KR100388794B1

KR100388794B1 - 피페리딘구조를갖는파네실전이효소억제제및그의제조방법

Info

Publication number: KR100388794B1
Application number: KR10-1998-0032150A
Authority: KR
Inventors: 이현일; 고종성; 신유승; 김종현; 정원희; 이진호; 정현호; 박기원; 김귀화; 최태생; 오영훈; 김청미; 노성구; 이선화; 김현성
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2003-10-10
Also published as: KR20000013335A

Abstract

본 발명은 피페리딘구조를 포함하며 파네실 전이효소를 억제할 수 있는 하기 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 그의 제조방법, 및 화학식 1의 화합물을 활성성분으로 함유함을 특징으로 하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기식에서

A, E 및 G는 명세서에서 정의된 바와 같다.

Description

피페리딘구조를 갖는 파네실 전이효소 억제제 및 그의 제조방법

본 발명은 피페리딘구조를 포함하며 파네실 전이효소를 억제할 수 있는 하기 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성체에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기식에서

A는 수소 또는 하기 구조식의 그룹을 나타내고,

여기에서

B는 CH₂, C=O 또는 SO₂를 나타내며,

D는 하기 구조식의 그룹 중 선택된 어느 하나를 나타내고;

여기에서

m 은 0 내지 3의 정수 이며,

n은 1 내지 3의 정수이고,

X는 수소, 페닐, 페녹시, 저급알킬, 저급알콕시, 할로겐, 니트로, 벤질 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아미노를 나타내며,

R¹및 R²는 각각 독립적으로 수소, 저급알킬, C₃-C₆사이클로알킬, C₃-C₆사이클로알킬로 치환된 저급알킬, 5환 또는 6환 헤테로사이클릭 방향족 화합물을 나타내고,

E는 페닐 또는 나프틸을 나타내며,

G는 하기구조식의 그룹중 선택된 어느하나를 나타내고:

여기에서

R³는 수소 또는 저급알킬을 나타낸다.

특히, 본발명에 따른 화합물은 지금까지 알려진 파네실 전이효소 억제제와 상의한 특이구조를 갖고 있을 뿐만 아니라 티올기도 전혀 포함하지 않고있다.

본 발명에는 또한 상기화학식 1의 화합물을 제조하는 방법 및 화학식 1 의 화합물을 활성성분으로 함유하는 항암제 조성물도 포함되어 있다. 따라서, 이 제조 방법 및 조성물도 본 발명의 대상이다.

Ras 단백질은 세포의 성장과 분화에 중요한 역할을 하는 21 kda 의 단백질로서 구아닌 뉴클레오타이드와 결합하며, 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 구아노신 디포스페이트( GDP )로 가수 분해하는 효소로서 세포내에서 특이적인 GTPase 회로를 조절하는 분자 스위치로 작용하는 것으로 알려져있다( 참조: Bourne, H.R; Sanders, D.A; McCormick, F.Nature1991, 349, 117).

Ras 단백질은 포유동물세포에서 3 가지의 Ras 유전자에 의해 아미노산 188개의 K-Ras-4B 또는 189개의 H-Ras, K-ras4A와 N-Ras로 생성된다. 이 단백질의 12,13, 61 번의 위치에 있는 아미노산들은 GTP의 인산기와 근접하여 있어, 이 아미노 산 잔기들은 GTP의 가수 분해에 관여하는 물 분자의 공간적 위치에 영향을 미침으로써 GTPase 효소 활성을 저해한다. 인체에서 암이 발생하는 경우, 이 위치의 아미노산에 돌연 변이가 관찰되는데, 이 돌연 변이가 결국 Ras 단백질 고유의 GTPase 활성을 저해하여GTP 결합 상태를 지속시킴으로써 비 정상적인 성장 신호를 지속적으로 전달하여 발암성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 발암성인 Ras 유전자는 특이적으로 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암등에 밀접한 관련이 있는것으로 알려져 있다 ( 참조: Bos, J.L.,Cancer Res., 1989, 49, 4682 ).

Ras 단백질이 생물학적으로 활성화 상태에 있기 위해서는 세포막 내에 부착되어야 하는데 이를 위해서는 Ras 파네실 전이 효소, Ras 단백질 카르복시 말단의 3 개 AAX 펩타이드 절단 효소, 메틸 전이 효소 및 팔미토일 전이 효소에 의한, 단백질 전이 후의 탄소 말단의 변형이 요구된다. 이 중 첫 번째 단계인 파네실화는 파네실 전이 효소 ( FTase ) 에 의해 이루어진다. 파네실 전이효소의 기질은 Ras 단백질의 카르복시 말단에 있는 CA1A2X라는 네 개의 펩타이드이며, 여기서 A1, A2는 전기적 부하를 띄지 않는 지방족 아미노산이고 X는 메티오닌, 알라닌 및 세린등이다. 파네실 반응은 시스테인에 일어나 황에테르 결합을 형성시키며, H-Ras와 N-Ras의 경우는 카르복시 말단 근처의 또 다른 시스테인에 팔미토일화가 일어난다. 이러한 파네실화의 결과로 Ras 단백질은 소수성이 증가되어 세포막 내에 부착되게 되며, 파네실화된 Ras 단백질은 카르복시 말단으로 부터 연이어 3개의 AAX 펩타이드가 절단 효소에 의해 제거되고 메틸화되어 파네실기가 세포막 내의 지질층 또는다른 수용체와의 결합을 용이하게 해주는 것으로 알려져 있다. 한편, K-Ras-4B의 경우는 H-Ras, N-Ras와는 달리 팔미토일화에 필요한 시스테인 대신 폴리베이직(Poly basic) 도메인이라 불리는 여러개의 라이신 염기가 배열된 부위를 가지고 있으며, 이를 통해 세포막내의 음이온성 지질과의 결합을 용이하게 해주는 것으로 알려져있다. Ras 단백질이 세포막내에 최적으로 부착하기 위해서는 모든 변형 단계가 필요하나, Ras 단백질의 활성화에는 파네실화 자체만으로도 충분한 것으로 알려져 있으므로 이 파네실화를 차단함으로써 돌연 변이에 의한 Ras 발암성을 억제하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다 ( 참조: Buss, J.E. et al.,Chemistry & Biology, 1995, 2, 787 ).

그간의 연구 결과, Ras로 형질 전환된 세포에서 파네실 전이효소를 저해했을 때 세포성장이 저해되는 것으로 관찰되었으며, 또한 Ras에 의해 변형된 세포 형질을 개선하는 것으로 나타났다.

실제로 파네실 전이 효소의 몇몇 저해제들은 Ras발암성 유전인자의 세포내 프레닐기에 의한 반응을 선택적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다(참조: Kohl, N.E.et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:9141(1994), Kohl, N.E.et al, Nature Medicine, 1:792(1995)). 개발된 전이효소 저해제로는 시스테인 티올 (thiol)기를 함유하며 CAAX와 유사한 구조를 갖는 펩타이드 변형체 및 이를 개선한 저해제 (참조: US patent 5,141,851; Kohl, N.E.et al, Science260:1934(1993), Grahamet al.,PCT/US95/12224), 페닐기로 변형된 펩타이드(참조: sebti, S. M.,J. Biol. Chem. 270:26802, 1995), 향정신성 의약품 골격구조중 벤조디아제핀을 펩타이드의turn 모사 구조로 활용한 변형체(참조: James,G.L.Science260:1937, 1993), 펩타이드 구조에서 벗어나 트리사이클릭 유기화합물을 골격으로한 저해제 (참조: Biship W.R.,J. Biol. Chem. 270:30611, 1995)를 들 수 있다. 또한, 파네실 전이 효소가 프레닐기를 전이시키는 작용기전이 전자 친화적 치환반응 (Electrophilic Displacement)이므로 반응의 트랜지션 상태 (transition state)에 양성부하를 요구함에 착안하여 프레닐기에 트랜지션 상태의 양성 부하를 연결시킨 새로운 형태의 저해제가 제시되었다(참조: Poulter C.D.et al, J. Am. Chem. Soc. 118:8761, 1996).

그러나, 많은 경우의 인체암에서 K-Ras활성화가 주요 원인으로 작용하며, 지금까지 개발된 대부분의 프레닐 전이효소 저해제들은 K-Ras를 활성화시킨다. 따라서, K-ras에 의해 형질전환된 세포의 성장저해 정도가 H-Ras, N-Ras에 의해 형질전환된 세포 성장 저해에 비해 떨어지므로K-Ras 활성을 효과적으로 저해할 수 있는 새로운 저해제의 연구가 주목받고 있다.

이에 본 발명자들은 K-Ras기질에 대한 효소활성저해능 및 세포내 K-Ras 프레닐화 저해능을 평가할수 있는 평가체계를 확립하여 이를 활용함으로써, K-Ras 뿐만 아니라 H-Ras, N-Ras 기질의 파네실화를 저해하는 신규한 화합물을 합성하고 그 저해능을 평가하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기화학식 1의 화합물이 본 발명의 소기 목적에 부합되어 이들이 항암제로서 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 우수한 항암효과를 갖는 화학식 1의 화합물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 화학식 1 의 화합물을 활성성분으로 함유함을 특징으로 하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기식에서

A는 수소 또는 하기 구조식의 그룹을 나타내고:

여기에서

B는 CH₂, C=O 또는 SO₂를 나타내며,

D는 하기 구조식의 그룹 중 선택된 어느 하나를 나타내고;

여기에서

m 은 0 내지 3의 정수이며,

n은 1 내지 3의 정수이고,

E는 페닐 또는 나프틸을 나타내며,

G는 하기구조식의 그룹중 선택된 어느하나를 나타내고:

여기에서,

R³는 수소 또는 저급알킬을 나타낸다.

상기 화학식 1의 화합물에 대한 치환기 정의에서 용어 "저급알킬"은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸 등과 같은 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 의미한다.

우수한 항암효과를 나타내는 상기화학식 1의 화합물 중에서도 바람직한 화합물은

A는를 나타내고,

여기에서

B는 CH₂, C=O 또는 SO₂를 나타내며,

D는 하기 구조식의 그룹 중 선택된 어느 하나를 나타내고:

여기에서

m 은 0 내지1의 정수 이며,

n은 1 내지 2의 정수이고,

X는 수소를 나타내며,

R¹및 R²는 각각 독립적으로 수소 또는 저급알킬을 나타내고,

E는 나프틸을 나타내며,

G는 하기구조식의 그룹중 선택된 어느하나를 나타낸다:

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 대표적인 예는 하기표 1a 내지 1d에 나타낸 바와 같다.

[표 1a]

[표 1b]

[표 1c]

[표 1d]

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은

(a) 하기화학식 2의 화합물을 용매중에서 염기의 존재하에 하기 화학식 3의 화합물과 반응시킨 후 탈 보호기화 하여 화학식 1a의 화합물을 수득하거나,

(b) 화학식 1a의 화합물을 용매중에서 하기화학식 4의 화합물과 반응시켜 하기화학식 1b의 화합물을 수득하거나,

(c) 화학식 1a의 화합물을 용매중에서 하기 화학식 5또는 화학식 6의 화합물과 반응시켜 하기화학식 1c의 화합물을 수득하거나,

(d) 화학식 1a의 화합물을 용매중에서 하기 화학식 7의 화합물과 반응시켜 하기화학식 1d의 화합물을 수득하거나,

(e) 화학식 1a의 화합물을 용매중에서, 포스겐 존재하에서 하기 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물과 반응시켜 하기화학식 1c의 화합물을 수득함을 특징으로 하여 제조할 수 있으며, 이러한 화학식 1화합물의 제조방법도 또한 본 발명의 목적이다.

그러나, 본 발명에 따른 화합물의 제조방법이 하기에 설명하는 것으로만 한정되는 것은 아니며, 본 명세서에서 기재되거나 선행문헌에 게시된 여러가지 합성 방법을 임의로 조합함으로써 용이하게 제조할 수 있고, 이러한 조합은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 범용화된 통상의 기술이다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 1a]

[화학식 4]

[화학식 1b]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 1c]

[화학식 7]

[화학식 1d]

[화학식 8]

[화학식 9]

상기식에서

A, D, E 및 G는 앞에서 정의한 바와 같고, Cbz 는 벤질옥시카르보닐을 나타내며, 이하 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 제조하는 상기방법 (a) 내지 (e) 에서 용매로서는 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란, 클로로포름 및 디메틸아세트아미드 중에서 선택된 1 종이상을 사용할 수 있으며, 방법 (a)에서 염기로서는 수소화나트륨, 포타슘 t-부톡사이드, 수소 비스 (트리메틸실릴)아미드, 소듐아미드 및 포타슘 비스(트리메틸실릴)아미드 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 또한, 방법 (a)에서 피페리딘환의 1번에 위치한 벤질옥시카르보닐기의 탈보호기화 반응은 통상의 반응조건을 적용하여 수행할 수 있으나, 바람직하게는 알콜 용매중에서 수소대기하에 Pd(OH)2/C, Pd/C 또는 수산화칼륨을 사용하여 수행한다.

방법 (b)에서는 방법 (a)에서 생성된 화학식 1a의 화합물을 상기 언급된 용매중에서, 소듐 트리아세톡시 보로하이드라이드 존재하에서 화학식 4의 화합물과 환원암모니아화 하여 화학식 1b의 화합물을 수득한다.

방법 (c)에서는 방법 (a)에서 생성된 화학식 1a의 화합물을 상기 언급된 용매중에서 임의의 3차아민 염기 존재하에서 화학식 5의 화합물과 반응시키거나, 화학식 6의 화합물과 커플링제의 존재하에서 반응시켜 화학식 1c의 화합물을 수득하는데, 이때 커플링제로서는 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), 1, 1'-디카르보닐디이미다졸(CDI) 등의 카르보이미드류와 1-하이드록시벤조트리아졸을 혼합된 상태로 사용할 수 있다.

방법 (d)에서는 방법 (a)에서 생성된 화학식 1a의 화합물을 상기 언급된 용매중에서 임의의 3차아민 염기 존재하에서 화학식 7의 화합물과 반응시켜 화학식 1d의 화합물을 제조할 수 있다.

방법 (e) 에서는 방법 (a)에서 생성된 화학식 1a의 화합물을 상기 언급된 용매중에서, 포스겐의 존재하에서 화학식 8 또는 화학식 9의 이소시아네이트 유도체와 반응시킴으로써 화학식 1c의 화합물을 제조할 수 있다.

본발명에 따른 방법 (a) 내지 (b) 에서 출발물질로 사용되는 화합물들은 하기 반응식 1 내지 3 에 도시된 방법에 따라 제조할 수 있다.

먼저 화학식 2의 화합물은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 4-(아미노 메틸)피페리딘을 사용하여, 보호기화, 벤질옥시 카르보닐화, 탈 보호기화 반응을 거쳐 아민을 제조한후, 디하이드록시 아세톤의 존재 하에서 티오 이미다졸 유도체를 제조한 후 탈황 및 할로겐화 반응을 거쳐 합성할 수 있다 (참조: J. Med. Chem., 33, 1312-1329, 1990).

화학식 3의 화합물은 1-나프트알데히드로부터 하기 반응식 2에 도시한 방법에 따라 합성할 수 있다.

화학식 1a)의 화합물은 화학식 2 와 3을 알킬화 한후 탈보호기하여 하기반응식 3에 도시한 방법에 따라 합성할 수 있다.

[반응식 1]

[반응식 2]

[반응식 3]

상기식에서

E, G는 앞에서 정의한 바와 같고,

CbzCl은 벤질클로로포메이트를 의미하며,

TosMIC은 토실메틸이소시아나이드를 나타낸다.

본 반응에서 반응물의 사용량, 반응온도, 반응시간 등을 포함한 반응조건은 특정의 반응물질에 따라 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 결정 될 수 있다.

또한, 상기의 반응에서 생성된 화학식 1의 유리화합물은 당해 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 따라 상술한 바와 같은 염으로 전환시킬 수 있다.

본 발명에 따르는 방법에서 반응이 완결된 후에 생성물은 통상적인 후처리 방법, 예를 들면 크로마토그래피, 재결정화 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.

상기한 바와 같은 방법에 따라 제조되는 본 발명의 화합물은 상술한 바와 같이 파네실 전이효소에 대한 저해작용을 가지고 있어 항암제로 유용하게 사용될 수있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 활성성분으로서 화학식 1 의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 화합물을 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여될 총 일일용량은 체중 1kg 당 5 내지 100 mg의 범위가 바람직하나, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 환자의 체중, 성, 건강상태, 식이, 약제의 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여할 수 있다. 주사용 제제, 예를들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 이를 위해 사용될 수 있는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일도 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용할 수 있다.

경구투여용 고체투여 형태로는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 있으며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태는 본 발명에 따른 화학식 1 의 활성화합물을 슈크로오즈, 락토오즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시킴으로서 제조할 수 있다.

본 발명, 특히 상기 설명한 제조방법들을 하기 제조예, 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 다음 제조예에서는 최종화합물을 만들기 위한 중간체의 합성방법을 설명하고 있고, 실시예에서는 제조예의 화합물과의 반응을 통하여 최종화합물을 합성하는 과정을 기술하고 있다. 다음의 실시예들은 본 발명의 신규 화합물의 제조방법을 더 자세히 설명하기 위해 제공된 것이나, 본 발명의 범위가 이들로 제한되는 것은 아니다.

제조예1. 4-(5-클로로메틸-이미다졸-1-일메틸)-피페리딘-1-카르복실산 벤질에스테르

1-1)4-아미노메틸-피페리딘-1-카르복실산 벤질에스테르

4-아미노메틸 피페리딘 22.2g (0.2 mol)을 250 ㎖의 톨루엔에 녹인후, 벤즈 알데히드 21.2 g (0.2 mol)을 가하였다. 반응물을 딘스탁하에서 3시간 동안 환류한후, 반응물온도를 0 ℃ 로 낮추고 벤질클로로포메이트 34.2 g (0.2mol)을 교반하에서 적가하였다. 3시간 동안 반응물을 교반한 후, 상온에서 1 N 황산수소칼륨(220 ㎖) 을 가하였다. 반응물을 200 ㎖ 에테르로 3번에 걸쳐 추출한 후 수용액 층을 수산화나트륨으로 염기화 하였다. 수용액을 포화 염화나트륨으로 처리한 후, 디클로로메탄 100 ㎖로 3번 추출한후 용액을 마그네슘설페이트로 건조 시킨 후 감압증류하여 표제화합물 38 g (수율 91%, 분자량 248)을 수득했다.

FAB 249 (M+H)

1-2)4-(5-하이드록시메틸-2-머캅토-이미다졸-1-일메틸)-피페리딘-1-카르복실산 벤질에스테르

제조예 1-1)의 화합물 24.8 g (0.1 mol)을 아세트산6.0 g (0.1 mol)과 함께 50 ㎖ n-부탄올에 녹인후, 포타슘티오시아네이트 12.6 g (0.13mol), 1.3-디하이드록시아세톤 다이머 15.2 g (0.1 mol), 아세트산 10.0 g (0.17 mol)이 n-부탄올 50㎖에 녹아있는 용액에 가하고 48시간 동안 교반하였다. 교반후 용매를 감압증류한후에틸아세테이트 200 ㎖ 를 첨가한후 물 100 ㎖로 3번 세척하였다. 유기층을 마그네슘설페이트로 건조시킨 후 감압증류하에서 용매를 제거한 후 표제화합물 27 g( 75 mmol: 수율 75% 분자량 361)을 수득했다.

FAB 362 (M+H)

1-3)4-(5-하이드록시메틸-이미다졸-1-일메틸)-피페리딘-1-카르복실산 벤질에스테르

제조예 1-2)의 화합물 18.05 g (50 mmol)을 100 ㎖ 10% 질산 과 에틸아세테이트 10 ㎖ 용액에 가한후 반응물을 차가운 얼음물에 식힌후 상온에서 3시간동안 교반하였다. 반응물을 4N 수산화나트륨 수용액으로 염기화 한후 에틸아세테이트100 ㎖로 2번 추출하였다. 추출유기용액을 마그네슘 설페이트로 건조시킨후 감압증류하여 표제화합물 12.3 g (38 mmol, 수율 75 %, 분자량 329)을 수득했다.

FAB 330 (M+M)

1-4)4-(5-클로로메틸-이미다졸-1-일메틸)-피페리딘-1-카르복실산 벤질에스테르

제조예 1-3)의 화합물 9.9 g (30 mmol)을 클로로포름 50㎖ 에 녹인후 티오닐클로라이드 7.1 g (60 mmol)을 0 ℃ 에서 천천히 적가하였다. 2시간 동안 교반한 후 용매를 감압증류하에서 제거한후 잔존 하이드로클로라이드를 제거한후 표제화합물의 염 9.9 g (수율: 95 %, 분자량 347.5)을 수득했다.

FAB 349 (M+H)

제조예2. N-메틸피페라질-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드

2-1)3-나프탈렌-1-일-아크릴산 에틸에스테르

트리에틸포스포노아세테이트 22.4 g (0.10 mol)을 500㎖ 의 테트라하이드로퓨란에 녹인 후 포타슘 t-부톡사이드 12.4 g (1.1 mol)을 서서히 첨가하였다. 이용액에 1-나프트알데히드 15.6 g (0.10 mol) 을 20 ㎖ 의 테트라하이드로퓨란에 녹여 서서히 가한 후 8 시간 동안 교반하였다. 유기용매를 감압증류하여 제거한 후 에틸 아세테이트에 녹이고 물로 2번 세척하였다. 마그네슘 설페이트로 건조시켜 농축한 후 헥산/에틸 아세테이트 (95/5, v/v)로 컬럼크로마토그래피를 실시하여 표제의 화합물 20.3g (0.090 mol, 90%)을 합성하였다.

FAB 227 (M+H)

2-2)에틸 4-나프탈렌-1-일-1H-피롤-3-카르복실레이트

제조예 2-1) 3-나프탈렌-1-일-아크릴산 에틸에스테르 5 g (18.9 mmol) 과 토실메틸이소시아나이드 3.68 g (18.9 mmol)을 테트라하이드로퓨란 100㎖ 에 녹였다. 여기에 포타슘 t-부톡사이드 2.55 g (22.7 mmol) 의 테트라하이드로퓨란 (100 ㎖) 용액을 천천히 첨가하고 30분간 환류하였다. 물 100 ㎖를 넣어 반응을 중지 시키고 감압하에서 용매를 제거하였다. 에테르로 추출하고 소금물로 씻어준 후 마그네슘 설페이트로 건조하였다. 용매를 감압하에서 제거하고, 에틸아세테이트/헥산 (1/3) 혼합용액으로 크로마토그래피를 실시 하여 표제의 화합물 3. 85 g (14.5 mmol,77%)을 합성하였다.

FAB 266 (M+H)

2-3)4-나프탈렌-1-일-1H-피롤-3-카르복실산

제조예 2-2)의 화합물 2.64 g (10 mmol) 을 50 % 에탄올 50 ㎖ 에 녹이고 수산화 칼륨 2.24 g (40 mmol) 을 가한후 7 시간동안 환류하였다. 상온으로 냉각시킨 후 pH를 4-5로 맞추고 에틸아세트로 추출하였다. 소듐설페이트로 건조하고 감압하여 용매를 제거한후 표제화합물 1.62 g (8.1 mmol, 81 %)을 얻었다. 이화합물은 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다.

FAB 236 (M+H)

2-4)N-메틸피페라질-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드

제조예 2-3) 의 화합물 234 mg (1 mmol)을 디메틸포름아미드 2㎖ 에 녹이고 EDC 230mg (1.2 mmol)과 HOBT 162 mg (1.7mmol)을 넣어준뒤 0 ℃에서 5 분간 교반 시켰다. N-메틸피페라진 88 mg (1 mmol)을 넣고 실온에서 5 시간 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 탄산칼륨 포화 수용액 10 ㎖ 를 넣은 후 에틸아세테이트로 추출한 후 소금물과 물로 세척하고 농축한후 컬럼크로마토그래피하여 (85/15:디클로메탄/메탄올) 표제화합물 240 mg (0.75 mmol)을 수득했다.

FAB 320 (M+H)

제조예 3. N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-매틸-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드

제조예 2-3) 의 화합물 234 mg (1 mmol)을 디메틸포름아미드 2 ㎖ 에 녹이고 EDC 230mg (1.2 mmol), 트리에틸아민 101 mg (1 mmol) 과 HOBT 162 mg (1.7 mmol)을 넣어준뒤 0℃에서 5 분간 교반 시켰다. N,N,N'-트리메틸에틸렌디아민 102 mg (1 mmol)을 넣고 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 탄산칼륨 포화 수용액 10 ㎖ 를 넣은 후 에틸아세테이트로 추출한 후 소금물과 물로 세척하고 농축한후 컬럼크로마토그래피하여 (85/15: 디클로메탄/메탄올)표제화합물 257 mg (0.8 mmol)을 얻었다.

FAB 322 (M+H)

제조예 4. 4-하이드록시메틸-2-(2-프로필)티아졸

4-1)2-메틸프로피온티오아미드

이소부티로니트릴 3.0 g (43 mmol)을 황화수소 가스가 포화된 피리딘 30 ㎖와 트리에틸아민 9㎖ 의 혼합 용매에 녹이고 상온에서 12 시간 동안 교반 하였다. 감압하에서 용매를 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 200 ㎖에 녹인 후 0.5N HCl과 물로 세척하였다. 무수 마그네슘 설페이트로 유기층을 건조시키고 농축한 후 컬럼크로마토그래피 (용리제 : 에틸 아세테이트/n-헥산 = 1/1)를 실시하여 표제의 화합물 3.1g (30mmol)을 70% 수율로 수득하였다.

4-2)4-카보에톡시-2-(2-프로필)티아졸

제조예 4-1) 의 화합물 3.0g (29 mmol) 과 에틸 브로모피루베이트 5.6g (29 mmol)을 에탄올 50㎖에 녹이고 3시간 동안 환류하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 컬럼크로마토그래피 (용리제 : 에틸 아세테이트/n-헥산 = 1/4)를 실시하여 표제의 화합물 4.5g (23mmol)을 79% 수율로 수득하였다.

4-3)4-히드록시메틸-2-(2-프로필)티아졸

리튬알루미늄하이드라이드 95 mg (2.5 mmol)을 0 ℃ 에서 테트라하이드로퓨란 3㎖ 에 넣고 제조예 4-2) 의 화합물 500 mg (2.51 mmol)을 천천히 첨가하였다.상온에서 10분간 교반 한 후 물 10 ㎖를 조심스럽게 첨가하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고 농축한 후 컬럼크로마토그래피 (용리제 : 에틸 아세테이트/n-헥산 = 7/3)를 실시하여 표제의 화합물 220 mg(1.40mmol)을 56 % 수율로 수득하였다.

제조예 5. 2-(2-프로필)티아졸-4-카르복실산

제조예 4-2)의 화합물 200 mg (1.00 mmol)을 테트라하이드로퓨란, 메탄올, 물의 혼합용매 (1.0㎖/0.6㎖/0.3㎖)에 녹이고 리튬하이드록사이드 63mg (1.5 mmol)을 첨가하였다. 상온에서 1시간 교반한 후 감압하에서 용매를 제거하였다. 잔류물에 물을 넣고 묽은 염산용액으로 pH를 6정도로 맞춘 후 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수 마그네슘 설페이트로 건조하고 농축하여 표제의 화합물 130 mg (1.40mmol)을 76 % 수율로 수득하였다. 이 화합물은 더 이상의 정제과정 없이 다음 반응에 사용하였다.

실시예1: 4-메틸피페라지노-1-{[1-(1-벤질옥시카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일]메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(1)

제조예 2-4) 의 화합물 612 mg (2.0 mmol)을 디메틸포름아미드 10 ㎖에 녹이고 0 ℃에서 소듐하이드라이드 (60%) 264 mg (6.6 mmol)을 가한후 5 분간 교반하였다. 제조예 1-4의 화합물 765 mg (2.2 mmol)을 첨가하고 상온에서 5 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거후 물 10 ㎖ 첨가하고 에틸아세테이트로 20 ㎖로 두번 추출하였다. 마그네슘 설페이트로 건조시키고 농축한후 디클로로메탄/메탄올 (90/10)로 컬럼크로마토그래피를 실시하여 표제화합물 930 mg (수율74 %)을 수득했다.

FAB (M+H) 631. C₃₈H₄₂N₆O₃

실시예 2: N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸-1-{[1-(1-벤질옥시카르보닐피페리딘-4-일)메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(2)

제조예 3의 화합물 612 mg (2.0 mmol)을 디메틸포름아미드 10 ㎖에 녹이고 0 ℃에서 소듐하이드라이드 (60%) 264 mg (6.6 mmol)을 가한후 5 분간 교반하였다. 제조예 1-4의 화합물 765 mg (2.2 mmol)을 첨가하고 상온에서 5 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거후 물 10 ㎖ 첨가하고 에틸아세테이트로 20 ㎖로 두번 추출하였다. 마그네슘 설페이트로 건조시키고 농축한후디클로로메탄/메탄올(90/10)로 컬럼크로마토그래피를 실시하여 표제화합물 870 mg (수율69 %)을 수득했다.

FAB (M+H) 633: C₃₈H₄₄N₆O₂

실시예 3 : 4-메틸피페라지노-1-[(1-메톡시카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(3)

3-1)4-메틸피페라지노-1-[(피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드

실시예 1의 화합물 227 mg (0.36 mmol)을 메탄올 5㎖에 녹인후 수산화칼륨 2g을 넣은후 8시간동안 환류하여 반응시킨다. 반응물의 온도를 낮춘 후 에틸아세테이트 10 ㎖로 두번 추출하여 무수황산나트륨으로 건조시킨 다음 감압하여 표제의 화합물을 80% 수율로 수득했다.

FAB (M+H): 496, C₃₀H₃₆N₆O

3-2)4-메틸피페라지노-1-[(1-메톡시카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드

실시예 3-1)의 화합물 30 mg (62 μmol)을 디클로로메탄 2 ㎖에 넣은후 메틸 클로로포메이트5.4 mg (6.9 μmol) 을 주사기로 첨가하였다. 2시간 반응후 용매를 감압하에서 제거하고 디클로로메탄/메탄올 (85/15)으로 컬럼크로마토그래피하여 표제화합물 27.8 mg (50 μmol, 80%)을 수득했다.

FAB (M+H):555, C₃₂H₃₈N₆O₃

실시예 4: 4-메틸피페라지노-1-[(1-메틸설포닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(4)

실시예 3-1의 화합물 30 mg (62 μmol)을 디클로로메탄 2 ㎖에 넣은후 메틸 설포닐클로라이드7.8 mg (6.9 μmol) 을 주사기로 첨가하였다. 2시간 반응후 용매를 감압하에서 제거하고 디클로로메탄/메탄올 (90/10)으로 컬럼크로마토그래피하여표제화합물 25 mg (4.1 μmol: 87%)을 수득했다.

FAB (M+H):555, C₃₂H₃₈N₆O₃

실시예 5: 4-메틸피페라지노-1-[(1-메틸카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(5)

실시예 3-1)의 화합물 30 mg (62 μmol)을 디클로로메탄 2 ㎖에 넣은후 아세틸클로라이드 5.4 mg (6.9 μmol) 을 주사기로 첨가하였다. 2시간 반응후 용매를 감압하에서 제거하고 디클로로메탄/메탄올 (80/20)으로 컬럼크로마토그래피하여 표제화합물 26 mg (4.8 μmol, 78%)을 수득했다.

FAB (M+H):538, C₃₂H₃₈N₆O₂

실시예 6: 4-메틸피페라지노-1-[(1-페닐에틸카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(6)

실시예 3-1)의 화합물 62 mg (107 μmol)을 2㎖ 디클로로메탄에 녹이고 3-페닐프로피오닐클로라이드22 mg (128 μmol)을 넣어 3시간 반응시킨후 용매를 날려버린후 디클로로메탄/메탄올 (95/5)로 컬럼크로마토그래피하여 표제화합물 49 mg (수율:73%)을 수득했다.

FAB (M+H):629, C₃₉H₄₄N₆O₂

실시예 7: 4-메틸피페라지노-1-[(1-페녹시메틸카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(7)

실시예 3-1)의 화합물 62 mg (107 μmol)을 2㎖ 디클로로메탄에 녹이고 페녹시아세틸클로라이드 23 mg (128 μmol)을 넣어 3시간 동안 반응시킨후 용매를 날려 버린후 디클로로메탄/메탄올 (95/5)로 컬럼크로마토그래피하여 표제화합물 50 mg (수율:74%)을 수득했다.

FAB (M+H):631, C₃₈H₄₂N₆O₃

실시예 8 : 4-메틸피페라지노-1-{[1-(나프탈렌-2-일메틸옥시카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(8)

2-나프탈렌메탄올1.19g (7.52mmol)을 15 ㎖ 톨루엔에 녹이고 포타슘디카르보네이트 1.04 g (7.53 mmol)을 가하였다. 0℃에서 포스겐 용액 3.89 ㎖ (1.93M 톨루엔 용액)를 가한 후 상온에서 2시간 동안 교반 하였다. 반응물을 여과하여 고체를 제거한 후 실시예 3-1) 의 화합물 0.108 g (0.222 mmol)과 트리에틸아민 0.046 ㎖ (0.33 mmol)을 가하였다. 상온에서 1시간 교반 후 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 포화 소듐비카르보네이트 수용액 10 ㎖ 를 넣고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 무수황산마그네슘으로 건조시키고 농축한 후 컬럼크로마토그래피를 (용리제 : 디클로로메탄/메탄올 = 95/5) 실시하여 표제의 화합물 65 mg (0.097mmol)을 43% 수율로 수득하였다.

실시예 9 - 실시예 11

실시예 8과 유사한 방법으로 표 2 의 화합물들을 각각 수득하였다.

[표 2]

실시예 12 : 4-메틸피페라지노-1-{[1-(나프탈렌-2-카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(12)

실시예 3-1 의 화합물 100 mg (0.206 mmol) 과 2-나프토산 39 mg (0.22mmol)을 디메틸포름아미드 1 ㎖ 에 녹이고 EDC 59 mg (0.31 mmol) 과 HOBT 42 mg (0.31mmol)을 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 감압 증류하여 용매를 제거 한 후 에틸 아세테이트에 녹이고 포화 소듐 비카르보네이트 수용액으로 세척했다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 농축한 후 컬럼크로마토그래피 (용리제 : 디클로로메탄/메탄올 = 95/5)를 실시하여 표제의 화합물 88 mg (0.14mmol)을 68% 수율로 수득하였다.

FAB (M+1): 627. C₃₉H₄₂N₆O₂

실시예 13 - 14 :

실시예 12에서 2-나프토산 대신에 각각 트랜스신남산과 2-(2-프로필)티아졸-4-카르복실산을 사용한 것을 제외하고는 실시예 12과 동일한 방법으로 표 3 의 화합물을 수득하였다.

[표 3]

실시예 15: 4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(N-벤질-N-메틸카르바모일)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(15)

실시예 3-1) 의 화합물 100 mg (0.206 mmol)을 테트라하이드로퓨란 1㎖에 녹이고 N-벤질메틸아민 27 mg (0.23mmol)을 가한 후 0℃ 에서 포스겐 용액 0.16 ㎖ (1.93M 톨루엔 용액)을 적가 하였다. 상온에서 1 시간 동안 교반 한 후 물 1 ㎖를 넣고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 농축한 후 컬럼크로마토그래피를 (용리제 : 디클로로메탄/메탄올 = 93/7) 실시하여 표제의 화합물 86 mg(0.133mmol)을 64% 의 수율로 수득하였다.

FAB (M+1) :644, C₃₉H₄₅N₇O₂

실시예 16: 4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(N,N-디메틸카르바모일)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(16)

실시예 15에서 N-벤질메틸아민 대신에 N,N-디메틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 15과 동일한 방법으로 표 4 의 화합물을 수득하였다.

실시예 17: 4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀린-1-일카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(17)

실시예 15에서 N-벤질메틸아민 대신에 1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀린을 사용한 것을 제외하고는 실시예 15과 동일한 방법으로 표 4 의 화합물을 수득하였다.

실시예 18: 4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-1-일카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(18)

실시예 15에서 N-벤질메틸아민 대신에 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린을 사용한 것을 제외하고는 실시예 15과 동일한 방법으로 표 4 의 화합물을 수득하였다.

[표 4]

실시예 19: 4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(4-비페닐메틸)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(19)

실시예 3-1) 의 화합물 100 mg (0.206 mmol)을 테트라하이드로퓨란 3 ㎖에 녹이고 4-페닐벤즈알데히드 45 mg (0.24 mmol) 과 소듐트리아세톡시보로하이드라이드 52 mg (0.24 mmol) 을 가한후 상온에서 10 시간 교반 한 후 메탄올 1N HCl 1 ㎖를 넣고 30분 동안 교반하고 염기화 한후 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 농축한 후 컬럼크로마토그래피를 (용리제 : 디클로로메탄/메탄올 = 93/7) 실시하여 표제의 화합물 100 mg (0.151mmol)을 75%의수율로 수득하였다.

FAB MS(M+1): 663

실시예 20: 4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(4-페녹시벤질)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(20)

실시예 19에서 4-페닐벤즈알데히드 대신에 4-페녹시 벤즈알데히드를 사용한 것을 제외하고는 실시예 19와 동일한 방법으로 표제의 화합물을 수득하였다.

FAB MS(M+1): 679

실험예 1 : Ras 파네실 전이효소 억제능 분석

본 실험에서는 폼프리아노 등의 방법( 참조:Pompliano et al., Biochemistry 31.3800(1992)) 등의 개선된 방법을 이용하였다. 즉, 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 Ras 파네실 전이효소를 사용하였으며, 기질로는 H-Ras(H-Ras-CVLS)와 K-Ras의 카르복시 말단 다염기성 라이신 도메인을 치환시킨 H-Ras와의 결합단백질(참조: 대한민국 특허출원 제97-14409호)을 공지된 방법(참조: Chung et al., Bichimica et Biophysica Acta 1129, 278(1992)) 에 따라 정제하여 사용하였다.

효소 반응은 염화칼륨25 mM, 염화마그네슘 25 mM, 디티티(DTT)10 mM 및 염화아연 50μM을 함유하는 50 ㎕의 50 mM 소듐 히피스 완충용액에서 수행하였으며, Ras 기질 단백질 1.5μM, 트리튬-파네실 피로 포스페이트 0.15 μM 및 파네실 전이 효소4.5 nM이 사용되었다. 파네실 전이효소를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응을 지속시킨 후 1mol의 염산을 함유한 에탄올 용액 1㎖를 첨가하여 반응을 정지시켰다.생성된 침전물을 필터바인딩을 위한 호퍼 하베스터(호퍼 #FH 225V)를 사용하여 GF/B 필터에 흡착시킨후, 에탄올을 사용하여 세척하고, 건조시킨 필터의 방사능을 LKB 베타 카운터를 사용하여 측정하였다. 효소 역가검정은 Ras 기질 단백질과 파네실 효소의 농도가 정량적 역가관계를 나타내는 기질 불포화 상태에서 측정되었으며, 합성된 화합물은 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켜 전체 반응액의 5퍼센트 이내에서 첨가하여 효소 저해능을 평가하였다. 효소 저해능은 시험화합물이 없는 상태에서 Ras 기질 단백질에 도입된 파네실량에 대해 시험화합물 존재하에서 측정된 파네실 도입량을 백분율로 표시하였으며, 50%의 효소활성을 저해하는 농도를 각 시험화합물의 IC₅₀로 결정하였다. 시험화합물의 선택적 저해능을 평가하기 위한 제라닐제라닐 전이효소는 샤버 등의 방법(참조: Schaber et al., J. Biol chem. 265:14701(1990))을 변형하여 소뇌로부터 정제하여 사용하였으며, 파네실 전이효소 반응과 유사한 조건에서 제라닐제라닐 전이 효소의 특이적 기질인 제라닐 제라닐 피로 포스페이트와 Ras-CVIL 기질 단백질을 사용하여 실험을 수행하였다. 실험결과는 하기 표 5 에 나타내었다.

실험예 2 : 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제효능 분석

본 실험에서는 돌연 변이에 의해 형질 전환 활성을 갖는 C-Harvey-Ras 단백질을 발현하는 Rat2 세포주와 K-Ras 카르복시 말단의 다염기성 라이신 도메인으로 치환한 H-Ras와 결합 단백질로 형질전환된 Rat2세포주(참조: 특허출원 제97-14409호)를 사용하였으며, 실험 방법은 드크루등의 방법 (참조: Declue. J. E. et al.,Cancer Research 51:712(1991))을 변형시켜 다음과 같이 수행하였다.

형질 전환된 Rat2 섬유아세포 (fibroblast) 세포주를 60mm 세포 배양 디쉬에 3×10⁵세포의 밀도로 분주하여 37℃ 세포 배양기에서 48시간 배양함으로써 50%이상의 밀도로 성장시킨 후 시험화합물로 처리하였다. 이때 시험화합물의 용매는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하였으며 대조군과 시험군 모두 디메틸설폭사이드 농도를 1%로 사용하였다. 시료를 처리한 뒤 4시간 후에 배지 1 ㎖당 150 μCi의 방사성 동위원소[³⁵S]로 표지된 메티오닌을 첨가하고 20시간 동안 배양한 후 생리적 식염수로 세포를 세척하였다. 냉각된 세포 용해 완충 용액 ( 염화마그네슘5mM , 디티티 1mM , NP40 1%, EDTA 1mM , PMSF 1mM, 루펩틴 2 μM, 펩스타틴에이 2μM 및 안티페인 2μM을 포함하는 소듐히피스 50 mM) 1 ㎖를 가하여 세포를 용해시킨 후 세포가 용해된 상등액을 고속원심분리(12,000g × 5분)에 의해 수득하였다. 상등액의 방사성 동이원소 표지량을 측정하여 면역 침전 반응시 정량적 결과를 얻을 수 있도록 표준화하였다. 그후 반응액에 Ras 단백질에 특이적 결합을 하는 단일클론 항체, Y13-259(참조: Furth, M.E. et al., J. Virol 43:294(1982))를 가하고 4℃에서 15시간동안 반응시켰다. 이 용액에 다시 고트에서 유래된 쥐의 면역글로블린에 대한 항체가 결합된 Protein A-아가로즈 현탁액을 넣어 1시간 4℃에서 반응시킨 후 면역 반응 침전물로 부터 비특이적 결합물을 제거하기 위해 완충용액(염화나트륨50 mM, 소듐 디옥시 콜레이트 0.5%, 엔피 40 0.5% 및 엔피 40 0.1% 를 포함하는 트리스 클로라이드 50 mM 완충용액)으로 세척하였다. 전기영동 방법을 사용하여 침전물을 분석하기 위해, 침전물을 전기영동 시료 완충액에 끓인 후 13.5%의 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동후 겔을 고정시키고 건조시킨후 X-ray 필름에 감광시킨 후 현상 인화하였다. 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제 효능은 Ras 단백질의 파네실이 결합된 밴드와 결합되지 않은 밴드의 강도를 측정하여 50%의 파네실 결합이 저해된 시험화합물의 농도(IC₅₀)로 나타내었다. 하기 표5 에는 본발명에 따른 대표적인 화합물들의 억제효능을 나타내었다. 여기서 IC₅₀는 실험예 1을 수행한 결과 얻어진 데이터이고 C IC₅₀는 실험예 2를 수행한 결과 얻어진 데이터이다.

하기 표 5 는 대표적인 화합물들의 억제 효능을 요약한 것이다.

[표 5]

Claims

하기 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이성체:

[화학식 1]

상기 식에서,

A는 수소 또는 하기 구조식의 그룹을 나타내고:

여기에서

B는 CH₂, C=O 또는 SO₂를 나타내며,

D는 하기 구조식의 그룹 중 선택된 어느 하나를 나타내고;

여기에서

m은 0 내지 3의 정수이며,

n은 1 내지 3의 정수이고,

X는 수소, 페닐, 페녹시, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 할로겐, 니트로, 벤질 또는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아미노를 나타내며,

R¹및 R²는 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C₃-C₆사이클로알킬, C₃-C₆사이클로알킬로 치환된 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 5환 또는 6환 헤테로사이클릭 방향족 화합물을 나타내고,

E는 페닐 또는 나프틸을 나타내며,

G는 하기 구조식의 그룹 중 선택된 어느 하나를 나타내고:

여기에서

R³는 수소 또는 탄소수 1 내지 4의 직새 또는 측쇄 알킬을 나타낸다.
제 1 항에 있어서,

A는를 나타내고,

여기에서

B는 CH₂, C=O 또는 SO₂를 나타내며,

D는 하기 구조식의 그룹 중 선택된 어느 하나를 나타내고:

여기에서

m은 0 내지 1의 정수이며,

n은 1 내지 2의 정수이고,

X는 수소를 나타내며,

R¹및 R²는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타내고,

E는 나프틸을 나타내며,

G는및의 그룹 중 선택된 어느 하나를 나타내는 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이성체.
제 2항에 있어서,

4-메틸피페라지노-1-1{[1-(1-벤질옥시카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일]메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(1),

N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸-1-{[1-(1-벤질옥시카르보닐피페리딘-4-일)메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(2),

4-메틸피페라지노-1-[(1-메톡시카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(3),

4-메틸피페라지노-1-[(1-메틸설포닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(4),

4-메틸피페라지노-1-[(1-메틸카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(5),

4-메틸피페라지노-1-[(1-페닐에틸카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(6),

4-메틸피페라지노-1-[(1-페녹시메틸카르보닐피페리딘-4-일메틸)-1H-이미다졸-5-일메틸]-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(7),

4-메틸피페라지노-1-{[1-(나프탈렌-2-일메틸옥시카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(8),

4-메틸피페라지노-1-{[1-(3-메틸부탄-1-일옥시카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(9),

4-메틸피페라지노-1-{[1-(4-플로로벤질옥시카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(10),

4-메틸피페라지노-1-{[1-(신나밀옥시카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(11),

4-메틸피페라지노-1-{[1-(나프탈렌-2-카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(12),

4-메틸피페라지노-1-{[1-(신나모일)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(13),

4-메틸피페라지노-1-{1[1-(2-프로필-4-카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(14),

4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(N-벤질-N-메틸카르바모일)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(15),

4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(N,N-디메틸카바모일)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(16),

4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀린-1-일카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(17),

4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-1-일카르보닐)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(18),

4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(4-비페닐메틸)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(19), 또는

4-메틸피페라지노-1-{1-[1-(4-페녹시벤질)피페리딘-4-일메틸]-1H-이미다졸-5-일메틸}-4-(1-나프틸)-1H-피롤-3-카르복스아미드(20)인 화합물.
(a) 하기 화학식 2의 화합물을 용매중에서 염기의 존재하에 하기 화학식 3의 화합물과 반응시킨 후 탈보호기화하여 화학식 1a의 화합물을 수득하거나,

(b) 화학식 1a의 화합물을 용매중에서 하기 화학식 4의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 1b의 화합물을 수득하거나,

(c) 화학식 1a의 화합물을 용매중에서 하기 화학식 5 또는 화학식 6의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 1c의 화합물을 수득하거나,

(d) 화학식 1a의 화합물을 용매중에서 하기 화학식 7의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 1d의 화합물을 수득하거나,

(e) 화학식 1a의 화합물을 용매중에서, 포스겐 존재하에서 하기 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 1c의 화합물을 수득함을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법:

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 1a]

[화학식 4]

[화학식 1b]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 1c]

[화학식 7]

[화학식 1d]

[화학식 8]

[화학식 9]

상기식에서

A, D, E 및 G는 제 1항에서 정의한 바와 같고, Cbz는 벤질옥시카르보닐을 나타낸다.
약제학적으로 허용되는 담체와 함께 유효성분으로 제 1 항에서 청구된 화합물을 함유하는 항암제 조성물.