KR100375421B1 - 항암효과를갖는파네실전이효소저해제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파네실 전이효소 억제 활성을 갖는 화학식 1로 표시되는 화합물, 그의 이성질체 및 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서 W, X, Y 및 Z는 명세서에 정의한 바와 같다.)

본 발명의 화합물 및 그를 유효성분으로 하는 조성물은 파네실 전이효소를 억제하는 작용을 하므로 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암 효과를 갖는 파네실 전이 효소 저해제

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 그의 이성질체 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물, 그의 제조방법, 그를 유효성분으로 함유하는 파네실 전이효소 저해제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Ras 단백질은 세포가 성장하고 분화하는데 중요한 역할을 하는 21kDa 크기의 단백질로서 구아닌 뉴클레오티드와 결합하며, 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 구아노신 다이 포스페이트(GDP)로 가수분해하거나 GDP를 GTP로 인산화하는 작용을 하는 GTPase회로에 참여하여 세포 신호전달 경로에 관련되어 있다고 알려져 있으며, 세포성장과 분화에 관련되어 있고, 포유동물 세포에서 3가지 ras 유전자로부터 생성되며 188개의 아미노산 잔기로 이루어진 K-Ras4B 단백질 또는 아미노산 189개로 이루어진 H-Ras, K-Ras4A, N-Ras 단백질의 4가지 종류가 있다(Bourne. H. R.; Sanders, D. A.; McCormick, F.,Nature,1991,349, 117).

Ras 단백질의 12, 13, 61번 위치에 있는 아미노산들은 GTP의 인산기 가까이 위치하고 있어서, 이 아미노산의 잔기들은 GTP의 가수분해에 관여하는 물분자의 공간적 위치에 큰 영향을 미친다. 인체에서 발생하는 암의 경우, 이 위치의 아미노산들의 돌연변이가 일어나면서 암을 유발하는 형태(발암성 Ras)가 되는 것이 그 원인인데, 이러한 돌연변이 Ras 단백질은 고유의 GTPase 활성을 잃어 GTP가 결합되어 활성화된 상태로 계속 존재하게 된다. 따라서, 이러한 돌연변이 Ras 단백질은 계속적으로 세포 신호를 전달하게 되어 발암성이 유발되는 것으로 보고되었으며, 실제로 췌장암, 폐암 및 피부암 등이 ras 유전자와 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Bos, J. L. Cancer Res.,1989,49, 4682).

Ras 단백질이 생물학적으로 활성화 상태에 있기 위해서는 세포막에 부착되어야 하며, Ras 단백질이 세포막에 부착되기 위해서는 우선 세포막 내의 지질층과 용이하게 결합할 수 있어야 한다. Ras 단백질은 파네실기가 결합하여 소수화되는데, 이러한 과정을 구체적으로 언급하자면 파네실화에 관여하는 Ras 파네실 전이효소(Farnecyltransferase)에 의한 과정, Ras 단백질 카르복시 말단에 존재하는 3개 아미노산으로 구성된 AAX 펩티드 절단 효소에 의한 과정, 메틸 전이효소 및 팔미토일 전이효소 등에 의한 과정 등이 있으며, 이러한 과정들에 의하여 Ras 단백질의 카르복시 말단이 변형된다. 이 단계들 중 첫번째인 파네실화는 파네실 전이효소(FTase)라는 효소에 의하여 진행되는데 Ras 단백질의 탄소 말단에 있는 CA₁A₂X라는 네 개의 아미노산으로 구성된 펩티드가 기질로서 이용된다. 여기서 A₁, A₂는 전기적 부하를 띄지않는 지방족의 아미노산이고 X는 메티오닌, 알라닌, 세린 등이다. 이 파네실화는 C(시스테인)부위에 일어나 황에테르 결합을 형성하는데, 특히 H-Ras와 N-Ras 단백질의 경우는 그의 카르복시 말단 근처에 존재하는 또 다른 시스테인에 팔미토일화가 일어난다. 이러한 파네실화의 결과로 Ras 단백질은 소수성(Hydrophobicity)이 증가하게 되어 파네실화된 Ras 단백질은 세포막에 용이하게 부착될 수 있게 된다. 파네실화된 Ras 단백질은 다시 그의 카르복시 말단의 3개의 아미노산이 AAX 펩티드 절단효소에 의해 떨어져 나가서 메틸화되어 파네실기가 세포막 내의 지질 이중층(lipid bilayer) 또는 다른 수용체와 용이하게 결합할 수 있다. 이렇게 생성된 Ras 단백질은 메틸 전이효소에 의하여 메틸에스테르화되는데, 그 결과 Ras 단백질의 전기적 부하상태나 공간적인 구조의 변화가 일어날 것으로 예상되며, 소수성도 증가하게 되므로 Ras 단백질이 세포막에 더욱 용이하게 부착될 수 있다.

한편, K-Ras4B의 경우는 H-Ras, N-Ras 와는 달리 팔미토일화에 필요한 시스테인 대신 폴리베이직 도메인 (Poly basic domain)이라 불리는 여러개의 라이신 염기가 배열된 부위를 가지고 있으며, 이 부위가 세포막내의 음이온성 지질과의 결합을 더욱 용이하게 해주는 것으로 알려져 있다.

Ras 단백질이 세포막에 최적의 조건으로 부착되기 위해서는 상기의 모든 변형단계가 필요하지만, Ras 단백질이 생물학적 활성을 나타내는데는 파네실화 자체만으로도 충분하다. 따라서, 상기 세 단계중 첫번째 단계인 파네실화 과정을 저해하면 돌연변이 Ras 단백질이 세포막에 부착되는 것을 막을 수 있어 돌연변이 Ras 단백질이 세포신호를 계속 전달하여 세포를 분열 및 증식시키는 것을 막을 수 있게된다. 따라서 파네실화를 저해하는 물질을 개발하는 것이 곧 항암제를 개발하는 것이라고 인식되어 최근에 여러기판에서 이에 대한 많은 연구가 활발히 진행되고 있다(N. E. Kohlet al.,Science,1993,260, 1934; G. L. Jameset al.,Science,1993,260, 1937; J. E. Busset al., Chemistry & Biology,1995,2, 787).

그간의 연구 결과, 파네실 전이효소를 저해했을 때 Ras 단백질로 형질전환된 세포성장이 저해될 뿐만 아니라 Ras 단백질에 의해 변형된 세포 형질이 개선되는 것이 관찰되었으며, 실제로 파네실 전이효소의 몇몇 저해제들은 발암성 Ras 단백질의 세포내 프레닐기에 의한 반응을 선택적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다 [Koh], N. E.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1994,91, 9141; Kohl, N. E.et al., Nature Medicine,1995,1, 792].

두 개의 기질인 파네실기와 Ras 단백질을 결합하여 반응물을 생성하는 파네실 전이효소의 저해제는 크게 세가지로 나눌 수 있다. 먼저 파네실기 (FPP)를 경쟁적으로 저해할 수 있는 화합물, 둘째로는 Ras 단백질의 C-말단의 작용을 저해하는 화합물, 그리고 파네실 전이효소가 두 기질을 사용하는 촉매반응의 활성화 단계를 모사하는 안정한 화합물을 저해제로 응용하는 것이다.

지금까지 연구된 대부분의 저해제는 Ras 단백질의 C-말단에 있는 프레닐기의 도입반응을 매개하는 CAAX 모티브에 연관된 것들로서, 파네실 전이효소의 Ras 단백질 기질에 대한 경쟁적 저해기전을 응용한 것이다. 예로서 콜 (Kohl, N. E.) 등은 CAAX를 모사한 시스테인 티올 (thiol)기를 함유한 펩타이드 변형체 및 이를 개선한 저해제를 연구하였으며 [미국 특허 5,141,851; Kohl, N. E.et al., Science,1993,260, 1934; PCT/US95/12224. Grahamet al.], 셉티 (Sebti, S. M.) 등은 펩타이드의 골격구조를 페닐기로 변형한 파네실 전이효소 저해제를 연구하였다[SebtiS. M.et al., J. Biol. Chem.,1995,270, 26802]. 또한 향정신성 의약품 골격구조 중 벤조다이아제핀을 펩타이드의 턴 (turn) 모사구조로 활용한 변형체가 보고된 바 있으며 [James, G. L.et al., Science,1993,260, 1937], 펩타이드 구조에서 벗어난 트리사이클린 유기화합물을 골격으로 한 저해제가 연구되었다 [Bishop, W. R.et al., J. Biol. Chem.,1995,270, 30611].

한편 파네실 전이효소의 촉매반응 단계를 모사하는 저해제의 연구는 풀터(Poulter, C. D.) 등이 파네실 전이효소가 프레닐기를 전이하는 작용기전이 전자친화적 치환반응 (Electriphilic Displacement)임을 제시한 후 [Poulter, C. D.et al., Poc. Natl. Acad. Sci.USA], 반응이 전이 상태 (transition state)에서 양성부하를 요구하는 것에 착안하여 프레닐기에 전이 상태의 양성 부하를 연결시킨 새로운 형태의 저해제를 연구하였다 [Poulter, C. D.et al., J. Am. Chem. Soc.,1996,118, 8761].

그러나 최근 인체 암에서 많은 경우 K-Ras 활성화가 주요 원인이며, 상기한 대부분의 프레닐 전이효소 제해제들의 경우 H-Ras 또는 N-Ras 에 의해 형질전환된 세포의 성장을 저해하는 효력보다는 K-Ras 활성화에 의해 형질전환된 세포의 성장을 저해하는 효력이 떨어진다는 것이 규명되어 K-Ras 활성을 효과적으로 저해할 수 있는 새로운 저해제의 연구가 주목받고 있다.

이에 본 발명자들은 K-Ras 기질에 대한 효소 저해 및 세포내 K-Ras 프레닐화 저해능을 평가할 수 있는 방법을 알아내고, 이 방법을 활용하여 K-Ras 뿐만 아니라 H-Ras 및 N-Ras 기질의 파네실화를 저해하는 우수한 화합물을 합성하여 본 발명을완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 파네실 전이효소 억제활성을 갖는 화합물, 그의 이성질체 및 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 파네실 전이효소를 억제함으로써 항암효과를 갖는 하기 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물, 그의 제조방법, 그를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약제학적 조성물을 제공한다.

화학식 1

상기 화학식 1에서

1) W는 -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂CH₂-, -CH=CHCH₂-, -CH₂CH=CH-, -CH₂CH=CHCH₂-, -CH=CHCH₂CH₂-또는 -CH₂CH₂CH=CH- 중에서 선택된다.

2) X는 수소 및 저급알킬 중에서 선택되거나 화학식 2로 표시되는 벤질 유도체 중에서 선택된다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서 R₁은 할로겐, 시아노, 니트로, 카르복실, 아미드, 페녹시, 페닐 및 저급 알킬 중에서 선택된다.

3) Y는 화학식 3으로 표시되는 질소 원자를 하나 이상 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물(5-membered hetrocyclic aromatic compound)이다.

[화학식 3]

상기 화학식 3에서 R₂는 수소; 할로겐; 저급알킬; 방향족; 방향족아민; 방향족이 치환된 저급알킬; 방향족이 치환된 알킬아민; 페녹시; 저급알킬로 치환된 페녹시 중에서 선택되거나 화학식 4로 표시되는 유도체 중에서 선택된다.

[화학식 4]

상기 화학식 4에서 R₃는 히드록시; 저급알킬; 저급알콕시; 방향족; 산소, 질소 및 황이 포함된 헤테로고리 방향족, 또는 방향족이 치환된 저급알킬 중에서 선택된다.

4) Z는 저급알킬; 방향족이 치환된 저급알킬; 하기 화학식 5로 표시되는 페닐 유도체 또는 바이사이클릭 방향족 화합물 중에서 선택된다.

[화학식 5]

상기 화학식 5에서의 R₁또는 R₄는 수소, 저급알킬, 저급알콕시, 할로겐, 시아노, 카르복시, 아미드, 티오아미드, 히드록시 페닐 또는 페녹시 중에서 각각 선택된다.

본 명세서에서 사용되는 용어인 "저급알킬"은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 의미한다.

본 발명의 화합물들은 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있고, 라세미체, 라세미화합물, 부분 입체이성체 혼합물 및 각각의 부분입체 이성체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성체는 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물 형태의화합물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르는 화학식 1의 화합물 중 대표적인 화합물에는 다음과 같은 물질이 있다.

1) 4-[5-(4-페닐이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴

2) 4-[5-(4-나프탈렌-1-일이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴

3) 4-[5-(4-나프탈렌-2-일이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴

4) 4-[5-(4-나프탈렌-1-일피라졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴

5) 1-[3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸]-4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트

6) 1-[3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸]-4-나프탈렌-1-일피롤-3-카르복실산

7) 1-(3-이미다졸-4-일프로펜)-4-나프탈렌-1-일이미다졸

8) 1-(3-이미다졸-4-일프로필)-4-나프탈렌-1-일이미다졸

9) 1-[3-(이미다졸-4-일)알릴]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트

10) 1-[3-(이미다졸-4-일)프로필]-4(나프탈렌-일)피롤-3-에틸 아세테이트

11) 1-[3-(이미다졸-4-일)프로필]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-카르복실산

본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 화합물의 제조방법은 다음과 같은 2가지 방법으로 대별된다.

방법 I

1) 출발물질인 히드록시메틸 이미다졸 하이드로클로라이드에 보호기를 부착하는 단계(제 1단계);

2) 상기 제 1단계에서 얻은 보호기가 부착된 히드록시메틸 이미다졸을 아세틸화하는 단계(제 2단계);

3) 상기 제 2단계에서 얻은 화합물의 염(salt)을 생성시키는 단계(제 3단계);

4) 상기 제 3단계에서 얻은 화합물의 보호기를 제거하는 단계(제 4단계);

5) 상기 제 4단계에서 얻은 화합물의 아세틸기를 제거하는 단계(제 5단계);

6) 상기 제 5단계에서 얻은 화합물을 염소화하는 단계(제 6단계) 및

7) 상기 제 6단계에서 얻은 클로로 메틸이미다졸 유도체와 질소원자를 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는 단계(제7단계).

방법II

1) 3-(이미다졸-4-일)아크릴산을 에스테르화하는 단계(제 1단계);

2) 상기 제 1단계에서 얻은 아크릴레이트 화합물에 보호기를 부착하는 단계(제 2단계);

3) 상기 제 2단계에서 얻은 보호기가 부착된 아크릴레이트 화합물을 환원시키는 단계(제 3단계);

4) 상기 제 3단계에서 얻은 환원된 프로펜을 화합물을 할로겐화하는 단계(제 4단계);

5) 상기 제 4단계에서 얻은 알릴할라이드 유도체와 한개 이상의 질소원자를 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물을 반응시키는 단계(제 5단계);

6) 상기 제 5단계에서 얻은 화합물의 보호기를 제거하는 단계(제 6단계) 및

7) 상기 제 6단계에서 얻은 보호기가 제거된 화합물을 환원시켜 화학식 1의 화합물을 얻는 단계(제 7단계).

구체적으로, 본 발명의 화합물은 하기 반응식 1 및 2로 구성되는 방법 또는 반응식 3 및 4로 구성되는 방법으로 제조할 수 있다.

[반응식 1]

[반응식 2]

상기 반응식 1은 본 발명의 화합물의 제조방법 I의 제 1단계 내지 제 6단계의 과정을 도시한 것이고, 반응식 2는 제 7단계를 도시한 것이다.

제 1단계에서는 먼저 반응식 1의 구조식 1으로 표시되는 히드록시메틸 이미다졸 하이드로클로라이드에 보호기를 부착시켜서 구조식 2의 화합물을 얻는다. 보호기는 이미다졸의 1-N 위치에 부착되는데, 입체장애(steric hindrance)가 큰 트리 페닐메틸기(Tr)가 바람직하다.

이때 용매는 DMF 또는 DMSO 등이 사용될 수 있으며, 염기는 트리에틸아민등이 사용될 수 있다.

제 2단계에서는 보호기가 부착된 반응식 1의 구조식 2로 표시되는 화합물의 히드록시기를 아세틸화하여 구조식 3의 화합물을 얻는다. 이때 아세틸화 반응에 사용되는 시약으로는 무수 아세트산 등이 있으며, 용매로는 에틸 아세테이트 등이 사용될 수 있고, 사용가능한 염기로는 피리딘 등이 있다.

제 3단계는 상기 제 2단계에서 얻은 구조식 3의 화합물을 벤질할라이드류와 반응시켜 구조식 4의 염이 생성되게 하는 단계로서, 사용될 수 있는 용매로는 메틸렌클로라이드 등이 있으며, 벤질할라이드로는 치환된 벤질브로마이드가 바람직하다.

제 4단계는 상기 제 3단계에서 생성된 구조식 4의 화합물에서 보호기를 제거하여 구조식 5의 화합물을 얻는 단계로서, 사용될 수 있는 산으로는 트리플루오르아세트산(TFA) 등이 있으며, 염기로는 트리에틸실란[(Et)₃SiH] 등이 사용될 수 있으며, 사용 가능한 용매로는 메틸렌클로라이드 등이 있다.

제 5단계는 상기 제 4단계에서 얻은 구조식 5의 화합물에서 아세틸기를 제거하는 단계로서, 사용될 수 있는 용매로는 메탄올 등이 있으며, 탄산칼륨 등의 포화용액이 염기로서 사용될 수 있다.

제 6단계는 상기 제 5단계에서 얻은 구조식 6의 화합물을 염소화하여 구조식 7의 클로로메틸이미다졸 유도체를 얻는 단계로서, 염소화 시약으로는 티오닐 클로라이드 등이 사용될 수 있으며, 용매로는 클로로포름 등이 사용될 수 있다.

다음 제 7단계는 상기 제 6단계에서 얻은 구조식 7의 클로로메틸이미다졸 유도체를 구조식 8의 질소원자를 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물과 반응시켜 목적화합물인 화학식 1의 화합물을 얻는 단계로서, 이때 질소원자를 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물은 페닐이미다졸 또는 나프탈렌이미다졸 등이 사용될 수 있으며, 염기로는 소디움하이드라이드가 사용될 수 있다.

[반응식 3]

[반응식 4]

상기 반응식 3은 본 발명의 화합물의 제조방법 II의 제 1단계 내지 제 4단계의 과정을 도시한 것이고, 반응식 4는 제 5단계 내지 제 7단계를 도시한 것이다.

제 1단계는 출발물질인 반응식 3의 구조식 9의 화합물인 3-(이미다졸-4-일)아크릴산을 에스테르화하는 단계로서, 이때 염산과 메탄올이 사용될 수 있다.

제 2단계는 상기 제 1단계에서 얻은 구조식 10의 메틸아크릴레이트 화합물에 보호기를 부착시켜서 구조식 11의 화합물을 얻는 단계로서, 보호기는 이미다졸의 1-N 위치에 부착되는데, 입체장애(steric hindrance)가 큰 트리페닐메틸기(Tr)가 바람직하다. 이때 용매는 DMF 또는 DMSO 등이 사용될 수 있으며, 염기는 트리에틸아민 등이 사용될 수 있다.

제 3단계는 상기 제 2단계에서 얻은 구조식 11의 보호기가 부착된 아크릴레이트 화합물을 환원하여 구조식 12의 프로펜을 화합물을 얻는 단계로서, 환원제로는 디이소부틸알미늄하이드라이드(DIBAL) 등이 사용될 수 있으며, 용매는 헥산 등이 사용될 수 있다.

제 4단계는 상기 제 3단계에서 얻은 구조식 12의 프로펜을 화합물을 염소화하는 단계로서, 사용될 수 있는 염소화 시약으로는 티오닐 클로라이드 등이 있으며, 용매로는 클로로포름 등이 사용될 수 있다.

제 5단계는 상기 제 4단계에서 얻은 구조식 13의 알릴 할라이드 유도체를 반응식 4의 구조식 14로 표시되는 한개 이상의 질소 원자를 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물과 반응시켜 구조식 15로 표시되는 화합물을 얻는 단계로서, 염기로는 소디움하이드라이드(NaH) 등이 사용될 수 있으며, 용매로는 디메틸설폭사이드(DMF) 등이 사용될 수 있다.

제 6단계는 상기 제 5단계에서 얻은 구조식 15의 화합물에서 보호기를 제거하는 단계로서, 사용될 수 있는 산으로는 트리플루오르아세트산(TFA) 등이 있으며, 용매로는 메틸렌클로라이드 등이 사용될 수 있다.

제 7단계는 상기 제 6단계에서 얻은 구조식 16의 보호기가 제거된 화합물을 환원시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻는 단계로서, 사용될 수 있는 환원제로는 수소가스와 팔라듐촉매/활성탄소 등이 있으며, 용매로는 메탄올 등이 사용될 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명의 신규 화합물의 제조방법을 상세히 설명하기로 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

한편 본 발명에 있어서 실시예 1 내지 6은방법 I을, 실시예 7 내지 9는방법 II를 적용하여 실시하였다. 따라서 실시예 1에서 예시한 방법을 적용하여 실시예 2 내지 6에 예시된 화합물을 제조 실시할 수 있었으며, 실시예 7에서 예시한 방법을 적용하여 실시예 8 및 9에 예시된 화합물을 제조 실시할 수 있었다.

<실시예 1> 4-[5-(4-페닐이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

(단계 1) 1-트리틸-4-히드록시메틸 이미다졸의 제조

출발물질인 구조식 6의 히드록시메틸 이미다졸 하이드로클로라이드[3.99 g(29.6 mmol)]를 30 ㎖의 디메틸포름아미드(DMF)와 10 ㎖의 트리에틸아민(Et₃N)에 녹인 후, 트리페닐메틸 클로라이드[9.35 g(33.5 mmol)]를 반응 혼합물 용액에 서서히 가하였다. 이 혼합물을 2시간 동안 방치한 뒤 500 ㎖의 얼음물을 가하여 생성된 고체를 얻었다. 이 고체를 디옥산으로 재결정하여 8.82 g(수율: 87%)의 표제 화합물을 얻었다.

m.p: 227∼229 ℃.

(단계 2) (1-트리틸-4-아세톡시메틸)이미다졸 아세테이트의 제조

피리딘 100 ㎖에 상기 (단계 1)에서 얻은 1-트리틸-4-히드록시메틸 이미다졸[5.00 g(14.7 nmol)]을 넣은 뒤, 무수 아세트산[1.65 g(16.2 mmol)]을 가하고 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 감압 증류하여 피리딘을 제거하고 200 ㎖의 에틸 아세테이트에 녹인 뒤 100 ㎖의 염화나트륨 수용액으로 세척하였다. 다음 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 5.22 g(13.7 mmol, 수율: 93%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 3) [1-트리틸-3-(4-시아노벤질)-4-아세톡시메틸]이미다졸 아세테이트 브롬화 염의 제조

상기 (단계 2)를 통하여 얻은 (1-트리틸-4-아세톡시메틸)이미다졸 아세테이트 [5.00 g(13.1 mmol)]를 디클로로메탄 20 ㎖에 녹인 후, 4-시아노벤질브로마이드 2.82 g (14.4 밀리몰)를 가하고 상온에서 60시간 동안 교반하였다. 다음 반응 혼합물에서 유기용매를 감압 중류한 뒤 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매를 이용하여 크로마토그래피를 실시하여 5.31 g(9.17 mmol, 수율: 70%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 4) [1-(4-시아노벤질)-5-아세톡시메틸]이미다졸 아세테이트의 제조

상기 (단계 3)을 통하여 얻은 [1-트리틸-3-(4-시아노벤질)-4-아세톡시메틸]이미다졸 아세테이트 브롬화 염[9.10 g(15.7 mmol)]을 메틸렌클로라이드 500 ㎖에 녹인 후, 0 ℃에서 트리플루오로아세트산[6.06 ㎖(78.7 mmol)]과 트리에틸실란[12.5 ㎖ (78.7 mmol)]을 서서히 가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 다음 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고, 탄산칼륨(K₂CO₃) 포화용액으로 pH를 10으로 조절한 다음 300 ㎖의 에틸 아세테이트로 반응혼합물을 추출하였다. 다음 유기 용매를 감압 증류한 뒤 에틸 아세테이트로 크로마토그래피를 실시하여 3.60 g(14.1 mmol, 수율: 90%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 5) 1-(4-시아노벤질)-5-히드록시메틸 이미다졸의 제조

상기 (단계 4)를 통하여 얻은 [1-(4-시아노벤질)-5-아세톡시메틸]이미다졸 아세테이트[4.20 g(16.5 mmol)]를 메탄올 200 ㎖에 녹인 후, 탄산칼륨 포화용액[4.50 g(32.9 mmol)]을 가하고 상온에서 20분 동안 교반하였다. 다음 유기용매를 감압 증류하여 제거하고 300 ㎖의 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 3.19 g(15.0 mmol, 수율: 91%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 6) 1-(4-시아노벤질)-5-클로로메틸-이미다졸의 제조

상기 (단계 5)를 통하여 얻은 1-(4-시아노벤질)-5-히드록시메틸 이미다졸[3.00 g(14.1 mmol)]을 클로로포름 40 ㎖에 녹인 후, 0 ℃에서 티오닐클로라이드[SOCl₂, 5.02 ㎖(70.5 mmol)]을 서서히 가하고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 다음 반응혼합물에서 유기 용매를 감압 증류하고 용매가 제거된 반응물을 50 ㎖의 에틸 아세테이트에 녹인 후, 중탄산나트륨(NaHCO₃) 포화 용액으로 세척한 다음 유기용매를 감압 증류하여 2.91 g(12.5 mmol, 수율: 89%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 7) 4-[5-(4-페닐이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

상기(단계 6)을 통하여 얻은 1-(4-시아노벤질)-5-클로로메틸-이미다졸의 염산 염[65 mg(0.24 mmol)]과 4-페닐이미다졸[35 mg(0.24 mmol)]을 디메틸포름아미드 2 ㎖에 녹이고 소디움하이드라이드(NaH, 30 mg)을 가하고 2시간 동안 교반하였다. 다음 용매를 감압 증류하고 메틸렌클로라이드-메탄올(10:1) 혼합용매로 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 8 mg(0.11 밀리몰, 수율: 47%)의 표제 화합물을 얻었다.

<실시예 2> 4-[5-(4-나프탈렌-1-일이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

(단계 1) 4-(나프탈렌-1-일)이미다졸의 제조

토실메틸이소시아나이드[tosylmethylisocynide, 625 mg(3.2 mmol)]을 테트라히드로퓨란(THF) 2 ㎖에 녹인 후 -55℃에서 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드(3.5 ㎖)와 테트라히드로퓨란(1 mol 용액)를 가한 다음 -60 ∼ -50℃ 를 유지하며 30분간 교반하여 토실메틸이소시아나이드 음이온 용액을 준비하였다. 다음 1-나프탈데하이드[500 mg(3.2 mmol)]을 테트라히드로퓨란(5 ㎖)에 녹이고 -65℃로 냉각하였다. 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드(3.5 ㎖)와 테트라히드로퓨란(1 mol 용액)를 가한 후 -30℃가 될때까지 가열하였다. 캐눌라를 이용하여 미리 준비된 토실메틸이소시아나이드의 용액을 가하고 다시 -78℃로 냉각시켜 30분간 교반하였다. 다음 반응혼합물을 0℃ 까지 가열하여 2시간 동안 교반한 후 다시 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 여기에 증류수 30 ㎖를 첨가하여 반응을 중지시키고 유기용매를 감압증류하여 제거한 후 1N 농도의 염산을 이용하여 pH를 10∼11로 조절하였다. 수용액을 염화나트륨으로 포화시킨 후 메틸렌클로라이드로 추출하였다. 그리고, 마그네슘설페이트(MgSO₄)로 유기층을 건조하고 농축한 후, 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 255 mg(1.31 mmol, 수율: 41%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 2) 4-[5-(4-나프탈렌-1-일이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

상기 (단계 1)을 통하여 얻은 4-(나프탈렌-1-일)이미다졸로부터 실시예 1의 단계 7과 동일한 방법을 수행하여 표제 화합물을 얻었다(수율: 69% ).

<실시예 3> 4-[5-(4-나프탈렌-2-일이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

(단계 1) 4-(나프탈렌-2-일)이미다졸의 제조

실시예 2의 (단계 1)과 동일한 방법을 수행하여 2-나프탈데하이드로부터 표제 화합물을 얻었다(수율: 48%).

(단계 2) 4-[5-(4-나프탈렌-2-일이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

상기 (단계 1)을 통하여 얻은 4-(나프탈렌-2-일)이미다졸로부터 실시예 1의(단계 7)과 동일한 방법을 수행하여 표제 화합물을 얻었다(수율: 70%).

<실시예 4> 4-[5-(4-나프탈렌-1-일피라졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

(단계 1) 4-[5-(4-요오드피라졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

4-요오드피라졸로부터 실시예 1의 (단계 7)과 동일한 방법으로 표제 화합물을 얻었다(수율: 61%).

(단계 2) 4-[5-(4-나프탈렌-1-일피라졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트[23 mg(0.058 mmol)], 1-나프탈렌보론산[10 mg(0.058 mmol)], 탄산나트륨 수화물(NaCO₃·10 H₂O, 87mg) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(2 mg)을 테트라히드로퓨란-증류수(1 mL/0.2 ㎖) 혼합용매에 넣고 4시간 동안 환류하였다. 다음 촉매를 여과하고 유기용매를 감압 증류하여 제거한 후 메틸렌클로라이드를 이용하여 반응물을 추출하였다. 다음 마그네슘설페이트로 건조한 후 농축하고, 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 15 mg(0.038 mmol, 수율: 66%)의 표제 화합물을 얻었다.

<실시예 5> 1-[3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸]-4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트의 제조

(단계 1) 4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트의 제조

에틸 3-(나프탈렌-1-일)아크릴레이트[500 mg(1.89 mmol)]와 토실메틸이소시아나이드[368 mg (1.89 mmol)]을 테트라히드로퓨란(10 ㎖)에 녹였다. 여기에 t-부톡시 칼륨[t-BOC-K⁺, 255 mg(2.27 mmol)]과 테트라히드로퓨란(10 ㎖)을 천천히 첨가한 뒤 30분 동안 환류하였다. 다음 증류수 10 ㎖를 넣어 반응을 중지시키고 감압증류하여 용매를 제거하였다. 용매가 제거된 반응물은 에테르로 추출하고 염화나트륨 수용액으로 세척한 후 마그네슘설페이트로 건조하였다. 다음 용매를 감압하에서 제거하고, 에틸 아세테이트-헥산(1:3) 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 385 mg(1.45 mmol, 수율: 77%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 2) 1-[3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸]-4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트의 제조

4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트로부터 실시예 1의 (단계 7)과 동일한 방법으로 표제 화합물을 얻었다(수율: 89%).

<실시예 6> 1-[3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸]-4-나프탈렌-1-일피롤-3-카르복실산의 제조

1-[3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸]-4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트[100 mg(0.22 mmol)]를 에탄올-물[1:1(v/v), 4 ㎖)]에 녹이고 포타슘히드록사이드[KH, 74 mg(1.30 mmol)]를 넣은 뒤 4시간 동안 환류하였다. 다음 반응혼합물은 감압 증류하여 대부분의 에탄올을 제거하고 1N 농도의 염산으로 중화시켰다. 중화된 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고 소디움설페이트로 건조한 후 농축하여, 71 mg (0.16 mmol)의 표제 화합물을 얻었다.

<실시예 7> 1-(3-이미다졸-4-일프로펜)-4-나프탈렌-1-일이미다졸의 제조

(단계 1) 메틸 3-(이미다졸-4-일)아크릴레이트의 제조

3-(이미다졸-4-일)아크릴산[500 mg(3.62 mmol)]을 메탄올릭 HCl(20 ㎖)에 넣고 10시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응혼합물은 감압하에서 용매를 제거하고, 메틸렌클로라이드(30 ㎖)를 넣은 뒤 중탄산나트륨(NaHCO₃)포화 용액, 염화나트륨 수용액 및 증류수로 세척하였다. 다음 유기층을 마그네슘설페이트로 건조한 뒤 농축하여 510 mg(3.35 mmol, 수율: 93%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 2) 메틸 3-(1-트리틸이미다졸-4-일)아크릴레이트의 제조

상기 (단계 1)을 통하여 얻은 메틸 3-(이미다졸-4-일)아크릴레이트[350 mg(2.30 mmol)]와 트리페닐메틸클로라이드[705 mg(2.53 mmol)]를디메틸포름아미드(10 ㎖)에 녹인 후 트리에틸아민[350 ㎖(2.53 mmol)]을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 방치한 후 반응 혼합물에 100 ㎖의 얼음물을 가하여 생성된 고체를 여과하고 에테르 및 헥산으로 세척한 후 건조하여 810 mg(2.05 mmol, 수율: 87%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 3) 1-(1-트리틸이미다졸-4-일)프로펜-3-올의 제조

상기 (단계 2)를 통하여 얻은 메틸 3-(1-트리틸이미다졸-4-일)아크릴레이트[800 mg(2.03 mmol)]를 무수 메틸렌클로라이드(20 ㎖)에 넣고 -78℃로 냉각시킨후 1M 헥산에 녹인 디이소부틸알루미늄하이드라이드(DIBAL, 6.1 ㎖)를 첨가하였다. 온도를 천천히 상온으로 올리고 증류수 2 ㎖를 넣어 반응을 중지시켰다. 1N 농도의 수산화나트륨 수용액(3 ㎖)을 첨가한 후 다시 증류수(2 ㎖)를 넣은 후 셀라이트를 통해 여과 했다. 여과된 용액의 유기층을 분리한 뒤 남은 물층을 메틸렌클로라이드로 추출하여 분리된 유기층에 합한 후 마그네슘설페이트로 건조시켰다. 다음 감압하에서 유기용매를 제거하고 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 671 mg(1.83 mmol, 수율: 90%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 4) 4-(3-클로로프로펜일)-1-트리틸이미다졸의 제조

상기 (단계 3)를 통하여 얻은 1-(1-트리틸이미다졸-4-일)프로펜-3-올[650 mg(1.77 mmol)]을 클로로포름(10 ㎖)에 넣고 0℃에서 티오닐클로라이드[SOCl₂, 135 ㎖ (1.9 mmol)]을 가한 다음 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 다음 유기 용매를 감압 증류하여 제거한 뒤 반응 혼합물을 10 ㎖의 에틸 아세테이트에 녹인 후, 중탄산나트륨 포화 용액으로 세척한 다음 유기 용매를 감압 증류하여 647 mg(1.68 mmol, 수율: 95%)의 표제 화합물을 얻었다.

(단계 5) 4-나프탈렌-1-일-1-[1-(1-트리틸이미다졸-4-일)프로펜-3-일]이미다졸의 제조

4-(나프탈렌-1-일)이미다졸과 상기 (단계 4)를 통하여 얻은 4-(3-클로로프로펜일)-1-트리틸이미다졸을 디메틸포름아미드(2 ㎖)에 녹이고 소디움하이드라이드(NaH, 30 mg)을 가한 후 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거하고 메틸렌클로라이드-메탄올(10:1) 혼합용매로 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 표제 화합물을 얻었다(수율: 74%).

(단계 6) 1-(1-이미다졸-4-일프로펜-3-일)-4-나프탈렌-1-일이미다졸의 제조

상기 (단계 5)를 통하여 얻은 4-나프탈렌-1-일-1-[1-(1-트리틸이미다졸-4-일)프로펜-3-일]이미다졸[108 mg(0.199 mmol)]을 메틸렌클로라이드-트리플로로아세트산(2:1, 3 ㎖) 혼합용매에 녹인 후 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 다음 감압하에서 용매를 제거한 후 메틸렌클로라이드(10 ㎖)를 가하여 녹였다. 다음 유기층을 중탄산나트륨 포화용액과 염화나트륨 수용액으로 세척한 후 마그네슘설페이트로 건조하고 농축한 후 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 45 mg (0.15 mmol, 수율: 75%)의 표제 화합물을 얻었다.

FAB MS : 301(M+1)

<실시예 8> 1-(1-이미다졸-4-일프로필-3-일)-4-나프탈렌-1-일이미다졸의 제조

상기 실시예 7의 (단계 6)을 통하여 얻은 1-(1-이미다졸-4-일프로펜-3-일)-4-나프탈렌-1-일이미다졸[28 mg(0.093 mmol)]을 메탄올(2 ㎖)에 녹이고 활성탄소(2 mg)를 넣어준 뒤 수소 분위기에서 2시간 동안 교반하여 환원하였다. 다음 촉매를 여과하여 제거하고 용매를 감압증류하여 28 mg(0.093 mmol, 수율: 100 %)의 표제 화합물을 얻었다.

<실시예 9> 1-[3-(이미다졸-4-일)알킬-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트의 제조

(단계 1) 1-[3-(1-트리틸이미다졸-4-일)알릴]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸아세테이트의 제조

4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트와 실시예 7의 (단계 4)를 통하여 얻은 4-(3-클로로프로펜일)-1-트리틸이미다졸을 메틸렌클로라이드-트리플로로아세트산(2:1, 3 ㎖) 혼합용매에 녹인 후 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 다음 감압하에서 용매를 제거한 후 메틸렌클로라이드(10 ㎖)를 가하여 반응혼합물을 녹였다. 다음 유기층을 중탄산나트륨 포화용액과 염화나트륨 수용액으로 세척한 후 마그네슘설페이트로 건조하고 농축한 후 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 표제 화합물을 얻었다(수율: 85%).

(단계 2) 1-[3-(이미다졸-4-일)알릴]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트의 제조

상기 (단계 1)을 통하여 얻은 1-[3-(1-트리틸이미다졸-4-일)알릴]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트[300 mg(0.49 mmol)]를 메틸렌클로라이드-트리플로로아세트산(1:1(v/v), 2 ㎖) 혼합용매에 녹이고 1시간 동안 교반하였다. 다음 감압증류하여 용매를 제거하고 용매가 제거된 반응혼합물에 중탄산나트륨 포화 용액(3 ㎖)을 넣고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 다음 마그네슘설페이트로 건조하고 농축한 후 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 115mg(0.31 mmol, 수율: 63%)의 표제 화합물을 얻었다.

FAB MS : 372(M+1)

<실시예 10> 1-[3-(이미다졸-4-일)프로필]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트의 제조

상기 실시예 9의 (단계 1)을 통하여 얻은 1-[3-(1-트리틸이미다졸-4-일)알릴]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트[120 mg(0.32 mmol)]를 메탄올에 녹이고 활성탄소(10 mg) 을 넣어준 뒤 수소 분위기에서 2시간 동안 교반하였다. 다음 촉매를 여과하여 제거하고 용매를 감압증류한 후 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매로 크로마토그래피를 실시하여 85 mg(0.23 mmol, 수율: 71%)의 표제 화합물을 얻었다.

<실시예 11> 1-[3-(이미다졸-4-일)프로필]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-카르복실산의 제조

상기 실시예 10을 통하여 얻은 1-[3-(이미다졸-4-일)프로필]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트[70 mg(0.19 mmol)]를 에탄올-증류수(1:1 (v/v), 4 ㎖)에 녹이고 포타슘히드록사이드[KH, 63 mg(1.1 mmol)]를 넣은 뒤 4시간 동안 환류시켰다. 감압하에서 대부분의 에탄올을 제거하고 1N 농도의 염산으로 반응혼합물을 중화시켰다. 다음 에틸 아세테이트로 추출하고 황산나트륨으로 건조한 후 농축하여, 42 mg (0.12 mmol, 수율: 64%)의 표제 화합물을 얻었다.

본 발명의 화합물의 파네실 전이효소 억제능을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

<실험예 1> Ras 파네실 전이효소 억제능 분석

본 실험에서는 폼프리아노 (Pomplianoet al., Biochemistry 1992,31, 3800) 등의 방법을 개선하여 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 Ras 파네실 전이효소를 사용하였으며, 기질은 H-Ras(H-Ras-CVLS)와 K-Ras의 카르복시 말단 다염기성라이신 도메인을 치환시킨 H-Ras와의 결합단백질(특허출원 제97-14409호)을 이미 보고된 방법(Chunget al., Bichimica et Biophysica Acta,1992,1129, 278)에 의해 정제하여 사용하였다.

효소 반응은 25 mmol의 포타슘 클로라이드, 25 mmol의 마그네슘 클로라이드, 10mmol DTT 및 50 μmol의 징크 클로라이드를 함유한 50 ㎕의 50 mM 소디움 히피스완충용액에서 수행하였으며, 1.5 μmol의 Ras 기질 단백질, 0.15 μmol의 트리튬-파네실 피로 포스페이트와 4.5 nmol의 파네실 전이효소가 사용되었다.

상세히 기술하면 파네실 전이효소를 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응을 지속시킨 후 1 M의 염산을 함유한 에탄올 용액(1 ㎖)를 첨가하여 반응을 중지시키고, 생성된 침전물을 필터바인딩을 위한 호퍼 하베스터(호퍼 #FH 225V)를 사용하여 GF/B 필터에 흡착시킨 후, 에탄올을 사용하여 세척하고, 건조시킨 필터를 LKB 베타카운터를 사용, 방사능을 측정함으로 수행하였다. 효소 역가검정은 Ras 기질 단백질과 파네실 효소의 농도가 정량적 역가를 나타내는 기질 불포화 상태에서 측정되었으며, 합성된 화합물은 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용매에 용해하여 전체 반응액의 5% 이내에서 첨가하여 효소 저해능을 평가하였다. 효소 저해능은 시료가 없는 상태에서 Ras 기질 단백질에 도입된 파네실에 대해 시료 존재하에서 측정된 파네실 도입량을 백분율로 표시하였으며, 50%의 효소활성을 저해하는 농도를 각 시료의 IC₅₀으로 결정하였다. 시료의 선택적 저해능을 평가하기 위한 제라닐제라닐 전이효소는, 샤버 등(Schaberet al., J. Biol chem,1990,265, 14701)의 방법을 변형하여 소뇌로부터 정제하여 사용하였으며, 파네실 전이효소 반응과 유사 조건에서 제라닐제라닐 전이 효소의 특이 기질인 제라닐제라닐 피로 포스페이트와 Ras-CVIL 기질 단백질을 사용하여 실험을 수행하였다.

<실험예 2> 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제효능 분석

본 실험에서는 돌연 변이에 의해 형질 전환 활성을 갖는 C-Harvey-Ras 단백질을 발현하는 Rat2 세포주와 K-Ras의 카르복시 말단의 다염기성 라이신 도메인으로 치환한 H-Ras와 결합 단백질로 형질전환된 Rat2 세포주(특허출원 제97-14409호)를 사용하였으며, 실험 방법은 드크루 등 (Declue. J. E.et al., Cancer Research,1991,51, 712)에 의해 보고된 방법을 변형하여 수행하였다. 하기에 실험을 상세히 기술하기로 한다.

형질 전환된 Rat2 피브로 블라스트 세포주를 60mm 세포 배양 디쉬에 3×10⁵세포를 분주하여 37℃ 세포 배양기에서 48시간 동안 배양하여 50% 이상 밀도로 자란후 시료를 처리한다. 이때 시료용매는 디메칠설폭사이드(DMSO)를 사용하였으며, 대조군 및 시험군 모두 1% 디메틸설폭사이드 농도를 사용하였다. 시료를 처리한 뒤 4시간 후에 배지 1 ㎖ 당 150 μCi의 방사성 동위원소(³⁵S)로 표지된 메치오닌을 첨가하고 20시간 배양한 후 생리 식염수로 세포를 세척하였다. 세포 용해를 위해 1 ㎖의 차가운 세포 용해 완충 용액 (5 mmol의 마그네슘 클로라이드, 1 mmol의 DTT, 1% NP 40, 1 mmol의 EDTA, 1 mmol의 PMSF, 2 μmol의 루펩틴, 2 μmol의 펩스타틴에이 및 2 μmol의 안티페인을 포함하는 50 mM의 소디움 히피스 완충용액)을 사용하여, 세포가 용해된 상등액을 고속원심분리(12,000 g×5분)하여 얻었다. 상등액의 방사성 동이원소 표지량을 측정하여 면역 침전 반응시 정량적 결과를 얻을수 있도록 표준화한 후 Ras 단백질에 특이적 결합을 하는 단일클론 항체인 Y13-259(Furth, M. E.et al., J. Virol,1982,43, 294]를 넣어 4℃ 에서 15시간 반응시켰다. 이 용액에 다시 고트에서 유래된 쥐의 면역글로블린에 대한 항체가 결합된 프로테인 A(Protein A)-아가로즈 현탁액을 넣어 1시간 동안 4℃에서 반응시킨 후 면역 반응 침전물을 비특이적 결합물을 제거하기 위해 완충용액(50 mmol의 소디움클로라이드,0.5% 소디움디옥시콜레이트, 0.5% NP 40 및 0.1% SDS를 포함하는 50 mM 트리스 클로라이드 완충욕액)으로 세척한다. 침전물의 분석을 위해 전기영동 방법을 사용하며, 침전물을 전기영동 시료 완충액에 끓인 후 13.5 퍼센트의 SDS 폴리아크릴아마이드젤을 사용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 젤을 고정하고 건조시킨 다음 X-ray 필름에 감광시킨 후 현상 인화하였다. 실험결과로부터 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제 효능은 Ras 단백질의 파네실이 결합된 밴드와 결합되지 않은 밴드의 강도를 측정하여 50%의 파네실 결합이 저해된 시료농도를 CIC₅₀로 결정하였다.

하기 표 2는 대표적인 화합물들의 억제 효능을 요약한 것이다.

[표 1]

기존의 파네실 전이효소 억제제가 H-Ras 또는 N-Ras 에 의해 형질전환된 세포의 성장을 저해하는 효력보다는 K-Ras 활성화에 의해 형질 전환된 세포의 성장을저해하는 효력이 떨어지는데 비하여, 본 발명의 화합물은 H-Ras 및 N-Ras 기질의 파네실화를 저해할 뿐만 아니라 K-Ras 의 활성도 효과적으로 저해함으로써 Ras 단백질의 작용을 억제하는 화합물이다.

즉, 본 발명의 화합물은 우수한 파네실 전이효소 억제능을 가짐으로써 항암제로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물.

   화학식 1

   

   상기 화학식 1에서

   1) W는 -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂CH₂-, -CH=CHCH₂-, -CH₂CH=CH-, -CH₂CH=CHCH₂-, -CH=CHCH₂CH₂-또는 -CH₂CH₂CH=CH- 중에서 선택된다.

   2) X는 수소 및 C₁-C₄알킬 중에서 선택되거나 화학식 2로 표시되는 벤질 유도체 중에서 선택된다.

   화학식 2

   

   상기 화학식 2에서 R₁은 할로겐, 시아노, 니트로, 카르복시, 아미드, 페녹시. 페닐 및 C₁-C₄알킬 중에서 선택된다.

   3) Y는 화학식 3으로 표시되는 질소 원자를 하나 이상 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물(5-membered hetrocyclic aromatic compound)이다.

   화학식 3

   

   상기 화학식 3에서 R₂는 수소; 할로겐; C₁-C₄알킬; C₁-C₄알킬로 치환된 페녹시 중에서 선택되거나 화학식 4로 표시되는 유도체 중에서 선택된다.

   화학식 4

   

   상기 화학식 4에서 R₃는 히드록시; C₁-C₄알킬; C₁-C₄알콕시 중에서 선택된다.

   4) Z는 C₁-C₄알킬; 하기 화학식 5로 표시되는 페닐 유도체 또는 바이사이클릭 방향족 화합물 중에서 선택된다.

   화학식 5

   

   상기 화학식 5에서 R₃또는 R₄는 수소, C₁-C₄알킬, C₁-C₄알콕시, 할로겐, 시아노, 카르복시, 아미드, 티오아미드, 히드록시, 페닐 또는 페녹시 중에서 각각 선택된다.
2. 제 1항에 있어서,

   4-[5-(4-페닐이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸] 벤조니트릴,

   4-[5-(4-나프탈렌-1-일이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴,

   4-[5-(4-나프탈렌-2-일이미다졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴,

   4-[5-(4-나프탈렌-1-일피라졸-1-일메틸)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴,

   1-[3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸]-4-나프탈렌-1-일피롤-3-에틸 아세테이트,

   1-[3-(4-시아노벤질)이미다졸-4-일메틸]-4-나프탈렌-1-일피롤-3-카르복실산,

   1-(3-이미다졸-4-일프로펜)-4-나프탈렌-1-일이미다졸,

   1-(3-이미다졸-4-일프로필)-4-나프탈렌-1-일이미다졸,

   1-[3-(이미다졸-4-일)알릴]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트,

   1-[3-(이미다졸-4-일)프로필]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-에틸 아세테이트 또는

   1-[3-(이미다졸-4-일)프로필]-4-(나프탈렌-1-일)피롤-3-카르복실산인 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물.
3. 1) 출발물질인 히드록시메틸 이미다졸 하이드로클로라이드에 보호기를 부착하는 단계(제 1단계);

   2) 상기 제 1단계에서 얻은 보호기가 부착된 히드록시메틸 이미다졸을 아세틸화하는 단계(제 2단계);

   3) 상기 제 2단계에서 얻은 화합물의 염(salt)을 생성시키는 단계(제 3단계);

   4) 상기 제 3단계에서 얻은 화합물의 보호기를 제거하는 단계(제 4단계);

   5) 상기 제 4단계에서 얻은 화합물의 아세틸기를 제거하는 단계(제 5단계);

   6) 상기 제 5단계에서 얻은 화합물을 염소화하는 단계(제 6단계) 및

   7) 상기 제 6단계에서 얻은 클로로 메틸이미다졸 유도체와 질소원자를 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는 단계(제 7단계)

   로 이루어지는 것을 특징으로 하는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법.
4. 1) 3-(이미다졸-4-일)아크릴산을 에스테르화하는 단계(제 1단계);

   2) 상기 제 1단계에서 얻은 아크릴레이트 화합물에 보호기를 부착하는 단계(제 2단계);

   3) 상기 제 2단계에서 얻은 보호기가 부착된 아크릴레이트 화합물을 환원시키는 단계(제 3단계);

   4) 상기 제 3단계에서 얻은 환원된 프로펜을 화합물을 할로겐화하는 단계(제 4단계);

   5) 상기 제 4단계에서 얻은 알릴할라이드 유도체와 한개 이상의 질소원자를 포함하는 5원 헤테로고리 방향족 화합물을 반응시키는 단계(제 5단계);

   6) 상기 제 5단계에서 얻은 화합물의 보호기를 제거하는 단계(제 6단계) 및

   7) 상기 제 6단계에서 얻은 보호기가 제거된 화합물을 환원시켜 화학식 1의 화합물을 얻는 단계(제 7단계)

   로 이루어지는 것을 특징으로 하는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법.
5. 제 1항의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약제학적 조성물.