KR100381213B1 - 파네실전이효소억제능을갖는사이클릭우레아유도체및그의제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파네실 전이 효소의 활성을 억제하는 기작에 의해 항암제로서 유용하게 사용될 수 있는 하기 화학식의 1의 신규한 사이클릭우레아 유도체, 약제학적으로 허용되는 그의 염, 이성체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기식에서
R1, R2, R3, R4, R, m, p 및 n 은 명세서에 정의한 바와 같다.

Description

파네실 전이효소 억제능을 갖는 사이클릭우레아 유도체 및 그의 제조방법
본 발명은 파네실 전이 효소의 활성을 억제하는 기작에 의해 항암제로서 유용하게 사용될 수 있는 하기 화학식 1의 신규한 사이클릭유레아(이미다졸리딘-2-온) 유도체, 약제학적으로 허용되는 그의 염, 이성체 및 그의 제조 방법에 관한 것이다:
화학식 1
상기 식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 디사이클릭방향족을 나타내고,
R3및 R4는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 저급알킬, 페닐, 방향족 헤테로사이클릭그룹, 비방향족 헤테로사이클릭 그룹, 또는
(여기에서, R5는 저급알킬, 저급알킬티오저급알킬 또는 페닐에 의해 치환되거나 비치환된 저급알킬을 나타내며, R6는 수소 또는 저급알킬을 나타낸다)을 나타내며,
R은 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 페닐, 방향족 헤테로사이클릭그룹 또는 비방향족 헤테로사이클릭그룹을 나타내고,
m 은 1 내지 4의 정수이며,
p는 0 내지 4 의 정수이고,
n 은 1 내지 5의 정수이다.
Ras 단백질은 세포의 성장과 분화에 중요한 역할을 하는 21kDa의 단백질로서 구아닌 뉴클레오타이드와 결합하며, 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 구아노신 디포스페이트(GDP)로 가수분해하는 효소이다. 또한, 세포 내에서 특이적인 GTPase 회로를 조절하는 분자스위치로도 작용하는 것으로 알려져 있다(참조: Bourne,H.R., Sanders,D.A., McCormick, F.Nature1991, 349, 117).
Ras 단백질은 포유동물세포에서 3 가지의 Ras 유전자에 의해 아미노산 188개의 K-Ras-4B 또는 189개의 H-Ras, K-Ras-4A 및 N-Ras로 생성된다. 이 단백질의 12, 13, 61번 위치에 있는 아미노산은 GTP의 인산기와 근접하여 있어, 이 아미노산 잔기들은 GTP의 가수분해에 관여하는 물분자의 공간적 위치에 영향을 미침으로써GTPase 활성에 영향을 미친다. 인체에서 암이 발생한 경우, 이 위치의 아미노산에 돌연변이가 관찰되는데, 이 돌연변이가 결국 Ras 단백질 고유의 GTPase 활성을 저해하여 GTP 결합상태를 지속시킴으로써 비정상적인 성장신호를 지속적으로 전달하여 발암성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 발암성인 Ras 유전자는 특이적으로 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암등에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며(참조: Bos,J.L.,Cancer Res., 1989, 49, 4682), Ras 단백질은 혈관평활근(vascular smooth muscle) 세포의 성장에도 관여한다고 보고되어 있어 동맥경화 및 당뇨병과도 밀접한 관련이 있는 것으로 생각되고 있다(참조: JP H7-112930 호).
Ras 단백질이 생물학적으로 활성화 상태에 있기 위해서는 세포막 내에 부착되어야 하는데 이를 위해서는 Ras 파네실 전이효소, Ras 단백질 카복시 말단의 3개 AAX 펩타이드 절단효소, 메틸 전이효소 및 팔미토일 전이효소에 의한 단백질 전이 후의 탄소말단의 변형이 요구된다. 이중 첫번째 단계인 파네실화는 파네실 전이효소(FTase)에 의해 이루어진다. 파네실 전이효소의 기질은 Ras 단백질의 카복시 말단에 있는 CA1A2X라는 네개의 펩타이드이며, 여기서 A1 및 A2는 전기적 부하를 띄지 않는 지방족 아미노산이고 X는 메티오닌, 알라닌 또는 세린등이다. 파네실 반응은 시스테인에 일어나 황에테르 결합을 형성시키며, H-Ras와 N-Ras의 경우에는 카복시 말단 근처의 또 다른 시스테인에 팔미토일화가 일어난다. 파네실화의 결과로 Ras 단백질은 친소성이 증가되어 세포막 내에 부착하게되며, 파네실화된 Ras 단백질은 카복시 말단으로 부터 연이어 3개의 AAX 펩타이드가 절단효소에 의해 제거되고 메틸화되어 파네실기가 세포막 내의 지질층 또는 다른 수용체와 결합하는 것을 용이하게 해주는 것으로 알려져 있다. 한편, K-Ras-4B는 H-Ras, N-Ras와는 달리 팔미토일화에 필요한 시스테인 대신 폴리베이직(Poly basic) 도메인이라 불리는 여러개의 라이신이 배열된 부위를 가지고 있으며, 이를 통해 세포막내의 음이온성 지질과의 결합이 용이하게 되는 것으로 알려져있다. Ras 단백질이 세포막내에 잘 부착하기 위해서는 모든 변형 단계가 필요하나, Ras 단백질의 활성화에는 파네실화만으로도 충분한 것으로 알려져 있으므로 이 파네실화를 차단함으로써 돌연변이에 의한 Ras 발암성을 억제하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(참조: Buss, J.E.et al.,Chemistry & Biology, 1995, 2, 787).
그간의 연구결과, Ras로 형질전환된 세포에서 파네실 전이효소를 저해했을때 세포의 성장이 저해되는 것으로 관찰되었으며, 또한 Ras에 의해 변형된 세포형질을 개선하는 것으로 나타났다.
실제로 파네실 전이효소의 몇몇 저해제들은 Ras 발암성 유전인자의 세포내 프레닐기에 의한 반응을 선택적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다(참조: Kohl,N.E.et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 9141(1994); Kohl, N.E.et al.,Nature Medicine, 1, 792(1995)). 두개의 기질, 파네실기와 Ras단백질을 결합하여 반응물을 생성하는 파네실 전이효소의 저해제는 크게 세가지로 나눌 수 있다. 먼저 파네실기(FPP)를 경쟁적으로 저해할 수 있는 화합물, 둘째로는 Ras 단백질의 C-터미날을 저해하는 화합물, 그리고 파네실 전이효소가 두 기질을 사용하는 측매반응의 활성화 단계를 모사하는 안정한 화합물을 저해제로 응용하는 것이다. 지금까지 연구된 대부분의 저해제는 Ras단백질의 C-터미날의 프레닐기의 도입반응을 매개하는 CAAX 모티브에 연관된 것들로서, 파네실 전이효소의 Ras 단백질 기질에 대한 경쟁적 저해 기전을 응용한 것이다.
개발된 파네실 전이효소 저해제로는 시스테인 티올(thiol)기를 함유하며 CAAX와 유사한 구조를 갖는 펩타이드 변형체 및 이를 개선한 저해제(참조: US Patent No. 5,141,851 호; Kohl,N.E.et al., Science260, 1934(1993); Grahamet al., PCT/US95/12224), 페닐기로 변형된 펩타이드(참조: Sebti, S.M.,J. Biol. Chem. 270, 26802, 1995), 향정신성 의약품 골격구조중 벤조디아제핀을 펩타이드의 turn 모사구조로 활용한 변형체(James,G.L.et al., Science, 260, 1937, 1993), 펩타이드 구조에서 벗어나 트리사이클릭 유기 화합물을 골격으로한 저해제(참조: Bishop W.R.et al., J. Biol. Chem., 270, 30611, 1995)를 들 수 있다. 또한, 파네실 전이효소가 프레닐기를 전이시키는 작용기전이 전자 친화적 치환반응(Electrophilic Displacement)이므로 반응의 트랜지션 상태(transition state)에 양성부하를 요구함에 착안하여 프레닐기에 트랜지션 상태의 양성 부하를 연결시킨 새로운 형태의 저해제가 제시되었다(참조: Poulter, C.D.et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 8761, 1996).
이러한 기술적 배경하에 본 발명자들은 파네실 전이효소의 트랜지션 상태를 모사할수있는 구조 특성을 갖는 화합물을 새로이 합성하는 한편, 이를 평가하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 화학식 1의 사이클릭우레아 유도체가 파네실 전이 효소를 억제하는 기작을 통해 항암제로서 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 항암제로서 유용하게 사용될 수 있는 화학식 1의 화합물, 약제학적으로 허용되는 그의 염, 이성체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 파네실 전이효소의 활성을 억제함으로써 항암효과를 갖는 하기 화학식 1의 사이클릭유레아 유도체, 약제학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성쳬에 관한 것이다.
화학식 1
상기 식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 디사이클릭방향족을 나타내고,
R3및 R4는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 저급알킬, 페닐, 방향족 헤테로사이클릭그룹 또는 비방향족 헤테로사이클릭 그룹, 또는
(여기에서, R5는 저급알킬, 저급알킬티오저급알킬 또는 페닐에 의해 치환되거나 비치환된 저급알킬을 나타내며, R6는 수소 또는 저급알킬을 나타낸다)을 나타내며,
R 은 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 페닐, 방향족 헤테로사이클릭그룹 또는 비방향족 헤테로사이클릭그룹을 나타내고,
m 은 1 내지 4의 정수이며,
p는 0 내지 4 의 정수이고,
n 은 1 내지 5의 정수이다.
상기 화학식 1의 화합물에 대한 치환기 정의에서 용어 "저급알킬"은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸 등과 같은 탄소 수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄알킬을 의미한다.
본 발명에따른 화학식 1의 화합물은 1개 이상의 비대칭중심을 가질 수 있으므로 R 또는 S 이성체, 라세미체, 부분입체이성체 또는 이들의 혼합물로 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위에는 이들 각각의 이성체 및 이들의 혼합물이 포함된다.
본 발명에 따른 화합물의 약제학적으로 허용되는 염에는 알칼리금속과의 염, 바람직하게는 나트륨, 칼륨 또는 리튬과의 염, 특히 바람직하게는 리튬과 염을 언급할 수 있다.
우수한 항암효과를 나타내는 상기 화학식의 1의 화합물중에서도 바람직한 화합물은 R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 나프틸을 나타내고, R3은 수소를 나타내며, R4는를 나타내고, R5는 이소부틸, 메틸티오에틸 또는 벤질을 나타내며, R6는 수소 또는 메틸을 나타내고, R은 수소이며, m은 1 내지 4고, p는 0이며, n 은 1 내지 4인 화합물이다.
본발명에 따른 화학식 1 화합물의 대표적인 예는 하기에 나타낸 바와 같다.
1-1) 메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸티오-부티레이트
1-2) 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸티오-부티르산
1-3) 메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]-아세틸아미노}-4-메틸-펜타노에이트
1-4) 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아디노}-4-메틸-펜타노산
1-5) 메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]-아세틸아미노}-3-폐닐-프로피오네이트
1-6) 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]-아세틸아미노}-3-페닐-프로피온산
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 화합물을 용매중에서 염기 및 커플링제의 존재하에 하기 화학식 3의 화합물과 커플링시킴을 특징으로하여 제조할 수 있으며, 이러한 화학식 1의 화합물의 제조 방법도 또한 본 발명의 목적이다:
[화학식 2]
[화학식 3]
상기식에서
R1, R2, R3, R4, R, m, p 및 n 은 앞에서 정의한 바와 같다.
상기 반응에서, 용매로는 벤젠, 톨루엔, 크실렌과 같은 방향족 탄화수소류, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소류, 디에틸에테르, 디옥산, 1,2-디메록시에탄, 테트라하이드로푸란과 같은 에테르류, 아세톤, 메틸에틸케톤, 사이클로헥사논과 같은 케톤류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 같은 니트릴류, 메틸 아세테이트, 에틸 아세이트 등의 에스테르류, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 디메틸설폭사이드 등의 극성용매류 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 염기로는 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 트리에틸아민, N,N-디메틸아닐린, 트리부틸아민, N-메틸모폴린 등의 유기 염기중에서 선택된 1 종 이상을 사용할 수 있으며,커플링제로는 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디아미드(EDC) 등의 카르보디이미드류와 실리콘 테트라클로라이드 등의 무기탈수제 중에서 선택된 1 종 이상을 1-하이드록시벤조트리아졸과 혼합된 상태로 사용할 수 있다. 특히, 1-하이드록시벤조트리아졸은 상기 화학식 3 화합물의 키랄성(chirality)을 유지하기 위하여 필요하다. 반응은 -30 내지 70℃의 온도, 바람직하게는 -10 내지 30℃의 온도에서 10분 내지 24 시간동안 진행시킨다.
또한, 상기 반응에 따라 수득된 화합물이 에스테르 형태(R6가 저급알킬)인 경우, 추가로 알킬리금속의 수산화물과 같은 염기존재하에 가수분해시킴으로써 R6가 수소인 카복실산 화합물을 수득할 수 있다.
상기 커플링 반응에 따라 수득된 화합물이 R이 트리틸이고 p가 0인 화합물인 경우에는 생성물을 용매중에서 트리플루오로아세트산, 또는 HCl 기체 존재하에 가수분해시킴으로써 트리틸 보호기가 제거되어 R이 수소이고 p가 0인 화학식 1의 화합물이 수득된다. 이 반응에서, 용매로는 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로푸란, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 메탄올 및 에탄올중에서 선택된 1 종 이상을 사용할 수 있다.
한편, 상기 반응에서 사용된 화학식 3의 화합물은 문헌(참조: JACS Vol.106, 1095, 1984)에 기재된 방법에 따라 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 상기반응에서 출발물질로 사용된 화학식 2의 화합물중 P 가 0 이고 R 이 트리틸인 화합물은 하기 반응식 2의 방법에 따라 제조하여 사용할 수 있다.
[반응식 2]
상기식에서
R1, R2, m 및 n은 앞에서 정의한 바와 같고,
Tr은 트리틸을 나타내며,
BOC 는 t-부톡시카보닐을 나타내고, 이하 동일하다.
나머지 화학식2의 화합물도 상기 반응식 2에 도시한 것과 유사한 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 제조예 빛 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명이 범위가 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 에틸 2-[5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-3-(3-트리틸이미다졸-4-일-메틸)-이미다졸리딘-1-일]-아세테이트의 제조
단계 1: 1-시아노아미노메틸-나프탈렌의 제조
시안화나트륨 5g(0.1mol)의 물 20ml 용액에 암모늄클로라이드 5.9g(0.11mol)을 함유하는 수용액 28ml을 35℃에서 가한 다음, 이를 암모니아 수용액 13.4ml(0.2mol)을 혼합하였다. 혼합액을 교반해주면서 1-나프탈데히드 15.6g(0.1mol)을 에탄올 60ml에 용해시킨 용액을 가하고, 60℃에서 4시간 동안 교반 하였다. 반응액을 감압증류하여 에탄올을 제거한 다음, 에틸아세테이트를 가하고 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세첵해주었다. 유기용매를 감압증류하여 제거시켜 표제화합물 10g(수율 55%)을 수득하였다.
단계 2: 1-[1-(t-부록시카보닐아미노)-2-아미노]에틸-나프탈렌의 제조
상기 단계 1에서 수득한 화합물 5g(27.5 mmol)을 디옥산 50ml와 물 10ml의 혼합액에 녹인 후, 수산화나트륨 1.2g(30.3 mmol)을 함유하는 수용액 10ml를 0℃에서 가하였다. 여기에 디(t-부틸)디카보네이트 6.0g(27.5 mmol)을 가하고 1시간 동안 교반하였다. 반응액을 감압증류하여 용매를 제거한 다음, 물을 가하여 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기용매를 감압증류로 제거한 후, 잔류물 7.5g을 에탄올 100ml에 용해시켰다. 여기에 라니니겔 0.7g을 가하고 70psi의 수소 압력하에 3시간 동안 반응시켰다. 셀라이트로 여과하여 라니니켈을 제거한 다음 용매를 감압증류로 제거하여 표제화합물 6.7g(수율 86%)을 수득하였다.
단계 3: 1-(t-부록시카보닐)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-3H-이미다졸리딘의 제조
상기 단계 2에서 수득한 화합물 6.7g(21.5 mmol)을 디클로로메탄 100ml에 녹인 다음 0℃로 온도를 낮추었다. 여기에 디클로로메탄 20ml에 용해시킨 트리포스겐 2.5g(8.6mmol)을 적가하였다. 반응액을 상온에서 1시간 교반한 다음 용매를 감압증류로 제거하였다. 잔류물에 에틸아세테이트를 가하고 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세척해주었다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용출제: 에틸아세테이트/헥산= 1/1, v/v)를 수행하여 표제 화합물 5.1g(수율 76%)을 수득하였다.
단계 4: 1-(t-부록시카보닐)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-3-(3-트리틸이미다졸 -4-일-메틸)-이미다졸리딘의 제조
상기 단계 3에서 수득한 화합물 5.1g(16.3mmol) 및 (3-트리틸이미다졸-4-일메틸)클로라이드의 염산염 6.4g(17.9mmol)을 다이메틸포름아미드 30ml에 녹인 후, 수소화나트륨 0.86g(35.86mmol)을 가하고 1시간 동안 교반하였다. 디메틸포름아미드를 감압증류로 제거하고, 잔류물을 에틸아세테이트에 녹인 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세척해주었다. 유기용매를 감압증류한 다음, 에틸아세테이트를 용출제로 하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 표제화합물 7.3g (수율 71%)을 수득하였다.
단계 5: 5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-3-(3-트리틸이미다졸-4-일-메틸)-1H-이미다졸리딘의 제조
상기 단계 4에서 수득한 화합물 7.3g(11.5mmol)과 트리이소프로필실란 4.69ml(23mmol)를 디클로로메탄 50ml에 녹인 후 트리플루오로아세트산 10ml를 가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압증류하여 제거하고, 포화탄산칼륨 수용액으로 pH를 10으로 조절한 다음 에틸아세테이트 100㎖로 추출하였다. 유기 용매를 감압증류로 제거하고 진공하에 완전히 건조하였다. 유기용매를 감압증류하여 제거한 다음, 에틸아세테이트를 용출제로 하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 표제화합물 5.25g(수율 85%)을 수득하였다.
단계 6: 에틸 2-[5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-3-(3-트리틸이미다졸-4-일-메틸) -이미다졸리딘-1-일]-아세테이트의 제조
상기 단계 5에서 수득한 화합물 5.25g(9.83mmol) 및 에틸 브로모아세테이트 1.08ml(9.83mmol)를 다이메틸포름아마이드 30ml에 녹인 후, 수소화나트륨 0.24g(9.83mmol)을 가하고 24시간동안 교반하였다. 디메틸포름아미드를 감압증류로 제거하여 수득한 화합물을 에틸아세테이트에 녹인 후, 10% 구연산 수용액으로 세척해주었다. 에틸아세테이트를 감압증류로 제거하고 에틸아세테이트를 용출제로 하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 표제 화합물 4.99g(수율 82%)을 수득하였다.
실시예 1: 메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노-4-메틸니오-부티레이트(1-1)의 합성
단계 1: 메틸 2-{2-[3-(3-트리틸-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸티오-부티레이트의 합성
제조예 1에서 수득한 화합물 0.3g(0.48mmol)을 테트라하이드로푸란과 물의 3:1(v/v) 혼합액에 녹인 후, 수산화리튬 0.02g(0.48mmol)을 가하고 1시간동안 교반하였다. 진공하에서 감압증류하여 완전히 건조시킨 화합물을 디메틸포름아미드 10ml에 용해시켰다. 이 용액에 메티오닌 메틸에스테르 0.096g(0.48mmol), 1-하이드록시벤조트리아졸 0.072g(0.53 mmol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 0.102g(0.53mmol)을 가하고 상온에서 12시간동안 교반하였다. 디메틸포름아미드를 감압증류로 제거하고 에틸아세테이트 30ml를 가한 다음, 10% 구연산 수용액 (10ml × 2), 포화 탄산칼륨 수용액(10ml × 2) 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세척해주었다. 에틸아세테이트를 용출제로 하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 0.32g(수율 95%)를 수득하였다.
단계 2: 메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸티오-부티레이트의 합성
상기 단계 1에서 수득한 화합물 0.32g(0.43mmol)과 트리이소프로필실란 0.18ml(0.86mmol) 을 디클로로메탄 10㎖에 녹인 후 트리플루오로아세트산 10㎖을 가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 유기용매를 감압증류로 제거하고, 포화 탄산칼륨 수용액으로 pH를 10으로 조절한 다음 에틸아세테이트 30㎖로 추출하였다. 유기용매를 감압증류로 제거한 다음, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용출제: 메탄올/디클로로메탄= 1/20, v/v)를 실시하여 표제 화합물 0.203g(수율 95%)을 수득하였다.
실시예 2: 메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸티오-부티르산(1-2)의 합성
실시예 1에서 수득한 화합물 0.10g(0.20mmol)을 테트라하이드로푸란과 물의 3:1(v/v) 혼합액에 녹인 후, 수산화리튬 0.008g(0.20mmol)을 가하고 1시간동안 교반하였다. 진공하에 감압증류하여 완전히 건조시킴으로써 표제화합물 0.09g(수율 91%)을 수득하였다.
실시예 3: 메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸-펜타노에이드(1-3)의 합성
단계 1에서 메티오닌 메틸에스테르 대신에 루신 메틸에스테르 68mg(0.37mmol) 사용하는 점을 제외하고는 상기 실시예 1에서와 동일하게 수행하여 표제화합물 150mg(수율 85%)을 수득하였다.
실시예 4: 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아디노}-4-메틸-펜타노산(1-4)의 합성
실시예 3에서 수득한 화합물 150mg(0.31mmol)을 사용하는 점을 제외하고는상기 실시예 2에서와 동일하게 수행하여 표제화합물100mg(수율 69%)을 수득하였다.
실시예 5: 메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-3-페닐-프로피오네이트(1-5)의 합성
단계 1에서 메티오닌 메틸에스테르 대신에 페닐알라닌 메틸에스테르 78mg(0.36mmol) 사용하는 점을 제회하고는 상기 실시예 1에서와 동일하게 수행하여 표제화합물 160mg(수율 87%)을 수득하였다.
실시예 6: 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-3-페닐-프로피온산(1-6)의 합성
실시예 5에서 수득한 화합물 160mg(0.31mmol)을 사용하는 점을 제외하고는 상기 실시예 2에서와 동일하게 수행하여 표제화합물 120mg(수율 77%)을 수득하였다.
실험예 1: Ras 파네실 전이효소 억제능 분석
본 실험에서는 폼프리아노 등의 방법(Pompliano et al.,Biochemistry31.3800(1992))의 개선된 방법을 이용하였다. 즉, 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 Ras 파네실 전이효소를 사용하였으며, 기질로는 Ras-CVLS를 기보고된 방법(참조: Chung et al.,Bichimica et Biophysica Acta1129, 278, 1992)에 따라 정제하여 사용하였다.
효소 반응은 염화칼륨 25mM, 염화마그네슘 25mM, 디티티(DTT) 10mM. 및 염화아연 50μM을 함유하는 50㎕의 50mM 소듐히피스 완충용액중에서 수행하였으며, Ras 기질 단백질 1.5μM, 트리튬-파네실 피로 포스페이트 0.15μM 및 파테실 전이효소 4.5nM이 사용되었다. 파네실 전이효소를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응을 지속시킨 후 1M 염산을 함유한 에탄올 용액 1㎖를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 생성된 침전물을 필터바인딩을 위한 호퍼 하베스터(호퍼 #FH 225V)를 사용하여 GF/B 필터에 흡착시킨후, 에탄올을 사용하여 세척하고, 건조시킨 필터의 방사능을 LKB 베타카운터를 사용하여 측정하였다. 효소 역가검정은 Ras 기질 단백질과 파네실 효소의 농도가 정량적 역가관계를 나타내는 기질 불포화 상태에서 측정되었으며, 본 발명에 따라 합성된 화합물은 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켜 전체 반응액의 5% 이내로 첨가하여 효소 저해능을 평가하였다. 효소 저해능은 시험화합물이 없는 상태에서 Ras 기질 단백질에 도입된 파네실량에 대해 시험화합물 존재하에 측정된 파네실 도입량을 백분율로 표시하였으며, 50%의 효소활성을 저해하는 농도를 각 시험화합물의 IC50로 결정하였다. 시험화합물의 선택적 저해능을 평가하기 위한 제라닐제라닐 전이효소는 샤버 등의 방법(참조: Schaberet al. J. BiolChem., 265, 14701, 1990)을 변형하여 소뇌로부터 정제하여 사용하였으며, 파네실 전이효소 반응과 유사한 조건에서 제라닐제라닐 전이효소의 특이적 기질인 제라닐제라닐 피로 포스페이트와 Ras-CVIL 기질 단백질을 사용하여 실험을 수행하였다. 실험결과는 하기 표 1에 나타내었다.
실험예 2: 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제효능 분석
본 실험에서는 돌연 변이에 의해 형질전환 활성을 갖는 C-Harvey-Ras 단백질을 발현하는 Rat2 세포주를 사용하였으며, 실험은 드크루 등의 방법(참조: Declue. J. E. et al.,Cancer Research, 51, 712, 1991)을 변형시켜 다음과 같이 수행하였다.
형질전환된 Rat2 섬유아세포(fibroblast) 세포주를 60mm 세포배양 디쉬에 디쉬당 3×105세포의 밀도로 분주하여 37℃ 세포배양기에서 48시간동안 배양함으로써 50%이상 밀도로 성장시킨 후 시험화합물로 처리하였다. 이때 시험화합물의 용매로는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하였으며, 대조군 시험군 모두 디메틸설폭사이드 농도를 1%로 사용하였다. 시험화합물로 처리한 지 4시간이 경과한 후에 배지 1㎖ 당 150μCi의 방사성 동위원소[35S]로 표지 된 메티오닌을 첨가하고 20시간 동안 배양한 후 생리적 식염수로 세포를 세척하였다. 냉각된 세포 용해 완충용액(염화마그네슘 5mM, 디티티 1mM, NP40 1%, EDTA 1mM, PMSF 1mM, 루펩틴 25μM, 펩스타틴에이 25μM 및 안티페인 25μM을 포함하는 소듐히피스 완충용액 505mM) 1㎖를 가하여, 세포를 용해시킨 후, 세포가 용해되어있는 상등액을 고속원심분리(12,000g × 5분)에 의해 수득하였다. 상등액의 방사성 동이원소 표지량을 측정하여 면역침전 반응시 정량적 결과를 얻을수 있도록 표준화하였다. 그 후, 반응액에 Ras 단백질에 특이적 결합을 하는 단일클론항체, Y13-259(참조: Furth, M.E.et al., J. Virol., 43, 294, 1982)를 가하고 4℃에서 15시간동안 반응시킨다. 이 용액에 다시 고트에서 유래된 쥐의 면역글로블린에 대한 항체가 결합된 Protein A-아가로즈 현탁액을 가하여 1시간동안 4℃에서 반응시킨 후 면역반응 침전물로부터 비특이적 결합물을 제거하기 위해 완충용액(염화나트륨 50mM, 소듐 디옥시콜레이트 0.5%, NP40 0.5% 및 SDS 0.1%를 포함하는 트리스 클로라이드 50mM 완충용액)으로 세척하였다. 전기영동 방법을 사용하여 침전물을 분석하기 위해, 침전물을 전기영동 시료 완충액에 끓인 후 13.5%의 SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 사용아혀 전기영동을 수행하였다. 전기영동후 겔을 고정시키고 건조시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 현상인화하였다. 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제효능은 Ras 단백질의 파네실이 결합된 밴드와 결합되지 않은 밴드의 강도를 측정하여 파네실 결합이 50% 저해된 시험화합물의 농도(IC50)로 나타내었다. 하기 표 1에는 본 발명에 따른 대표적인 화합물의 억제효능을 나타내었다. 여기서 IC50은 실험예 1을 수행한 결과 얻어진 데이터이고 CIC50은 실험예 2를 수행한 결과 얻어진 데이터이다. 또한 하기 표 1에서 ND는 측정할 수 없는 경우를 의미한다.
[표 1]

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1의 사이클릭우레아 유도체, 약제학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체;
    화학식 I
    상기 식에서,
    R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 나프틸을 나타내고,
    R3및 R4는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 페닐, 또는(여기에서, R5는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-C4알킬티오C1-C4알킬 또는 페닐에 의해 치환되거나 비치환된 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타내며, R6은 수소 또는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타낸다)을 나타내며,
    R 은 수소, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2-C4알케닐 또는 페닐을 나타내고,
    m 은 1 내지 4의 정수이며,
    p 는 0 내지 4의 정수이고,
    n 은 1내지 5의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서, R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 나프틸을 나타내고, R3은 수소를 나타내고, R4는를 나타내고, R5는 이소부틸, 메틸티오에틸 또는 벤질을 나타내며, R6는 수소 또는 메틸을 나타내고, R 은 수소이며, m 은 1 내지 4고, p는 0 이며, n은 1 내지 4인 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸티오-부티레이트;
    2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸티오-부티르산;
    메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]-아세틸아미노}-4-메틸-펜타노에이트;
    2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-4-메틸-펜타노산;
    메틸 2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-3-페닐-프로피오네이트; 또는
    2-{2-[3-(3H-이미다졸-4-일-메틸)-5-(나프탈렌-1-일)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일]아세틸아미노}-3-페닐-프로피온산인 화합물.
  4. 하기 화학식 2의 화합물을 하기 화학식 3의 화합물과 커플링시킴을 특징으로 하여 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법:
    화학식 2
    화학식 3
    화학식 1
    상기 식에서,
    R1, R2, R3, R4, R, m, p 및 n은 제 1 항에서 정의한 바와 같다.
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