JPWO2008111597A1 - Ｈｌａクラスｉを認識する抗体を有効成分として含有する化学療法剤耐性癌治療剤、およびその利用 - Google Patents

Abstract

本発明者らは、MDR1およびHLAクラスIAタンパク質を高発現している化学療法剤耐性血液腫瘍細胞株で、C3B3 diabodyによる細胞傷害活性が親株に比べて低濃度で誘導されることを明らかにした。また、該化学療法剤耐性血液腫瘍細胞株をC3B3 diabody前処理すると、化学療法剤単独による細胞傷害が増強されること、細胞中の薬剤取り込み量が増加することを明らかにした。即ち、HLAクラスIを高発現しているMDR1発現腫瘍細胞に対して、C3B3 diabodyが抗腫瘍活性を発揮すること、および薬剤抵抗性を克服する作用を有することを見出した。

Description

本発明は、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する化学療法剤耐性癌治療剤、およびその利用に関する。また、HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、化学療法剤耐性癌を治療する方法に関する。

HLAは外来性の抗原、細菌、ウイルス感染細胞等を異物と認識し除去する免疫反応において重要な分子である。HLA分子の主な役割は、細胞の中で作られる8〜10残基程度のアミノ酸でできた抗原ペプチドをCD8+T細胞に提示することであり、これによって誘導される免疫応答や免疫寛容に非常に重要な役割を担っている。HLAは、α1〜３の３つのドメインからなる45KDのα鎖と12KDのβ2マイクログロブリン（β2M）のヘテロダイマーによって形成されるクラスIと、α1、α２の２つのドメインからなる30〜34KDのα鎖とβ1、β2の２つのドメインからなる26〜29KDのβ鎖のヘテロダイマーによって形成されるクラスIIに分類される。さらに、HLAクラスI（HLA-I）には、HLA-A、B, C等の存在が知られている(以下において、HLA-Aを「HLAクラスI A（HLA-IA）」とも称する)。

これまでに、リンパ球細胞において抗HLAクラスI A抗体によるライゲーションで、細胞増殖抑制効果や細胞死誘導効果が報告されており、HLA分子のシグナル伝達分子としての可能性が示唆されている。例えばヒトHLAクラスI Aのα1ドメインに対する抗体B9.12.1、α2ドメインに対する抗体W6/32、α3ドメインに対する抗体TP25.99, A1.4は、活性化リンパ球に対して細胞増殖を抑制するとの報告がある（非特許文献１、２）。また、α1ドメインに対する二種類の抗体MoAb90, YTH862は、活性化リンパ球に対してアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献２、３、４）。この２つの抗体によって誘導されるアポトーシスはカスパーゼを介した反応であることが明らかにされており（非特許文献４）、このことからリンパ球細胞で発現するHLAクラスI Aは、アポトーシスの信号伝達にも関与していると推測されている。

さらに、ヒトHLAクラスI Aのα3ドメインに対する抗体 5H7（非特許文献５）、マウスMHCクラスIのα2ドメインに対する抗体RE2（非特許文献６）も、活性化リンパ球などに細胞死を誘導することが報告されている。

ヒト骨髄腫細胞を免疫して得られたモノクローナル抗体2D7（非特許文献８）も、HLAクラスI Aを認識する抗体であり、該2D7を低分子化（diabody化）することにより、ヒト骨髄腫細胞株に対して短時間で激しい細胞死を誘導することが報告されている。また、ヒトHLAクラスIAと、ヒトβ2Mを共発現させた細胞をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体C3B3（特許文献５）はHLAクラスI抗原のα２ドメインを認識する抗体であり、抗マウスIgG抗体とクロスリンクすることにより、強い細胞傷害活性を示す。さらにこのC3B3抗体を低分子化抗体（C3B3 diabody）へと改変することにより、C3B3 diabody (C3B3-DB)単独で2D7 diabody単独よりも強い抗腫瘍作用を示した（特許文献５）。

2D7 diabodyおよびC3B3 diabodyは、各種ヒト骨髄腫細胞株、および、活性化リンパ球細胞に対して強い細胞死誘導活性を示し、マウスにヒト骨髄腫細胞株を移植した多発性骨髄腫モデルマウスにおいても、有意な延命効果を示したことから、骨髄腫治療薬として開発が進められている(特許文献１〜５、非特許文献７)。このような、HLAクラスI関与の細胞死誘導を利用した治療をさらに発展させれば、骨髄腫等に対する有効性の高い医薬品が開発されるものと期待される。

悪性腫瘍に対する化学療法の問題点として、腫瘍細胞にATP-binding cassette(ABC) transporter superfamilyに属するMDR1（P糖タンパク, Multidrug resistance protein 1, ATP-binding cassette sub-family B member 1(ABCB1)）の発現が誘導されることが知られている。このMDR1発現は腫瘍細胞の薬剤（化学療法剤）抵抗性の獲得に関与しており、その後の化学療法の効果を減弱させる要因となる。従って、MDR1発現腫瘍に対しては薬剤抵抗性を克服させるような治療戦略の開発が重要な課題となっている。MDR1は細胞内の薬剤を細胞外へ排出する働きをすることから、ABC transporter 阻害剤のverapamilなどを用いてその作用を抑制する治療法の試みがなされているが、未だ臨床的な有効性は確立されていない。一方、MDR1発現腫瘍においてはHLAクラスI分子が高発現していることが報告されている（非特許文献９、１０）。

なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
WO2004/033499 WO2005/056603 WO2005/100560 WO2006/123724 PCT/JP2007/063946 Fayen et al., Int. Immunol., 10: 1347-1358(1998) Genestier et al., Blood, 90: 3629-3639 (1997) Genestier et al., Blood, 90: 726-735 (1997) Genestier et al., J. Biol. Chem., 273: 5060-5066 (1998) Woodle et al., J. Immunol., 158: 2156-2164 (1997) Matsuoka et al., J. Exp. Med., 181: 2007-2015 (1995) Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209 (2004) 岡達三 三共生命科学財団研究報告集 12: 46-56 (1998) Neoplasma,(2003);50(2):p91-96 Prados J, et al. Neoplasm 53 (3):226-231, 2006 Journal of Internal Medicine,(2000),247,p521-534

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する化学療法剤耐性癌治療剤を提供することにある。また、HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、化学療法剤耐性癌を治療する方法の提供を課題とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、C3B3抗体の低分子型抗体であるC3B3 diabody (C3B3-DB)の薬剤抵抗性腫瘍細胞に対する効果について検討した。

まず、化学療法剤（Vincristine）耐性血液腫瘍細胞株で、MDR1およびHLA-1A(HLAクラスIA)タンパク質が高発現していること、および血液腫瘍患者由来の腫瘍細胞を初診時と再発時に比較すると再発時のほうがMDR1およびHLA-1Aタンパク質が高発現していることを確認した。

次に、この化学療法剤耐性血液腫瘍細胞株ではC3B3 diabodyによる細胞傷害活性が親株に比べて低濃度で誘導されることを明らかにした。また、化学療法剤耐性血液腫瘍細胞株をC3B3 diabody(0.1μg/mL)で６時間前処理すると、前処理なしの場合と比較して、化学療法剤(vincristine)による細胞傷害が増強されることを明らかにした。さらに、化学療法剤耐性血液腫瘍細胞株をC3B3 diabody(0.1μg/mL)で前処理すると、細胞表面上のMDR1タンパク質の発現が一部の細胞で低下し、細胞中の薬剤取り込み量が増加することを明らかにした。

即ち、HLAクラスIを高発現しているMDR1発現腫瘍細胞に対して、C3B3 diabodyが抗腫瘍活性を発揮すること、および薬剤抵抗性を克服する作用を有することを見出し、これにより本発明を完成するに至った。

本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔４３〕を提供するものである。
〔１〕 HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、化学療法剤耐性癌治療剤。
〔２〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔１〕に記載の化学療法剤耐性癌治療剤。
〔３〕 化学療法剤と併用することを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の化学療法剤耐性癌治療剤。
〔４〕 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の化学療法剤耐性癌治療剤。
〔５〕 HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、化学療法剤の作用増強剤。
〔６〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔５〕に記載の化学療法剤の作用増強剤。
〔７〕 化学療法剤と併用することを特徴とする、〔５〕または〔６〕に記載の化学療法剤の作用増強剤。
〔８〕 化学療法剤によって治療する癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、〔５〕から〔７〕のいずれかに記載の化学療法剤の作用増強剤。
〔９〕 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、〔８〕に記載の化学療法剤の作用増強剤。
〔１０〕 化学療法剤と併用することを特徴とする、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
〔１１〕 化学療法剤と併用することを特徴とする、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
〔１２〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔１０〕または〔１１〕に記載の医薬組成物。
〔１３〕 化学療法剤およびHLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、癌治療用医薬組成物。
〔１４〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔１３〕に記載の癌治療用医薬組成物。
〔１５〕 化学療法剤によって治療する癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、〔１０〕から〔１４〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔１６〕 化学療法剤耐性癌が、血液腫瘍であることを特徴とする、〔１５〕に記載の医薬組成物。
〔１７〕 HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、化学療法剤耐性癌を治療する方法。
〔１８〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕 化学療法剤を併用することを特徴とする、〔１７〕または〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、〔１７〕から〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕 HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、化学療法剤の作用を増強する方法。
〔２２〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕 化学療法剤を併用することを特徴とする、〔２１〕または〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕 化学療法剤によって治療する癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、〔２１〕から〔２３〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕 化学療法剤およびHLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法。
〔２７〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕 癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、〔２６〕または〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕 化学療法剤耐性癌が、血液腫瘍であることを特徴とする、〔２８〕に記載の方法。
〔３０〕 化学療法剤耐性癌治療剤を製造するための、HLAクラスIを認識する抗体の使用。
〔３１〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔３０〕に記載の使用。
〔３２〕 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、〔３０〕または〔３１〕に記載の使用。
〔３３〕 化学療法剤の作用増強剤を製造するための、HLAクラスIを認識する抗体の使用。
〔３４〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔３３〕に記載の使用。
〔３５〕 化学療法剤によって治療する癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、〔３３〕または〔３４〕に記載の使用。
〔３６〕 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、〔３５〕に記載の使用。
〔３７〕 癌治療用医薬組成物を製造するための、化学療法剤およびHLAクラスIを認識する抗体の使用。
〔３８〕 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔３７〕に記載の使用。
〔３９〕 癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、〔３７〕または〔３８〕に記載の使用。
〔４０〕 化学療法剤耐性癌が、血液腫瘍であることを特徴とする、〔３９〕に記載の使用。
〔４１〕 化学療法剤耐性癌を治療するための方法に使用するためのHLAクラスIを認識する抗体。
〔４２〕 化学療法剤の作用を増強するための方法に使用するためのHLAクラスIを認識する抗体。
〔４３〕 癌を治療するための方法に使用するための化学療法剤およびHLAクラスIを認識する抗体。

〔発明の実施の形態〕
本発明者らは、抗HLAクラスI抗体が化学療法剤耐性癌に対する細胞傷害活性を有することを見出し、これにより、化学療法剤耐性癌の治療が可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。

本発明は、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、化学療法剤耐性癌治療剤に関する。

本発明において、HLAクラスIを認識する抗体としては、HLAクラスIを抗原とし、生物学的作用を有する抗体が挙げられる。

本発明において、HLAとは、ヒト白血球抗原を意味する。HLA分子はクラスIとクラスIIに分類され、クラスIとしてはHLA-A、B、C、E、F、G、H、Jなどが知られている。本発明の抗体が認識する抗原はHLAクラスIに分類される分子であれば特に制限されないが、好ましくはHLA-IAであり、より好ましくはHLAクラスIAのα２ドメインである。

本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。

本発明で使用される抗HLAクラスI抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗HLAクラスI抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。

このような抗体としては、C3B3抗体（特願2006-193053）や、2D7抗体（Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209 (2004)）等が挙げられる。

抗HLAクラスI抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、HLAクラスIを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（WO98/46777など）等に準じて行うことができる。また、HLAクラスIの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のHLAクラスI分子を公知の方法で精製し、この精製HLAクラスI蛋白質を感作抗原として用いることもできる。また、HLAクラスI分子と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。

このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) 、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519 ）、MPC-11（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270 ）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133 ）等が適宜使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C. 、Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。

より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000〜6000程度のPEG溶液を通常、30〜60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。

当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。

具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全RNA を調製し、mRNA Purification Kit (GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。

得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。

目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。

本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

本発明で使用される抗体の具体的な例としては、配列番号：７、８、９に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域を含む抗体、または、配列番号：１０、１１、１２に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体を挙げることができる。

本発明の抗体の好ましい例として、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の重鎖可変領域を含む抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する重鎖可変領域であって、(ａ)に記載の重鎖可変領域と機能的に同等な重鎖可変領域
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAがコードするアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするアミノ酸配列を有する重鎖可変領域

または、本発明の抗体として、以下の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の軽鎖可変領域を含む抗体が例として挙げられる。
（ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（ｆ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域であって、(ｅ)に記載の軽鎖可変領域と機能的に同等な軽鎖可変領域
（ｇ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるDNAがコードするアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（ｈ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域

さらに、このような重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体の例としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する抗体が例として挙げられる。
（ａ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるDNAがコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするアミノ酸配列

重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。

ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が、配列番号：７、８、９に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域または配列番号：１０、１１、１２に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を有する抗体と同等の活性（例えば、HLA-Aへの結合活性、細胞傷害活性、細胞死誘導活性、細胞増殖抑制活性など）を有することを意味する。

あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。

変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。

本発明の抗体には、本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。

本発明で使用される抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明の抗体として使用することができる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明で使用される抗体はこのような抗体も包含する。

本発明には、抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には、配列番号：７、８、９に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域または配列番号：１０、１１、１２に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域コードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体の可変領域をコードするDNAを、抗体定常領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

本発明の抗体には、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）等の塩基または塩基対からなる重合体である。本発明のポリヌクレオチドは天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺伝子工学的な手法により発現させる際に使用することができる。また本発明の抗体と同等な機能を有する抗体をスクリーニングする際に、プローブとして用いることもできる。即ち本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとして用い、ハイブリダイゼーション、遺伝子増幅技術（例えばPCR）等の技術により、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするDNAを得ることができる。このようなDNAも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）は当業者によく知られた技術である。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により得られるポリヌクレオチドがコードする、本発明の抗体と機能的に同等な抗体は、通常、これら抗体とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の抗体には、本発明の抗体と機能的に同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。

本発明で使用される抗体としては、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドにコードされる抗体もまた、好ましい例として挙げることができる。
（ａ）配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチド。

また、本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（chimeric）抗体、ヒト化（humanized）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。

キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。

ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。

具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。

CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。

キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体C領域が使用される。ヒト抗体C領域としては、Cγが挙げられ、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。

キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域からなり、両者はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。

また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。

前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。

また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40)等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。

例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) 、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ）に従えば容易に実施することができる。

大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546；Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。

抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。

複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。

本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Veroなど、(2)両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。

これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。

一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。

哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。

これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。

また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994)24, 131-138）。

上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。

本発明で使用される抗体は、低分子化抗体であってもよい。本発明において低分子化抗体(minibody)とは、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)を親抗体とし、全長抗体の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（VH）又は軽鎖可変領域（VL）を含んでいることが好ましく、特に好ましいのはVHとVLの両方を含む断片である。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（シングルチェインFv）、sc（Fv_２）などを挙げることができるが、好ましくはdiabody (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 及び Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))である。このような抗体断片を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。

本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。

本発明において好ましい低分子化抗体は、抗体のVHを2つ以上及びVLを2つ以上含み、これら各可変領域を直接あるいはリンカー等を介して間接的に結合した抗体である。結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、また、共有結合と非共有結合の両方でよい。さらに好ましい低分子化抗体は、VHとVLが非共有結合により結合して形成されるVH-VL対を2つ以上含んでいる抗体である。この場合、低分子化抗体中の一方のVH-VL対と他方のVH-VL対との間の距離が、全長抗体における距離よりも短くなる抗体が好ましい。

本発明においてscFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域を連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。

scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖又は、H鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖又は、L鎖V領域をコードするDNAを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNAおよびその両端を各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。

また、一旦scFvをコードするDNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、scFvを得ることができる。

これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。

本発明において特に好ましい低分子化抗体はdiabodyである。diabodyは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、scFv等）（以下、diabodyを構成するフラグメント）を2つ結合させて二量体化させたものであり、通常、2つのVLと2つのVHを含む(P.Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 6444-6448 (1993)、EP404097号、WO93/11161号、Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991)、Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996)、Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994)、John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999)、Holliger et al,. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 6444-6448, (1993)、Atwell et al., Mol.Immunol. 33, 1301-1312, (1996))。diabodyを構成するフラグメント間の結合は非共有結合でも、共有結合でよいが、好ましくは非共有結合である。

また、diabodyを構成するフラグメント同士をリンカーなどで結合して、一本鎖diabody（sc diabody）とすることも可能である。その際、diabodyを構成するフラグメント同士を20アミノ酸程度の長いリンカーを用いて結合すると、同一鎖上に存在するdiabodyを構成するフラグメント同士で非共有結合が可能となり、二量体を形成する。

diabodyを構成するフラグメントは、VLとVHを結合したもの、VLとVLを結合したもの、VHとVHを結合したもの等を挙げることができるが、好ましくはVHとVLを結合したものである。diabodyを構成するフラグメント中において、可変領域と可変領域を結合するリンカーは特に制限されないが、同一フラグメント中の可変領域の間で非共有結合がおこらない程度に短いリンカーを用いることが好ましい。そのようなリンカーの長さは当業者が適宜決定することができるが、通常2〜14アミノ酸、好ましくは3〜9アミノ酸、特に好ましくは4〜6アミノ酸である。この場合、同一フラグメント上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため、同一鎖上のVLとVHの間で非共有結合がおこらず、単鎖V領域フラグメントが形成されない為、他のフラグメントとの非共有結合による二量体を形成する。さらに、diabody作製と同じ原理で、diabodyを構成するフラグメントを3つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体化させた抗体を作製することも可能である。

本発明におけるdiabodyとしては、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するdiabodyまたは配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異（置換、欠失、挿入、および／または付加）したアミノ酸配列を有するdiabodyであって、配列番号：６に記載の配列を有するdiabodyと機能的に同等なdiabodyや、配列番号：２のCDR（又は可変領域）および配列番号：４のCDR（又は可変領域）のアミノ酸配列を有するdiabodyまたは配列番号：２のCDR（又は可変領域）および配列番号：４のCDR（又は可変領域）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異（置換、欠失、挿入、および／または付加）したアミノ酸配列を有するdiabodyであって、配列番号：２のCDR（又は可変領域）および配列番号：４のCDR（又は可変領域）の配列を有するdiabodyと機能的に同等なdiabodyを例示できるが、これらに限定されるものではない。

ここで「機能的に同等」とは、対象となるdiabodyが、配列番号：６に記載の配列を有するdiabody、または配列番号：２のCDR（又は可変領域）および配列番号：４のCDR（又は可変領域）の配列を有するdiabodyと同等の活性（例えば、HLA-Aへの結合活性、細胞傷害活性、細胞死誘導活性、細胞増殖抑制活性など）を有することを意味する。

変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。

また、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するdiabodyまたは、配列番号：２のCDR（又は可変領域）および配列番号：４のCDR（又は可変領域）の配列を有するdiabodyを、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的としてヒト化、キメラ化してもよい。

配列番号：２に記載されているアミノ酸配列で、1番目〜125番目が可変領域に相当し、31番目〜35番目がCDR1、50番目〜66番目がCDR2、99番目〜114番目がCDR3に相当する（それぞれ配列番号：７、８、９）。配列番号：４に記載されているアミノ酸配列で、1番目〜107番目が可変領域に相当し、24番目〜34番目がCDR1、50番目〜56番目がCDR2、89番目〜97番目がCDR3に相当する（それぞれ配列番号：１０、１１、１２）。

本発明においてHLAを認識する低分子化抗体は、HLAに特異的に結合し、生物学的作用を有していれば特に制限されない。本発明の低分子化抗体は、当業者に公知の方法により作製することが可能である。例えば、実施例に記載されているように、HLAを認識する抗体の配列（特に可変領域の配列や相補鎖決定領域（CDR）の配列）を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することが可能である。

HLAを認識する抗体の配列は、既に公知の抗体の配列を用いることが可能であり、又、HLAを抗原として、当業者に公知の方法により抗HLA抗体を作製し、その抗体の配列を取得して用いることも可能である。

本発明において、抗HLAクラスI抗体の活性とは、抗体が抗原に結合することにより生じる生物学的作用をいう。例えば生物学的作用としては細胞傷害作用、抗腫瘍作用などが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに具体的な例としては、細胞死誘導作用、アポトーシス誘導作用、細胞増殖抑制作用、細胞分化抑制作用、細胞分裂抑制作用、細胞増殖誘導作用、細胞分化誘導作用、細胞分裂誘導作用、細胞周期調節作用などを挙げることができるが、好ましくは細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用である。
細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用などの上記作用の対象となる細胞は特に限定されないが、血球系細胞や浮遊細胞が好ましい。血球系細胞の具体的な例としては、リンパ球（B細胞、T細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、単球（好ましくは活性化した末梢血単核球(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)）、ミエローマ細胞などを挙げることができるが、リンパ球（B細胞、T細胞）、ミエローマ細胞が好ましく、T細胞またはB細胞（特に活性化したB細胞または活性化したT細胞）が最も好ましい。浮遊細胞は、細胞を培養した際、細胞がガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着することなく、浮遊状で増殖する細胞である。これに対し、接着細胞（付着細胞）とは、細胞を培養した際、ガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着する細胞である。

一般的に、全長抗HLA抗体では細胞死誘導活性を増強させる為に抗IgG抗体などでクロスリンクを行ってもよく、クロスリンクは当業者に公知の方法により行うことができる。

本発明においては、上記HLAクラスIを認識する抗体を投与することにより、例えば、血液腫瘍（造血器腫瘍）などの腫瘍（具体的な例として、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、形質細胞異常症（骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症）、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症）など）や自己免疫疾患（具体的な例として、リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、乾癬、ベーチェット病、など）のような疾患の治療、予防などをおこなうことが可能である。また、本発明の抗体は生体内での安定性に優れていると考えられる為、生体に投与する際には特に有効であると考えられる。

本発明のHLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、化学療法剤耐性癌治療剤は、化学療法剤耐性癌の治療において使用することが可能である。

癌の化学療法とは、化学療法剤を用いて癌を治療することをいう。化学療法に対する反応性は症例により異なるが一般に、複数の異なる作用機序に基づいた薬剤を組み合わせて用いる事により相乗的な効果を期待しつつ副作用を最小限とするよう投与が行なわれる。

また、化学療法剤に対する耐性癌としては、治療の初めから化学療法剤の効果がみられない自然耐性と、治療を続けていくうちに最初は有効であった化学療法剤が効かなくなり、癌が再発する獲得耐性とが挙げられる。本発明の治療剤が使用される化学療法剤耐性癌は自然耐性、獲得耐性のどちらであってもよいが、好ましくは獲得耐性癌である。化学療法剤に対する獲得耐性癌の特徴としては、例えば、薬物代謝酵素類の過剰発現や薬剤標的蛋白の変異、薬剤の細胞内取り込みの減少、薬剤の細胞外排出の増大等が挙げられるが、これに限定されるものではない。薬剤の細胞外排出に関与するタンパク質の具体的な例としては、MDR1（P糖タンパク）が挙げられる。

本発明の治療剤が使用される癌としては、特に限定されないが、好ましくは血液腫瘍（造血器腫瘍）などの腫瘍、具体的には、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、形質細胞異常症（骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症）などの耐性癌を挙げることができる。

本発明における「化学療法剤」には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然産物、白金錯体、およびその他の薬剤が含まれる。アルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード類(Nitrogen Mustards)、エチレンイミン類(Ethylenimines)、メチルメラミン類(Methylmelamines)、スルホン酸アルキル類(Alkyl Sulfonates)、ニトロソウレア類(Nitrosoureas)、トリアゼン類(Triazens)が挙げられる。ナイトロジェンマスタード類としては、例えば、メクロルエタミン(Mechlorethamine)、シクロフォスファミド(Cyclophosphamide)、イフォスファミド(Ifosfamide)、メルファラン(Melphalan)、クロラムブシル(Chlorambucil)が挙げられる。エチレンイミン類とメチルメラミン類としては、例えば、ヘキサメチルメラミン(Hexamethylmelamine)、チオテパ(Thiotepa)が挙げられる。スルホン酸アルキル類としては、ブスルファン(Busulfan)が挙げられる。ニトロソウレア類としては、例えば、カルムスチン(Carmustine: BCNU)、ロムスチン(Lomustine: CCNU)、セムスチン(Semustine: methyl-CCNU)、ストレプトゾシン(Streptozocin)が挙げられる。トリアゼン類としては、ダカルバジン(Dacarbazine: DTIC)が挙げられる。代謝拮抗剤としては、葉酸類似物質、ピリミジン類似物質、プリン類似物質が挙げられる。葉酸類似物質としては、メトトレキセート(Methotrexate)が挙げられる。ピリミジン類似物質としては、例えば、フルオロウラシル(Fluorouracil: 5-FU)、ドキシフルリジン(Doxifluridine: 5'-DFUR、商品名 フルツロン)、カペシタビン(Capecitabine、商品名 ゼローダ)、フロクスウリジン(Floxuridine: FudR)、シタラビン(Cytarabine)が挙げられる。プリン類似物質としては、例えば、メルカプトプリン(Mercaptopurine: 6-MP)、チオグアニン(Thioguanine: TG)、ペントスタチン(Pentostatin)が挙げられる。天然産物としては、ビンカアルカロイド類(Vinca Alkaloids)、エピポドフィロトキシン類(Epipodophyllotoxins)、抗生物質類が挙げられる。ビンカアルカロイド類としては、例えば、ビンブラスチン(Vinblastine: VLB)、ビンクリスチン(Vincristine: VCR)が挙げられる。エピポドフィロトキシン類としては、例えば、エトポシド(Etoposide)、テニポシド(Teniposide)が挙げられる。抗生物質としては、例えば、ダクチノマイシン(Dactinomycin: actinomycin D)、ダウノルビシン(Daunorubicin)、ドキソルビシン(Doxorubicin)、ブレオマイシン(Bleomycin)、プリカマイシン(Plicamycin)、マイトマイシン(Mitomycin)が挙げられる。白金錯体とは、プラチナ配位複合体を指し、例えば、シスプラチン(Cisplatin: CDDP)、カルボプラチン(Carboplatin)が挙げられる。その他の薬剤としては、タキソール類、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、アントラセネジオン類(Anthracenediones)、例えばミトキサントロン(Mitoxantrone)、尿素置換体類、例えばヒドロキシウレア(Hydroxyurea)、メチルヒドラジン類(Methyl Hydrazines)、例えば塩酸プロカルバジン(Procarbazine Hydrochloride、商品名 ナツラン)、ビタミンＡ代謝物類、例えばトレチノイン(Tretinoin、商品名 ベサノイド)が挙げられる。

本発明の抗HLAクラスI抗体は、化学療法剤の作用増強剤としても使用することもできる。

本発明において「作用増強剤」とは、他の薬剤と同一の対象に対して使用されたときに、当該他の薬剤の特定の作用を強める作用を有する薬剤である。従って、対象となる薬剤が、抗癌剤（化学療法剤）と同一の対象に対して使用されたときに、その細胞傷害作用、細胞殺傷作用あるいは細胞増殖抑制作用を強める作用を有すれば、当該対象となる薬剤は「作用増強剤」である。抗癌作用を増強するための薬剤は、抗癌剤を投与する患者と同一の患者に対して使用され、抗癌剤単独での治療効果と比較して、相乗的な効果、あるいは、質的に異なる治療効果を与えるものである。

また、本発明の抗HLAクラスI抗体は、上記化学療法剤と併用することもできる。

本発明において抗HLAクラスI抗体と化学療法剤との併用とは、抗HLAクラスI抗体と化学療法剤を共に投与または使用（以下、単に「投与」と記載する。）することを意味し、投与の順番や投与間隔などで限定されるものではない。また、本発明の抗HLAクラスI抗体と化学療法剤を組み合わせたキットとして実施してもよい。さらに、本発明の抗HLAクラスI抗体と化学療法剤を併用する場合は、いずれかを単独で用いる場合に比べて、所望により各々の投与量を少なくすることも可能である。

本発明の抗HLAクラスI抗体と化学療法剤との投与の順番は、化学療法剤投与後に抗HLAクラスI抗体を投与、化学療法剤と抗HLAクラスI抗体を同時に投与、抗HLAクラスI抗体投与後に化学療法剤を投与、のいずれの順番でもよいが、好ましくは抗HLAクラスI抗体投与後に化学療法剤を投与または化学療法剤と抗HLA クラスI抗体を同時に投与することであり、さらに好ましくは抗HLAクラスI抗体投与後に化学療法剤を投与することである。

抗HLAクラスI抗体投与後に化学療法剤を投与する場合、化学療法剤と抗HLAクラスI抗体の投与間隔は特に限定されず、投与経路や剤形等の要因を考慮して設定することができる。あえて投与間隔の一例を挙げるとすれば、通常、0時間〜72時間であり、好ましくは0時間〜24時間であり、さらに好ましくは0時間〜12時間、さらに好ましくは0時間〜6時間である。

抗HLAクラスI抗体は化学療法剤とともに一つの医薬組成物とすることができる。また、抗HLAクラスI抗体は、化学療法剤と併用することを特徴とする、医薬組成物とすることができる。すなわち、抗HLAクラスI抗体は、「化学療法剤と併用することを特徴とする、抗HLAクラスI抗体および製剤上許容しうる担体を含む医薬組成物」の製造のために使用することができる。また、化学療法剤は、抗HLAクラスI抗体と併用することを特徴とする、医薬組成物とすることができる。すなわち、化学療法剤は、「抗HLAクラスI抗体と併用することを特徴とする、化学療法剤および製剤上許容しうる担体を含む医薬組成物」の製造のために使用することができる。

本発明の医薬組成物は、細胞死誘導剤、癌治療剤としても使用することができる。したがって本発明は、化学療法剤およびHLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する細胞死誘導剤、および化学療法剤およびHLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する癌治療剤を提供する。また、化学療法剤と併用することを特徴とする、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する細胞死誘導剤、および化学療法剤と併用することを特徴とする、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する癌治療剤を提供する。

本発明の薬剤が投与される対象は哺乳動物である。哺乳動物は、好ましくはヒトである。

本発明の薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.01mgから100mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり1〜1000mg、好ましくは5〜50mgの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重1kgあたり１ヶ月（４週間）に0.5mgから40mg、好ましくは1mgから20mgを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。

本発明において薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、それ自体は上記の細胞傷害活性を有する材料であってもよいし、当該活性を有さない材料であってもよく、上記の薬剤とともに投与可能な材料を意味する。また、細胞傷害活性を有さない材料であるが、抗HLAクラスI抗体と併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。

製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。

本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。

また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。

本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート20、40、60又は80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート20及び80が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ-68（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。

界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルベート20又はポリソルベート80の場合では、一般には0.001〜100mg/mLであり、好ましくは0.003〜50mg/mLであり、さらに好ましくは0.005〜2mg/mLである。

本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸などの他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。

また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には1〜500mMであり、好ましくは5〜100mMであり、さらに好ましくは10〜20mMである。

また、本発明の化学療法剤耐性癌治療剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。

本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいpH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオルニチンである。さらに、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、システイン、またはアラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体のN-アセチルトリプトファンを使用することもできる。

本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。

本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。

本発明の薬剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液と混合することができる。また該水溶液は適当な溶解補助剤（例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等）と併用してもよい。

所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。

本発明において、含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。

また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。

また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16^th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。

使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、化学療法剤耐性癌を治療する方法に関する。また、本発明は、化学療法剤とHLAクラスIを認識する抗体を併用することを特徴とする、細胞死を誘導する方法、および癌を治療する方法に関する。

本発明において、「対象」とは、本発明の化学療法剤耐性癌治療剤を投与する生物体、該生物体の体内の一部分をいう。生物体は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む。上記の「生物体の体内の一部分」については特に限定されない。

本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含まれる。経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。

非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、静脈注射剤、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。また、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することができる。また、本発明の薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明のペプチドをコードするDNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。

本発明の薬剤の対象への投与は、一回であってもよいし、連続して投与することもできる。

また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に投与を行う際には、本発明の薬剤を生物体の一部に「接触」させてもよい。

また、本発明において「接触」は、生物体の状態に応じて行う。例えば、生物体の一部への本薬剤の散布、あるいは、生物体の一部の破砕物への本薬剤の添加等を挙げることができるが、これらの方法に制限されない。生物体の一部が培養細胞の場合には、該細胞の培養液への本薬剤の添加あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドを含むDNAを、生物体の一部を構成する細胞へ導入することにより、上記「接触」を行うことも可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

化学療法剤耐性細胞株における、mdr1 mRNAとMDR1 タンパク質の発現を示す写真および図である。（Ａ）RT-PCRによるmRNA発現量を示す写真である。（Ｂ）抗MDR1抗体およびFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体を用いたフローサイトメトリーによる、細胞表面のMDR1発現量を示す図である。点線は対照抗体、実線は抗MDR1抗体を用いて測定した結果を示す。 化学療法剤耐性細胞株における、HLAクラスI分子の過剰発現を、フローサイトメトリーによって測定した結果を示す図である。点線は対照抗体、実線は抗C3B3IgG抗体(C3B3全長抗体)を用いて測定した結果を示す。 急性骨髄性白血病（AML）患者の腫瘍細胞における、初診時および再発時のMDR1の発現量を、フローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。点線は対照抗体、実線は初診時における抗MDR1抗体による測定結果、太線は再発時における抗MDR1抗体による測定結果を示す。 急性骨髄性白血病（AML）患者の腫瘍細胞における、初診時および再発時のHLAクラスI分子の発現量を、フローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。点線は対照抗体、実線は抗C3B3IgG抗体(C3B3全長抗体)を用いて測定した結果を示す。 化学療法剤耐性細胞株におけるC3B3 diabodyの細胞傷害活性の測定結果を示す図である。 化学療法剤耐性細胞株における、C3B3 diabodyによるvincristineの細胞傷害活性の増強作用を示す図である。 化学療法剤耐性細胞株における、C3B3 diabody処理後の細胞表面上のMDR1発現量を示す図である。点線は対照抗体、実線は抗MDR1抗体による測定結果、太線はC3B3 diabody処理後の抗MDR1抗体による測定結果を示す。 C3B3 diabody処理により、化学療法剤耐性細胞株において薬剤保持能が回復することを示す図である。点線は対照、実践はDaunorubicinのみ、太線は抗C3B3 diabody処理後にDaunorubicinを添加した結果を示す。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

〔実施例１〕 化学療法剤（Vincristine）耐性血液腫瘍細胞株の樹立
Acute myeloid leukemia cell line HL60 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)、およびBurkitt’s lymphoma cell line BLTH（徳島大学廣瀬先生より供与. Br J Cancer 56:413-417, 1987）をvincristineの存在下に培養し，vincristine抵抗性細胞株HL60-RとBLTH-Rを得た。

〔実施例２〕 腫瘍細胞株におけるmdr1 mRNAおよびHLAクラスI発現量の確認
最初にHL60、HL60-R、BLTHおよびBLTH-Rにおけるmdr1 mRNA発現については、RT-PCRで、細胞表面上のMDR1タンパク質およびHLAクラスＩタンパク質発現についてはフローサイトメトリーにて確認した。
これらの細胞におけるmdr1 mRNA発現は、特異的プライマー( 5’-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG（配列番号：１３）、 3’-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA（配列番号：１４）) を用いたRT-PCRにて検討した。対照としてβ2-microglobulin mRNAの発現を特異的プライマー（5’-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA（配列番号：１５）、 3’-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG（配列番号：１６）)を用いて検討した。
細胞表面のMDR1発現は抗MDR1抗体 (UIC-2, Chemicon, Temecula, CA, USA) とFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体 (Biosourse, Camarillo, CA, USA)を用いたフローサイトメトリーにて検討した。対照（コントロール）抗体としてはマウスIgG (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)を用いた。
その結果、親株であるHL60とBLTHにおいてはmdr1 mRNAの発現は認められなかったが，vincristine抵抗性株であるHL60-RとBLTH-Rにはmdr1 mRNAの発現が認められた（図１）。

また、これらの細胞の細胞表面上のHLAクラスI発現強度を比較した。HLAクラスIの発現はAlexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 標識したC3B3抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定した。その結果、いずれもvincristine抵抗性株において細胞表面上のHLAクラスIの発現が増強していることが明らかとなった（図２）。
急性骨髄性白血病患者の初診時および再発時に得た腫瘍細胞についても同様にフローサイトメトリーによる解析を行い、腫瘍細胞表面上のMDR1およびHLAクラスI発現量を確認した。その結果、初診時と比較し再発時にはMDR1の発現が誘導されており（図３）、HLAクラスIの発現についても増強していることが確認された（図４）。

〔実施例３〕 腫瘍細胞株におけるC3B3-DBの細胞傷害活性
まず、これらの腫瘍細胞を用いC3B3-DBに対する感受性を検討した。C3B3-DBの抗腫瘍活性（細胞傷害活性）については、これらの腫瘍細胞を各種濃度のC3B3-DB存在下にて培養した後、WST-8 (Kishida Chemicals, Osaka)を用いた細胞増殖試験により測定した。
C3B3-DBの存在下でこれらの細胞を24時間培養し、細胞の生存率を比較したところ、vincristine抵抗性株であるHL60-RとBLTH-Rにおいて、より低濃度のC3B3-DBから細胞傷害が誘導されることが明らかとなった（図５）。

さらに、これらの細胞をC3B3-DB (0.1 μg/mL) 存在下または非存在下で6時間培養した後vincristineを添加し、化学療法剤耐性腫瘍細胞の薬剤抵抗性が克服（改善）されるか否かについて検討を行った。親株であるHL60とBLTHにおいてはC3B3-DBによる前処理の有無にほとんど影響されずvincristineによる濃度依存的細胞傷害が誘導され、C3B3-DB前処理によるvincristineの細胞傷害活性の増強効果は明らかではなかった。一方、HL60-RとBLTH-RにおいてはC3B3-DBでの前処理によりvincristineによる細胞傷害活性が増強されることが明らかとなった（図６）。

〔実施例４〕
C3B3-DBによる薬剤（化学療法剤）抵抗性克服の機序を明らかにするため、これらの細胞をC3B3-DB (0.1 μg/mL) で6時間処理した後の細胞表面上のMDR1発現について検討した。C3B3-DBで処理した後は一部の細胞においてMDR1の発現が低下することが明らかとなった（図７）。さらに、これらの細胞をC3B3-DBで処理した後、daunorubicin (0.1 μg/mL、明治製菓、東京) の存在下で培養し、細胞内のdaunorubicin取り込み量について比較した。
具体的には、薬剤の細胞内取り込み(accumulation phase)については，C3B3-DB存在下や非存在下で2時間培養した後、daunorubicinを添加し30分間培養し、細胞を洗浄した後フローサイトメトリーにてPE強度を測定することにより評価した。薬剤の細胞内残存(efflux phase)については、その後さらに30分間培養し、同様にフローサイトメトリーにて評価した。
その結果、親株においてはaccumulation phaseとefflux phaseにおいてともに一定量のdaunorubicinが取り込まれており、C3B3-DBの前処理による影響は認められなかった。一方、vincristine抵抗性株においてはいずれのphaseにおいてもdaunorubicinの取り込み量は著減していたが、C3B3-DBの前処理により取り込み量が増加することが明らかとなった（図８）。

以上より、薬剤抵抗性株や再発した急性骨髄性白血病患者由来の腫瘍細胞においては細胞表面上のMDR1発現が誘導されるが、同時にHLAクラスIの発現が増強していることが確認された。HLAクラスIの高発現の機序としてはMDR1のトランスポーター機能による可能性が考えられる。
C3B3-DBはHLAクラスIを高発現している薬剤抵抗性腫瘍細胞に対し特異的に抗体単独による細胞傷害を誘導した。また、化学療法剤との併用では薬剤による細胞傷害活性を増強させた。その機序として、C3B3-DBがこれらの細胞のMDR1の発現を低下させることにより、化学療法剤の細胞内取り込み量を増強させることが明らかとなった。
以上の結果より、C3B3-DBを化学療法剤と併用して用いることにより、MDR1発現腫瘍細胞の薬剤抵抗性を克服できる。

本発明により、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する化学療法剤耐性癌治療剤、およびHLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、化学療法剤耐性癌を治療する方法が提供された。

悪性腫瘍に対する化学療法において、化学療法の効果を減弱させる要因であるMDR1発現腫瘍に対し、薬剤抵抗性を克服させるような治療戦略の開発が重要な課題となっている。本発明の治療剤により、薬剤抵抗性を持つMDR1発現腫瘍であっても、HLAクラスI分子を標的とした免疫学的な治療法が可能となった。

Claims (25)

1. HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、化学療法剤耐性癌治療剤。
2. 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の化学療法剤耐性癌治療剤。
3. 化学療法剤と併用することを特徴とする、請求項１または２に記載の化学療法剤耐性癌治療剤。
4. 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の化学療法剤耐性癌治療剤。
5. HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、化学療法剤の作用増強剤。
6. 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の化学療法剤の作用増強剤。
7. 化学療法剤と併用することを特徴とする、請求項５または６に記載の化学療法剤の作用増強剤。
8. 化学療法剤によって治療する癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、請求項５から７のいずれかに記載の化学療法剤の作用増強剤。
9. 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、請求項８に記載の化学療法剤の作用増強剤。
10. 化学療法剤と併用することを特徴とする、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
11. 化学療法剤と併用することを特徴とする、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
12. 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
13. 化学療法剤およびHLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、癌治療用医薬組成物。
14. 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項１３に記載の癌治療用医薬組成物。
15. 化学療法剤によって治療する癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、請求項１０から１４のいずれかに記載の医薬組成物。
16. 化学療法剤耐性癌が、血液腫瘍であることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、化学療法剤耐性癌を治療する方法。
18. 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
19. 化学療法剤を併用することを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
21. HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、化学療法剤の作用を増強する方法。
22. 抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
23. 化学療法剤を併用することを特徴とする、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 化学療法剤によって治療する癌が化学療法剤耐性癌であることを特徴とする、請求項２１から２３のいずれかに記載の方法。
25. 化学療法剤耐性癌が血液腫瘍であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。

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