KR100232636B1

KR100232636B1 - 항암 효과를 갖는 파네실 전이효소 저해제

Info

Publication number: KR100232636B1
Application number: KR1019990013967A
Authority: KR
Inventors: 이현일; 박지효; 정원희; 윤흥식; 오영수; 정현호; 문경덕; 유정권; 김미정; 노성구; 백선관
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1997-03-06
Filing date: 1999-04-20
Publication date: 2000-03-15
Also published as: KR100232637B1; KR19980072611A; KR100225460B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3 으로 표시되는 새로운 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염, 그리고 그들의 제조방법에 관한 것이다.

(상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3 에서 R₁, R₂및 R₃는 명세서에 정의한 바와 같다.)

상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3 의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염은 파네실 전이효소를 억제하는 작용을 하므로 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암 효과를 갖는 파네실 전이효소 저해제{Farnesyl transferase inhibitor having anti-tumor properties}

본 발명은 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3 의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 그들의 제조방법 및 그들의 파네실 전이효소 저해제로서의 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 파네실 전이효소를 저해하는 작용을 하는 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3 의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 그들의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 화합물은 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

파네실 전이효소는 Ras 단백질에 파네실기를 전이하는 효소로서 본 발명의 화합물은 파네실 전이효소의 작용을 억제함으로써 Ras 단백질의 작용을 억제한다.

Ras 단백질은 세포가 성장하고 분화하는데 중요한 역할을 하는 21 kDa 크기의 단백질로서, 구아닌 뉴클레오타이드와 결합하며, 구아노신 트리포스페이트 (GTP)를 구아노신 다이 포스페이트(GDP)로 가수분해하거나 GDP 를 GTP 로 인산화하는 작용을 한다. GTP 는 G 단백질을 활성화시키고 GDP 는 G 단백질을 억제하므로 Ras 단백질은 G 단백질에 의한 세포신호전달계를 조절하는 분자 스위치로 작용한다 (Bourne, H. R, Sanders, D. A, McCormick, F., Nature, 1991, 349, 117).

Ras 단백질은 포유동물 세포에서 3가지 ras 유전자로부터 생성되며 아미노산 188개로 이루어진 K-Ras-4B 단백질 또는 아미노산 189개로 이루어진 H-Ras, K-Ras4A 및 N-Ras 단백질이 있다. 이들 단백질에서 12, 13 및 61 번에 위치하는 아미노산들은 GTP의 인산기와 근접하여 있어 이들 아미노산 잔기들이 GTP 가 가수분해되는 과정에 관여하는 물 분자의 공간적 위치에 영향을 주므로 Ras 단백질의 GTPase 효소 활성에 중요한 작용을 한다. 구체적으로 인체에서 발생하는 몇몇 암 세포는 상기 아미노산 위치에서 돌연변이가 생긴 것이 관찰되는데, 이 돌연변이로 인해 Ras 단백질 고유의 GTPase 효소 활성이 저해되면 GTP 결합상태가 지속되어 비정상적인 성장 신호가 지속적으로 전달되게 되며, 이러한 신호 전달체계의 이상으로 발암성이 유발되는 것으로 보고되었다. 실제로 이들 발암성을 갖는 ras 유전자는 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암 등과 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Bos, J. L., Cancer Res., 49, 4682, 1989).

Ras 단백질이 생물학적 활성을 나타내기 위해서는 세포막에 부착되어야 하며, Ras 단백질이 세포막에 부착되기 위해서는, 우선 세포막 내의 지질층과 용이하게 결합할 수 있어야 한다. Ras 단백질은 여러 단계의 결합을 거쳐 소수화 (hydrophobic)되는데, 이러한 과정을 구체적으로 언급하자면, 파네실화에 관여하는 Ras 파네실 전이효소 (Farnesyltransferase)에 의한 과정, Ras 단백질 카복시 말단에 존재하는 3개 아미노산으로 구성된 AAX 펩타이드 절단효소에 의한 과정, 메칠 전이효소 및 팔미토일 전이효소에 의한 과정 등이 있으며, 이러한 과정에 의하여 Ras 단백질의 카복시 말단이 변형된다. 상기 과정 중 첫 번째인 파네실화는 파네닐 전이효소에 의해 이루어지는데, 이 과정에서는 Ras 단백질의 카복시 말단에 존재하는 CA1A2X 라는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드가 기질로서 이용된다. 여기서 A1 및 A2 는 전기적 부하를 띄지 않는 지방족 아미노산이고 X 는 메티오닌, 알라닌 및 세린 등이다. 이러한 파네실화 반응은 시스테인 부위에서 일어나 황에테르 결합을 형성하는데, 특히 H-Ras 와 N-Ras 단백질의 경우는 그의 카복시 말단 근처에 존재하는 또 다른 시스테인의 팔미토일화도 일어난다. 이러한 파네실화의 결과로 Ras 단백질은 소수성이 증가되어 세포막 내에 부착될 수 있게 되는 것으로서, 파네실화된 Ras 단백질은 다시 그의 카복시 말단의 3개 아미노산 AAX 의 펩타이드가 절단효소에 의해 제거되면서 메틸화되어, Ras 단백질의 파네실기가 세포막 내의 지질층 또는 다른 수용체와 용이하게 결합되게 한다고 알려져 있다. 실제로 Ras 단백질이 세포막 내에 최적의 조건으로 부착되기 위해서는 상기의 모든 변형 단계가 필요하지만 Ras 단백질이 활성을 나타내는데는 파네실화 자체만으로 충분하다고 보고되어 있다. 따라서, 상기 파네실화 과정을 차단하면 돌연변이로 인해 유발되는 Ras 단백질의 발암성을 효과적으로 저해할 수 있으므로 파네실화를 저해하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Buss, J. E. et al., Chemistry & Biology, 2, 787, 1995).

그간의 연구 결과, 파네실 전이효소를 저해했을 때 Ras 단백질로 형질전환된 세포성장이 저해될 뿐만 아니라 Ras 단백질에 의해 변형된 세포 형질이 개선되는 것이 관찰되었으며, 실제로 파네실 전이효소의 몇몇 저해제들은 발암성 Ras 단백질의 세포내 프레닐기에 의한 반응을 선택적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다 [Kokl, N. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9141 (1994); Kokl, N. E. et al., Nature Medicine, 1:792 (1995)].

두 개의 기질인 파네실기와 Ras 단백질을 결합하여 반응물을 생성하는 파네실 전이효소의 저해제는 크게 세가지로 나눌 수 있다. 먼저 파네실기 (FPP)를 경쟁적으로 저해할 수 있는 화합물, 둘째로는 Ras 단백질의 C-말단의 작용을 저해하는 화합물, 그리고 파네실 전이효소가 두 기질을 사용하는 촉매반응의 활성화 단계를 모사하는 안정한 화합물을 저해제로 응용하는 것이다.

지금까지 연구된 대부분의 저해제는 Ras 단백질의 C-말단에 있는 프레닐기의 도입반응을 매개하는 CAAX 모티브에 연관된 것들로서, 파네실 전이효소의 Ras 단백질 기질에 대한 경쟁적 저해기전을 응용한 것이다. 예로서 콕 (Kokl, N. E.) 등은 CAAX를 모사한 시스테인 티올 (thiol)기를 함유한 펩타이드 변형체 및 이를 개선한 저해제를 연구하였으며 [미국 특허 5,141,851; Kokl, N. E. et al., Science 260:1934 (1993); PCT/US95/12224, Graham et al], 셉티 (Sebti S. M.) 등은 펩타이드의 골격구조를 페닐기로 변형한 파네실 전이효소 저해제를 연구하였다 [Sebti S. M. et al., J. Biol. Chem. 270:26802(1995)]. 또한 향정신성 의약품 골격구조 중 벤조다이아제핀을 펩타이드의 턴 (turn) 모사구조로 활용한 변형체가 보고된 바 있으며 [James, G. L. et al., Science 260:1937(1993)], 펩타이드 구조에서 벗어난 트리사이클린 유기화합물을 골격으로 한 저해제가 연구되었다 [Bishop W. R. et al., J. Biol. Chem. 270:30611(1995)].

한편 파네실 전이효소의 촉매반응 단계를 모사하는 저해제의 연구는 풀터 (Poulter C. D.) 등이 파네실 전이효소가 프레닐기를 전이하는 작용기전이 전자 친화적 치환반응 (Electriphilic Displacement)임을 제시한 후 [Poulter, C. D. et al., Poc. Natl. Acad. Sci. USA], 반응이 전이 상태 (transition state)에서 양성 부하를 요구하는 것에 착안하여 프레닐기에 전이 상태의 양성 부하를 연결시킨 새로운 형태의 저해제를 연구하였다 [Poulter C. D. et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8761(1996)]. 상기한 트랜지션 상태를 모사한 저해제는 효소저해능 및 선택성이 개선되지 못한 화합물임이 밝혀졌다.

이에 본 발명자들은 풀터 (Poulter C. D.) 등에 의해 제시된 트랜지션 상태의 양성 부하의 결합양상을 모델화하여 생리적 상태에서 양성 부하를 가질 수 있는 질소 원자를 함유한 헤테로사이클 (heterocycle) 화합물인 이미다졸 (imidazole)을 이용하여, 티올 (thiol)을 함유한 시스테인을 대체하고, CAAX 모티브의 친소성 AAX 펩타이드 구조를 비펩타이드성 사이클릭 우레아 방향족 유기화합물로 치환한 트랜지션 상태를 모사한 파네실 전이효소 저해제를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 파네실 전이효소를 저해하는 작용을 하는 신규의 화합물, 그의 제조방법 및 항암제로서의 용도를 제공함을 목적으로 한다.

본 발명에서는 파네실 전이효소를 억제함으로써 항암효과를 갖는 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3 의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다.

화학식 1

화학식 2

화학식 3

상기식에서 R₁은 방향족, 저급 알킬이 치환된 방향족, 질소 및 황 원자가 포함된 방향족, 방향족이 치환된 저급 알킬 중에 선택되거나, 화학식 4 로 표시되는 작용화된 아실이다.

상기 화학식 4 에서 X 는 방향족, 저급 알킬이 치환된 방향족, 질소 및 황 원자가 포함된 방향족, 방향족이 치환된 저급 알킬 중에 선택된다.

R₂는 아미노산의 잔기, 저급 알킬, 질소 및 산소를 포함하는 저급 알킬, 방향족이 치환된 저급 알킬, 방향족, 저급 알킬이 치환된 방향족 중에 선택된다.

R₃는 하기 화학식 5로 표시된다.

상기 화학식 5 에서 A 는 할로겐, CN, NO₂, COOH, 아미드, 티오아미드, SR 및 저급 알킬이 치환된 방향족이거나, 할로겐, CN, NO₂, COOH 아미드, 티오아미드, SR 및 저급 알킬이 치환된 질소 및 황 원자가 고리에 포함된 방향족이거나 그러한 방향족이 치환된 저급 알킬 중에서 선택이 되는데, 여기서 R 은 저급 알킬을 의미한다. B, C, D 및 E 는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 또는 저급 알킬 중에서 선택되며, n 은 0 내지 4 중에서 선택된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '저급 알킬'은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸 및 t-부틸을 포함하는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄알킬을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '질소 및 황 원자가 포함된 방향족'은 모노 또는 디사이클릭 방향족으로 한 개 내지 두 개의 질소 또는 황 원자가 방향족환 안에 포함되어 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 아미노산에 관한 약어들은 아미노산 및 펩타이드에 대한 생화학적 명명법에 관한 IUPAC-IUB 합동회의에 따른 것이다 [Eur. J. Biochem. 1984, 158, 9-31].

본 발명의 화합물들은 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으며, 라세미체, 라세미화합물, 부분 입체 이성체 혼합물 및 개개부분 입체 이성체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성체 형태는 본 발명에 포함된다.

본 발명의 대표적인 화합물 중에는 다음과 같은 물질들이 있다.

1) 4-[5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴

2) 4-{5-[5S-이소부틸-3-(2-나프탈렌-1-카르보닐)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸]-이미다졸-1-일메틸}-벤조니트릴

3) 4-[5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일메틸-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴

4) 4-[5-(5S-이소부틸-3-(나프탈렌-1-일-아세틸)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴

5) 1-(4-시아노페닐메틸)-2-[5S-이소부틸-3-(나프탈렌-1-일-아세틸)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸]-피페라진

6)4-[5-(5S-부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴

7) 1-(4-시아노페닐메틸)-2-[5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸]-피페라진

8) 1-(4-바이페닐메틸)-5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸

9) 1-(4-에틴닐페닐메틸)-5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸

10)4-[5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2,4-디옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴

11) 4-[5-(2S-이소부틸-4-나프탈렌-1-일-3,6-디옥소-피페라진-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴

본 발명의 화합물의 제조방법은 다음과 같은 단계로 요약될 수 있다.

1) 적절한 보호기를 포함하는 아미노산과 적절한 아민을 아미드 커플링 하는 단계 (1 단계),

2) 상기 1 단계에서 제조한 화합물을 탈 보호기 반응시킨 후, 환원하는 단계 (2 단계),

3) 상기 2 단계에서 제조한 화합물을 고리화하는 단계 (3 단계) 및

4) 상기 3 단계에서 제조한 화합물을 적절한 치환기를 포함하는 화합물과 치환 반응시켜 원하는 치환기를 도입하는 단계 (4 단계).

보다 상세하게는, 본 발명의 화합물은 반응식 1 에서 반응식 2 까지 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

상기 반응식 1은 본 발명의 제조방법의 최종 치환반응에 사용되는 이미다졸 유도체를 제조하는 방법을 나타낸 것으로, 하이드록시메틸 이미다졸 하이드로클로라이드로부터 착보호기 반응, 아세틸화 반응, 염화반응, 탈보호기 반응 및 할로겐화 반응을 통하여 제조된다. 이는 후술하는 제조예에 의하여 상세히 설명하기로 한다.

반응식 2는 BOC-L-Leucine 으로부터 아미드 커플링, 탈 보호기 반응, 환원반응, 고리화 반응 및 치환반응을 거쳐 최종화합물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다. 상기 과정에서 사용될 수 있는 공지의 커플링 시약에는 이소부틸 클로로포르메이트, 디사이클로 헥실 카보디이미드 (DCC), 3-에틸-3'-(디메틸아미노)-프로필 카보디이미드 (EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산 클로라이드(BOP-C1), 디페닐 포스포릴 아지드 (DPPA) 등이 포함될 수 있다. 단 이들로 제한되는 것은 아니다.

이하 실시예에 의하여 본 발명의 신규 화합물의 제조방법을 상세히 설명하기로 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 실시예에 앞서 본 발명의 화합물을 제조하는데 사용되는 물질의 제조방법을 제조예에 의하여 설명한다.

<제조예> 1-(4-시아노벤질)-5-클로로메틸이미다졸의 제조

(단계 1) 1-트리틸-4-히드록시메틸이미다졸의 제조

히드록시메틸 이미다졸 하이드로클로라이드 3.99 g (29.6 mmol)을 30 mL 의 디메틸포름아미드와 10 mL 의 트리메틸아민에 녹인 후, 9.35 g (33.5 mmol) 트리페닐메틸의 클로라이드의 디메틸포름아미드 (110 mL) 용액을 서서히 가하였다. 2시간 후에 500 mL 의 얼음물을 가한 다음, 생성된 고체를 얻었다. 이 고체를 디옥산으로 재결정하여 표제 화합물 8.82 g (수율 87%)을 얻었다.

mp 227 - 229℃.

(단계 2) 1-트리틸이미다졸-4-일메틸 아세테이트의 제조

피리딘 100 mL 에 상기 제조예의 (단계 1)에서 제조한 화합물 5.00 g (14.7 mmol)을 넣어준 뒤, 아세틱 언하이드라이드 1.65 g (16.2 mmol)을 가한 다음 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 감압증류하여 피리딘을 제거하고 200 mL 의 에틸아세테이트에 녹인 다음, 100 mL 의 소금물로 씻어주었다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 디클로로메탄/메탄올로 크로마토그래피를 실시하여 표제 화합물 5.22 g (13.7 mmol, 수율 93%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 2.01 (3H, s), 4.95 (2H, s), 6.88 (1H, s), 7.08 (5H, s), 7.27 (10H, s), 7.45 (1H, s).

(단계 3) 1-트리틸-3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸 아세테이트의 브롬화염의 제조

상기 (단계 2)에서 제조한 화합물 5.00 g (13.1 mmol)을 디클로로메탄 20 mL 에 녹인 후, 4-시아노벤질브로마이드 2.82 g (14.4 mmol)을 가하여 상온에서 60시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압증류하여 제거하고, 디클로로메탄/메탄올로 크로마토그래피를 실시하여 표제 화합물 5.31 g (9.17 mmol, 수율 70%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃+ CD₃OD) δ 1.95 (3H, s), 4.95 (2H, s), 5.45 (2H, s), 7.11-7.40 (18H, m), 7.65 (2H, d), 8.21 (1H, s).

(단계 4) 1-(4-시아노벤질)이미다졸-5-일메틸 아세테이트의 제조

상기 (단계 3)에서 제조한 화합물 9.10 g (15.7mmol)을 디클로로메탄 500 mL 에 녹인 후, 0℃ 에서 트리플로로 아세트산 6.06 mL (78.7 mmol)과 트리에틸실란 12.5 mL (78.7 mmol)을 서서히 가한 다음 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고, 탄산칼륨 (K₂CO₃) 포화용액으로 pH 를 10으로 맞춘 다음 300 mL 의 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 에틸아세테이트로 크로마토그래피를 실시하여 표제화합물 3.60 g (14.1 mmol, 수율 90%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 1.90(3H, s), 4.97 (2H, s), 5.25 (2H, s), 7.14 (2H, d), 7.21 (1H, d), 7.67 (1H, s), 7.75 (2H, d).

(단계 5) 1-(4-시아노벤질)-5-히드록시메틸이미다졸의 제조

상기 (단계 4)에서 제조한 화합물 4.20 g (16.5 mmol)을 메탄올 200 mL 에 녹인 후, 탄산칼륨 4.50 g (32.9 mmol)을 가한 다음 상온에서 20분 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 300 mL의 에틸아세테이트로 추출한 다음, 디클로로메탄/메탄올로 크로마토그래피를 실시하여 표제 화합물 3.19 g (15.0 mmol, 수율 91%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃+ CD₃OD) δ 4.28 (2H, s), 5.18 (2H, s), 6.84 (1H, s), 7.12 (2H, d), 7.42 (1H, s), 7.55 (2H, d).

(단계 6) 1-(4-시아노벤질)-5-클로로메틸이미다졸의 제조

상기 (단계 5)에서 제조한 화합물 3.00 g (14.1 mmol)을 클로로포름 40 mL 에 녹인 후, 0℃ 에서 티오닐클로라이드 5.02 mL (70.5 mmol)을 서서히 가한 다음 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 50 mL 의 에틸아세테이트에 녹인 후, 탄산수소나트륨 (NaHCO₃) 포화용액으로 씻어준 다음 유기 용매를 감압 증류하여 표제 화합물 2.91 g (12.5 mmol, 수율 89%)을 얻었다. 이 화합물은 정제하지 않고 바로 후술하는 실시예 1의 (단계 4)에 사용하였다.

<실시예1> 4-[5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴의 제조

(단계 1) t-부톡시카르보닐-L-루시노일-1-나프틸아민의 제조

t-부톡시카르보닐-L-루이신 11 g (50 mmole)을 200 ml 디클로로메탄에 녹인 후 -20℃ 로 온도를 낮춘 다음, N-메틸모폴린 5.6 g (55 mmole)을 가하고, 이소부틸클로로포르메이트 7.5 g (55 mmole)을 천천히 가하였다. 20분 후에 1-나프틸아민 7.2 g (50 mmole)을 50 ml 의 디클로로메탄에 녹여 가한 다음, 상온으로 온도를 올리고 5시간 동안 교반하였다. NaHCO₃포화용액 200 ml 를 가하여 반응을 종결시킨 후, 300 ml 의 디클로로메탄으로 추출한 다음 용매를 감압 증류하여 갈색 고체를 얻었다. 이 고체를 10% 에틸아세테이트/헥산으로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 표제화합물 15.6 g (45 mmole, 수율 90%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.95-1.02 (m, 6H), 1.51 (s, 9H), 1.59-1.63 (m, 1H), 1.75-1.92 (m, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.95 (m, 1H), 8.01 (d, 1H), 8.41-8.50 (m, 4H), 8.65 (d, 1H), 8.82 (d, 1H), 8.90 (br, 1H)

(단계 2) 3S-아미노-1-(1-나프틸)아미노-4-메틸펜탄의 제조

상기 실시예 1의 (단계 1)에서 제조한 화합물 15.6 g (45 mmole)을 100 ml 디클로로메탄에 녹인 후, 상온에서 트리플루오르아세트산 30 ml 를 가하였다. 30분 후에 용매를 감압 증류하여 제거하고, 에틸아세테이트 300 ml 에 녹인 다음 100 ml 의 탄산칼륨 (K₂CO₃) 포화용액으로 씻은 후 용매를 감압 증류하여 아민 11 g (43 mmole, 수율 96%)을 얻었다.

이 아민을 무수 테트라히드로퓨란 200 ml 에 녹인 다음 온도를 0℃ 로 낮춘 후, 2M 농도의 보란디메틸 설파이드 43 ml 를 가하고 2시간 동안 환류하였다. 상온으로 식힌 후 6N 농도의 염산 10 ml 를 가해 반응을 종결시킨 다음 용매를 감압 증류하여 제거하고, 탄산칼륨 포화용액으로 pH 를 11 로 맞추었다. 에틸아세테이트 300 ml 로 추출한 다음 용매를 감압 증류하여 제거하고, 에틸아세테이트로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 표제화합물 6.7 g (28 mmole, 수율 65%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.75-0.88 (m, 6H), 2.38-2.65 (m, 3H), 2.95-3.38 (m, 1H), 3.25-3.40 (m, 2H), 6.65 (d, 1H), 7.35-7.58 (m, 5H), 7.85 (d, 1H), 7.95 (d, 1H)

(단계 3) 4S-이소부틸-1-나프탈렌-1-일-이미다졸리딘-2-온의 제조

상기 실시예 1의 (단계 2)에서 제조한 화합물 2.4 g (10 mmole)과 디페닐카보네이트 2.6 g 을 110℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 70% 에틸아세테이트/헥산으로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 표제화합물 2.57 g (9.6 mmole, 수율 96%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.80-0.95 (m, 6H), 2.48-2.51 (m, 1H), 2.60-2.69 (m, 2H), 3.45-3.49 (m, 1H), 3.91-4.40 (m, 2H), 5.50 (br, 1H), 7.35-7.51 (m, 4H), 7.76 (d, 1H), 7.82 (d, 1H), 7.91 (d, 1H)

(단계 4) 4[5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴의 제조

상기 실시예 1의 (단계 3)에서 제조한 화합물 2.57 g (9.6 mmole)과 제조예의 표제 화합물 2.56 g (9.6 mmole)을 10 ml 의 디메틸포름아미드에 녹이고 60% 소디움하이드라이드 0.8 g (20 mmole)을 0℃ 에서 가하였다. 3시간 후에 디메틸포름아미드를 감압 증류하여 제거하고 100 ml 의 에틸아세테이트에 녹인 다음 20 ml 의 소금물로 씻어 주었다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고, 에틸아세테이트로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 표제화합물 3.55 g (7.68 mmole, 수율 80%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.89-0.99 (m, 6H), 1.40-1.65 (m, 3H), 3.31 (t, 1H), 3.62-3.77 (m, 2H), 5.21-5.34 (m, 2H), 7.12-7.85 (m, 15H)

FAB MS : 464 (M+1)

<실시예2> 4-{5-[5S-이소부틸-3-(2-나프탈렌-1-카르보닐)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸]-이미다졸-1-일메틸}-벤조니트릴의 제조

실시예 1과 유사한 방법으로 반응을 실시하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.75-0.92(m, 6H), 1.25-1.50(m, 3H), 3.55-4.05(m, 3H), 4.51(d. 1H), 4.75(d, 1H), 5.10-5.15(m, 2H), 7.05-7.95(m, 13H)

FAB MS : 492 (M+1)

<실시예 3> 4-[5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일메틸-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.82(m, 6H), 1.21(m, 2H), 1.78(m, 1H), 2.54(m, 1H), 2.88 (m, 1H), 3.21(m, 1H), 4.13(d, 1H), 4.55(m, 2H), 4.88(d, 1H), 5.23(d, 1H), 5.26(d, 1H), 7.05-7.85(m, 13H)

FAB MS : 478 (M+1)

<실시예 4> 4-[5-(5S-이소부틸-3-(나프탈렌-1-일-아세틸)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.77-0.92(m, 6H), 1.25-1.51(m, 3H), 3.36-3.40(m, 2H), 3.50-3.58(m, 1H), 4.59-4.70(m, 4H), 5.12-5.19(m, 2H), 6.96-7.95(m, 13H)

FAB MS : 506 (M+1)

<실시예 5> 1-(4-시아노페닐메틸)-2-[5S-이소부틸-3-(나프탈렌-1-일-아세틸)-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸]-피페라진의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.78-0.90(m, 6H), 1.15-1.45(m, 3H), 2.30-2.59(m, 4H), 2.74-3.10(m, 5H), 3.35-3.50(m, 3H), 3.75-3.85(m, 3H), 3.90-4.02(m, 2H), 7.35-8.00(m, 11H)

FAB MS : 524 (M+1)

<실시예 6> 4-[5-(5S-부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.80-1.00(m, 3H), 1.15-1.50(m, 6H), 3.45-3.70(m, 4H), 4.20-4.30(m, 1H), 5.20-5.31(m, 2H), 7.05-7.90(m, 13H)

FAB MS : 464 (M+1)

<실시예 7> 1-(4-시아노페닐메틸)-2-[5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸]-피페라진의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.94(m, 6H), 1.20(m, 2H), 1.72(m, 1H), 2.32-2.92(m, 9H), 3.21(m, 1H), 3.45(m, 2H), 3.67(m, 2H), 7.12-7.88(m, 11H)

FAB MS : 497 (M+1)

<실시예 8> 1-(4-바이페닐메틸)-5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.98(m, 6H), 1.43(m, 2H), 1.85(m, 1H), 3.34(m, 1H), 3.68 (m, 2H), 4.32(d, 1H), 4.88(d, 1H), 5.42(d, 1H), 5.49(d, 1H), 7.13-7.95(m, 13H)

FAB MS : 515 (M+1)

<실시예 9> 1-(4-에틴닐페닐메틸)-5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2-옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.91(m, 6H), 1.51(m, 2H), 1.78(m, 1H), 3.11(s, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.67(m, 2H), 4.22(d, 1H), 4.77(d, 1H), 5.25(d, 1H), 5.37(d, 1H), 7.05-7.92(m, 13H)

FAB MS : 463 (M+1)

<실시예 10> 4-[5-(5S-이소부틸-3-나프탈렌-1-일-2,4-디옥소-이미다졸리딘-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.95-1.02(m, 6H), 1.59-2.10(m, 3H), 4.45-4.52(m, 1H), 4.66-4.73(m, 1H), 5.45-5.65(m, 3H), 7.10-8.02(m, 13H)

FAB MS : 478 (M+1)

<실시예 11> 4-[5-(2S-이소부틸-4-나프탈렌-1-일-3,6-디옥소-피페라진-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴의 제조

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.96-1.05(m, 6H), 1.65-2.15(m, 3H), 4.22-4.30(m, 2H), 4.50-4.55(m, 1H), 4.69-4.79(m, 1H), 5.50-5.65(m, 3H), 7.10-8.05(m, 13H)

FAB MS : 492 (M+1)

Ras 파네실 전이효소 억제능 분석 실험

본 실험에서는 폼프리아노 [Pompliano et al., Biochemistry 31. 3800 (1992)] 등의 방법을 개선하여 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 Ras 파네실 전이효소를 사용하였으며, Ras 기질 (Ras-CVLS) 단백질은 이미 보고된 방법 [Chung et al., Bichimica et Biophysica Acta 1129, 278(1992)]에 의해 정제하여 사용하였다.

효소반응은 25 mmol 의 포타슘 클로라이드, 25 mmol 의 마그네슘 클로라이드, 10 mmol DTT 및 50 μmol 의 징크 클로라이드를 함유한 50㎕ 의 50 mM 소디움 히피스 완충용액에서 수행하였으며 1.5 μmol 의 Ras 기질 단백질, 0.15 μmol 의 트리튬-파네실 피로 포스페이트와 4.5 nmol 의 파네실 전이효소가 사용되었다.

상세히 기술하면 파네실 전이효소를 첨가한 후 37℃ 에서 30분간 반응을 지속시킨 후 1 M 의 염산을 함유한 에탄올 용액 1 ml 를 첨가하여 반응을 정지시키고, 생성된 침전물을 필터바인딩을 위한 호퍼 하베스터 (호퍼 #FH 225V)를 사용하여 GF/B 필터에 흡착시킨 후, 에탄올을 사용하여 세척하고, 건조시킨 필터를 LKB 베타 카운터를 사용, 방사능을 측정함으로 수행하였다. 효소 역가검정은 Ras 기질 단백질과 파네실 효소의 농도가 정량적 역가를 나타내는 기질 불포화 상태에서 측정되었으며, 합성된 화합물은 디메틸설폭사이드 (DMSO) 용매에 용해하여 전체 반응액의 5% 이내에서 첨가하여 효소 저해능을 평가하였다. 효소 저해능은 시료가 없는 상태에서 Ras 기질 단백질에 도입된 파네실에 대해 시료 존재하에서 측정된 파네실 도입량을 백분율로 표시하였으며, 50% 의 효소활성을 저해하는 농도를 각 시료의 IC₅₀으로 결정하였다. 시료의 선택적 저해능을 평가하기 위한 제라닐제라닐 전이효소는, 샤버 등 [Schaber et al., J. Biol chem. 265:14701(1990)]의 방법을 변형하여 소뇌로부터 정제하여 사용하였으며, 파네실 전이효소 반응과 유사한 조건에서 제라닐제라닐 전이효소의 특이 기질인 제라닐제라닐 피로 포스페이트와 Ras-CVIL 기질 단백질을 사용하여 실험을 수행하였다.

세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제효능 분석 실험

본 실험에서는 돌연변이에 의해 형질전환 활성을 갖는 C-Harvey-Ras 단백질을 발현하는 Rat2 세포주를 사용하였으며, 실험방법은 드크류 등 [Declue J. E. et. al., Cancer Research 51:712 (1991)]에 의해 보고된 방법을 변형하여 수행하였다. 하기에 실험 방법을 상세히 기술하기로 한다.

형질전환된 Rat2 피브로 블라스트 세포주를 60 mm 세포배양 디쉬에 3×10⁵세포를 분주하여 37℃ 세포 배양기에서 48시간 동안 배양하여 50% 이상 밀도로 자란 후 시료를 처리하였다. 이 때 시료용매는 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 사용하였으며, 대조군 및 시험군 모두 1% 디메틸설폭사이드 농도를 사용하였다. 시료를 처리한 뒤 4시간 후에 배지 1 ml 당 150 μCi 방사성 동위원소 [35S]로 표지된 메치오닌을 첨가하고 20시간 동안 배양한 후 생리 식염수로 세포를 세척하였다. 세포 용해를 위해 1 ml 의 차가운 세포용해 완충용액 (5mmol 마그네슘 클로라이드, 1mmol DTT, 1% NP 40, 1 mmol EDTA, 1 mmol PMSF, 2 μmol 루펩틴, 2 μmol 펩스타틴에이 및 2 μmol 안티페인을 포함하는 50 mM 소디움 히피스 완충용액)을 사용하여, 세포가 용해된 상등액을 고속원심분리 (12,000g×5분)하여 얻었다. 상등액의 방사성 동위원소 표지량을 측정하여 면역 침전 반응시 정량적 결과를 얻을 수 있도록 표준화한 후 Ras 단백질에 특이적 결합을 하는 단일클론 항체인 Y13-259 [Furth, M. E. et. al., J. Virol 43:294 (1982)]를 넣어 4℃ 에서 15시간 동안 반응시켰다. 이 용액에 다시 고트에서 유래된 쥐의 면역글로블린에 대한 항체가 결합된 프로테인 A-아가로즈 현탁액을 넣어 1시간 동안 4℃ 에서 반응시킨 후 면역반응 침전물을 비특이적 결합물을 제거하기 위해 완충용액 (50mmol 소디움 클로라이드, 0.5% 소디움 디옥시 콜레이트, 0.5% NP 40 및 0.1% SDS 를 포함하는 50 mM 트리스 클로라이드 완충용액)으로 세척하였다. 침전물의 분석을 위해 전기영동 방법을 사용하는데, 침전물을 전기영동 시료 완충액에 끓인 후 13.5% 의 SDS 폴리아크릴아마이드젤을 사용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 젤을 고정하고 건조시킨 다음 X-ray 필름에 감광시킨 후 현상 인화하였다. 실험결과로부터 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제효능은 Ras 단백질의 파네실이 결합된 밴드와 결합되지 않은 밴드의 강도를 측정하여 50% 의 파네실 결합이 저해된 시료농도를 CIC₅₀으로 결정하였다.

하기 표 1은 대표적인 화합물들의 억제효능을 요약한 것이다. 일반적으로 IC₅₀은 효소의 활성을 반으로 줄이는데 필요한 저해제의 농도를 일컫고, CIC₅₀은 세포내에서 효소의 활성을 반으로 줄이는데 필요한 저해제의 농도를 니타낸다.

화합물 번호	IC₅0(μM)	CIC₅₀(μM)
1	0.009	1.0
2	0.10	7.5
3	0.19	6.5
4	0.36	8.0
5	100	ND
6	0.005	0.8
7	1.0	ND
8	3.1	ND
9	0.34	ND
10	0.042	1.5
11	0.013	1.0
ND : 측정하지 않았음.

본 발명의 화합물은 Ras 단백질의 파네실기를 전이하는 효소인 파네실 전이효소의 작용을 억제함으로써 Ras 단백질의 작용을 억제하는 신규한 화합물이다.

본 발명의 화합물은 우수한 파네실 전이효소 억제능을 가짐으로써 항암제로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 수화물.

화학식 3

상기 화학식 3에서

1) R₁은 방향족, 저급 알킬이 치환된 방향족, 방향족이 치환된 저급 알킬 중에 선택되거나, 화학식 4로 표시되는 작용화된 아실이다.

화학식 4

상기 화학식 4에서 X 는 방향족, 저급 알킬이 치환된 방향족, 방향족이 치환된 저급 알킬 중에 선택된다.

2) R₂는 아미노산의 잔기, 저급 알킬 중에 선택된다.

3) R₃는 하기 화학식 5로 표시된다.

화학식 5

상기 화학식 5에서 A 는 할로겐, CN, NO₂, COOH 아미드, 티오아미드, SR 및 저급 알킬이 치환된 방향족이거나, 그러한 방향족이 치환된 저급 알킬중에서 선택되는데, 여기서 R 은 저급 알킬을 의미한다. B, C, D 및 E 는 각각 독립적으로 수소 할로겐, 또는 저급 알킬 중에 선택되며, n 은 0 내지 4 중에서 선택된다.
제 1항에 있어서, 4-[5-(2S-이소부틸-4-나프탈렌-1-일-3,6-디옥소-피페라진-1-일메틸)-이미다졸-1-일메틸]-벤조니트릴인 것을 특징으로 하는 화합물, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 수화물.
1) 보호기를 포함하는 지방족 아미노산과 방향족 아민을 아마이드 커플링 하는 단계 (1 단계),

2) 상기 1 단계에서 제조한 화합물을 탈 보호기 반응시킨 후, 환원하는 단계 (2 단계),

3) 상기 2 단계에서 제조한 화합물을 고리화하는 단계 (3 단계) 및

4) 상기 3 단계에서 제조한 화합물을 제 1항의 화학식 3으로 표시되는 치환기를 포함하는 화합물과 치환 반응시켜 치환기를 도입하는 단계 (4 단계)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항의 화합물을 제조하는 방법.
제 1항의 화합물을 유효성분으로 하는 파네실 전이효소 저해제.
제 1항의 화합물을 유효성분으로 하는 항암제용 약학적 조성물.