JPWO2014027663A1 - ウシ白血病ウイルス検出用プライマーセット、及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明に係るプライマーセットは、ウシ白血病ウイルス(BLV)に由来するDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅可能なものである。すなわち、本発明に係るプライマーセットは、BLV由来のDNA又は当該DNAの断片にハイブリダイズして、PCRにより所定サイズの上記DNA断片を増幅させる。
ウシ白血病ウイルスに由来するDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せからなるプライマーセットであって、上記フォワードプライマーは、(1)配列番号1に示す塩基配列における16番目のシトシンを含んだ15個以上の連続する塩基を含むポリヌクレオチドからなる第一のプライマーと、(2)配列番号2に示す塩基配列における少なくとも1〜15番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなる第二のプライマーとの混合物であって、配列番号2中における塩基MはA(アデニン)又はC(シトシン)を示し、塩基NはA、C、G(グアニン)又はT(チミン)を示し、塩基YはC又はTを示し、塩基KはG又はTを示し、塩基DはA、G又はTを示し、上記第二のプライマーに含まれる塩基M、塩基N、塩基Y、塩基K、及び塩基Dのうちの2つ以上は2種以上の塩基を指定する縮重塩基であるとともに、当該第二のプライマーは、配列番号3〜12に示す各塩基配列における少なくとも1〜15番目の塩基を含む10種のポリヌクレオチドを少なくとも含んでいる、プライマーセット。なお、本明細書において「塩基」とは特に断りの無い限り核酸塩基を指す。
本発明に係るBLVの検出キットは、上記説明した本発明に係るプライマーセットを備える。この検出キットは、BLVの有無の判別を含む検出に用いる。さらに、必要に応じて、1)PCRに用いる各種試薬及び器具(ポリメラーゼ、PCRバッファー、各dNTP、ピペット等)、2)PCRに供するDNAを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具(試験管、バッファー等)、3)PCR増幅断片を解析するための各種試薬及び器具(電気泳動ゲル材料、ピペット等)、4)さらなる詳細解析のため、特定のBLVのみを増幅可能なPCRプライマーセット、5)検出キットの使用説明書、等の少なくとも1つを備えていてもよい。
本発明に係るBLVの検出方法は、以下の工程:
(a)対象サンプルからDNAを含有する試料を調製する工程、
(b)上記試料に対して、本発明に係るプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(c)上記(b)の工程で得られる増幅断片を検出する工程、を含む。
工程(a)は、対象サンプルからDNAを含有する試料を調製する工程である。ここで、「対象サンプル」とは、BLVの検出をしようとするサンプルを意味する。対象サンプルは、BLVを含む可能性のあるものであればよい。例えば、哺乳動物由来の試料が挙げられ、より具体的にはウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ等のBLVの感染が成立するウシ科の哺乳動物の体液(特に血液又は乳汁)由来又は組織由来の試料が挙げられる。或いは、試験管内でBLVの感染が成立するウシ、ヒツジ、ネコ、コウモリ、ヒト等の多くの哺乳動物由来の培養細胞が挙げられる。DNAを含有する試料は、対象サンプルの種類に応じて常法に従って調製することができる。例えば、BLVのプロウイルスDNAを検出対象とする場合、対象サンプルから常法に従ってゲノムDNAを抽出すればよいし、当該プロウイルスDNAの転写産物(RNA)を検出対象とする場合は、対象サンプルから常法に従ってトータルRNAを抽出し、これを常法に従って逆転写してcDNAとすることで当該試料を得るようにしてもよい。
工程(b)は、工程(a)で得た試料に対して、上記した本発明に係るプライマーセットを用いたPCRを行う工程である。工程(b)におけるPCRは、常法に従って行うことができる。工程(b)により、試料中にBLVが含まれている場合には、使用したプライマーの塩基配列を両端に有するBLV由来のPCR増幅断片が得られる。
工程(c)は、工程(b)で得られるPCR増幅断片の有無を検出する工程である。PCR増幅断片(アンプリコン)の有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動によりPCR増幅断片の有無及びサイズを確認することができる。また、必要に応じて定量的にPCR増幅断片を検出してもよい。なお、工程(b)〜(c)をリアルタイムPCRでワンステップで行うことがより好ましい。
本発明に係るプライマーセットに含まれるフォワードプライマーは、例えば、次のように設計される。実施例に示す11種類の主要なBLVを検出可能とするために、第一のプライマーは配列番号1に記載の塩基配列に基づいて、他のプライマーとは独立に設計する。配列番号1に記載の塩基配列は、DQ287255なるBLV(参考文献・出典等は以下を参照)の変異部位を含んだ塩基配列である。
DQ287255: Hirsch,C., Barbosa-Stancioli,E.F., Camargos,M.F., Reis,J.K.P. and Leite,R.C., Bovine Leukemia Virus LTR: Genetic Variability and Phylogeny of Brazilian Samples, Direct Submission Submitted (10-NOV-2005)(出典A)
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DQ288193: (出典E)。
非特許文献1の記載を参照して、BLV検出用のフォワードプライマーとして配列番号13に示すもの(塩基配列:MNMYCYKDRSYKSYKSAYYTCACCT)を、リバースプライマーとして配列番号14に示すもの(塩基配列:TACCTGMCSSCTKSCGGATAGCCGA)を用いて、以下の条件にてリアルタイムPCR反応によるBLVの遺伝子断片の増幅を行った。なお、配列番号13及び14においてMはA及びCを、NはA、C、G及びTを、YはC及びTを、KはG及びTを、DはA、G及びTを、RはA及びGを、SはG及びCを表す何れも縮重塩基であって、フォワードプライマーの縮重度は393216である。なお、フォワードプライマーは異なる三社(A〜C社)が製造した液体品(液体納品)又は乾燥品(乾燥納品)を用い、リバースプライマーは液体品を用いた。なお、参考例及び実施例において、液体品とは所定の液体(10mM Tris-HCL、1mM EDTA(pH8.0))に溶解した水溶液状態で納品されたオリゴDNAを指し、乾燥品とは乾燥状態で納品されたオリゴDNAを指す。
ウシB細胞白血病細胞株で、白血病ウイルスをつくらないが、1×104copy/μL程度のBLVが検出される細胞株KU−1を培養し、1×107個の細胞を回収した。得られた培養細胞から、Wizard(登録商標) Genomic DNA Purification Kit(Promega)を用いてゲノムDNAを抽出し、TEバッファーに溶解して50ng/μL、100μg程度のゲノムDNA溶液を回収し、リアルタイムPCR用の高濃度試料(HA)サンプルとして使用した。
リアルタイムPCRにおいて用いたTaqManプローブの配列は、DRA検出用のVIC‐DRAが(5’‐VIC‐TGTGTGCCCTGGGC‐NFQ‐MGB‐3’:配列番号15)であり、BLV検出用のFAM‐BLVが(5’‐FAM‐CTCAGCTCTCGGTCC‐NFQ‐MGB‐3’:配列番号16)である。また、リアルタイムPCRは、Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステムを用いて、以下のPCR反応条件下で行った。
・PCR用の反応液組成:
(1)DRA用反応液(20μL中)
DRA検出用フォワードプライマー及びDRA検出用リバースプライマー 各85nM
(DRA検出用フォワードプライマーの配列(配列番号20):CCCAGAGACCACAGAGCCTGC)
(DRA検出用リバースプライマーの配列(配列番号21):CCCACCAGAGCCACAATCA)
2×TaqMan Gene Expression Master mix 10μL
ウシ由来ゲノムDNA 150μg
(2)BLV用反応液(20μL中)
BLV検出用のフォワードプライマー 850nM
BLV検出用のリバースプライマー 85nM
2×TaqMan Gene Expression Master mix 10μL
ウシ由来ゲノムDNA 150μg
・PCRの反応条件(DRAの検出とBLVの検出とで共通):
50℃で2分、続いて95℃で10分反応した後に、95℃で15秒の反応と60℃で1分の反応とを1サイクルとして、85サイクルの反応を行った。
図1〜図2は、リアルタイムPCRのサイクル数(横軸)とデルタRn(縦軸)との関係(いわゆるamplification plot)を示す。図1から分かるように、異なる会社が製造した液体品間、及び乾燥品間の何れでも品質のバラつきが観察された。また、図2は、図1中で最も優れた品質を示すA社の液体品(「A社 液体納品」と記載)を、A社の異なるロットA〜C(液体品及び乾燥品)と比較したものである。図2に示す通り、同一製品でもロットが異なれば品質のバラつきが観察された。
まず、BLV検出用のフォワードプライマーとして下記の表1に示すNo.5−1〜5−3の混合物(セット5と称する)を、リバースプライマーとして配列番号14に示すもの(参考例1と同じ配列)を用いて、以下の条件にてリアルタイムPCR反応によるBLVの遺伝子断片の増幅を行った。なお、フォワードプライマーにおいてBはA、C及びGを、YはC及びTを、KはG及びTを、RはA及びGを表す何れも縮重塩基であって、フォワードプライマーの縮重度は64である(表1中のNo.5−2の配列では3×2×2×2×2=48、No.5−3の配列では2×2×2×2=16)。なお、フォワードプライマーは液体品を用い、リバースプライマーは液体品を用いた。
参考例1で調製した濃度既知の1 cut検量線プラスミド1×107mol/μL(107 copy)のストックを100倍〜100万倍に希釈した試料(1×101mol/μL(10 copy)〜1×105mol/μL(105 copy))、及び、リアルタイムPCR用の高濃度試料(HA)と、当該HAをBLVが検出されないウシゲノムDNAを使用し、10倍〜1000倍に希釈し、50ng/μLに調製した試料も準備した。
リアルタイムPCRの反応試薬として表3に示す組成のものを用いた点以外は、参考例1と同様の反応条件、及びデータ解析条件に従った。
図3は、リアルタイムPCRのサイクル数(横軸)とデルタRn(縦軸)との関係(amplification plot)を示す。図3は、参考例1で最も優れた品質を示すA社の液体品(図中で「A社 液体納品」と記載)を、上述のセット5及び6と比較したものである。
図3及び表4〜5に示す通り、セット5及び6は何れもA社の液体品より高品質であった。
BLV検出用のフォワードプライマーとして上記の表2に示すNo.6−1〜6−2の混合物(セット6)を、リバースプライマーとして配列番号14に示すものを用いて、以下の条件にてリアルタイムPCR反応によるBLVの遺伝子断片の増幅を行った。なお、セット6は実施例1で用いたものを含めて4ロットを準備した。
実施例1と同様に、濃度既知の1 cut検量線プラスミド1×107mol/μL(107 copy)のストックを100倍〜100万倍に希釈した試料(1×101mol/μL(10 copy)〜1×105mol/μL(105 copy))を用意した。
リアルタイムPCRの反応試薬として、上記の表3に示す組成を用い、50℃で2分、95℃で10分反応させた後、95℃で15秒、60℃で1分の反応を1サイクルとして85サイクルのPCR反応を行った。この点以外は、参考例1と同様の反応条件、及びデータ解析条件に従った。
Ct値の測定結果は下記の表6に示す。
BLV検出用のフォワードプライマーとして以下のNo.7−1〜7−2の混合物(セット7:配列番号17及び18)を、リバースプライマーとして配列番号19(TTGCCTTACCTGMCSSCTKSCGGATAGCCGA)に示すものを用いて、以下の条件にてリアルタイムPCR反応によるBLVの遺伝子断片の増幅を行った。また、フォワードプライマーとして実施例1及び2で示したセット6を用いた以外は同じ条件でBLVの遺伝子断片の増幅を行った。なお、セット7中に含まれるプライマーの混合比は表7に示すように調製した。
No.7−1:(配列番号17)
5‘‐AATCCMNMYCYKDAGCTGCTGAYYTCACCT‐3’
No.7−2:(配列番号18)
5‘‐ATCCACACCCTGAGCTGCTGCACCTCACCT‐3’
<リアルタイムPCR用の試料の調製>
実施例1と同様に、濃度既知の1 cut検量線プラスミド1×107mol/μL(107 copy)のストックを100倍〜100万倍に希釈した試料(1×101mol/μL(10 copy)〜1×105mol/μL(105 copy))を用意した。また、リアルタイムPCR用の高濃度試料(HA)を100倍に希釈した試料(LA)も準備した。
リアルタイムPCRの反応試薬として、上記の表3に示す組成を用い、50℃で2分、95℃で10分反応させた後、95℃で15秒、60℃で30秒の反応を1サイクルとして60サイクルのPCR反応を行った。この点以外は、参考例1と同様の反応条件、及びデータ解析条件に従った。
図4は、リアルタイムPCRのサイクル数(横軸)とデルタRn(縦軸)との関係(amplification plot)を示す。また、Ct値の測定結果は下記の表7に示す。
Claims (5)
- ウシ白血病ウイルスに由来するDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せからなるプライマーセットであって、
上記フォワードプライマーは、(1)配列番号1に示す塩基配列における16番目のシトシンを含んだ15個以上の連続する塩基を含むポリヌクレオチドからなる第一のプライマーと、(2)配列番号2に示す塩基配列における少なくとも1〜15番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなる第二のプライマーとの混合物であって、
配列番号2中における塩基MはA又はCを示し、塩基NはA、C、G又はTを示し、塩基YはC又はTを示し、塩基KはG又はTを示し、塩基DはA、G又はTを示し、
上記第二のプライマーに含まれる塩基M、塩基N、塩基Y、塩基K、及び塩基Dのうちの2つ以上は2種以上の塩基を指定する縮重塩基であるとともに、当該第二のプライマーは、配列番号3〜12に示す各塩基配列における少なくとも1〜15番目の塩基を含む10種のポリヌクレオチドを少なくとも含んでいる、
プライマーセット。 - 上記第二のプライマーに含まれる塩基M、塩基N、塩基Y、塩基K、及び塩基Dは全て、取り得る全種の塩基を指定する縮重塩基である、請求項1に記載のプライマーセット。
- 上記第二のプライマーは配列番号2に示す塩基配列における少なくとも1〜18番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなる、請求項1又は2に記載のプライマーセット。
- 請求項1〜3の何れか一項に記載のプライマーセットを備えるウシ白血病ウイルスの検出キット。
- 以下の工程:
(a)対象サンプルからDNAを含有する試料を調製する工程、
(b)上記試料に対して、請求項1〜3の何れか一項に記載のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(c)上記(b)の工程で得られる増幅断片を検出する工程、
を含む、ウシ白血病ウイルスの検出方法。
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