JPWO2009044531A1 - β−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Biochemistry,46(2007)9785−9794 Biochemistry,42(2003)12708−12718 Nature,448(2007)824−827 J.Am.Chem.Soc.,129(2007)6988−6989
(S)−β−フェニルアラニン、(R)−β−フェニルアラニン、L−フェニルアラニンは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。これらの分析条件は次の通りである。
(1)の分析は主に、β−フェニルアラニンの光学純度の測定を目的とする。
カラム;CHIRALPAK WH 4.6×250(ダイセル化学工業株式会社)
カラム温度;50℃
ポンプ流速;1.5ml/min
溶離液;2mmol/l 硫酸銅
検出;UV254nm
本分析条件において、(S)−β−フェニルアラニン及び(R)−β−フェニルアラニンの検出限界は、いずれもおおよそ1×10−4重量%(wt%)であった。
(2) の分析は主に、反応収率の測定を目的とする。
カラム;Develosil TMS−UG−5 4.6×250(野村化学株式会社)
カラム温度;40℃
ポンプ流速;1.0ml/min
溶離液;5mmol/l クエン酸緩衝液(pH6.0):メタノール=8:2(v/v)
検出;UV254nm
(S)−β−フェニルアラニンの光学純度は、上記(1)に示す分析条件下で得られたクロマトグラムのピーク面積値から算出した。また、(S)−β−フェニルアラニンの反応収率は、上記(2)に示す分析条件下で得られたクロマトグラムのピーク面積値から算出した。具体的には、反応液がβ−フェニルアラニンの固体もしくはL−フェニルアラニンの固体を含む場合は、それら固体を含む反応液を一部採取し、0.2mol/l塩酸溶液と混合してそれら固体を溶解した溶液を分析した。(S)−β−フェニルアラニン標品の検量線を用いて(S)−β−フェニルアラニンの生成量(g)をクロマトグラムのピーク面積値から算出し、(式1)から収率を求めた。
(式1)収率(%)=(S)−β−フェニルアラニンの生成量(g)/L−フェニルアラニン添加量(g)×100
[(1)S体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするDNAの合成]
配列番号1に示す塩基配列を有するDNAをDNA2.0社に委託して合成した。該合成DNAは、5'末端及び3'末端付近に、それぞれEcoRI及びHindIIIの制限酵素認識配列を有するようにした。
組換えDNAとして組換えプラスミドを作製した。合成したDNA及びプラスミドpUC18をEcoRI及びHindIIIで消化し、ライゲーション・ハイ(東洋紡績社製)を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Eschrichia coli DH5α(東洋紡績社製)を形質転換した。形質転換体を、アンピシリン(Am)100μg/ml及びX−Gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド)を含むLB寒天培地で培養し、Am耐性でかつ白色コロニーとなった形質転換体を得た。このようにして得られた形質転換体よりプラスミドを抽出した。
通常の塩基配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたDNA断片の塩基配列が配列番号1に示す塩基配列であることを確認した。得られたS体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするDNAを持つプラスミドをpSPAMと命名した。
pSPAMを用いてEscherichia coli DH5αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をMT−11046と命名した。該形質転換体を500mlのバッフル付き三角フラスコ中のAm100μg/mlを含むLB培地100mlに接種し、30℃にてOD(660nm)が0.5になるまで振盪培養した後、IPTG(イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド)が1mmol/lとなるように添加し、さらに16時間振盪培養した。培養液を8000rpmで20分間遠心分離し、得られた菌体をそのまま−20℃にて凍結保存するかまたは0.1mol/lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁し、−20℃にて凍結保存した。
反応液(4.0g)は、8重量%(wt%)L−フェニルアラニン、0.4gの1mol/lトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、実施例1で調製したMT−11046の菌体懸濁液(適当量)および水を含み、25℃で48時間反応させた。反応液中の固体を一部採取し、上記に示す分析条件で分析することで、(S)−β−フェニルアラニンの固体の析出を確認した。(S)−β−フェニルアラニンの反応収率は83%であった。光学純度については、(R)−β−フェニルアラニンが検出限界以下であり、99.5%ee以上であることを確認した。
反応液(4.0g)は、1.7×10−2重量%(wt%)L−フェニルアラニン、0.8gの100mmol/lトリシン緩衝液(pH8.25)、実施例1で調製したMT−11046の菌体懸濁液(適当量)および水を含み、30℃で4時間反応させた。反応液中に(S)−β−フェニルアラニンの固体は析出せず、(S)−β−フェニルアラニンの反応収率は48%であった。
反応液(250g)は、12重量%(wt%)L−フェニルアラニン、実施例1で調製したMT−11046の菌体(適当量)および水を含み、25℃で24時間以上反応させた。反応中、反応液のpHを25%アンモニア水にて表1に示す各pHに調整した。検討した全ての条件下で(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各pHにおける(S)−β−フェニルアラニンの反応収率を表1に示す。
反応液(250g)は、12重量%(wt%)L−フェニルアラニン、実施例1で調製したMT−11046の菌体(適当量)および水を含み、25℃で24時間以上反応させた。反応中、反応液のpHを6mol/l塩酸溶液もしくは25%アンモニア水にて表2に示す各pHに調整した。検討した全ての条件下で(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出しないことを確認した。各pHにおける(S)−β−フェニルアラニンの反応収率を表2に示す。
反応液(250g)は、36重量%(wt%)L−フェニルアラニン、実施例1で調製したMT−11046の菌体(適当量)および水を含み、25℃で24時間以上反応させた。反応中、反応液のpHを25%アンモニア水にて表3に示す各pHに調整した。検討した全ての条件下で(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各pHにおける(S)−β−フェニルアラニンの反応収率を表3に示す。
反応液(250g)は、12重量%(wt%)L−フェニルアラニン、実施例1で調製したMT−11046の菌体(適当量)および水を含み、20℃で24時間以上反応させた。反応中、反応液のpHを25%アンモニア水にてpH9.2に調整した。検討した条件下で、(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。(S)−β−フェニルアラニンの反応収率は62%であった。
反応液(250g)は、36重量%(wt%)L−フェニルアラニン、実施例1で調製したMT−11046の菌体(適当量)および水を含み、25℃で24時間以上反応させた。反応中、反応液のpHを6mol/l塩酸溶液もしくは25%アンモニア水にて表4に示す各pHに調整した。検討した全ての条件下で(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出しないことを確認した。各pHにおける(S)−β−フェニルアラニンの反応収率を表4に示す。
反応液(4.0g)は、12重量%(wt%)L−フェニルアラニン、0.4gの1mol/lトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、実施例1で調製したMT−11046の菌体懸濁液(適当量)および水を含み、表5に示す各温度で24時間以上反応させた。検討した全ての条件下で(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各温度における(S)−β−フェニルアラニンの反応収率を表5に示す。
反応液(250g)は、36重量%(wt%)L−フェニルアラニン、実施例1で調製したMT−11046の菌体(適当量)および水を含み、表6に示す各温度で24時間以上反応させた。反応中、反応液のpHを25%アンモニア水にてpH8.0に調整した。検討した全ての条件下で(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各温度における(S)−β−フェニルアラニンの反応収率を表6に示す。
反応液(4.0g)は、表7に示す各添加量のL−フェニルアラニン、0.4gの1mol/lトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、実施例1で調製したMT−11046の菌体懸濁液(適当量)および水を含み、25℃で24時間以上反応させた。検討した全ての条件下で、(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各基質添加量における(S)−β−フェニルアラニンの反応収率を表7に示す。
反応液(4.0g)は、表8に示す各添加量のL−フェニルアラニン、0.4gの1mol/lトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、実施例1で調製したMT−11046の菌体懸濁液(適当量)および水を含み、10℃で24時間以上反応させた。検討した全ての条件下で(S)−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各基質添加量における(S)−β−フェニルアラニンの反応収率を表8に示す。
実施例3において、pH8.0に調製した反応液に6mol/l塩酸を添加してpH2.1に調製し、固体として析出した(S)−β−フェニルアラニンを溶解させた。その後、活性炭(50%含水率)16gを加え、25℃で30分間攪拌し、ろ過により活性炭と菌体成分を除去した。次いで、活性炭を水32gで洗浄し、ろ液と洗浄液を合わせた後、10℃で穏やかに攪拌しながら混合液を20%水酸化ナトリウム水溶液にてpH5.6に調製し、(S)−β−フェニルアラニンを析出させた。晶析液をろ過し、結晶を冷水30mlで3回洗浄した。乾燥後、白色結晶の(S)−β−フェニルアラニン21.6gを得た。結晶の水溶液をHPLCにて分析した結果、(R)−β−フェニルアラニンが検出限界以下であり、光学純度は99.5%ee以上であることを確認した。
Claims (16)
- アミノ酸アミノムターゼの存在下、α−アミノ酸からβ−アミノ酸を合成する工程を含むβ−アミノ酸の製造方法であって、反応液中でβ−アミノ酸を固体として析出させることを特徴とするβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記アミノ酸アミノムターゼは、芳香族アミノ酸アミノムターゼであることを特徴とする請求項1に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記芳香族アミノ酸アミノムターゼは、フェニルアラニンアミノムターゼであることを特徴とする請求項2に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記フェニルアラニンアミノムターゼは、S体選択性フェニルアラニンアミノムターゼであることを特徴とする請求項3に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記フェニルアラニンアミノムターゼは、R体選択性フェニルアラニンアミノムターゼであることを特徴とする請求項3に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記α−アミノ酸は、芳香族L−アミノ酸であることを特徴とする請求項2に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記芳香族L−アミノ酸は、L−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項6に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記β−アミノ酸は、芳香族β−アミノ酸であることを特徴とする請求項2に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記芳香族β−アミノ酸は、β−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項8に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記β−フェニルアラニンは、(S)−β−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項9に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記β−フェニルアラニンは、(R)−β−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項9に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記芳香族アミノ酸アミノムターゼは、チロシンアミノムターゼであることを特徴とする請求項2に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記芳香族L−アミノ酸は、L−チロシンであることを特徴とする請求項6に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記芳香族β−アミノ酸は、β−チロシンであることを特徴とする請求項8に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記反応液のpHが6以上10以下であることを特徴とする請求項1乃至14いずれかに記載のβ−アミノ酸の製造方法。
- 前記反応液の温度が、4℃以上であって、前記アミノ酸アミノムターゼが失活する温度以下であることを特徴とする請求項1乃至15いずれかに記載のβ−アミノ酸の製造方法。
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