당도(*Brix) |
색도(L) |
색도(a) |
색도(b) |
사과 |
88.3 |
0.18 |
0.22 |
3.09 |
4.48 |
12.3 |
13.29 |
9.38 |
20.62 |
배 |
89.0 |
0.42 |
0.24 |
5.01 |
4.69 |
10.8 |
19.49 |
5.55 |
19.73 |
포도 |
81.6 |
0.26 |
0.22 |
2.38 |
3.78 |
15.2 |
4.58 |
4.34 |
6.09 |
토마토 |
94.5 |
0.34 |
0.40 |
17.18 |
4.50 |
5.0 |
0.84 |
1.93 |
1.43 |
L : Lightness, a : redness, b : yellowness
표 3. 큰느타리버섯의 배양일 수에 따는 향 생선능을 후각으로 평가결과
과채즙배지 종류 |
0일 |
2일 |
6일 |
10일 |
13일 |
15일 |
사과 |
- |
- |
+ |
+ |
++ |
++ |
배 |
- |
- |
+ |
+ |
++ |
++ |
포도 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
토마토 |
- |
- |
+ |
++ |
+++ |
+++ |
<실시예 4>
배양온도를 20℃, 22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃로 한 것을 제외하고는 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법으로 아니스알데히드를 얻고, 배양 온도에 따른 아니스알데히드의 생성량을 분석한 경과, 25℃가 가장 접합한 것으로 나타났다.
<실시예 5>
접종비를 3%, 4%, 6%, 7%, 8%로 한 것을 제외하고는 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법으로 아니스알데히드를 얻고, 접종비에 따른 아니스알데히드의 생성량을 분석한 경과, 5%(v/v)가 가장 효과적인 것으로 나타났다.
<실시예 6>
슈크로즈를 토마토 과채즙 배지에 첨가한 것을 제외하고는 실시에 1과 동일한 방법으로 아니스알데히드를 얻고, 슈크로즈 첨가 농도에 따른 향 생성능, pH 변화, 당도(*Brix) 변화를 측정 및 평가하여 표 4 내지 표 6에 기재하고, 슈크로즈 첨가 농도에 따른 건조균사체량과 건조단백량을 측정하여 도 1 및 도 2에 도시하였다.
표 4. 슈크로즈 첨가 농도에 따른 향 생성능
슈크로즈농도(%) |
0일 |
2일 |
6일 |
10일 |
13일 |
15일 |
0 |
- |
- |
+ |
++ |
+++ |
+++ |
1 |
- |
- |
+ |
+ |
++ |
++ |
3 |
- |
- |
+ |
+ |
++ |
++ |
5 |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
7 |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
- : 없음, + : 약함, ++ : 강함, +++ : 매우 강함
표 5. 슈크로즈 첨가 농도에 따른 pH 변화
슈크로즈농도(%) |
0일 |
2일 |
6일 |
10일 |
13일 |
15일 |
0 |
4.50 |
4.49 |
4.64 |
4.62 |
4.64 |
6.00 |
1 |
4.50 |
4.21 |
4.61 |
4.72 |
5.41 |
5.97 |
3 |
4.50 |
4.05 |
4.51 |
4.62 |
5.25 |
5.73 |
5 |
4.50 |
4.48 |
4.53 |
4.69 |
5.05 |
5.47 |
7 |
4.50 |
4.36 |
4.50 |
4.63 |
5.30 |
5.79 |
표 6. 슈크로즈 첨가 농도에 따른 당도(*Brix) 변화
슈크로즈농도(%) |
0일 |
2일 |
6일 |
10일 |
13일 |
15일 |
0 |
5.0 |
4.8 |
4.9 |
4.0 |
3.5 |
2.2 |
1 |
5.7 |
5.5 |
5.2 |
4.3 |
3.2 |
1.9 |
3 |
7.5 |
6.8 |
6.6 |
6.2 |
5.2 |
4.9 |
5 |
9.5 |
8.2 |
8.4 |
8.0 |
7.8 |
7.1 |
7 |
10.9 |
9.1 |
10.0 |
9.1 |
8.9 |
7.3 |
<실시예 7>
통기량을 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 아니스알데히드를 얻고, 통기량에 따는 향 생성능, pH 변화, 당도(*Brix) 변화를 측정 및 평가하여 표 7 내지 표 9에 기재하고, 통기량에 따른 건조균사체량과 건조단백량을측정하여 도 3 및 도 4에 도시하였다.
표 7. 통기량에 따른 향 생성능
통기량(vvm) |
0일 |
2일 |
6일 |
10일 |
13일 |
15일 |
0.5 |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
1.0 |
- |
- |
++ |
++ |
+ |
+ |
1.5 |
- |
- |
++ |
++ |
+ |
+ |
2.0 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- : 없음, + : 약함, ++ : 강함
표 8. 통기량에 따른 pH 변화
통기량(vvm) |
0일 |
2일 |
6일 |
10일 |
13일 |
15일 |
0.5 |
4.50 |
4.48 |
4.38 |
4.34 |
4.47 |
4.15 |
1.0 |
4.50 |
4.48 |
4.32 |
4.27 |
4.55 |
4.6 |
1.5 |
4.50 |
4.47 |
4.32 |
4.28 |
4.41 |
4.28 |
2.0 |
4.50 |
4.47 |
4.34 |
4.31 |
4.39 |
4.29 |
표 9. 통기량에 따른 당도(*Brix) 변화
통기량(vvm) |
0일 |
2일 |
6일 |
10일 |
13일 |
15일 |
0.5 |
5.0 |
5.0 |
5.3 |
4.5 |
4.2 |
2.9 |
1.0 |
5.0 |
4.3 |
5.1 |
4.5 |
4.7 |
4.4 |
1.5 |
5.0 |
4.5 |
5.0 |
4.9 |
5.3 |
4.9 |
2.0 |
5.0 |
4.4 |
4.7 |
4.9 |
5.4 |
5.3 |
상기 실시예들로부터 알 수 있는 바와 같이 회전진탕배양의 경우에는 배양온도 25℃, 교반속도 150rpm, 접종비 5%(v/v)에서 균사체 생산 및 향생산성이 가장 우수하였으며, 슈크로즈 첨가농도에 따라 배양여액의 pH는 다소 증가하였고, 당도는 감소하였으며, 슈크로즈 무첨가시 배지에서 가장 강한 "체리향"이 생성되었고, 슈크로즈 첨가농도에 따라 균사체(65g/ℓ) 단백다당체 생성량(3g/ℓ)은 증가하는 경향이 있었다.
또한, 통기배양의 경우에는 25℃, 통기량 1.0 ∼ 1.5vvm, 접종비 5%(v/v)에서 균사체 생산 및 향생산성이 가장 우수하였으며, 통기량에 따라 pH는 감소하였으나 당도는 큰 변화가 없었으며, 통기량에 따른 균사체 생산량은 통기량 1vvm으로 15일 동안 배양시 최고값(30g/ℓ)을 나타내었고, 삼각플라스크에 의한 회전진탕배양방법이 바이오리액터에 의한 통기배양보다 향생성능, 균사체 및 단백다량생산능이 우수함을 알 수 있었다.