KR19990079267A - 이소옥사졸(또는 이소옥사졸린) 구조를 갖는 파네실 전이효소억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파네실 전이효소를 억제하는 것으로 지금까지 알려진 헤테로환 화합물과는 다른 구조를 가지고 있는 새로운 헤테로환 화합물, 즉 이소옥사졸(또는 이소옥사졸린)을 포함하는 화합물에 관한 것이다. 본 발명에는 또한, 이 화합물의 제조방법 및 이 화합물을 함유함을 특징으로 하는 항암제 조성물도 포함되어 있다.

Description

이소옥사졸(또는 이소옥사졸린) 구조를 갖는 파네실 전이효소 억제제

본 발명은 파네실 전이효소를 억제하는 것으로 지금까지 알려진 헤테로환 화합물과는 다른 구조를 가지고 있는 새로운 헤테로환 화합물, 즉 이소옥사졸(또는 이소옥사졸린)을 포함하는 화합물에 관한 것이다. 본 발명에는 또한, 이 화합물의 제조방법 및 이 화합물을 함유함을 특징으로 하는 항암제 조성물도 포함되어 있다.

Ras 단백질은 세포의 성장과 분화에 중요한 역할을 하는 21kDa의 단백질로서 구아닌 뉴클레오타이드와 결합하며, 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 구아노신 디포스페이트(GDP)로 가수분해하는 효소이다. 또한, 세포 내에서 특이적인 GTPase 회로를 조절하는 분자스위치로도 작용하는 것으로 알려져 있다(참조: Bourne,H.R., Sanders,D.A., McCormick, F.Nature1991, 349, 117).

Ras 단백질은 포유동물세포에서 3 가지의 Ras 유전자에 의해 아미노산 188개의 K-Ras-4B 또는 189개의 H-Ras, K-ras-4A 및 N-Ras로 생성된다. 이 단백질의 12, 13, 61번 위치에 있는 아미노산은 GTP의 인산기와 근접하여 있어, 이 아미노산 잔기들은 GTP의 가수분해에 관여하는 물분자의 공간적 위치에 영향을 미침으로써 GTPase 활성에 영향을 미친다. 인체에서 암이 발생한 경우, 이 위치의 아미노산에 돌연변이가 관찰되는데, 이 돌연변이가 결국 Ras 단백질 고유의 GTPase 활성을 저해하여 GTP 결합상태를 지속시킴으로써 비정상적인 성장신호를 지속적으로 전달하여 발암성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 발암성인 Ras 유전자는 특이적으로 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암등에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며(참조: Bos,J.L.,Cancer Res., 1989, 49, 4682), Ras 단백질은 혈관평활근(vascular smooth muscle) 세포의 성장에도 관여한다고 보고되어 있어 동맥경화 및 당뇨병과도 밀접한 관련이 있는 것으로 생각되고 있다(참조: JP H7-112930 호).

Ras 단백질이 생물학적으로 활성화 상태에 있기 위해서는 세포막 내에 부착되어야 하는데 이를 위해서는 Ras 파네실 전이효소, Ras 단백질 카복시 말단의 3 개 AAX 펩타이드 절단효소, 메틸 전이효소 및 팔미토일 전이효소에 의한 단백질 전이 후의 탄소말단의 변형이 요구된다. 이중 첫번째 단계인 파네실화는 파네실 전이효소(FTase)에 의해 이루어진다. 파네실 전이효소의 기질은 Ras 단백질의 카복시 말단에 있는 CA1A2X라는 네개의 펩타이드이며, 여기서 A1 및 A2는 전기적 부하를 띄지 않는 지방족 아미노산이고 X는 메티오닌, 알라닌 또는 세린등이다. 파네실 반응은 시스테인에 일어나 황에테르 결합을 형성시키며, H-Ras와 N-Ras의 경우에는 카복시 말단 근처의 또 다른 시스테인에 팔미토일화가 일어난다. 파네실화의 결과로 Ras 단백질은 친소성이 증가되어 세포막 내에 부착하게되며, 파네실화된 Ras 단백질은 카복시 말단으로 부터 연이어 3개의 AAX 펩타이드가 절단효소에 의해 제거되고 메틸화되어 파네실기가 세포막 내의 지질층 또는 다른 수용체와 결합하는 것을 용이하게 해주는 것으로 알려져 있다. 한편, K-Ras-4B는 H-Ras, N-Ras와는 달리 팔미토일화에 필요한 시스테인 대신 폴리베이직(Poly basic) 도메인이라 불리는 여러개의 라이신이 배열된 부위를 가지고 있으며, 이를 통해 세포막내의 음이온성 지질과의 결합이 용이하게 되는 것으로 알려져있다. Ras 단백질이 세포막내에 잘 부착하기 위해서는 모든 변형 단계가 필요하나, Ras 단백질의 활성화에는 파네실화만으로도 충분한 것으로 알려져 있으므로 이 파네실화를 차단함으로써 돌연변이에 의한 Ras 발암성을 억제하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(참조: Buss, J.E.et al.,Chemistry & Biology, 1995, 2, 787).

그간의 연구결과, Ras로 형질전환된 세포에서 파네실 전이효소를 저해했을때 세포의 성장이 저해되는 것으로 관찰되었으며, 또한 Ras에 의해 변형된 세포형질을 개선하는 것으로 나타났다.

실제로 파네실 전이효소의 몇몇 저해제들은 Ras 발암성 유전인자의 세포내 프레닐기에 의한 반응을 선택적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다(참조: Kohl,N.E.et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 9141(1994); Kohl, N.E.et al., Nature Medicine, 1, 792(1995)). 개발된 파네실 전이효소 저해제로는 시스테인 티올(thiol)기를 함유하며 CAAX와 유사한 구조를 갖는 펩타이드 변형체 및 이를 개선한 저해제(참조: US Patent No. 5,141,851 호; Kohl,N.E.et al., Science260, 1934(1993); Grahamet al.,PCT/US95/12224), 페닐기로 변형된 펩타이드(참조: Sebti, S.M.,J. Biol. Chem.270, 26802, 1995), 향정신성 의약품 골격구조중 벤조디아제핀을 펩타이드의 turn 모사구조로 활용한 변형체(James,G.L.et al.,Science,260, 1937, 1993), 펩타이드 구조에서 벗어나 트리사이클릭 유기 화합물을 골격으로한 저해제(참조: Bishop W.R.et al.,J. Biol. Chem.,270, 30611, 1995)를 들 수 있다. 또한, 파네실 전이효소가 프레닐기를 전이시키는 작용기전이 전자 친화적 치환반응 (Electrophilic Displacement)이므로 반응의 트랜지션 상태(transition state)에 양성부하를 요구함에 착안하여 프레닐기에 트랜지션 상태의 양성 부하를 연결시킨 새로운 형태의 저해제가 제시되었다(참조: Poulter, C.D.et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 8761, 1996).

그러나, 많은 경우의 인체암에서 K-Ras 활성화가 주요 원인으로 작용하며, 지금까지 개발된 대부분의 프레닐 전이효소 저해제들은 K-Ras를 활성화시킨다. 따라서, K-Ras에 의해 형질전환된 세포의 성장저해 정도가 H-Ras, N-Ras에 의해 형질전환된 세포의 성장저해에 비해 떨어지므로 K-Ras 활성을 효과적으로 저해할 수 있는 새로운 저해제의 연구가 주목을 받고 있다.

이에 본 발명자들은 K-Ras 기질에 대한 효소활성 저해능 및 세포내 K-Ras 프레닐화 저해능을 평가할 수 있는 새로운 평가체계를 확립하여 이를 활용함으로써 K-Ras 뿐만 아니라 H-Ras, N-Ras 기질의 파네실화를 저해하는 신규한 화합물을 합성하고 그 저해능을 평가하였다. 그 결과, 본 발명자들은 하기 화학식 1의 화합물이 본 발명의 소기 목적에 부합되어 이들이 항암제로서 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 파네실 전이효소 억제능을 함유함으로써 항암효과를 나타내는 하기 화학식 1의 신규한 헤테로환 화합물을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물을 제조하는 신규한 방법을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물을 제조하는 과정에서 유용하게 사용되는 신규한 중간체를 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물을 함유함을 특징으로 하는 파네실 전이효소 억제용 약제학적 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

발명의 범위를 설명함에 앞서 다음의 중요한 용어 몇가지부터 정의하기로 한다.

a) 단순알킬체인(Simple Alkyl Chain, 약칭이 필요할 경우는 SAC로 나타낸다): 탄소수 1-8개로 구성된 탄화수소로서, 측쇄형(branched isomeric form)으로 이루어진 경우를 포함한다.

b) 단순사이클로알킬체인(Simple Cyclo Alkyl Chain, 약칭이 필요할 경우는 SCAC로 나타낸다): 탄소수 3-10개로 구성된 고리형 화합물이다.

c) 아릴그룹(aryl group, 약칭하여 Ar로 나타낸다): 벤젠{benzene[1:2, 3,4,5,6]}, 나프탈렌{naphthalene[1,2:1,2,3,4,5,6,7,8,]}, 피리딘{pyridine[2,3, 4:2,3,4,5,6]}, 인돌{indole[1,2,3,4,5,6,7:1,2,3,4,5,6,7]}, 퀴놀린{quinoline[2, 3,4,5,6,7,8:2,3,4,5,6,7,8]}, 이소퀴놀린{isoquinoline[1,3,4,5,6,7,8: 1,3,4,5, 6,7,8]}, 푸란{furan[2,3:2,3,4,5]}, 티오펜{thiophene[2,3:2,3,4,5]}, 피롤{pyrole[1,2,3:1,2,3,4,5]}, 피리미딘{pyrimidine[2,4,5,6:2,4,5,6]}, 이미다졸{imidazole[1,2,4,5:1,2,4,5]} 등을 나타낸다. 여기서 중괄호안의 앞쪽의 숫자는 해당되는 아릴그룹이 본 발명에 따른 저해제와 결합되는 위치를 나타내고, 콜론뒤의 숫자는 하기에서 별도로 정의된 치환체(=Y)가 치환될 수 있는 위치를 나타낸다. 치환체는 하기 정의된 것들 중에서 순서와 종류에 관계없이 치환가능한 수 만큼 최대한 치환될 수 있다.

치환체(=Y): -OH, OR(R =-SAC, -SCAC), -C(=O)R(R = -H, -SAC, -SCAC), -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -NC, -N₃, -CO₂H, CF₃, -CO₂R(R = -SAC, -SCAC), -C(=O)NHR(R = -SAC, -SCAC), -C(=O)NR₂(R = -SAC, -SCAC)

또한, 자주 등장하는 용어를 다음과 같이 약칭한다.

N-클로로석신이미드(N-chlorosuccinimide) : NCS

N-메틸몰포린( N-methylmorporline) : NMM

N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethyl formamide) : DMF

1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드{1-(3-dimethylaminopropyl)- 3-ethylcarbodiimide}: EDC

1-히드록시벤조트리아졸 수화물(1-hydroxybenzotriazole hydrate) : HOBt

트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) : TFA

t-부틸옥시카보닐(t-butoxycarbonyl) : Boc

벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl) : Cbz

메틸(methyl) : Me

에틸(ethyl) : Et

당량(equivalent) : Eq

본 발명은 파네실 전이효소의 억제효능을 지님으로해서 항암효과를 나타내는 하기 화학식 1의 신규한 이소옥사졸(또는 이소옥사졸린) 유도체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서 치환체 R, R₁, R₂, R₃, R₄, R', R"에 대한 구체적인 정의는 다음과 같다.

I)은 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다(단,이 이중결합인 경우 R₂는 존재하지 않는다).

II) R 은 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar) 또는 수소를 나타내며, 바람직하게는 수소를 나타낸다.

III) R' 은 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar) 또는 수소를 나타낸다.

IV) R" 은 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar) 또는 수소를 나타내며, R" = H 인 경우 약제학적으로 허용되는 염(salt) 형태로 존재하는 경우도 포함된다.

V) R₁및 R₃는 각각 독립적으로 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 일 수 있으며, 모든 천연아미노산의 곁가지(side chain residue)와 특별히 다음의 단순 유도체를 포함한다. 예를 들어 메티오닌의 곁가지가 설폭사이드나 설폰인 경우가 포함된다. 아미노산의 곁가지(side chain residue)로서 카르복실산이나, 염기로 구성되어 있을 경우 단순 에스테르등으로 보호기가 붙어있는 경우나, 약제학적으로 허용되는 염(salt) 형태로 존재하는 경우도 포함된다. 또한 곁가지(side chain residue)가 알콜이나, 티올로 구성되어 있을 경우, 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱이 붙은 알킬(-SAC-Ar) 로 치환된 에테르나 티오에테르등(치환체: -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar)도 포함된다. R₁또는 R₃로 인하여 인접위치가 스테레오센터가 되는 경우 두가지 경우의 입체화합물이 모두 포함되며, 두가지형의 화합물이 공존하는 경우(디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함된다.

VI) R₂는 SAC, SCAC, Ar, -SAC-Ar 일 수 있으며, 모든 천연아미노산의 곁가지(side chain residue)를 포함한다. R₂로 인하여 인접위치가 스테레오센터가 되는경우 두가지 경우의 입체화합물이 모두 포함되며, 두가지형의 화합물이 공존하는 경우(디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함된다. R₂가 아미노산의 곁가지(side chain residue) 로서 카르복실산이나, 염기로 구성되어 있을 경우 단순 에스테르등으로 보호기일 경우 단순 에스테르등으로 보호기가 붙어있는 경우나, 약제학적으로 허용되는 염(salt) 형태로 존재하는 경우도 포함된다. R₂는 다음의 특별한 경우도 포함한다, 즉, -(CH₂)_nOR (R = SAC, SCAC, Ar, Ar-SAC: n = 1, 2), -(CH₂)_nOC(=O)R (R=SAC, SCAC, Ar, Ar-SAC: n=1, 2)

VII) R₄는 모든 아미노산의 유기산 아실그룹, 또는 -C(=O)R(R = H, -SAC, -ACAC, -Ar, -SAC-Ar), -C(=O)OR(R=SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar), -C(=O)NRR'(R,R' = H, SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar), -SOR(R = SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar) 또는 -SO₂R(R = SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar)를 포함한다.

VIII) R₁과 인접한 R, 및 R₃와 인접한 R 은 각각 서로 연결되어 (CH₂)n, (CH₂)n-O-(CH₂)m 또는 (CH₂)n-NR'-(CH₂)m [여기에서, n+m < 9 이며, R' 는 SAC, SCAC, Ar, SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-ACAC, -C(=O)-Ar 또는 -C(=O)-SAC-Ar 이다]을 포함한다.

IX) Q 그룹은 하기와 같은 구조를 나타낼 수 있으며,

여기에서

n+m<5 이고, X 는 NH, NR, O, CH₂, S을 나타내고, R 및 R₅는 각각 독립적으로 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar)을 포함한다. 또한, 독립적으로 R₅와 (CH₂)_nX(CH₂)_m이 이미다졸에 연결된 치환위치는 이미다졸의 1-5 위치 어느 곳이라도 좋다.

X) W 그룹은 -NR₆R₇[R₆및 R₇은 각각 독립적으로 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar)이거나, 또는 각각 서로 연결되어 고리형 화합물일 수도 있다. 즉, R₆-R₇, R₇-R₆= (CH₂)n, (CH₂)n-O-(CH₂)m, (CH₂)n-NR₈-(CH₂)m [n+m < 9, R₈= SAC, SCAC, Ar, SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-ACAC, -C(=O)-Ar, -C(=O)-SAC-Ar]을 포함한다.

본 발명에서 나타난 이소옥사졸린이나 이소옥사졸을 합성하는 법은 하기 반응식 1 및 2에서 나타낸 바와 같다. 이 설명은 단지 가장 일반적으로 본 발명에서 사용된 방법 만을 나타낸 것일 뿐 단위조작의 순서는 얼마든지 바꿀 수 있으므로 아래에서 설명하는 방법에만 국한 되는 것은 아니다.

아미노기가 보호된 아미노산 1을 환원하여 N-프로텍티드 아미노알콜 2를 합성하고, 2를 다시 산화하여 N-프로텍티드 아미노 알데히드 3 을 만든다. N-프로텍티드 아미노 알데히드 3을 알콜-물 혼합용액에서 히드록실아민-히드로클로라이드 및 탄산나트륨과 반응하여 옥심4(syn, and anti oxime)를 합성한다. 얻어진 옥심유도체4를 디메틸포름아미드 용액에서 NCS (N-chlorosuccinimide)를 처리하여 히드록사모일클로라이드 유도체 5(hydroxamoyl chloride)를 합성한다. 히드록사모일클로라이드 유도체를 합성하는데 사용한 치환체로는 다음과 같은 그룹들이 대표적이다. P₁은 Cbz, t-Boc등이며, R 은 주로 H이고, R₃는 주로 이소프로필, H이다.

a) P₁=Cbz, R=H, R₃=i-Pr

b) P₁=t-Boc, R=H, R₃=i-Pr

c) P₁=Cbz, R=H, R₃=H

d) P₁=t-Boc, R=H, R₃=H

얻어진 히드록사모일클로라이드 5 를 아크릴레이트 유도체 6와 반응시켜 이소옥사졸린 유도체 7을 얻는다(반응식 2 참조). 경우에 따라서는 옥심유도체 4에서 직접 이소옥사졸린 유도체 7을 얻기도 한다. 보호기 P₁를 바로 억제제에 사용할 수 있는 경우(예로서 Cbz 그룹을 들 수 있다)에는, 이소옥사졸린 유도체 7을 직접 화합물 9와 반응시켜 일반식으로 표시된 화합물을 얻고, 보호기 P₁을 새로운 치환기로 변환할 필요가 있는 경우는 P₁를 제거하고 다시 R₄기를 도입한다.

7a) P₁= t-Boc, R = H, R₃= i-Pr, R₂= CH₂Ph, P₂=Et

7b) P₁= t-Boc, R = H, R₃= i-Pr, R₂= CH₂OPh, P₂= Et

7c) P₁= t-Boc, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 1-나프틸, P₂= Et

7d) P₁= t-Boc, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 2-나프틸, P₂= Et

7e) P₁= t-Boc, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 페닐, P₂= Et

7g) P₁= t-Boc, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 4-브로모페닐, P₂= Et

8a) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R = H, R₃= i-Pr, R₂= CH₂Ph, P₂= Et

8b) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R = H, R₃= i-Pr, R₂= CH₂OPh, P₂= Et

8c) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 1-나프틸, P₂= Et

8d) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 2-나프틸, P₂= Et

8e) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 페닐, P₂= Et

8f) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 4-브로모페닐, P₂= Et

8g) Q = 1-트리틸-이미다졸-5-일, R = H, R₃= H, R₂= 4-브로모페닐, P₂= Et

9a) P₁= t-Boc, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= CH₂Ph, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

9b) P₁= t-Boc, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= CH₂OPh, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

9c) P₁= t-Boc, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 1-나프틸, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

9d) P₁= t-Boc, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 2-나프틸, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

9e) P₁= t-Boc, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 페닐, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

9f) P₁= t-Boc, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 4-브로모페닐, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

9g) P₁= t-Boc, R' = CH₃, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 페닐, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10a) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= CH₂Ph, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10b) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= CH₂OPh, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10c) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 1-나프틸, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10d) R₄= [(H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 2-나프틸, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10e) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 페닐, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10f) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 4-브로모페닐, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10g) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 4-브로모페닐, R₁= CH₂CH(CH₃)₂, R" = CH₃

10h) R₄=[(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= H, R₂= 페닐, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10i) R₄=[(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 메틸, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10j) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 2-나프틸, W = 페닐

10k) R₄=[(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 2-나프틸, W = 페닐메틸

10l) R₄= [(1H)-이미다졸-5-일]-에타노일, R' = H, R = H, R₃= i-Pr, R₂= 2-나프틸, W = 디페닐메틸

10m) Q = 이미다졸-1-일, R' = H, R = H, R₃= H, R₂= 페닐, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

10n) Q= [(1H)-이미다졸-5-일]-에틸, R' = H, R₂= 4-브로모페닐, R₁= CH₂CH₂SCH₃, R" = CH₃

화학식 1에 나타낸 이소옥사졸 억제제의 경우는 위에서 언급한 이소옥사졸린 합성법과 유사하나, 단지 하이드록사모일 클로라이드 유도체 5와 반응하는 파트너를 아크릴레이트 유도체 6 대신 3중결합을 가진 프로피온 산 유도체와 반응한다는 점만 다르다.

아크릴레이트 유도체 6 을 합성하는 방법은 하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이 크게 두 가지로 나뉜다. 에스테르 유도체 11을 디에틸 옥살레이트와 반응하여 옥살레이트 유도체 12을 합성하고 다시 포름알데히드와 염기 존재하에 반응시키면 원하는 아크릴레이트 유도체 6을 합성할 수 있다. 또 다른 방법으로는 알려진 화합물13a에서 출발하여 여러 가지로 변형이 가능하다. 즉 알려진 화합물13a를 13b, 6e, 6f, 6g등으로 쉽게 변형시켜서 사용하였다.

11 및 12

a) P₂=Et, R₂=Ph

b) P₂=Et, R₂=4-브로모페닐

c) P₂=Et, R₂=1-나프틸

d) P₂=Et, R₂=2-나프틸

6a) R₂=Ph, P₂=Et

6b) R₂=4-브로모페닐, P₂=Et

6c) R₂=1-나프틸, P₂=Et

6d) R₂=2-나프틸, P₂=Et

6e) R₂=CH₂OAc, P₂=Et

6f) R₂=CH₂Ph, P₂=Et

6g) R₂=CH₂OPh, P₂=Et

13a) P₂=Et, Z=OH

13b) P₂=Et, Z=Br

아래에서 본 발명으로 합성한 대표적인 화합물의 구조식을 기술하였다. 이는 이들의 합성법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 기술하기 위한 목적일 뿐이다. 그러므로 하기의 실시예는 본 발명이 실제로 행하여 졌고 또 가능하다는 사실을 증명하기 위한 예시일 뿐, 본 발명이 이로써 제한되는 것은 아니다.

4. 합성및 바인딩 측정의 실시예

a) 히드록사모일 클로라이드 (hydroxamoyl chloride)의 합성

(제조예1): 중간체 N-t-부톡시카르보닐-(S)-발린알 [N-t-butoxycarbonyl- (S)-valinal](3b)의 합성 및 N-t-부톡시카르보닐-(S)-발린알옥심 [N-t-butoxycar- bonyl-(S)-valinal oxime](4b)의 합성

디메틸술폭시드(11.7 mL, 3.0 당량)를 질소 기압하에 정제된 무수 디클로로메탄(약 200mL)에 녹이고, 약 -60^oC 에서 옥살릴클로라이드(oxalyl chloride, 5.78mL, 1.2 eq)을 천천히 가하였다. 10분후에 N-t-부톡시카르보닐-(S)-발리놀(2b) [N-t-butoxycarbonyl-(S)-valinol, 11.23g, 55.24mmol)을 무수 디클로메탄(30mL)에 녹인 용액을 천천히 가하고, 플라스크를 20mL의 디클로로메탄으로 헹구어 넣었다. 결과로 얻어지는 흰색의 서스펜션을 약 50^oC로 유지하면서 한시간 동안 교반하였다. 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine, 28.8mL, 3.0당량)을 가하고 온도를 -23^oC 정도로 약 20분 유지시켰다. 이 용액에 헥산(hexanes, 400mL)을 가하고, 분액 깔때기에서 물(150mL), 1N-KHSO₄용액(total 1L)으로 3번 씻은후, 건조(무수 Na₂SO₄), 감압 농축하였다. 얻어진 옅은 노랑색의 액체(3b)를 더 이상의 정제나 조작을 거치지 않고 바로 다음 단계반응에 사용하였다.

위에서 얻은 알데히드(3b)를 에탄올(60mL)-물(30mL)에 녹이고 상온 물 중탕에서 히드록실아민히드로클로라이드(hydroxylamine hydrochloride, 5.76g, 1.5당량)과 무수탄산나트륨(Na₂CO₃, 4.39g, 0.75 당량)을 가하였다. 약 1분후 많은 양의 고체가 생성되어 물-에탄올(1:1, 60mL)를 가하고 한시간 동안 교반 하였다. 포화된 소금물(100mL)를 가하고 에틸아세테이트로 두번 추출하였다(300mL). 추출액을 옅은 농도의 탄산수소나트륨 용액(NaHCO₃, 100mL x 2)으로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄)-감압농축 하였다. 11.34g 의 흰색분말의 옥심(4b)이 syn, anti 혼합물 형태로 얻어졌다.

(실시예1) : 3-[1-트리틸-이미다졸-5-일]-프로판알 옥심 {3-[1-trityl- imidazole-5-yl]-propanal oxime}

제조예1과 같은 방법으로 합성하였다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.55-7.22(18H, m), 6.68-6.66(1H, two s), 2.88-2.61(4H, m).

(실시예2): 중간체 2-(t-부톡시카보닐)아미노-(2S)-1-클로로-3-메틸-부탄-1-온 옥심 [2-(t-butoxy carbonyl)amino-(2S)-1-chloro-3-methyl-butane-1-one oxime } (5b) 의 합성

위에서 얻은 옥심(4b, 11.34g)을 디메틸포름아미드(100mL)에 녹이고 NCS (N-chlorosuccimide, 7.75g)을 가하였다. 이 용액을 약 40^oC 물 중탕에서 교반한 다음 휘발성 용매를 감압 증류하여 제거하였다. 잔류물질을 에틸아세테이트-헥산(1:1, 150 mL)에 녹이고 물(100mL x 3)로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축하였다. 다시 헥산에 녹이고 감압 농축하여 13.69g의 원하는 화합물(5b)을 얻었다. 이 화합물은 불안정하여 바로 다음반응에 쓰여졌다.

5a,5c, 5d도 제조예1, 실시예 2와 같은 방법으로 합성하였다.

b) 아크릴레이트 유도체의 합성

(실시예3): 에틸2-(4-브로모페닐) 아크릴레이트[ Ethyl 2-(4-bromophenyl) acrylate ] (6b) 의 합성

이미 알려진 에틸 2-페닐프로페노에이트 (Ethyl 2-phenylpropenoate) 의 제법을 따라서 합성하였다. (Helvetica Chimica Acta1986,69,2048)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.46 (2H, d), 7.29 (2H, d), 6.37 (1H, s), 5.90 (1H, s), 4.29 (2H, q), 1.33 (3H, t).

에틸 2-(나프탈렌-1-일)-아크릴레이트[Ethyl 2-(naphthalen-1-yl)-acrylate] (6c)

실시예 3과 유사한 방법으로 합성하였다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.86(2H, t, J = 7.3Hz), 7.44(1H, d, J = 8.8Hz), 7.48-7.43(3H, m), 7.37(1H, d, J = 6.8Hz), 6.70(1H, d, J = 2.0Hz), 5.89(1H, d, J = 2.0Hz), 4.22(2H, q, J = 7.3 Hz), 1.21(3H, t, J = 7.3Hz),

에틸 2-(나프탈렌-2-일) 아크릴레이트 [Ethyl 2-(naphthalen-2-yl)acrylate] (6d)

실시예 3과 유사한 방법으로 합성하였다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.95(1H, s), 7.90-7.86(3H, m), 7.59-7.52(3H, m), 6.47(1H, d, J = 1.0Hz), 6.06(1H, d, J = 1.0Hz), 4.38(2H, q, J = 6.8Hz), 1.40(3H, t, J = 6.8Hz).

(실시예4): 에틸2-(페닐메틸) 아크릴레이트[Ethyl 2-(phenylmethyl)acrylate ] (6f) 의 합성

브로모벤젠 7.15g(4.80mL, 45.5mmol, 2.2eq)을 질소 기압하에 정제된 무수 테트라히드로푸란(30mL)에 녹인후, -78^oC에서 노말부틸리튬(n-BuLi, 2.5M in Hexane, 41.4mmol, 16.6mL, 2.0eq)을 천천히 가하였다. 약 15분간 -78^oC에서 교반한 후, 이 결과로 얻어지는 약간 노란색의 서스펜션을 CuCN (3.71g, 41.4mmol, 2.0eq)의 서스펜션 (정제된 무수 테트라히드로푸란 30mL)에 -78^oC에서 캐뉼라로 가하였다. 약 10분간 -78^oC에서 교반한 후, 에틸 2-브로모메틸아크릴레이트 4.00g (20.7mmol, 1.0eg)을 무수 테트라히드로푸란(30mL)에 녹여서 가하였다. 진한 녹색의 서스펜션을 한시간 동안 천천히 상온으로 올려준 후, 2N HCl(25mL)을 가하였다. 이 혼합물을 celite를 통과하여 녹색빛을 띠는 하얀 침전물을 제거한 후 헥산-에틸아세테이트(9:1) 용액으로 씻어 주었다. 분액 깔때기에서 유기층을 분리하고, 포화된 탄산수소나트륨 용액(NaHCO₃, 100mL)과 소금물(100mL)으로 씻어 주었다. 건조(무수 Na₂SO₄)-감압농축한 후, 관 크로마토그라피(헥산:에틸아세테이트(50:1)로 3.04g(77%)의 원하는 화합물(6f)를 얻었다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 34-7.22(5H, m), 6.26(1H, s), 5.48(1H, s), 4.22(2H, qt, J = 7.3Hz), 2.66(2H, s), 1.29(3H, t, J = 7.3Hz).

(실시예5): 에틸 2-아세톡시메틸아크릴레이트[Ethyl 2-acetoxymethylacryl- ate] (6e) 의 합성

에틸 2-히드로시메틸아크릴레이트 (Ethyl 2-hydroxymethylacrylate) (13a, 17.3g, 133mmol, 순도 약 70%, 합성법: Villieras, J. and Rambaud, M. Synthesis,1982,914)를 질소 기압하에 약 200mL의 무수 디클로로메탄에 녹이고, 0^oC로 유지한 다음 초산 무수물 (18.8 mL, 1.5 eq)과 트리에틸아민(37 mL, 2.0 eq)을 가하였다. 하룻밤 교반 한 후에, 헥산(400 mL)을 가하고, 포화 탄산수소나트륨 용액(300 mL x 2)으로 씻었다. 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축한 다음, 단순증류(simple distillation)하여 14.6g 의 투명한 액체를 얻었다.¹H-NMR(CDCl₃, 500 MHz)로 분석한 결과 약 70%의 순도를 가진 원하는 화합물임이 밝혀졌다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 6.36(1H, s), 5.84 (1H, s), 4.81(2H, s), 4.25(2H, q, J = 7.3Hz), 2.11(3H, s), 1.31(3H, t, J = 7.3 Hz)

(실시예6): 에틸2-페녹시메틸아크릴레이트 (Ethyl 2-phenoxymethylacrylate ) (6g) 의 합성

에틸 2-브로모메틸아크릴레이트 (Ethyl 2-bromomethylacrylate,13b, 2.00g, 10.4 mmol, 합성법: Villieras, J. and Rambaud, M. Synthesis,1982,914)와 페놀(975 mg, 1.0eq)을 질소 기압하에 무수 테트라히드로푸란(20 mL)에 녹이고0^oC로 유지한 다음, 무수탄산칼륨(1.43g, 1.0 mol eq)을 가하였다. 1시간동안 교반 하였으나, 아무런 반응이 일어나지 않아, 무수디메틸포름아미드(20 mL)를 가하고0^oC에서 2 시간, 상온에서 1 시간 동안 교반 하였다. 감압 농축한후, 물(100 mL)를 가하고, 에틸아세테이트로(100 mLx2) 추출하였다. 유기층을 소금물(100 mL)로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축한후, 관 크로마토그래피로 분리(40% 디클로로메탄/헥산)하여 1.712g (80%)의 원하는 화합물을 얻었다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.30 (2H, yt, J=7.3 Hz), 6.99-6.96 (3H, m), 6.41 (1H, s), 6.01 (1H, s), 4.78 (2H, s), 4.27 (2H, q, J = 7.33 Hz)

c) 본 발명에서 사용한 이소옥사졸린(isoxazoline)의 일반적인 합성방법

(실시예7): 3-(1-벤질옥시카보닐아미노-2-메틸-프로필)-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르 [3-(1-benzyloxycarbonylamino-2- methyl-propyl)-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester]의 합성

히드록사모일 클로라이드5a(640 mg, 2.25 mmol)와 에틸2-페녹시메틸아크릴레이트 (6g, 464 mg)을 질소 기압하에 무수 에테르(10 mL)에 녹이고-78^oC로 유지한 다음, 트리에틸아민(627mL, 2.0eq)을 가하였다. 서서히 온도를 상온으로 가도록 유지하면서 하룻밤동안 교반 하였다. 물(100 mL)를 가하고, 에틸아세테이트(100mLx2)로 추출한 다음, 물(100mL)로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축하였다. 관 크로마토그래피로 분리(15% 에틸아세테이트-헥산)하여 851mg(83%)의 원하는 화합물을 얻었다.¹H-NMR로 분석한 결과 거의 1:1디아스테레오머 혼합물이었다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.34(7H, m), 6.98(1H, t, J = 7.3Hz), 6.89(2H, d, J = 7.7Hz), 5.61(1H, d, J = 9.3Hz), 5.15-5.08(2H, m), 4.50 (1H, br s), 4.33-4.22(4H, m), 3.60-3.54(1H, m), 3.32-3.27(1H, m), 2.10 (1H, m), 1.29(3H, m), 1.02-0.94(6H, m).

3-[(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로필)-5-(나프탈렌-2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르]{3-[(1S)-1-t-butoxycarbonyl-amino- 2-methylpropyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester } (7d)

실시예7과 유사한 방법으로 합성하였다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.97(1H, s), 7.86-7.82(3H, m), 7.52-7.48(3H, m), 4.93(1H, br), 4.37(1H, m), 4.25 -4.18(2H, m), 4.10-4.05(1H, two doublets, J = 17.1, 17.6 Hz), 3.28-3.22(1H, two doublets, J = 17.1, 17.1Hz), 2.05(1H, m), 1.43(H, s), 1.24-1.20(3H, m), 0.98-0.91(6H, m).

3-[(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로필)-5-페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르] {3-[(1S)-1-t-butoxycarbonylamino-2- methylpropyl]-5-phenylmethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester} (~1:1 디아스테레오머) (7a)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.25(5H, m), 4.82 and 4.60(1H, two m), 4.25-4.15(3H, m), 3.38-3.29(2H, m), 3.10(1H, m), 2.90(1H, m), 1.43 and 1.42(9H, two s), 1.27(3H, m), 0.90-0.80(6H, m).

5-아세톡시메틸-3-[(1S)-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로필]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, {5-acetoxymethyl-3-[(1S)-1-t-butoxy- carbonylamino-2-methylpropyl]-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester} (7m)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 4.93(1H, br), 4.44-4.26(5H, m), 3.50(1H, m), 3.10(1H, m), 2.08(4H, s + br 1H), 1.46(9H, s), 1.32-1.30(3H, m), 1.02-0.96(6H, m).

3-[(1S)-t-벤질옥시카보닐아미노-2-메틸프로필)-이소옥사졸-5-카르복실산 메틸 에스테르] {3-[(1S)-1-benzyloxycarbonylamino-2-methylpropyl]-isoxazole-5- carboxylic acid methyl ester}

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.35-7.28(5H, m), 6.84(1H, s), 5.35(1H, m), 5.10(2H, 2ABq, J = 18.5, 17.7 Hz), 4.83(1H, m) 3.96(3H, s), 2.19(1H,m), 0.95(1H, m).

5-(4-브로모페닐)-3-{2-[-트리틸-이미다졸-5-일]-에틸}-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르] {5-(4-bromophenyl)-3-{2-[1-trytyl-imidazole- 5-yl]-ethyl}-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester} (8g)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.37(2H, d, J = 8.3 Hz), 7.26-7.01(20H, m), 6.47(1H, s), 4.10(1H, m), 4.08 (1H, m), 3.82(1H, d, J = 7.1 Hz), 2.99(1H, d, j = 7.6 Hz), 2.73(2H, t, J = 7.3 Hz), 2.62(2H, t, J = 8.3 Hz), 1.12(3H, t, J = 7.0 Hz).

d) 이소옥사졸린 (isoxazoline)의 변환 (보호기 제거, R₄그룹의 도입, 에스테르의 가수분해)

(실시예 8): 3-[(1S)-1-아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르 {3-[(1S)-1-amino-2-methylpropyl]- 5-(4-bromophenyl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester }의 합성

3-[(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르 (280mg, 0.60 mmol)을 질소 기압하에 5mL 의 디클로로메탄에 녹이고 0^oC로 유지한 다음 TFA (2mL)를 가하였다. 1.5 시간 후에 감압 증류하여 농축한 다음 잔류물을 약 100mL 의 에틸아세테이트에 녹이고, 포화탄산수소나트륨 수용액(100mL x 2)으로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하였다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 8.30 (1H,s), 7.93-7.84 (4H, m), 7.58-7.52 (2H, m), 7.29-7.22 (2H, m), 7.00-6.81 (4H, m), 5.06-5.01 (1H, m), 4.36-4.24 (4H, m), 3.68-3.61 (1H, m), 3.43-3.39 (1H, m), 2.28 (1H, m), 1.31-1.26 (3H, m), 1.12-1.05 (6H, m).

3-[(1S)-1-아미노-2-메틸프로틸]-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르 {3-[(1S)-1-amino-2-methylpropyl]-isoxazole-5-carboxylic acid methyl ester}

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 6.94(1H, s), 3.97(3H, s), 1.97(1H, m), 1.88(2H, bs), 0.99(3H, d, J = 6.8Hz), 0.92(3H, d, J = 6.8Hz).

3-[(1S)-1-아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-2-일)]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르 {3-[(1S)-1-amino-methylpropyl]-5-(naphthalene- 2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester} (~1.3:1 디아스테레오머)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.99(1H, s), 7.86-7.82(3H, m), 7.53-7.49(3H, m), 4.25-4.02(3H, m), 3.55-3.48(1H, two d, J = 7.3, 6.8Hz), 3.35(0.45H, d, J = 17.1 Hz), 3.19(0.55H, d, J = 17.1Hz), 1.78(1H, m), 1.22 (3H, t, J = 7.3Hz), 0.96-0.82 (6H, m).

(실시예9): 3-[(1S)-1-{2-[(1H)-이미다졸-5-일]-에탄노일아미노}-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 3-[(1S)-1-{2-[(1H)-imidazole-5-yl]-ethanoylamino}-2-methyl-propyl]-5-(4-bromophenyl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester (8f) 의 합성

3-[(1S)-1-amino-2-methyl-propyl]-5-(4-bromophenyl)-4,5-dihydro-iso- xazole-5-carboxylic acid ethyl ester(110mg, 1.30mmol) 에 EDC(86mg, 1.5eq), 4-이미다졸아세트산 하이드로클로라이드(4-imidazoleacetic acid hydrochloride, 58mg, 1.2eq), HOBt (60mg, 1.5eq)를 가하고 0^oC로 유지한 다음, DMF(1.5mL)를 가하였다. 여기에 트리에틸아민 (83mL, 2.0eq)를 가하고, 하룻밤 동안 상온에서 교반 하였다. 감압 증류하여 DMF와 휘발성 물질을 제거한 다음, 잔류물을 약 100mL 의 에틸아세테이트에 녹이고, 물 (50mL)과 포화탄산수소나트륨 수용액(100mL x 2)으로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하였다. 관 크로마토그래피 법으로 정제(에틸아세테이트, 7% 메탄올/디클로로메탄)하여 104mg(73%)의 원하는 화합물을 얻었다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.60(1H, s), 7.59-7.47(3H, m), 7.30(2H, d, J = 8.3Hz), 6.89(1H, s), 4.66(1H, m), 4.21-4.16(2H, two qt, J= 7.3, 6.8Hz), 3.92(1H, d, J = 17.1Hz), 3.57(2H, s), 3.11(0.5H,d, J = 17.1Hz), 3.08 (0.5H,d, J = 17.1Hz), 2.07(1H, m), 1.12-1.19(2H, two triplets, J = 7.3, 6.8Hz), 0.90-0.84 (6H, m).

위의 화합물은 다음과 같이 가수분해 하였다.

(실시예 10): 위의 화합물(46mg, 96.4mmol)을 증류한 테트라히드로푸란(1.5mL)에 녹이고1N-NaOH(113mL, 1.1eq)를 가하였다. 약 4시간 교반하고 1N-HCl로 중화하고 감압증류하여 대부분의 테트라히드로푸란을 제거하고, 잔류물을 디크로로메탄(100mL)에 녹이고, 물로 씻고 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하였다. 정량적으로 얻어진 목적화합물은 더 이상 정제하지 않고 다음단계 반응에 사용하였다.

아래의 화합물들도 위와 동일한 조작을 거쳐 합성하고, 가수분해도 유사한 방법으로 실시하였다.

3-[(1S)-1-{2-[(1H)-이미다졸-5-일]-에탄노일아미노}-2-메틸프로틸]-이소옥사졸-5-카르복실산 메틸 에스테르, 3-[(1S)-1-{2-[(1H)-imidazole-5-yl]-ethanoyl- amino}-2-methyl-propyl]-isoxazole-5-carboxylic acid methyl ester

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.91(1H, d, J = 7.8Hz), 7.57(1H, s), 6.83(1H, s), 6.77(1H, s), 5.0(1H, two doublets, J = 8.8, 6.3Hz), 3.87(1H, s), 3.53(2H, s), 2.12(m, 1H), 0.85(6H, two doublets, J = 6.8, 6.8Hz).

3-[(1S)-1-{2-[(1H)-이미다졸-5-일]-에탄노일아미노}-2-메틸프로틸]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 3-[(1S)-1-{2-[(1H) -imidazole-5-yl]-ethanoylamino}-2-methylpropyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester (8b)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.64(1H, bs), 7.60-6.74(7H, m), 4.71(1H, m), 4.33-4.05(4H, m), 3.63-3.43(3H, m), 3.24(1H, two doublets), 2.08(1H, m), 1.26(3H, t), 1.03-0.80(6H, m).

3-[(1S)-1-{2-[(1H)-이미다졸-5-일]-에탄노일아미노}-2-메틸프로틸]-5-나프탈렌-2-일-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 3-{(1S)-1-[2- ((1H)-imidazole-5-yl)-ethanoylamino]-2-methyl-propyl}-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester (~1.3:1 디아스테레오머) (8d)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.92(1H, s), 7.83(3H, m), 7.55-7.45(5H, m), 6.83 (1H, s), 4.70(1H, m), 4.26-4.17(2H, m), 4.03(1H, d, J = 17.1 Hz), 3.57(2H, m), 3.27-3.21(1H, two doublets, J = 17.1, 17.1 Hz), 2.11-2.05(1H, m), 1.19(3H, m), 0.90-0.83(6H, m).

3-[(1S)-1-{2-[(1H)-이미다졸-5-일]-에탄노일아미노}-2-메틸프로틸]-5-페닐-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 3-[(1S)-1-{2-[(1H)-imid- azole-5-yl]-ethanoylamino}-2-methylpropyl]-5-phenyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester (8e)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.66(1H, s), 7.64(1H, bs), 7.49-7.38(6H, m), 6. 93(1H, two s), 4.77(1H, m), 4.28-4.23(2H, two qt, J = 7.3, 7.3Hz), 4.00(1H, two d, J = 17.4, 17.1 Hz), 3.64(2H, m), 3.24(0.5H, d, J = 17.1Hz), 3.21(0.5H, d, J = 17.6Hz), 2.15(1H, m), 1.29-1.25(2H, two triplets, J = 7.3, 7.3Hz), 0.97-0.90(6H, m).

e)이사옥사졸린 (isoxazoline)의 변환 (에스테르 가수분해, R₁그룹의 도입, 보호기 제거)

(실시예 11): (2S)-2-{3-[(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-t-butoxycarbonylamino-2-methylpropyl]-5- (naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (~1.3:1 디아스테레오머) (9d) 의 합성

(2S)-2-{3-[(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르(1.30g, 2.34mmol)을 테트라히드로푸란(14mL)에 녹이고, 1N-NaOH(2.80 mL)를 가하였다. 상온에서 3시간 교반후, 1N-HCl(2.80mL)를 가하고 감압 농축하였다. 잔류물에 포화 소금물 (50mL + 2-3mL의1N-HCl )을 가하고 에틸아세테이트(100mLx2)로 추출한 후 건조(무수 Na₂SO₄), 감압 농축하여 1.04g (109%)의 이소옥사졸린카르복스산을 얻었다. 더 이상의 정제를 거치지 않고 다음 단계에 바로 사용하였다.

위에서 얻은 이소옥사졸린카르복스산(457mg, 1.10mmol)과 L-methionine methyl ester hydrochloride 221mg, 1.0eq)를 약 15mL의 디메틸포름아미드에 녹이고 0^oC로 유지한 다음 HOBt (180mg, 1.2 eq), EDC (255mg, 1.2 eq) 트리에틸아민(0.23mL, 1.5eq)를 가하고, 서서히 온도를 상온으로 가도록 유지하면서 3 시간 동안 교반 하였다. 감압 농축하여 용매를 제거하고, 잔류물을 일반적인 방법으로 처리, 관 크로마토그라피(25% EtOac in Hexane)를 이용하여 508mg(82%)를 얻었다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 8.00(1H, d), 7.85-7.80(3H, m), 7.63(1H, m), 7.50-7.44(3H, m), 4.93(1H, m), 4.63(1H, m), 4.39(1H, m), 4.05-3.95 (1H, two doublets, J = 17.1, 17.1 Hz), 3.74 and 3.64(3H, two singlets), 3.32-3.24(1H, two doublets), 2.48(1H, m), 2.28(1H, m), 2.18-1.85(6H, m), 1.44 and 1.42(9H, two singlets), 0.98-0.84(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로틸]-5페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)- 2-{3-[(1S)-1-t-butoxycarbonylamino-2-methyl-propyl]-5-phenylmethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (~1:1 디아스테레오머) (9a)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.28(5H, m), 7.07(1H, d, 7.8Hz), 4.84-4.20(3H, m), 3.68 and 3.67(3H, two singlets), 3.34-3.27(2H, m), 3.13-2.90(2H, m), 2.42(1H, m), 2.05 and 1.99(3H, two singlets), 0.90-0.77(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-1-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2- {3-[(1S)-1-amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-1-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}4-methylthio-butanoic acid methyl ester

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 8.01-7.50(7H, m), 6.78(1H, m), 4.66 (1H, m), 4.53(0.5H, d, J = 17.1Hz), 4.42 (0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.73 and 3.51(3H, two s), 3.58-3.48(1H, m), 3.37(0.5H, d, J = 17.1Hz), 3.23(0.5H, d, J = 17.1Hz), 2.47 (1H, m), 2.20-1.74(3H, m), 2.06 and 1.75(3H, m), 1.01-0.82(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2- {3-[(1S)-1-amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 8.02(1H, s), 7.85-7.47(7H, m), 4.65(1H, m), 4.07(1H, m), 4.09(0.5H, d, J = 17.1H), 3.73 and 3.64(3H, two s), 3.50(1H, m), 3.35(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.23(0.5H, d, J = 17.1 Hz), 2.49(1H, t, J = 7.3 Hz), 2.27(1H, t, J = 7.3Hz), 2.16-1.81(2H, m), 2.07-1.84(3H, two s), 1.56-0.85(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-아미노-2-메틸프로틸]-5페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)- 1-amino-2-methyl-propyl]-5-phenylmethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.22-7.06(6H, m), 4.51(1H, m), 3.62(3H, two singlets), 3.32-2.77(5H, m), 2.33(1H, m), 2.05-1.67(4H, m), 1.99&1.94(3H, two singlets), 0.80-0.60(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3- [(1S)-1-amino-2-methyl-propyl]-5-(4-bromophenyl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.50-7.28(5H, m), 3.97(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.84(0.5H, d, J = 17.1Hz), 3.73&3.68(3H, two singlets), 3.49(1H, m), 3.22(0.5H, d, J = 17.1Hz), 3.10(0.5H, d, J = 17.6Hz), 2.47-2.31(2H, two triplets, J = 7.8, 7.3 Hz), 2.14-1.92(2H, m), 2.08&1.96(3H, two singlets), 1.79(1H, m), 0.97-0.84(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-메틸아미노-2-메틸프로틸]-5-페닐-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1- methylamino-2-methyl-propyl]-5-phenyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.63-7.30(6H, m), 4.72(1H, m), 4.02(0.5H, d), 3.89(0.5H, d), 3.80 and 3.76 (3H, two s), 3.18(1H, m), 3.26(0.5H, d), 3.18(0.5H, d), 2.56(1H, t), 2.41 and 2.36(3H, two s), 2.38(1H, m), 2.25-1.98(2H, m), 2.14 and 2.05(3H, two s), 1.08-0.89 (6H, m).

(2S)-2-(3-1-아미노메틸-5-페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-(3-aminomethyl-5-phenyl- 4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino)-4-methylthio-butanoic acid methyl ester

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.60-7.29(6H, m), 4.68(1H, m), 3.98(1H, d), 3.81&3.72(3H, two singlets), 3.67(2H, m), 3.31(1H, two doublets), 2.54&2.34(2H, two triplets), 2.26-1.91(2H, m), 2.12&1.97(3H, two singlets)

(2S)-2-(3-클로로메틸-5-페닐-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노)-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-(3-chloromethyl-5-phenyl- 4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino)-4-methylthio-butanoic acid methyl ester

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.47(1H, d, J = 8.0Hz), 7.45-7.25(4H, m), 4.58(1H, m), 4.27-4.19(2H, m), 4.00(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.97(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.68&3.61(3H, two singlets), 2.41(1H, t, J= 7.3Hz), 2.22-1.82(3H, m), 2.01&1.86(3H, two signlets).

f) R₁or R₄group 의 도입으로 화합물10 시리즈합성

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}- ethanoyl]-amino-2-methyl-propyl]-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.86(1H, d), 7.56(1H, s), 7.47(1H, d), 6.83(1H, s), 6.70(1H, s), 4.99(1H, m), 3.87(1H, s), 4.81(1H, m) 3.72(3H, s), 3.53(2H, m), 2.51(2H, t, J = 7.3 Hz), 2.18-1.97(3H, m), 2.04(3H, s), 0.85(6H, two doublets, J = 6.8, 6.3Hz).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-{2-[(1H)-imidazole-5-yl]-ethanoylamino} -2-methyl-propyl]-5-phenylmethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (~1:1 디아스테레오머) (10a)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.64(1H, m), 7.30(6.5H, m), 7.06(0.5 H, d, J = 8.3 Hz), 6.90(1H, s), 4.63-4.52(2H, m), 3.68 and 3.67(3H, two singlets), 3.55(2H, m), 3.30-3.26(1.5H, m), 3.18(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.06(1H, d, J = 13.7Hz), 2.93-2.84(1H, two doublets, J = 18.6, 17.6Hz), 2.38(1H, m), 2.06 and 1.99(3H, two singlets), 2.07-1.71(4H, m), 0.87-0.70(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]- amino-2-methyl-propyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (10b)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.62(1H, d), 7.52(1H, s), 7.50 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.10(2H, 2H, 7.3Hz), 6.89(1H, t, J = 7.3 Hz), 6.81-6.77(4H, m), 4.66-4.56(2H, m), 4.26-4.10(2H, two ABq, J= 10.0, 10.2Hz), 3.66(3H, 2 singlets), 3.51(2H, m), 3.23-3.05(1H, ABq, J = 17.1 Hz), 3.18(1H, s), 2.47-2.40(2H, m), 2.01&1.98(3H, 2 singlets), 2.20-1.93(3H, m), 0.89-0.86(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-1-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]- amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-1-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (10c)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.89-7.44(9H, m), 6.85(1H, s), 6.77(1H, s), 4.71(1H, m), 4.59(1H, m), 4.32(0.5H, d, J = 18.0 Hz), 4.30(0.5H, d, J = 17.6 Hz), 3.73-3.46(2H, m), 3.69&3.48(two singlets, 3H), 3.22(0.5H, d, J = 17.1 Hz), 3.16(0.5H, d, J = 17.1 Hz), 2.41(1H, m), 2.09-1.70(4H, m), 2.02&1.72(3H, two singlets), 0.96-0.86(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-나프탈렌-2-일-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]- amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (10d)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.89(1H, s), 7.76-7.40(11H, m), 6.80&6.77(1H, two singlets), 4.66-4.55(2H, m), 3.85(1H, d, J = 17.6Hz), 3.65&3.56(3H, two singlets), 3.50(2H, m), 2.40(1H, t, J = 7.3Hz), 2.21(1H, t, J = 7.3Hz), 2.00&1.78(3H, two singlets), 2.08-1.78(3H, m), 0.90-0.78(6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]- amino-2-methyl-propyl]-5-(4-bromophenyl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (10f)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.62(2H, m), 7.48-7.28(5H, m), 6.89(1H, two singlets), 4.65(2H, m), 4.71-4.53(2H, m), 4.71-4.53(2H, m), 3.81(1H, two doublets, J = 17.6, 17.6Hz), 3.73&3.68(3H, two singlets), 3.58(2H, two singlets), 3.13(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.07(0.5H, d, J = 17.6Hz), 2.46&2.32(2H, two triplets, J = 7.3, 7.3Hz), 2.11-1.25(3H, m), 2.09&1.97(3H, two singlets), 0.92-0.88(6H, m)

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸펜타노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]-amino- 2-methyl-propyl]-5-(4-bromophenyl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methyl-pentanoic acid methyl ester (10g)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.54-7.11(7H, m), 6.82(1H, s), 4.59(1H, m), 4.42(1H, m), 3.77-3.50(6H, m), 3.09(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.02(0.5H, d, J = 17.6Hz), 1.98(1H, m), 1.58-1.47(3H, m), 1.19-0.73(12H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-페닐-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-{3-[2-((1H)-imidazole-5-yl)-ethanoyl]-aminomethyl]-5- phenyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (10h)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.60-7.23(8H, m), 6.90(1H, s), 4.64(1H, m), 4.24-4.18(2H, m), 3.90(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.89(0.5H, d, J = 18.1Hz), 3.79-3.58(2H, m), 3.78&3.69(3H, two singlets), 3.25(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.22(0.5H, d, J = 17.6Hz), 2.40(1H, t, J = 7.3Hz), 2.30(1H, t, J = 7.8Hz), 2.11&1.95(3H, two siglets), 2.19-1.91(2H, m)

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸에스테르,(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]-amino-2- methylpropyl]-5-methyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (10i)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.68(1H, two singlets), 7.62(1H, d), 7.43(1H, m), 6.96(s, 1h0, 4.70(2H, m), 3.78&3.65(3H, two singlets), 3.65(2H, s), 3.38(0.5H, d, J = 18.1Hz), 3.35(0.5H, d, J = 17.6Hz), 2.90(0.5H, d, J = 17.6Hz), 2.87(0.5H, d, J = 16.6Hz), 2.57&2.51(2H, two triplets, J = 18.8, 18.8 Hz), 2.30-1.98(3H, m), 2.30&1.98(3H, two singlets), 1.66&1.64(3H, two singlets), 0.99-0.95(6H, m).

3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보실산 페닐 아미드, 3-[(1S)-1-[2- {(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]-amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid phenyl amide (Aj)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 8.64(1H,d), 8.03-7.04(14H, m), 6.78(1H, s), 4.70(1H, m), 4.12(1H, two doublets), 3.55(2H, s), 3.28(0.5H, d), 3.21(0.5H, d), 2.02(1H, m), 0.96-0.68(6H, m): MS [M+H]⁺496.

3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보실산 페닐메틸 아미드, 3-[(1S)- 1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]-amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid phenylmethyl amide (Ak)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.88(1H, s), 7.78-7.03(14H, m), 6.78(1H, s), 4.64(1H, m), 4.34(2h, m), 3.90(0.5H, d), 3.88(0.5H, d), 3.48(2H, ABq), 3.18(0.5H, d), 3.13(0.5H, d), 1.98(1H, m), 0.84-0.72(6H, m).

3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(나프탈렌-2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보실산 디페닐메틸 아미드, 3-[(1S) -1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]-amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid diphenylmethyl amide (Al)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.68-6.73(19H, m), 6.13(1H, m), 4.72(1H, m), 3.86(1H, 2 doublets), 3.57(2H, m), 3.13(1H, 2 doublets), 2.03(1H, m), 0.90 (6H, m).

(2S)-2-[3-(이미다졸-1-일)-메틸-5-페닐-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노]-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-[3-(imidazole-1-yl)- methyl-5-phenyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino]-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (10m)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.60-6.85(9H, m), 6.81(2H, m), 3.79(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.77(0.5H, d, J = 17.6Hz), 3.69&3.60(3H, two singlets), 2.99(1H, two doublets, J = 15.6, 17.1Hz), 2.41-2.19(2H, two triplets, J = 8.3, 7.3Hz), 2.10-1.84(2H, m), 2.01and 1.86(3H, two singlets).

(2S)-2-[5-(4-브로모페닐)-3-{2-[1(H)-이미다졸-5-일]-에틸}-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노]-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르, (2S)-2-[5- (4-bromophenyl)-3-{2-[1(H)-imidazole-5-yl]-ethyl}-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino]-4-methylthio-butanoic acid methyl ester (10n)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.50-7.19(6H, m), 6.70(1H, s), 4.54(1H, m), 3.72(1H, two d, J = 17.1, 17.6 Hz), 3.68 and 3.61(3H, two s), 3.03(1H, two d, J = 17.1, 17.6 Hz), 2.84 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.68-2.61 (2H, m), 2.39 (1H, t, J = 7.3 Hz), 2.24 (1H, t, J = 7.0 Hz), 2.07-1.85 (2H, m), 2.01 and 1.89(3H, two s).

g) 화합물 10 시리즈의 가수분해

(실시예12): (2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-나프탈렌-2-일-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 리튬염 (2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl] -amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid lithium salt (Ad)의 합성

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-나프탈렌-2-일-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 메틸 에스테르 {(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-imidazole-5-yl}-ethanoyl]- amino-2-methyl-propyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-methylthio-butanoic acid methyl ester} 17mg(30mmol)을 1.5ml의 혼합용매(H₂0 : MeOH : THF = 1:2:3)에 녹인후 수산화리튬수화물(lithium Hydroxide monohydrate ,1.3mg, 1.0eq)를 가하였다. 상온에서 하루밤동안 교반 한후 감압농축 하여 17mg(100%)의 원하는 salt를 얻었다.

이 salt를 assay에 사용하였다.

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 8.61-6.97 (9H, m), 4.68-4.61 91H, m), 4.34 (1H, m), 3.99 (1H, m), 3.65-3.49 (3H, m), 2.53-1.74 (7H, m): MS [M+H]⁺558.

모든 최종화합물은 위와 동일한 조작을 거쳐 합성하였다.

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 (Aa)

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 7.66 (1H, s), 7.30 (5H, m), 6.98 (1H, m), 4.49-4.19 (2H, m), 3.70-3.02 (6H, m), 2.43-1.83 (7H, m), 0.93-0.61 (6H, m): MS [M+H]⁺522.

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 (Ba)

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 8.52 and 7.60 (1H, two s), 6.91 (2H, s), 4.47 (1H, m), 3.56 (2H, app s), 2.53 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.25-2.10 (2H, m), 2.07 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.89 (3H, d, J = 6.8 Hz) : MS [M+H]⁺430.

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 (Ab)

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 8.57 and 7.64 (1H, two s), 7.28 (2H, m), 6.95 (4H, m), 4.60-4.15 (4H, m), 3.60 (2H, m), 3.38 3.20 (2H, m), 2.57-1.92 (8H, m), 1.02-0.95 (6H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-나프탈렌-1-일-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 (Ac)

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 7.92-7.40 (8H, m), 6.95 and 6.81 (1H, two s), 4.60-4.53 (1H, m), 4.33-4.17 (2H, m), 3.59-3.23 (3H, m), 2.39-1.66 (7H, m), 0.94-0.84 (6H, m) : MS [M+H]⁺558.

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 (Af)

MS [M-Li+2H]⁺580.

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-(4-브로모페닐)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸펜타노일산 (Ag)

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 8.66-7.07 (6H, m), 4.68 (1H, m), 4.38 (1H, m), 3.93-3.25 (4H, m), 2.20-1.55 (4H, m), 1.05-0.87 (12H, m).

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-아미노-2-메틸프로틸]-5-페닐-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 (Ah)

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 8.53 (~0.5H, s), 7.61-6.97 (~6.5H, m), 4.22-4.11 (~3.5H, m), 3.83-3.77 (1H, m), 3.59-3.53 (2H, m), 3.34-3.24 (1H, m), 2.44-1.82 (7H, m).

(2S)-2-[3-(이미다졸-1-일)-메틸-5-페닐-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노]-4-메틸티오-부탄노일산 (Am)

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 8.61-7.07 (8H, m), 5.13 (2H, two s), 4.31 (1H, m), 3.86-3.26 (2H, m), 2.51-1.91 (7H, m) : MS [M+H]⁺409.

(2S)-2-[5-(4-브로모페닐)-3-{2-[1(H)-이미다졸-5-일]-에틸}-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노]-4-메틸티오-부탄노일산 (An)

MS [M-Li+2H]⁺495.

(2S)-2-{3-[(1S)-1-[2-{(1H)-이미다졸-5-일}-에탄노일]-N-메틸아미노-2-메틸프로틸]-5-페닐-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르보닐아미노}-4-메틸티오-부탄노일산 (Ao)

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) d 8.63 (1H, s), 7.70-7.00 (6H, m), 5.10 (1H, m), 4.31 (1H, m), 3.86-1.93 (15H, m), 1.14-0.92 (6H, m) : MS [M+H]⁺522.

5. Ras 파네실 전이효소 억제능 분석

본 실험에서는 폼프리아노(Pompliano et al., Biochemistry 31.3800(1992)) 등의 방법을 개선하여 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 Ras 파네실 전이효소를 사용하였으며 기질은 H-Ras(H-Ras-CVLS)와 K-Ras의 카복시 말단 다염기성 라이신 도메인을 치환시킨 H-Ras와의 결합단백질(특허출원 제97-14409호)을 기 보고된(Chung et al., Bichimica et Biophysica Acta 1129, 278(1992)) 방법에 의해 정제 사용하였다.

효소 반응은 25밀리몰의 포타슘 클로라이드, 25밀리몰의 마그네슘 클로라이드, 10밀리몰 디티티 및 50마이크로몰의 징크 클로라이드를 함유한 50마이크로리터의 50밀리몰 소디움 히피스 완충용액에서 수행하였으며 1.5마이크로몰의 Ras 기질 단백질, 0.15마이크로몰의 트리튬-파네실 피로 포스페이트와 4.5나노몰의 파네실 전이효소가 사용되었다. 상세히 기술하면 파네실 전이효소를 첨가한후 37℃에서 30분간 반응을 지속시킨 후 1몰의 염산을 함유한 에탄올 용액 1밀리리터를 첨가하여 반응을 정지시키고, 생성된 침전물을 필터바인딩을 위한 호퍼 하베스터(호퍼 #FH 225V)를 사용하여 GF/B 필터에 흡착시킨후, 에탄올을 사용하여 세척하고, 건조시킨 필터를 LKB 베타 카운터를 사용, 방사능을 측정함으로 수행하였다. 효소 역가검정은 Ras 기질 단백질과 파네실 효소의 농도가 정량적 역가를 나타내는 기질 불포화 상태에서 측정되었으며 합성된 화합물은 디메칠 설폭사이드(DMSO) 용매에 용해하여 전체 반응액의 5퍼센트 이내에서 첨가하여 효소 저해능을 평가하였다. 효소 저해능은 시료가 없는 상태에서 Ras 기질 단백질에 도입된 파네실에 대해 시료 존재하에서 측정된 파네실 도입량을 백분율로 표시하였으며, 50%의 효소활성을 저해하는 농도를 각 시료의 IC₅₀로 결정하였다. 시료의 선택적 저해능을 평가하기 위한 제라닐제라닐 전이효소는, 샤버등(Schaber et. al. J. Biol chem. 265:14701(1990))의 방법을 변형하여 소뇌로부터 정제하여 사용하였으며, 파네실 전이효소 반응과 유사 조건에서 제라닐제라닐 전이 효소의 특이 기질인 제라닐 제라닐 피로 포스페이트와 Ras-CVIL 기질 단백질을 사용하여 실험을 수행하였다. 이 방법으로 앞에서 얻어진 저해제를 측정한 결과 IC₅₀는 300mM-30nM사이에 나타났다.

6. 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제효능 분석

본 실험에서는 돌연 변이에 의해 형질 전환 활성을 갖는 C-Harvey-Ras 단백질을 발현하는 Rat2 세포주와 K-Ras의 카복시 말단의 다염기성 라이신 도메인으로 치환한 H-Ras와 결합 단백질로 형질전환된 Rat2세포주(특허출원 제97-14409호)를 사용하였으며, 실험 방법은 드크루등 (Declue. J. E. et al., Cancer Research 51:712(1991))에 의해 보고된 방법을 변형하여 수행하였다. 실험을 상세히 기술하면, 형질 전환된 Rat2 피브로 블라스트 세포주를 60mm 세포 배양 디쉬에 3x10⁵세포를 분주하여 37℃ 세포 배양기에서 48시간 배양하여 50%이상 밀도로 자란후 시료를 처리한다. 이때 시료용매는 디메칠설폭사이드(DMSO)를 사용하였으며 대조군, 시험군 공히 1퍼센트 디메칠설폭사이드 농도를 사용한다. 시료를 처리한 뒤 4시간 후에 배지 1밀리리터당 150마이크로큐리의 방사성 동위원소[35S]로 표지된 메치오닌을 첨가하고 20시간 배양한 후 생리적 식염수로 세포를 세척한다. 세포 용해를 위해 1밀리리터의 차가운 세포 용해 완충 용액 (5밀리몰 마그네슘 클로라이드, 1밀리몰 디티티, 1퍼센트 엔피40, 1밀리몰 이디티에이, 1밀리몰 피엠에스에프, 2마이크로몰 루펩틴, 2마이크로몰 펩스타틴에이 및 2마이크로몰 안티페인을 포함하는 50밀리몰 소디움 히피스 완충용액)을 사용하여, 세포가 용해된 상등액을 고속원심분리(12,000g x 5분)에 의해 얻는다. 상등액의 방사성 동이원소 표지량을 측정하여 면역 침전 반응시 정량적 결과를 얻을수 있도록 표준화한 후 Ras 단백질에 특이적 결합을 하는 단일클론 항체, Y13-259(Furth, M.E. et al., J. Virol 43:294(1982))를 넣어 4℃에서 15시간 반응시킨다. 이용액에 다시 고트에서 유래된 쥐의 면역글로블린에 대한 항체가 결합된 Protein A-아가로즈 현탁액을 넣어 1시간 4℃에서 반응시킨 후 면역 반응 침전물을 비특이적 결합물을 제거하기 위해 완충용액(50밀리몰 소디움 클로라이드, 0.5퍼센트 소디움 디옥시 콜레이트, 0.5퍼센트 엔피 40 및 0.1퍼센트 에스디에스를 포함하는 50밀리몰 트리스 클로라이드 완충욕액)으로 세척한다. 침전물의 분석을 위해 전기영동 방법을 사용하며, 침전물을 전기영동 시료 완충액에 끓인 후 13.5퍼센트의 에스리에스 폴리아크릴아마이드 젤을 사용 전기영동을 수행한다. 전기영동후 젤을 고정하고 건조시킨후 X-ray 필름에 감광시킨 후 현상 인화한다. 실험 결과로부터 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제 효능은 Ras 단백질의 파네실이 결합된 밴드와 결합되지 않은 밴드의 강도를 측정하여 50%의 파네실 결합이 저해된 시료농도를 IC₅₀로 결정한다. 이 방법으로 앞에서 얻어진 저해제를 측정한 결과 IC₅₀는 C-Harvey-Ras에서 0.1 mmol-300mM, K-Ras에서 0.1mmol-300mM 사이에서 나왔다.

Claims (3)

1. 하기 화학식 1의 신규한 이소옥사졸(또는 이소옥사졸린) 유도체, 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성체:

   화학식 1

   상기식에서

   I)은 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다(단,이 이중결합인 경우 R₂는 존재하지 않는다).

   II) R 은 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar) 또는 수소를 나타내며, 바람직하게는 수소를 나타낸다.

   III) R' 은 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar) 또는 수소를 나타낸다.

   IV) R" 은 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar) 또는 수소를 나타내며, R" = H 인 경우 약제학적으로 허용되는 염(salt) 형태로 존재하는 경우도 포함된다.

   V) R₁및 R₃는 각각 독립적으로 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 일 수 있으며, 모든 천연아미노산의 곁가지(side chain residue)와 특별히 다음의 단순 유도체를 포함한다. 예를 들어 메티오닌의 곁가지가 설폭사이드나 설폰인 경우가 포함된다. 아미노산의 곁가지(side chain residue)로서 카르복실산이나, 염기로 구성되어 있을 경우 단순 에스테르등으로 보호기가 붙어있는 경우나, 약제학적으로 허용되는 염(salt) 형태로 존재하는 경우도 포함된다. 또한 곁가지(side chain residue)가 알콜이나, 티올로 구성되어 있을 경우, 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱이 붙은 알킬(-SAC-Ar) 로 치환된 에테르나 티오에테르등(치환체: -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar)도 포함된다. R₁또는 R₃로 인하여 인접위치가 스테레오센터가 되는 경우 두가지 경우의 입체화합물이 모두 포함되며, 두가지형의 화합물이 공존하는 경우(디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함된다.

   VI) R₂는 SAC, SCAC, Ar, -SAC-Ar 일 수 있으며, 모든 천연아미노산의 곁가지(side chain residue)를 포함한다. R₂로 인하여 인접위치가 스테레오센터가 되는경우 두가지 경우의 입체화합물이 모두 포함되며, 두가지형의 화합물이 공존하는 경우(디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함된다. R₂가 아미노산의 곁가지(side chain residue) 로서 카르복실산이나, 염기로 구성되어 있을 경우 단순 에스테르등으로 보호기일 경우 단순 에스테르등으로 보호기가 붙어있는 경우나, 약제학적으로 허용되는 염(salt) 형태로 존재하는 경우도 포함된다. R₂는 다음의 특별한 경우도 포함한다, 즉, -(CH₂)_nOR (R = SAC, SCAC, Ar, Ar-SAC: n = 1, 2), -(CH₂)_nOC(=O)R (R=SAC, SCAC, Ar, Ar-SAC: n=1, 2)

   VII) R₄는 모든 아미노산의 유기산 아실그룹, 또는 -C(=O)R(R = H, -SAC, -ACAC, -Ar, -SAC-Ar), -C(=O)OR(R=SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar), -C(=O)NRR'(R,R' = H, SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar), -SOR(R = SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar) 또는 -SO₂R(R = SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar)를 포함한다.

   VIII) R₁과 인접한 R, 및 R₃와 인접한 R 은 각각 서로 연결되어 (CH₂)n, (CH₂)n-O-(CH₂)m 또는 (CH₂)n-NR'-(CH₂)m [여기에서, n+m < 9 이며, R' 는 SAC, SCAC, Ar, SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-ACAC, -C(=O)-Ar 또는 -C(=O)-SAC-Ar 이다]을 포함한다.

   IX) Q 그룹은 하기와 같은 구조를 나타낼 수 있으며,

   여기에서

   n+m<5 이고, X 는 NH, NR, O, CH₂, S을 나타내고, R 및 R₅는 각각 독립적으로 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar)을 포함한다. 또한, 독립적으로 R₅와 (CH₂)_nX(CH₂)_m이 이미다졸에 연결된 치환위치는 이미다졸의 1-5 위치 어느 곳이라도 좋다.

   X) W 그룹은 -NR₆R₇[R₆및 R₇은 각각 독립적으로 알킬그룹(-SAC)이거나, 사이클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar)이거나, 또는 각각 서로 연결되어 고리형 화합물일 수도 있다. 즉, R₆-R₇, R₇-R₆= (CH₂)n, (CH₂)n-O-(CH₂)m, (CH₂)n-NR₈-(CH₂)m [n+m < 9, R₈= SAC, SCAC, Ar, SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-ACAC, -C(=O)-Ar, -C(=O)-SAC-Ar]을 포함한다.
2. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제 1 항에 정의된 화합물을 함유함을 특징으로 하는 항암제 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 경구투여형, 주사제형 또는 패취형으로 제조된 조성물.