KR101929457B1 - 송이버섯 균사체 대량 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연산 송이버섯에서 신선한 세포를 분리하여 이를 대량으로 세포배양할 수 있는 송이버섯 균사체 대량 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 균사체 생산방법은 대량으로 송이버섯 세포배양체를 생산함으로써, 인공배양이 어려운 자연산 송이버섯을 대체 및 재현할 수 있는 효과가 있다. 또한, 대량으로 생산된 송이버섯 세포배양체를 가공하여 다양한 식품군 및 화장료 조성물로도 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

송이버섯 균사체 대량 생산 방법{Culture method for mass producing Tricholoma matsutake mycelium}

본 발명은 송이버섯 균사체 대량 생산 방법 및 송이버섯 균사체를 포함하는 송이버섯 가공식품 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

송이버섯(Tricholoma matsutake)은 주름버섯목 송이과에 속하며 소나무의 뿌리에 공생균을 형성하여 소나무로부터 영양분을 얻는 외생공생균으로 한국을 비롯한 북한, 일본 및 중국 동아시아에서 널리 채집되어지고 있다. 이러한 송이버섯은 외형이 크고 육질이 충실하며, 특히 그 독특한 향과 맛으로 오래 전부터 최고의 식용버섯으로 알려져 왔다.

우리나라에서 송이버섯의 중요성이 크게 나타난 시기는 1967년경 송이버섯이 수출되면서부터이며, 근래에는 해마다 송이버섯의 수출로 벌어들이는 소득이 연평균 약 400억원으로 추산되고 있다. 이러한 소득은 임업부산물로서 특별한 시설투자 없이도 송이발생지의 농민들에게 중요한 소득원이 될 수 있으며, 나아가 산촌민의 경제 안정화의 효과를 생각해 볼 때 경제적 가치가 매우 크다고 할 수 있다.

하지만 과거 30여년의 기록에 의하여 볼 때 송이버섯은 그 발생량이 매년 일정하지 못하고 풍년과 흉년을 번갈아가는 현상을 보이며, 1980년대를 시점으로 하여 점차 그 발생량이 감소하는 문제점을 나타내고 있다. 이는 송이버섯이 기후변동 및 발생지의 주변 환경에 따라 그 발생량의 격차를 심하게 나타내며, 게다가 근래에는 소나무림의 솔잎 혹파리 피해, 산불에 의한 소나무림의 감소, 송이산 방치로 인한 하부 식생의 밀생, 유기물의 퇴적이 많이 되므로 송이버섯의 생산량이 전체적으로 감소하고 있기 때문이다.

이에 인위적인 노력에 의한 지속가능한 송이버섯 생산과 나아가 송이버섯의 인공재배를 위한 많은 연구들이 지금까지 이루어져 왔다. 하지만 송이버섯은 특징적으로 소나무의 뿌리와 공생관계에 있을 때에만 자실체를 형성하기 때문에 인공재배를 통한 자실체의 형성은 아직까지 실현되지 못하고 있으며, 송이버섯의 발생기에 적합한 기상조건의 조절의 방안은 아직까지 실현되지 못하고 있다.

또한, 대부분의 버섯은 죽은 나무에서 발아하여 기생하지만 송이는 살아있는 나무, 그중에서도 소나무에만 기생하는 독특한 종자이며, 인공재배를 위해서는 살아있는 소나무와 똑같은 환경을 만들어 주어야 하는데 우리 나라와 일본의 많은 학자들이 대를 이어가며 연구했지만 아직까지도 인공재배에는 성공하지 못할 정도로 온도, 습도, 토양 및 환경에 아주 민감하다.

이에, 자연산 송이버섯을 대체하면서도 이를 동일하게 재현해낼 수 있는 송이 버섯 균사체에 대한 관심이 높아지고 있다. 송이버섯 균사체는 자연산 송이버섯과 동일한 성분들을 함유하고 있어 그 효능도 동일한 것으로 알려져 있다. 하지만, 균사체의 생산에 대한 연구는 균사체의 일반적인 배양조건 검토 정도에 지나지 않고 있어 잠재적인 국내 및 국제시장에서의 송이버섯 관련 시장확보를 위해 국내기술에 의한 균사체 대량생산기술 개발이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 자연산 송이버섯에서 신선한 세포를 분리하여 이를 대량으로 세포배양함으로써, 자연산 송이버섯을 대체 및 재현할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 송이버섯 균사체를 대량으로 생산하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생산방법을 통해 수득한 균사체를 가공하여 제조된 송이버섯 가공식품 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 송이버섯 자실체의 일부 또는 전부를 배지에 접종하여 균사체를 배양하는 단계, (b) 배양 후 성장한 균사체를 배지 I에서 1차 전배양하는 단계, (c) 1차 전배양된 균사체를 배지 Ⅱ에서 2차 전배양하는 단계, (d) 2차 전배양된 균사체를 세절한 후 생물배양기 내의 배지 Ⅲ에서 본 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배지 Ⅱ의 pH가 배지 I의 pH 보다 더 높고, 상기 배지 Ⅲ의 pH가 배지 Ⅱ의 pH 보다 더 높은 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배지 I 내지 Ⅲ의 pH가 4.5 내지 6.5 범위 이내인 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 배지 I의 pH는 4.8~5.2이고, 배지 Ⅱ의 pH는 5.3~5.7이며, 배지 Ⅲ의 pH는 5.8~6.2인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 생산방법을 통해 생산된 송이버섯 균사체를 가공하여 제조된 송이버섯 가공식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 생산방법을 통해 생산된 송이버섯 균사체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면 대량으로 송이버섯 세포배양체를 생산할 수 있어, 인공배양이 어려운 자연산 송이버섯을 저비용으로 대체 및 재현할 수 있는 효과가 있다. 또한, 송이버섯이 고가이기 때문에 활용되지 못했던 분야에 있어서도, 대량으로 생산된 송이버섯 세포배양체를 가공하여 다양한 식품군 및 화장료 조성물로도 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 송이버섯 균사체 대량생산 방법에 대한 공정도이다.
도 2는 1차 전배양시의 균사체 배양모습을 촬영한 사진이다.
도 3은 2차 전배양시의 균사체 배양모습을 촬영한 사진이다.
도 4는 본 배양시의 생물배양기 모습을 촬영한 사진이다.
도 5는 각 배양단계에서의 균사체 생장량을 나타내는 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 송이버섯 자실체의 일부 또는 전부를 배지에 접종하여 균사체를 배양하는 단계; (b) 배양 후 성장한 균사체를 배지 I에서 1차 전배양하는 단계; (c) 1차 전배양된 균사체를 배지 Ⅱ에서 2차 전배양하는 단계; (d) 2차 전배양된 균사체를 세절한 후 생물배양기 내의 배지 Ⅲ에서 본 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배지 Ⅱ의 pH가 배지 I의 pH 보다 더 높고, 상기 배지 Ⅲ의 pH가 배지 Ⅱ의 pH 보다 더 높은 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법에 관한 것이다.

버섯은 몸체에 뿌리줄기잎의 구별이 없고 대개 균사(菌絲：팡이실)로 이루어지며, 엽록소가 없어서 다른 생물이 만들어 놓은 양분을 받아 생활한다. 그리고 번식은 포자(胞子：균씨, 홑씨)로 이루어진다. 즉 포자가 살포되고 발아하면 균사가 생기게 되고, 이 균사가 만연하면 다시 포자를 만드는 자실체가 생기는 것이다. 버섯의 발생은 온도, 습도, 흙의 습도, 빛, 흙 속의 양분 등이 적정해야 가능한데, 버섯의 종류에 따라 조건의 범위한계가 서로 다르다.

자실체(子實體：균사가 모여 덩이를 이룬 것)는 갓과 자루로 이루어지는데, 갓의 윗면은 흑갈색이고, 아랫면에는 많은 주름살이 있다. 포자는 주름살의 양면에 생기고, 익으면 바람에 날려 적당한 곳에서 발아한다.

본 발명은 송이버섯 자실체에서 신선한 세포를 분리하여 배지의 pH를 배양 단계에 따라 점차 상승시킴으로써, 대량으로 송이버섯 균사체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 1차 전배양 시 낮은 pH에서 다량의 세포덩어리를 생산한 뒤 점차 pH를 높여 세포덩어리를 더욱 큰 형태로 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 송이버섯 균사체 생산방법은 ton 단위의 대량 생물배양기에서도 적용가능하므로, 종래 (리터) 단위로 생산되던 균사체의 생산량을, ton(톤) 단위로 획기적으로 증가시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 배지 I 내지 Ⅲ의 pH는 4.5 내지 6.5 범위 이내일 수 있고, 바람직하게는 상기 배지 I의 pH는 4.8~5.2이고, 배지 Ⅱ의 pH는 5.3~5.7이며, 배지 Ⅲ의 pH는 5.8~6.2 일 수 있다.

본 발명에서, 1차 전배양시 배지 I의 pH는 4.8~5.2로서, 상대적으로 낮은 pH 에서 다량의 세포덩어리를 형성시킨 뒤, 2차 전배양시 배지 Ⅱ의 pH를 5.3~5.7으로 상승시켜 세포덩어리를 더욱 큰 형태로 유도할 수 있다. 그 다음, 본 배양시 배지 Ⅲ의 pH를 5.8~6.2으로 높임으로써, 최종적으로 세포배양체의 부피를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 배지 I의 pH는 약 5, 배지 Ⅱ의 pH는 약 5.5, 배지 Ⅲ의 pH는 약 6으로 상승시킴으로써, 최대 균사체 생산량이 30.62 g/L(Dry Cell Weight, DCW)에 이르는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서는, 5ton 배양기를 이용하여 한번에 대량배양을 하였는데, 5ton 배양기 기준(working volume : 3.5ton) 107.17kg(DCW)의 균사체 생산이 가능하였다. 더욱이, 배양기의 배양탱크 수를 늘릴 경우, 균사체의 양은 107.17kg(DCW)의 배수가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 배양탱크 4대를 가동함으로써, 총 428.68kg(DCW)의 균사체를 생산하였다.

이처럼, 본 발명에 따른 균사체 배양방법은 ton 단위의 대량 배양기에도 적용가능한 바, 한번에 균사체의 대량배양이 가능한 장점이 있다.

또한, 본 발명은 최적의 배지 조성물의 조건을 통해 균사체 생육에 적합한 환경을 구현하였다.

본 발명에서, 상기 배지 I은 소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 10 g/L, 녹말(starch) 10 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 배지 I과 배지 Ⅱ는 조성은 동일하고 pH가 상이할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 배지 I과 배지 Ⅱ는 조성물이 "소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 10 g/L, 녹말(starch) 10 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L"로 동일하고, 배지 I의 pH는 약 5 인 반면, 배지 Ⅱ의 pH는 약 5.5로 상승시켜, pH 조건에만 차이를 두었다.

그 결과, 1차 전배양시 13.27g/L였던 균사체 생산량이 2차 전배양 과정을 통해 21.56g/L까지 증가하였으며, 1차 전배양에서 수득한 세포덩어리의 부피가 더욱 큰 형태로 증식되는 것을 확인하였다.

본 발명에서, 상기 배지 Ⅲ는 소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 15 g/L, 녹말(starch) 5 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L, CaCl₂ 0.3 g/L을 포함할 수 있다.

또한, 상기 (d) 단계에서, 상기 배지 Ⅲ의 탄소원이 모두 소진되는 경우 배지 Ⅳ을 추가로 공급할 수 있다.

배지에서 탄소원이 소진되었는지 여부를 분석하는 방법으로는 최초 투입된 총 당(glucose, starch, maltose 등)의 함량 변화를 분석하여 배양액 내 탄수화물을 정량하는 총 당 정량법(Phenol-sulfuric acid Method) 또는 환원당을 측정하는 DNS method 분석법 등이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 총 당 정량법(Phenol-sulfuric acid Method)을 이용하여 배양액 내 탄수화물을 정량화 하였다.

상기 배지 Ⅳ은 말토오스(Maltose) 및 맥아추출물(malt extract)을 포함할 수 있고, 바람직하게는, 상기 배지 Ⅳ는 말토오스(Maltose) 36 g/L 및 맥아추출물(malt extract) 18 g/L을 포함하고 pH는 6 일 수 있다.

본 발명은 버섯 균사체의 생산량 증가 및 배양기간 단축을 위하여 탄소원인 말토오스(Maltose)와 함께 질소원인 맥아추출물(malt extract)을 간헐적 및 지속적 방식에 의해 공급하는 유가식 배양을 실시할 수 있다.

이는, 에너지원으로서 이용되는 포도당(glucose 외) 소진 시 이를 추가 공급함으로써, 균사체의 성장을 더욱 유도하기 위한 것으로, 예비테스트 결과 두 성분에서의 세포 성장이 해당 pH 조건에서 유의한 효과가 있음을 확인하였다.

이와 같이, 본 발명은 1차 전배양, 2차 전배양, 본배양시 송이버섯 균사체 성장을 최대로 이끌어 낼 수 있는 최적의 배지 조성을 각각 확립함과 동시에, 배양 단계에 따른 pH 조절을 통해 대량의 송이버섯 균사체를 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, (e) 배양액 중 상등액을 제거하여 균사체를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이 때, 상등액 제거시 여과막을 이용하여 균사체만을 분리할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 생산방법을 통해 생산된 송이버섯 균사체를 가공하여 제조된 송이버섯 가공식품에 관한 것이다.

송이버섯은 탁월한 항암, 항바이러스, 면역력 증가 및 혈중 콜레스테롤 저하 효과 등 다양한 생리활성기능이 있는 것으로 보고되고 있으며, 뇌졸중, 심장병 등과 같은 성인병에 대한 예방 및 개선효과도 우수하여 건강식품 혹은 치료식이소재로의 이용이 크게 증가하고 있다.

따라서, 송이버섯을 가공하여 다양한 식품군에 이용함으로써 인체 건강에 도움이 될 수 있다.

본 발명에 따르면, 송이버섯 균사체를 대량으로 생산할 수 있어, 종래 고가여서 활용되지 못했던 분야에도 다양하게 활용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 송이버섯 균사체의 가공방법으로는 동결건조, 저온건조 등의 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 동결건조는 버섯에 함유된 영양소의 파괴를 최소화할 수 있는 장점이 있다.

상기 송이버섯 가공식품은, 건강기능식품류, 건강보조식품류, 기호식품 등 일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 라면, 과자, 음료, 차, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 비타민 복합제, 유제품, 캔디류, 젤리류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵바, 초콜릿 제품, 가공식품, 곡물 제품, 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방 제품, 유제품 음료, 차, 두유, 냉동식품, 조리식품 및 대체 음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵, 케이크, 크키 및 크래커 등일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 생산방법을 통해 생산된 송이버섯 균사체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따라 대량생산된 송이버섯 균사체를 이용하여 주름개선 및 피부 탄력 증진, 미백효과 등을 위한 화장료 조성물로 활용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

1. 버섯세포의 분리선발

자연산 송이버섯을 취득 후 자실체 표면을 알코올(70% 농도)로 표면소독 후 뒤집어 자루부위의 정중앙을 살균된 메스로 칼집을 내고 양손으로 2등분으로 찢어 자실체 내부의 일부를 작은 조각으로 떼내고 준비된 인공배지(PDA, Potato Dextrose agar)에 접종시킨 후 25℃에서 약 2~4주간 배양하여 순수한 버섯세포(균사체)를 얻었다.

2. 순수 분리된 세포의 보관

인공배지(PDA)에서 순수배양된 버섯세포를 살균된 메스(칼)로 0.5cm × 0.5cm 의 크기로 절단 후 Glycerin 20%(동결보호제)가 들어있는 냉동전용 바이알(Cryo vial)에 1 block(여기서 'block'은 주로 곰팡이, 버섯 등의 진균류를 다른 배지에 이식할 때 취하는 세포덩어리 형상을 의미함) 내지 2 block을 넣고 약 15분간 상온방치 후 -80℃의 초저온냉동고에 장기보관하였다. 이 때, 상기 glycerin은 냉동 시 얼음결정 형성과정에서 버섯세포 조직에 손상을 입히는 것을 이를 보호하는 역할을 한다.

3. 송이버섯 세포의 1차 전배양 (batch culture)

상기 1단계의 고체배지(PDA)로부터 얻은 세포 Block을 여러 조직으로 파생시키기 위하여 1차 전배양을 실시하였다. 인공배지(PDA)에서 충분히 성장한(약 2~3주) 버섯세포를 액체배양 하였으며, 배지Ⅰ[소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 10 g/L, 녹말(starch) 10 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L]을 121℃, 30분간 고압멸균조건으로 100ml 제조(총 용적 250ml Flask, pH 5.0) 한 후 버섯세포 조직 Block 5ea를 접종시키고, 25℃에서 140rpm으로 2주간 진탕 배양하였다(도 2).

본 발명자들은 배지 I의 조성에 있어서, "소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 10 g/L, 녹말(starch) 10 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L" 일 때 송이버섯 세포 성장이 최대가 됨을 확인하였다. 즉, 상기 배지 I의 조성은 본 발명자가 송이버섯 세포 성장에 있어 최적의 조건을 연구하여 확립한 것이다.

4. 송이버섯 세포의 2차 전배양 (batch culture)

1차 전배양액의 균사체를 추가로 증식시키기 위하여 2차 액체배양을 실시하였다. 1차 세포배양액을 호모게나이져(조직 균질기)로 25,000rpm에서 약 15초간 균질화 시킨 후 121℃, 60분간 고압멸균조건으로 멸균된 배지Ⅱ[소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 10 g/L, 녹말(starch) 10 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L] 15L(총 용적 20L, pH 5.5) 배양용기에 접종한 후 25℃에서 공기주입식으로 0.1vvm(aeration volume/medium volume/minute)으로 2주간 배양하였다.

2차 전배양 과정에서의 배지Ⅱ는, 1차와 동일한 배지 조성을 이용하면서도, pH는 5에서 5.5로 상승시켰다. 그 결과, 1차 전배양에서 수득한 세포덩어리의 부피가 더욱 큰 형태로 증식되는 것을 확인하였다(도 3).

5. 송이버섯 세포의 본배양 (Fed-batch culture)

2차 전배양액을 100L용 접종기(호모게나이져 기능 탑제)에 투입 후 10,000rpm으로 균질기를 1분간 작동시켜 세포덩어리를 다시 작은 입자로 파쇄 후 5ton tank(생물배양기)에 접종하여 25℃에서 4주간 배양시켰다(도 4). 상기 접종기는 내부에 칼날이 설치되어 있어 모터를 구동하여 세포배양체 덩어리를 잘게 파쇄할 수 있으며, 멸균건조된 에어로 압력을 조절한 뒤 접종기에서 본배양 Tank로 균사체를 이동시키는 역할을 한다.

생물배양기 내의 배지조성은 배지Ⅲ [소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 15 g/L, 녹말(starch) 5 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L, CaCl₂ 0.3 g/L]로서, pH 6.0의 조건으로 working volume 70% 기준인 3.5ton으로 배지를 압력 1.2bar, 121℃, 60분간 멸균 후 세포파쇄물 접종량 2.8%를 기준으로 접종하였다.

배지 Ⅲ는 전 단계의 배지 Ⅱ에 비해 pH를 5.5에서 6.0으로 상승시켰으며, 그 결과 최종적으로 세포배양체의 부피가 크게 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 배양 시작 10일 경과 후 탄소원이(glucose, starch) 모두 소진되는 시점을 기준으로 배지Ⅳ [말토오스(Maltose) 36 g/L 및 맥아추출물(malt extract) 18 g/L, pH 6.0]을 100L씩 5일 간격으로 2회 무균적으로 투입하여 배양하였다. 탄소원이 소진되는 시점은 총 당 정량법(Phenol-sulfuric acid Method)을 이용하여 배양액 내 탄수화물을 정량화함으로써 측정하였다. 그 결과, 에너지원 소진시 추가 에너지원 공급을 통해 균사체의 성장이 크게 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

도 5 및 하기 표 1을 참고하면, 본 발명에 따른 균사체 생산방법을 통해 생산된 균사체의 단계별 생산량은 1차 전배양시 13.27 g/L, 2차 전배양시 21.56g/L, 본 배양시 30.62g/L로 점차 크게 증가하였다.

[배양단계별 균사체 생산량]

단계	균사체 생산량(Dry Cell Weight(g/L))
1차 전배양	13.27
2차 전배양	21.56
본 배양	30.62

본 발명을 통해 생산된 최종 세포배양체 양은 최대 30.62 g/L로서, 5ton 배양기 기준으로 환산하면 최종 균사체 양은 107.17kg(Dry cell Weight, DCW)에 이르렀다. 배양탱크 4대를 총 가동 시에는 한번에 총 428.68kg(DCW)까지 생산할 수 있었다.

6. 버섯 세포의 회수

여과막을 이용해 배양상등액은 버리고 순수 세포배양체만 얻었다.

7. 가공

회수한 세포배양체를 동결건조하여 최종 제품을 수득하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

1. (a) 송이버섯 자실체의 일부 또는 전부를 배지에 접종하여 균사체를 배양하는 단계;
   (b) 배양 후 성장한 균사체를 배지 I에서 1차 전배양하는 단계;
   (c) 1차 전배양된 균사체를 배지 Ⅱ에서 2차 전배양하는 단계;
   (d) 2차 전배양된 균사체를 세절한 후 생물배양기 내의 배지 Ⅲ에서 본 배양하는 단계를 포함하고,
   상기 배지 I 내지 Ⅲ의 pH가 4.5 내지 6.5 범위 이내이며,
   상기 배지 Ⅱ의 pH가 상기 배지 I의 pH 보다 더 높고, 상기 배지 Ⅲ의 pH가 상기 배지 Ⅱ의 pH 보다 더 높으며,
   배지 I 및 배지 II는 소이펩톤(Soypeptone), 효모 추출물(Yeast extract), 글루코오스(glucose), 녹말(starch), L-아르기닌(L-arginine), 티아민(Thiamine), KH₂PO₄, MgSO₄을 포함하고,
   배지 Ⅲ은 소이펩톤(Soypeptone), 효모 추출물(Yeast extract), 글루코오스(glucose), 녹말(starch), L-아르기닌(L-arginine), 티아민(Thiamine), KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂을 포함하는 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
   
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3. 제 1항에 있어서,
   상기 배지 I의 pH는 4.8~5.2이고, 배지 Ⅱ의 pH는 5.3~5.7이며, 배지 Ⅲ의 pH는 5.8~6.2인 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 배지 I과 배지 Ⅱ는 조성은 동일하고 pH가 상이한 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 배지 I은 소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 10 g/L, 녹말(starch) 10 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L을 포함하는 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 배지 Ⅲ은 소이펩톤(Soypeptone) 2 g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 3 g/L, 글루코오스(glucose) 15 g/L, 녹말(starch) 5 g/L, L-아르기닌(L-arginine) 0.5 g/L, 티아민(Thiamine) 0.02ppm, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L, CaCl₂ 0.3 g/L을 포함하는 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 (d) 단계에서, 상기 배지 Ⅲ의 탄소원이 모두 소진되는 경우, 배지 Ⅳ를 추가로 공급하는 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 배지 Ⅳ는 말토오스(Maltose) 및 맥아추출물(malt extract)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
   
9. 제 7항에 있어서,
   상기 배지 Ⅳ는 말토오스(Maltose) 36 g/L 및 맥아추출물(malt extract) 18 g/L을 포함하고 pH는 6인 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
   
10. 제 1항에 있어서,
    (e) 배양액 중 상등액을 제거하여 균사체를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 송이버섯 균사체 대량 생산 방법.
    
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