WO2010126074A1 - Hlaクラスiを認識する抗体を有効成分として含有する維持療法用医薬組成物 - Google Patents

Hlaクラスiを認識する抗体を有効成分として含有する維持療法用医薬組成物 Download PDF

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cells
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cancer
hla class
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俊夫 松本
正博 安倍
修治 尾崎
孝司 伊藤
大輔 辻
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中外製薬株式会社
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for maintenance therapy containing an antibody recognizing HLA class I as an active ingredient, and use thereof.
  • the present invention also relates to a method for maintaining a state after treatment of a disease, comprising a step of administering an antibody recognizing HLA class I to a subject.
  • HLA is an important molecule in the immune reaction that recognizes foreign antigens, bacteria, virus-infected cells, etc. as foreign substances and removes them.
  • the main role of the HLA molecule is to present to the CD8 + T cells an antigenic peptide consisting of about 8 to 10 amino acids made in the cell. It plays a very important role.
  • HLA is a class I formed by a 45 KD ⁇ chain consisting of three domains of ⁇ 1 to 3 and a heterodimer of 12 KD ⁇ 2 microglobulin ( ⁇ 2M), and an ⁇ of 30 to 34 KDa consisting of two domains of ⁇ 1 and ⁇ 2.
  • HLA class I HLA-I
  • HLA-IA HLA class I A
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Two types of antibodies against the ⁇ 1 domain, MoAb90 and YTH862, have been reported to induce apoptosis on activated lymphocytes (Non-Patent Documents 2, 3, and 4).
  • Non-patent Document 4 HLA class I ⁇ A expressed in lymphocyte cells is a signal transducing apoptosis. It is speculated that it is also involved.
  • Monoclonal antibody 2D7 obtained by immunizing human myeloma cells is also an antibody that recognizes HLA class I A, and by reducing the molecular weight (diabody) of 2D7, human myeloma It has been reported to induce severe cell death in a short time against cell lines.
  • monoclonal antibody C3B3 obtained by immunizing mice with cells co-expressing human HLA class IA and human ⁇ 2M is an antibody that recognizes the ⁇ 2 domain of HLA class I antigen, and is anti-mouse. Strong cytotoxic activity by cross-linking with IgG antibody.
  • C3B3-DB C3B3 diabody
  • 2D7 diabody and C3B3 diabody show strong cell death-inducing activity against various human myeloma cell lines and activated lymphocyte cells, and in multiple myeloma model mice transplanted with human myeloma cell lines. Since it showed a significant life-prolonging effect, it has been developed as a therapeutic agent for myeloma (Patent Documents 1 to 5, Non-Patent Document 7). If such treatment using cell death induction involving HLA class I is further developed, it is expected that highly effective pharmaceuticals for myeloma and the like will be developed.
  • Chemotherapy is effective for blood cancer and multiple myeloma, and it is possible to make cancer cells not confirmed in blood or bone marrow by continuing chemotherapy.
  • cancer may recur after a certain period of time. This is because even though hematological cancer and myeloma seem to be completely cured by chemotherapy, cancer stem cells actually exist, and after a certain period of time, the cancer stem cells proliferate and the cancer recurs. It is considered.
  • Maintenance therapy that continues drug administration after cancer cells are no longer confirmed to prevent cancer recurrence may be performed, but conventional chemotherapeutic agents are considered to be less effective against cancer stem cells So far, no drug with high therapeutic effect on cancer stem cells has been reported.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is to provide a highly effective pharmaceutical agent for myeloma and the like. More specifically, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for maintenance therapy for preventing recurrence of cancer such as myeloma. It is another object of the present invention to provide a method for maintaining a state after treatment of cancer such as myeloma.
  • the present inventors investigated the cytotoxic activity against SP (side-population) fraction of tumor cells, so that anti-HLA class I antibodies are effective for maintenance therapy of diseases such as myeloma. It was examined whether or not.
  • the present inventors confirmed that HLA-A was highly expressed in both the SP fraction and non-SP fraction of tumor cells. From this, the present inventors considered that these cells could be therapeutic targets for anti-HLA class I antibodies.
  • the present inventors also confirmed that ABCG2, which is one type of ABC transporter involved in drug resistance, is highly expressed on the cell surface as compared with the non-SP fraction in the SP fraction of tumor cells. Furthermore, the present inventors have confirmed that the SP fraction has a slower growth rate than the non-SP fraction. Based on these facts, the present inventors considered that SP fraction has characteristics similar to drug-resistant and dormant cancer stem cells, and tried to examine the effect of anti-HLA class I antibodies on SP fraction.
  • the present inventors have revealed that anti-HLA class I antibody induces cytotoxicity not only to the non-SP fraction of tumor cells but also to the SP fraction.
  • the inventors of the present invention can be expected to be effective as a maintenance therapy that damages the remaining anticancer drug resistant cancer stem cells by adding treatment with anti-HLA class I antibody after conventional anticancer drug treatment and leads to suppression of recurrence.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention provides the following [1] to [25].
  • a pharmaceutical composition for maintenance therapy comprising an antibody that recognizes HLA class I as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition according to [1] which is used for maintenance therapy in myeloma or blood cancer.
  • the use according to [21], wherein the disease is myeloma or blood cancer.
  • FIG. 1 It is a figure which shows presence of SP cell in a myeloma cell line.
  • the upper row shows the analysis of the dye incorporated into cells after culturing in three myeloma cell lines (RPMI-8226, U266, MM.1S) in the presence of Hoechst33342 by flow cytometry.
  • the lower panel is a diagram obtained by analyzing the dye incorporated into cells after culturing in the presence of Hoechst33342 + Verapamil by flow cytometry.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for maintenance therapy comprising an antibody recognizing HLA class I as an active ingredient.
  • HLA means human leukocyte antigen.
  • HLA molecules are classified into class I and class II.
  • class I HLA-A, B, C, E, F, G, H, J and the like are known.
  • the antigen recognized by the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is a molecule classified as HLA class I, but is preferably HLA class IA, and more preferably HLA class IA ⁇ 1 domain and / or ⁇ 2 domain.
  • the origin of the antibody in the present invention is not particularly limited, but is preferably derived from a mammal, more preferably a mouse-derived antibody or a human-derived antibody.
  • the antibody that recognizes HLA class I (anti-HLA class I antibody) used in the present invention preferably binds specifically to HLA class I.
  • Anti-HLA class I antibodies used in the present invention can be obtained as polyclonal or monoclonal antibodies using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include antibodies produced by hybridomas, antibodies produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques, and the like. Examples of such antibodies include C3B3 antibody (WO2008 / 007755) and 2D7 antibody (Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209 (2004)). It is not limited.
  • An anti-HLA class I antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, using HLA class I as a sensitizing antigen, this is immunized according to a normal immunization method, the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and a monoclonal antibody is obtained by a normal screening method. It is possible to prepare by screening for an antibody-producing cell.
  • the antigen can be prepared according to a known method, for example, a method using a baculovirus (WO98 / 46777 etc.).
  • the desired HLA class I molecule is obtained from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • the purified HLA class I protein can be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein of an HLA class I molecule and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • Animals such as mice, rats, hamsters and the like are used.
  • the animal is immunized with the sensitizing antigen according to a known method. For example, as a general method, it is performed by injecting a sensitizing antigen intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline and suspended, and then mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, after emulsification.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion. Spleen cells are particularly preferred as preferable immune cells to be subjected to cell fusion.
  • Mammalian myeloma cells as the other parental cells to be fused with the immune cells are already known in various cell lines such as P3X63Ag8.653 (Kearney, JF et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511 -519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can be done according to this.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion accelerator, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells is preferably, for example, 1 to 10 times as many immune cells as that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture can be used. Serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution pre-warmed to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually used.
  • the target fused cell (hybridoma) is formed by adding and mixing at a concentration of 30 to 60% (w / v). Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma can be removed by adding an appropriate culture solution successively and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a time sufficient for the cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually several days to several weeks.
  • a HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, and its ascites
  • the method obtained as follows is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique can be used.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique
  • V variable
  • Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc., and then prepare mRNA using mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience). Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience). The cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932).
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the deoxy method. If DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector. Alternatively, DNA encoding an antibody V region may be incorporated into an expression vector containing antibody C region DNA.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later. Next, host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • An antibody comprising a light chain variable region having CDR1, 2, and 3 consisting of the amino acid sequences described in 10, 11, and 12 can be exemplified.
  • antibody of the present invention include antibodies comprising the heavy chain variable region described in any of the following (a) to (d).
  • A Heavy chain variable region having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2
  • Heavy chain variable region having amino acid sequence (d) Heavy chain variable region having an amino acid sequence encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • examples of the antibody of the present invention include antibodies comprising the light chain variable region described in any of (e) to (h) below.
  • (f) One or more amino acid sequences in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 are substituted, deleted, inserted, and / or added
  • a light chain variable region having an amino acid sequence which is functionally equivalent to the light chain variable region described in (e) (g) and which is encoded by a DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3
  • Light chain variable region having an amino acid sequence (h) Light chain variable region having an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3
  • an antibody having an amino acid sequence described in any of the following (a) to (d) can be mentioned.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region or the light chain variable region may be substituted, deleted, added and / or inserted. Furthermore, when the heavy chain variable region and the light chain variable region are associated, a part may be deleted or another polypeptide may be added as long as it has antigen binding activity.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • “functionally equivalent” means that the antibody of interest has a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7, 8, 9 or SEQ ID NOs: 10, 11 , 12, an activity equivalent to that of an antibody having a light chain variable region having CDR1, 2, 3 comprising the amino acid sequence described in (for example, binding activity to HLA-A, cytotoxic activity, cell death inducing activity, cell growth inhibition) Activity).
  • a method for introducing a mutation into the polypeptide is known.
  • a person skilled in the art can perform site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100 , 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.
  • Antibodies can be prepared. Amino acid mutations can also occur in nature. Thus, an antibody having an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of the antibody of the present invention and functionally equivalent to the antibody is also included in the antibody of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids (C, M) having carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids having base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains
  • the amino acids (H, F, Y, W) that can be used can be listed (the parentheses indicate the single letter of the amino acid).
  • the antibody of the present invention also includes an antibody in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of the antibody of the present invention. Also included are fusion proteins in which an antibody is fused with another peptide or protein. In the method for producing a fusion protein, a polynucleotide encoding an antibody of the present invention and a polynucleotide encoding another peptide or polypeptide are linked so that the frames coincide with each other, introduced into an expression vector, and expressed in a host. Any technique known to those skilled in the art can be used.
  • peptides or polypeptides to be subjected to fusion with the antibody of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 His (histidine) residues 6 ⁇ His, 10 ⁇ His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen
  • FLAG Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210
  • 6 His histidine residues 6 ⁇ His, 10 ⁇ His
  • influenza agglutinin (HA) human c-myc fragment
  • VSV-GP fragment p18HIV fragment
  • T7-tag HSV-tag
  • E-tag E-tag
  • SV40T antigen Known peptides such as fragments, lck tag, ⁇ -tubulin fragment,
  • polypeptides to be subjected to fusion with the antibody of the present invention examples include GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase, MBP (maltose). Binding protein) and the like. Preparing a fusion polypeptide by fusing a commercially available polynucleotide encoding the peptide or polypeptide with a polynucleotide encoding the antibody of the present invention and expressing the fusion polynucleotide prepared thereby. Can do.
  • the antibody used in the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence or form of sugar chain, etc., depending on the cell, host or purification method that produces it. However, as long as the obtained antibody has a function equivalent to the antibody of the present invention, it can be used as the antibody of the present invention. For example, when the antibody of the present invention is expressed in prokaryotic cells such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original antibody amino acid sequence.
  • the antibody used in the present invention includes such an antibody.
  • a recombinant antibody produced by incorporating a gene into an appropriate vector and introducing it into a host and using a gene recombination technique can be used (for example, Carl, A. K). Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in The United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • DNA encoding a heavy chain variable region or a light chain variable region is obtained, it is ligated with DNA encoding a desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding an antibody variable region may be incorporated into an expression vector containing antibody constant region DNA. It is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a genetically engineered antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans such as a chimeric antibody or a humanized antibody
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is a mammal other than a human, for example, a mouse antibody heavy chain, light chain variable region and a human antibody heavy chain, light chain constant region, and a DNA encoding the murine antibody variable region.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it (Europe). Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759). Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and is a non-human mammal, for example, a complementarity determining region (CDR) of a mouse antibody transplanted to the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • oligos were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication Number EP 239400, International Patent Application Publication Number). (See WO 96/02576).
  • the FR of the human antibody to be linked via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • Examples of the human antibody C region include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, or C ⁇ 4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody is composed of a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a C region derived from a human antibody, and the humanized antibody is a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody, a framework region derived from a human antibody, and C Since both have a reduced antigenicity in the human body, they are useful as antibodies used in the present invention.
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen or cells expressing the desired antigen in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to have a desired human antibody having an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared from the sequence to obtain a human antibody.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method.
  • a mammalian cell When a mammalian cell is used, it can be expressed by a commonly used useful promoter, an antibody gene to be expressed, a DNA having a poly A signal operably linked to the 3 ′ downstream thereof, or a vector containing the same.
  • the promoter / enhancer include human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • other promoters / enhancers that can be used for the expression of antibodies used in the present invention include retrovirus, polyomavirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40) and other viral promoters / enhancers and human elongation factor 1 ⁇ (HEF1 ⁇ ).
  • Promoters / enhancers derived from mammalian cells such as for example, when the SV40 promoter / enhancer is used, the method of Mulligan et al. (Mulligan, RC et al., Nature (1979) 277, 108-114), and when the HEF1 ⁇ promoter / enhancer is used, the method of Mizushima et al. Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • Escherichia coli it can be expressed by functionally combining a commonly used useful promoter, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include lacZ promoter and araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter Can be used according to the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043).
  • a pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used in the case of production in the periplasm of E. coli. After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, WO96 / 30394).
  • the origin of replication those derived from SV40, polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV), etc. can be used. Furthermore, for amplification of gene copy number in the host cell system, the expression vector is used as a selection marker.
  • An aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, a thymidine kinase (TK) gene, an E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, a dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • eukaryotic cells there are production systems using animal cells, plant cells, or fungal cells.
  • Animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or (3) insects Cells such as sf9, sf21, Tn5, etc. are known.
  • cells derived from Nicotiana tabacum are known, and these may be cultured in callus.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger, are known.
  • prokaryotic cells there are production systems using bacterial cells.
  • Known bacterial cells include E. coli and Bacillus subtilis.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method.
  • DMEM fetal calf serum
  • MEM fetal calf serum
  • RPMI1640 fetal calf serum
  • IMDM fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced to the peritoneal cavity of animals.
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants.
  • animals When animals are used, there are production systems using mammals and insects.
  • mammals As mammals, goats, pigs, sheep, mice, cows and the like can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • silkworms can be used as insects.
  • tobacco When using a plant, for example, tobacco can be used.
  • An antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibodies are produced and collected in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted into the middle of a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat ⁇ casein to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing a fusion gene into which an antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that received the embryo or its offspring.
  • Hormones may be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from the transgenic goat (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699- 702).
  • silkworms silkworms are infected with baculovirus into which the antibody gene of interest is inserted, and desired antibodies are obtained from the body fluids of these silkworms (Maeda, S.
  • the target antibody gene is inserted into a plant expression vector such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). .
  • DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector and simultaneously transformed into the host.
  • the host may be transformed by incorporating DNAs encoding the H and L chains into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO 94-11523).
  • the antibody used in the present invention may be a low molecular weight antibody.
  • a low molecular weight antibody includes a full-length antibody (whole antibody such as whole IgG) as a parent antibody and includes an antibody fragment in which a part of the full-length antibody is deleted, and has an ability to bind to an antigen. If it does, it will not specifically limit.
  • the antibody fragment of the present invention is not particularly limited as long as it is a part of a full-length antibody, but preferably contains a heavy chain variable region (VH) or a light chain variable region (VL), particularly preferably VH and VL. A fragment containing both.
  • antibody fragments include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain Fv), sc (Fv 2 ), and preferably diabody (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883, Plickthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” Vol. 113, Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269- 315, (1994)).
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or genes encoding these antibody fragments are constructed and introduced into expression vectors. Thereafter, it may be expressed in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, AH, Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • the low molecular weight antibody in the present invention preferably has a smaller molecular weight than the full-length antibody. However, for example, it may form a multimer such as a dimer, trimer or tetramer, and the molecular weight is larger than that of the full-length antibody. There is also.
  • a preferred low molecular weight antibody in the present invention is an antibody comprising two or more VHs and two or more VLs of an antibody, and these variable regions are bound directly or indirectly through a linker or the like.
  • the bond may be covalent or non-covalent, and may be both covalent and non-covalent.
  • Further preferred low molecular weight antibodies are antibodies comprising two or more VH-VL pairs formed by binding VH and VL by non-covalent bonds. In this case, an antibody in which the distance between one VH-VL pair and the other VH-VL pair in the low molecular weight antibody is shorter than the distance in the full-length antibody is preferable.
  • scFv is obtained by linking an H chain V region and an L chain V region of an antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879. -5883).
  • the H chain V region and the L chain V region in scFv may be derived from any of those described as the above antibody.
  • the peptide linker that links the V regions for example, any single chain peptide consisting of amino acid residues 12-19 is used.
  • the DNA encoding scFv is a DNA sequence encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA encoding the L chain or L chain V region, and a desired amino acid sequence of those sequences.
  • a DNA portion encoding the DNA is amplified by PCR using a primer pair that defines both ends thereof, and then further specified so that the DNA encoding the peptide linker portion and both ends thereof are linked to the H chain and L chain, respectively. Obtained by combining and amplifying primer pairs.
  • an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method, and the host can be used according to a conventional method.
  • ScFv can be obtained.
  • antibody fragments can be produced by the host by obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • the term “antibody” as used in the present invention encompasses these antibody fragments.
  • a particularly preferred low molecular weight antibody in the present invention is diabody.
  • a diabody is a dimerization by linking two fragments (for example, scFv, etc.) obtained by connecting a variable region and a variable region with a linker or the like (hereinafter, fragments comprising diabody). Containing VL and two VHs (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the bond between the fragments constituting the diabody may be a non-covalent bond or a covalent bond, but is preferably a non-covalent bond.
  • fragments constituting diabody can be combined with a linker or the like to form a single-chain diabody (sc diabody).
  • sc diabody single-chain diabody
  • the fragments constituting the diabody existing on the same chain can be non-covalently bound to form a dimer.
  • the fragment constituting the diabody include a combination of VL and VH, a combination of VL and VL, a combination of VH and VH, and the like, and preferably a combination of VH and VL.
  • the linker that connects the variable region and the variable region is not particularly limited, but it is preferable to use a linker that is short enough so that non-covalent bonding does not occur between the variable regions in the same fragment.
  • the length of such a linker can be appropriately determined by those skilled in the art, but is usually 2 to 14 amino acids, preferably 3 to 9 amino acids, particularly preferably 4 to 6 amino acids.
  • VL and VH encoded on the same fragment have a short linker, so non-covalent bonding does not occur between VL and VH on the same chain, and no single-chain V region fragment is formed. Forms non-covalent dimers with other fragments.
  • diabody examples include the above-mentioned C3B3 diabody (WO2008 / 007755), 2D7 diabody (Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209 (2004)), and the like. Not.
  • the antibody used in the present invention preferably has an anti-HLA class I antibody activity.
  • the activity of an anti-HLA class I antibody refers to a biological action that occurs when an antibody binds to an antigen.
  • the biological action includes, but is not limited to, a cytotoxic action and an antitumor action. More specific examples include cell death inducing action, apoptosis inducing action, cell proliferation inhibiting action, cell differentiation inhibiting action, cell division inhibiting action, cell proliferation inducing action, cell differentiation inducing action, cell division inducing action, cell cycle regulation. Examples thereof include an action and the like, but a cell death inducing action and a cell growth inhibiting action are preferable.
  • the cells that are the targets of the above-described actions such as cell death inducing action and cell growth inhibitory action are not particularly limited, but blood cells and floating cells are preferable.
  • Specific examples of hematopoietic cells include lymphocytes (B cells, T cells), neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes (preferably activated peripheral blood mononuclear cells (peripheral blood mononuclear) cell, PBMC)), myeloma cells, etc., but lymphocytes (B cells, T cells), myeloma cells are preferred, and T cells or B cells (particularly activated B cells or activated T cells) Is most preferred.
  • a floating cell is a cell that proliferates in a floating state when the cell is cultured without the cell adhering to the surface of an incubator such as glass or plastic.
  • adherent cells adherent cells are cells that adhere to the surface of an incubator such as glass or plastic when cells are cultured.
  • anti-HLA class I antibodies such as full-length anti-HLA antibodies
  • anti-IgG antibodies may be cross-linked with anti-IgG antibodies to enhance cell death-inducing activity, and cross-linking should be performed by methods known to those skilled in the art. Can do.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for maintenance therapy, particularly maintenance therapy for cancer.
  • Maintenance therapy is usually a treatment method performed to maintain the current state (the state after treatment of the disease).
  • treatment is performed to prevent (prevent) recurrence after a disease has been cured by treatment (surgery, medication, etc.).
  • Examples of such treatment include, but are not limited to, continuing to take a low dose of drug after treatment of the disease.
  • the disease that is the subject of the maintenance therapy of the present invention is not particularly limited, but is preferably cancer, more preferably myeloma or hematological cancer. For example, even when cancer cells are considered to have been removed or killed in cancer treatment, cancer cells that are not observed may remain.
  • the cancer may recur or metastasize after a certain period of time, and it is necessary to perform treatment for preventing or suppressing the recurrence or metastasis of the cancer after the cancer treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for preventing or suppressing cancer recurrence and metastasis after such cancer treatment.
  • cancer treatment refers to physical removal of cancer tissue, chemotherapy using an anticancer agent, radiation therapy, percutaneous ethanol injection therapy, percutaneous radiofrequency radiation thermocoagulation therapy, transcatheter hepatic artery embolization therapy, etc. Any treatment is possible as long as the purpose is to suppress the growth of cancer cells, kill the cancer cells, decrease the cancer cells, remove the cancer cells, or the like. “After cancer treatment” means after these treatments have been performed. In the present invention, “after cancer treatment” does not necessarily mean that the cancer has been cured, but it is preferably after the cancer has been cured.
  • cancer treatment include treatment with a chemotherapeutic agent, bone marrow transplantation, and the like.
  • “Chemotherapeutic agents” include alkylating agents, antimetabolites, natural products, platinum complexes, and other drugs.
  • alkylating agents nitrogen mustards (Nitrogen Mustards), ethyleneimines (Ethylenimines), methyl melamines (Methylmelamines), alkyl sulfonates (Alkyl Sulfonates), nitrosoureas (Nitrosoureas), triazenes (Triazens) Is mentioned.
  • nitrogen mustards include mechlorethamine, cyclophosphamide, ifosfamide, melphalan, and chlorambucil.
  • ethyleneimines and methylmelamines include hexamethylmelamine (Hexamethylmelamine) and thiotepa (Thiotepa).
  • alkyl sulfonates include busulfan.
  • nitrosoureas include carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), semustine (methyl-CCNU), and streptozocin.
  • triazenes include dacarbazine (DTIC).
  • Antimetabolites include folic acid analogs, pyrimidine analogs, and purine analogs.
  • folic acid analog is methotrexate.
  • Pyrimidine analogues include, for example, fluorouracil (5-FU), doxifluridine (5'-DFUR, trade name Fluturon), capecitabine (trade name Xeloda), floxuridine (FudR), cytarabine (Cytarabine).
  • the purine analog include mercaptopurine (Mercaptopurine: 6-MP), thioguanine (TG), and pentostatin.
  • Natural products include vinca alkaloids, epipodophyllotoxins, and antibiotics. Examples of vinca alkaloids include vinblastine (VLB) and vincristine (VCR).
  • epipodophyllotoxins examples include etoposide and teniposide.
  • Antibiotics include, for example, dactinomycin (Dactinomycin: actinomycin D), daunorubicin (Daunorubicin), doxorubicin (Bleomycin), plicamycin (Plicamycin), and mitomycin.
  • the platinum complex refers to a platinum coordination complex, and examples thereof include cisplatin (CDDP) and carboplatin.
  • drugs include taxols such as paclitaxel, docetaxel, anthracenediones such as mitoxantrone, urea substitutes such as hydroxyurea, methyl hydrazines, Examples thereof include procarbazine hydrochloride (trade name: Nathlan) and vitamin A metabolites such as tretinoin (trade name: besanoid).
  • the chemotherapeutic agent preferably does not include an antibody that recognizes HLA class I, and more preferably the chemotherapeutic agent does not include an antibody.
  • the time when the pharmaceutical composition of the present invention is administered is not particularly limited, and may be administered at any time.
  • administration may be started immediately after completion of cancer treatment, or administration may be started after a certain period of time has elapsed after cancer treatment.
  • a preferable administration timing is after cancer treatment until cancer recurrence.
  • administration is generally started within 12 weeks or 6 weeks after treatment.
  • Whether or not cancer has recurred can be determined by methods known to those skilled in the art.
  • it can be determined by whether or not a tumor can be confirmed by macroscopic or pathological findings. Tumors can be confirmed by methods known to those skilled in the art, such as methods using various tumor markers as indicators and imaging.
  • the maintenance therapy of the present invention may be a method called adjuvant therapy or postoperative adjuvant therapy.
  • the cancer type is not particularly limited, and myeloma, blood cancer (blood tumor), liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, leukemia, lymphoma, Any cancer such as pancreatic cancer and bile duct cancer may be used. Cancer can be either primary or secondary. Preferred cancers include myeloma or blood cancer (blood tumor).
  • blood cancers blood tumors
  • blood cancers include leukemia, myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, Burkitt lymphoma, chronic myelogenous leukemia, acute myeloid leukemia, plasma cell abnormalities (myeloma, multiple myeloma, Macroglobulinemia), myeloproliferative diseases (true erythrocytosis, essential thrombocythemia, idiopathic myelofibrosis) and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with other drugs for maintenance therapy.
  • the present invention provides a cancer stem cell growth inhibitor containing an antibody that recognizes HLA class I as an active ingredient.
  • cancer stem cells are not particularly limited, and examples thereof include cancer stem cells present in the SP fraction. Cancer stem cell growth inhibitors are useful for cancer maintenance therapy and the like.
  • the subject to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered is a mammal.
  • the mammal is preferably a human.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in the form of a pharmaceutical, and can be administered systemically or locally orally or parenterally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solvent, etc.
  • the effective dose is selected in the range of 0.01 mg to 100 mg per kg body weight.
  • a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg per patient can be selected.
  • a preferable dose and administration method are effective doses in such an amount that free antibodies exist in the blood, and specific examples include 0.5 mg to 40 mg per month (4 weeks) per kg of body weight, preferably 1 mg to 20 mg divided into 1 to several times, for example, intravenous / subcutaneous injection such as infusions, subcutaneous injection, etc. on a dosing schedule of 2 times / week, 1 time / week, 1 time / 2 weeks, 1 time / 4 weeks, etc. It is a method of administering by such a method.
  • the administration schedule is 2 times / week or once / week to once / 2 weeks, once / 3 weeks, once / 4 weeks, etc. while observing the state after administration and observing the trend of blood test values It is also possible to adjust such as extending the administration interval.
  • pharmaceutical preparations such as preservatives and stabilizers may be added to the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may itself be a material having the above-mentioned cytotoxic activity or a material having no such activity, and can be administered together with the pharmaceutical composition of the present invention. Means material. Moreover, although it is a material which does not have cytotoxic activity, the material which has a synergistic or additive stabilization effect by using together with an anti- HLA class I antibody may be sufficient.
  • Examples of materials that are acceptable for formulation include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders, and the like. .
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomyristate.
  • nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomyristate.
  • Glycerin fatty acid esters such as glyceryl monostearate; polyglycerin fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate , Polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxyethylene Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as rubitan tristearate; Polyoxyethylene sorbite fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbite tetrastearate and polyoxyethylene sorbite tetraoleate; Polyoxyethylene glycerin such as polyoxyethylene glyceryl monostearate Fatty acid ester; polyethylene glycol fatty acid ester such as polyethylene glycol distearate; polyoxyethylene alkyl ether such as poly
  • the surfactant examples include anionic surfactants such as alkyl sulfates having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, and sodium oleyl sulfate; polyoxyethylene Polyoxyethylene alkyl ether sulfates having an average addition mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group of 10 to 18 carbon atoms such as sodium lauryl sulfate; Carbon atoms of the alkyl group such as sodium lauryl sulfosuccinate Typical examples include alkylsulfosuccinic acid ester salts having a number of 8 to 18; natural surfactants such as lecithin, glycerophospholipid; sphingophospholipids such as sphingomyelin; and sucrose fatty acid esters of fatty acids having 12 to 18 carbon atoms. As an example.
  • anionic surfactants such as alkyl
  • one or more of these surfactants can be added in combination.
  • Preferred surfactants for use in the pharmaceutical compositions of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by poloxamer such as Pluronic F-68 (registered trademark) is also preferable.
  • the amount of surfactant to be added varies depending on the type of surfactant to be used, but in the case of polysorbate 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to 100 mg / mL, preferably 0.003 to 50 mg / mL, and more preferably 0.005 to 2 mg / mL.
  • phosphoric acid citric acid buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, gluconic acid, caprylic acid, deoxycholic acid, salicylic acid, triethanolamine, fumaric acid Other organic acids, etc., or carbonate buffer, Tris buffer, histidine buffer, imidazole buffer, etc. can be mentioned.
  • a solution formulation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulation.
  • the concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain other low molecular weight polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • amino acids in the present invention include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine and the like, or inorganic salts of these amino acids (preferably in the form of hydrochloride or phosphate, that is, phosphate amino acids). it can.
  • the preferred pH value is adjusted by the addition of suitable physiologically acceptable buffer substances, such as inorganic acids, in particular hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts.
  • suitable physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, in particular hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts.
  • phosphate is particularly advantageous in that a particularly stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, citric acid, succinic acid, fumaric acid or the like or the corresponding anion (malate ion, tartaric acid ion, citrate ion, succinic acid ion, fumaric acid This is particularly advantageous when no acid ions or the like are present.
  • Preferred amino acids are arginine, lysine, histidine, or ornithine.
  • acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid and their salt forms (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine or alanine, or aromatic Amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyltryptophan can also be used.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, glucose, fructose, lactose, xylose, mannose, maltose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used as an aqueous solution for injection, it is isotonic containing, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride). Can be mixed with liquid.
  • the aqueous solution may be used in combination with an appropriate solubilizing agent (for example, alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) etc.).
  • an appropriate solubilizing agent for example, alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) etc.
  • it may further contain a diluent, a solubilizer, a pH adjuster, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and its salts, thiosulfuric acid
  • examples thereof include sodium, glutathione, and those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • antioxidant in the present invention examples include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbyl palmitate, L-ascorbic acid steer.
  • examples thereof include chelating agents such as rate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate, disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, and sodium metaphosphate.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]
  • colloid drug delivery systems liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, nanocapsules, etc.
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech 1982, 12: 98-105; US Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP 133,988).
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for maintaining a state after treatment of a disease, comprising administering to a subject an antibody that recognizes HLA class I. Furthermore, the present invention relates to a method for preventing recurrence of a disease, comprising a step of administering an antibody recognizing HLA class I to a subject.
  • the disease targeted by the method of the present invention is not particularly limited, but is preferably cancer, more preferably myeloma or hematological cancer.
  • the “subject” refers to an organism to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered, and a part of the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals).
  • the “part of the living body” is not particularly limited.
  • a “subject” is usually an organism or a portion of the organism after it has been treated for a disease.
  • the “subject” of the present invention is usually the organism after cancer treatment or a part of the organism.
  • Cancer treatment refers to physical removal of cancer tissue, chemotherapy using anticancer drugs, radiation therapy, percutaneous ethanol injection therapy, percutaneous radiofrequency radiation thermal coagulation therapy, transcatheter hepatic artery embolization therapy, etc.
  • any treatment is possible as long as the purpose is to suppress growth, kill cancer cells, decrease cancer cells, remove cancer cells, or the like.
  • preferable cancer treatment include chemotherapy using an anticancer agent.
  • “After cancer treatment” means after these treatments have been performed.
  • “after cancer treatment” does not necessarily mean that the cancer has been cured, but it is preferably after the cancer has been cured.
  • the time when the antibody recognizing HLA class I is administered is not particularly limited, and may be administered at any time. For example, administration may be started immediately after the end of treatment of the disease, or administration may be started after a certain period of time has elapsed after treatment of the disease. In addition, there may be periods of overlap between disease treatment and maintenance therapy with antibodies that recognize HLA class I.
  • a preferred administration timing is from after treatment of the disease until recurrence of the disease.
  • administration is generally started within 12 weeks or 6 weeks after treatment.
  • Whether or not cancer has recurred can be determined by methods known to those skilled in the art.
  • it can be determined by whether or not a tumor can be confirmed by macroscopic or pathological findings. Tumors can be confirmed by methods known to those skilled in the art, such as methods using various tumor markers as indicators and imaging.
  • the present invention relates to a method for suppressing the growth of cancer stem cells, comprising the step of administering an antibody that recognizes HLA class I to a subject that needs to suppress the growth of cancer stem cells.
  • administering includes administering orally or parenterally.
  • Oral administration can include administration in the form of an oral agent, and as the oral agent, a dosage form such as a granule, powder, tablet, capsule, solvent, emulsion, or suspension is selected. be able to.
  • Parenteral administration can include administration in the form of injections, and examples of injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, and the like.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing an oligonucleotide to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be locally administered to an area where treatment is desired. For example, it can be administered by local injection during surgery, the use of a catheter, or targeted gene delivery of DNA encoding a peptide of the invention.
  • the administration of the pharmaceutical composition of the present invention to the subject may be performed once or multiple times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be “contacted” with the part of the organism.
  • “contact” is performed according to the state of the organism.
  • spraying of the pharmaceutical composition of the present invention to a part of the organism for example, spraying of the pharmaceutical composition of the present invention to a part of the organism, addition of the pharmaceutical composition of the present invention to a part of the crushed organism, etc. can be mentioned.
  • a part of the organism is a cultured cell
  • the addition of the pharmaceutical composition of the invention to the culture medium of the cell or the introduction of the DNA containing the oligonucleotide of the invention into the cell constituting the part of the organism By doing so, it is possible to perform the “contact”.
  • the “method for maintaining the state after treatment of the disease” of the present invention can also be expressed as “a method for preventing the recurrence of the disease”. It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • SP side population
  • anti-HLA class I antibody was found to be effective for SP cells, which are a kind of hematological cancer stem cell in the present invention. It is considered effective.
  • SP fraction in MM cell line The myeloma cell lines RPMI 8226 (Health Science Resources Bank, Osaka, Japan), U266 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), MM.1S (provided by Dr.
  • ABCG2 protein expression of ABCG2 one of the ABC transporters involved in drug resistance, cytospin specimens were stained with ABCG2 antibody and FITC-labeled secondary antibody (Zymed, San Francisco, CA), and confocal laser scanning microscope (Nikon, Tokyo, Japan). The SP fraction of RPMI 8226 was highly expressed on the cell surface compared to the non-SP fraction (FIG. 3).
  • Apoptosis assay RPMI 8226 is sorted into SP fraction and non-SP fraction, each of which is C3B3-DB (1 ⁇ g / ml), bortezomib (5, 10, 20 nM; (Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, MA)), melphalan (5, 10 , 20 ⁇ M) for 48 hours. Subsequently, Annexin V-PI staining (MBL, Nagoya, Japan) was performed, the proportion of apoptosis was measured, and the viable cell rate was shown with the control as 100% (FIG. 7). In bortezomib and melphalan, non-SP fraction was more severely damaged than SP fraction, but in C3B3-DB, strong cell damage was induced in both SP fraction and non-SP fraction.
  • Colony assay RPMI 8226 was sorted into SP fraction and non-SP fraction, and each was cultured in methylcellulose medium (MethoCult, StemCell technologies) for 11 days in the presence of C3B3-DB (1 ⁇ g / ml). The number of colonies was measured using a population of 50 or more cells as a colony (FIG. 8). The SP fraction formed more colonies than the non-SP fraction, but was almost completely suppressed by C3B3-DB. The non-SP fraction was poor in colony formation, but the colony formation was similarly almost completely suppressed by C3B3-DB.
  • a pharmaceutical composition for maintenance therapy for preventing recurrence of cancer such as myeloma
  • cancer may recur after a certain period of time even if cancer cells are no longer confirmed by chemotherapy. This is probably because cancer stem cells that were not damaged by chemotherapy proliferated.
  • maintenance therapy that continues drug administration after cancer cells are no longer confirmed may be performed, but conventional chemotherapeutic agents are less effective against cancer stem cells Was the actual situation.
  • the composition of the present invention has a damaging effect on cancer stem cells that are difficult to be damaged by conventional chemotherapeutic agents.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for the treatment of tumors that are difficult to cure with anticancer agents alone and the prevention of recurrence.

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Abstract

　本発明者らは、抗HLAクラスI抗体の存在下で腫瘍細胞のSP fractionおよびnon-SP fractionの培養を行った結果、SP fraction、non-SP fractionの双方において、細胞数が減少することを確認した。一方、抗HLAクラスI抗体の非存在下においては、non-SP fractionでは細胞数の減少が見られるものの、SP fractionでは細胞数に変化が見られないことを確認した。また本発明者らは、抗HLAクラスI抗体がSP fraction、non-SP fractionの双方に対し、強い細胞障害活性を示すことを確認した。従来の抗癌剤治療後に抗HLAクラスI抗体による治療を行うことにより、残存する抗癌剤抵抗性のcancer stem cellを障害し、癌の再発を抑制することが可能である。

Description

HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する維持療法用医薬組成物
　本発明は、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する維持療法用医薬組成物、およびその利用に関する。また本発明は、HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、疾患の治療後の状態を維持する方法に関する。
　HLAは外来性の抗原、細菌、ウィルス感染細胞等を異物と認識し除去する免疫反応において重要な分子である。HLA分子の主な役割は、細胞の中で作られる8～10残基程度のアミノ酸でできた抗原ペプチドをCD8+T細胞に提示することであり、これによって誘導される免疫応答や免疫寛容に非常に重要な役割を担っている。HLAは、α1～3の３つのドメインからなる45KDのα鎖と12KDのβ2マイクログロブリン（β2M）のヘテロダイマーによって形成されるクラスIと、α1、α2の２つのドメインからなる30～34KDのα鎖とβ1、β2の２つのドメインからなる26～29KDのβ鎖のヘテロダイマーによって形成されるクラスIIに分類される。さらに、HLAクラスI（HLA-I）には、HLA-A、B、C等の存在が知られている(以下において、HLA-Aを「HLAクラスI A（HLA-IA）」とも称する)。
　これまでに、リンパ球細胞において抗HLAクラスI A抗体によるライゲーションで、細胞増殖抑制効果や細胞死誘導効果が報告されており、HLA分子のシグナル伝達分子としての可能性が示唆されている。例えばヒトHLAクラスI Aのα1ドメインに対する抗体B9.12.1、α2ドメインに対する抗体W6/32、α3ドメインに対する抗体TP25.99, A1.4は、活性化リンパ球に対して細胞増殖を抑制するとの報告がある（非特許文献１、２）。また、α1ドメインに対する二種類の抗体MoAb90、YTH862は、活性化リンパ球に対してアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献２、３、４）。この２つの抗体によって誘導されるアポトーシスはカスパーゼを介した反応であることが明らかにされており（非特許文献４）、このことからリンパ球細胞で発現するHLAクラスI Aは、アポトーシスの信号伝達にも関与していると推測されている。
　さらに、ヒトHLAクラスI Aのα3ドメインに対する抗体 5H7（非特許文献５）、マウスMHCクラスIのα2ドメインに対する抗体RE2（非特許文献６）も、活性化リンパ球などに細胞死を誘導することが報告されている。
　ヒト骨髄腫細胞を免疫して得られたモノクローナル抗体2D7（非特許文献８）も、HLAクラスI Aを認識する抗体であり、該2D7を低分子化（diabody化）することにより、ヒト骨髄腫細胞株に対して短時間で激しい細胞死を誘導することが報告されている。また、ヒトHLAクラスIAと、ヒトβ2Mを共発現させた細胞をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体C3B3（特許文献５）はHLAクラスI抗原のα2ドメインを認識する抗体であり、抗マウスIgG抗体とクロスリンクすることにより、強い細胞傷害活性を示す。さらにこのC3B3抗体を低分子化抗体（C3B3 diabody）へと改変することにより、C3B3 diabody (C3B3-DB)単独で2D7 diabody単独よりも強い抗腫瘍作用を示した（特許文献５）。
　2D7 diabodyおよびC3B3 diabodyは、各種ヒト骨髄腫細胞株、および、活性化リンパ球細胞に対して強い細胞死誘導活性を示し、マウスにヒト骨髄腫細胞株を移植した多発性骨髄腫モデルマウスにおいても、有意な延命効果を示したことから、骨髄腫治療薬として開発が進められている(特許文献１～５、非特許文献７)。このような、HLAクラスI関与の細胞死誘導を利用した治療をさらに発展させれば、骨髄腫等に対する有効性の高い医薬品が開発されるものと期待される。
　血液癌や多発性骨髄腫では化学療法が効果的であり、化学療法を続けることにより血中や骨髄において癌細胞が確認されない状態にすることが可能である。しかしながら、血液癌や骨髄腫においては、このように癌細胞が確認されなくなった場合であっても、一定期間経過後に癌が再発することがある。これは、化学療法により血液癌や骨髄腫が完治されたように見えても、実際には癌幹細胞が存在しており、一定期間を経過した後にこの癌幹細胞が増殖して、癌が再発すると考えられている。癌の再発を抑制するために癌細胞が確認されなくなった後も薬剤の投与を継続する維持療法が行われることがあるが、癌幹細胞に対しては従来の化学療法剤は効果が低いと考えられており、今までのところ癌幹細胞に対して治療効果の高い薬剤は報告されていない。
Fayen et al., Int. Immunol., 10: 1347-1358(1998) Genestier et al., Blood, 90: 3629-3639 (1997) Genestier et al., Blood, 90: 726-735 (1997) Genestier et al., J. Biol. Chem., 273: 5060-5066 (1998) Woodle et al., J. Immunol., 158: 2156-2164 (1997) Matsuoka et al., J. Exp. Med., 181: 2007-2015 (1995) Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209 (2004) 岡達三　三共生命科学財団研究報告集 12: 46-56 (1998)
WO2004/033499 WO2005/056603 WO2005/100560 WO2006/123724 PCT/JP2007/063946
　本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、骨髄腫等に対する有効性の高い医薬品を提供することにある。より具体的には本発明は、骨髄腫等の癌の再発を予防するための維持療法用医薬組成物を提供することを課題とする。また、骨髄腫等の癌の治療後の状態を維持する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記の課題を解決するために、腫瘍細胞のSP(side-population) fractionに対する細胞障害活性を検討することにより、抗HLAクラスI抗体が骨髄腫等の疾患の維持療法に有効であるか否か検討した。
　まず本発明者らは、腫瘍細胞のSP fractionとnon-SP fraction の双方において、HLA-Aが高発現していることを確認した。このことから本発明者らは、これらの細胞が抗HLAクラスI抗体の治療標的となりうると考えた。
　また本発明者らは、腫瘍細胞のSP fractionはnon-SP fractionと比較し、薬剤耐性に関与するABC transporterの１種であるABCG2を細胞表面に高発現していることを確認した。さらに本発明者らは、SP fractionはnon-SP fractionよりも増殖速度が遅いことを確認した。これらのことから本発明者らは、SP fractionは薬剤耐性でdormantなcancer stem cellに類似した特徴を有していると考え、SP fractionに対する抗HLAクラスI抗体の効果の検討を試みた。
　本発明者らは、抗HLAクラスI抗体の存在下でSP fractionおよびnon-SP fractionの培養を行った結果、SP fraction、non-SP fractionの双方において、細胞数が減少することを確認した。一方、抗HLAクラスI抗体の非存在下においては、non-SP fractionでは細胞数の減少が見られるものの、SP fractionでは細胞数に変化が見られないことを確認した。
　さらに本発明者らは、抗HLAクラスI抗体がSP fraction、non-SP fractionの双方に対し、強い細胞障害活性を示すことを確認した。
　このように本発明者らは、抗HLAクラスI抗体が腫瘍細胞のnon-SP fractionのみならずSP fractionに対しても細胞傷害を誘導することを明らかにした。本発明者らは、従来の抗癌剤治療後に抗HLAクラスI抗体による治療を追加することにより、残存する抗癌剤抵抗性のcancer stem cellを障害し、再発を抑制につながる維持療法として効果が期待できるものと考え、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下〔１〕～〔２５〕を提供するものである。
〔１〕HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、維持療法用医薬組成物。
〔２〕骨髄腫または血液癌における維持療法に用いられることを特徴とする〔１〕に記載の医薬組成物。
〔３〕骨髄腫または血液癌の治療後に用いられることを特徴とする〔２〕に記載の医薬組成物。
〔４〕骨髄腫または血液癌の再発防止のために用いられる〔３〕に記載の医薬組成物。
〔５〕HLAクラスIを認識する抗体がHLA-Aを認識する抗体である〔１〕～〔４〕いずれかに記載の医薬組成物。
〔６〕HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、疾患の治療後の状態を維持する方法。
〔７〕疾患が骨髄腫または血液癌である、〔６〕に記載の方法。
〔８〕抗体が骨髄腫または血液癌の治療後に投与される、〔７〕に記載の方法。
〔９〕抗体が骨髄腫または血液癌の再発防止のために投与される、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕HLAクラスIを認識する抗体がHLA-Aを認識する抗体である〔６〕～〔９〕いずれかに記載の方法。
〔１１〕維持療法用医薬組成物を製造するための、HLAクラスIを認識する抗体の使用。
〔１２〕医薬組成物が骨髄腫または血液癌の維持療法に用いられる、〔１１〕に記載の使用。
〔１３〕医薬組成物が骨髄腫または血液癌の治療後に用いられる、〔１２〕に記載の使用。
〔１４〕医薬組成物が骨髄腫または血液癌の再発防止のために用いられる、〔１３〕に記載の使用。
〔１５〕HLAクラスIを認識する抗体がHLA-Aを認識する抗体である〔１１〕～〔１４〕いずれかに記載の使用。
〔１６〕疾患の治療後の状態を維持するために用いられる（疾患の維持療法のために用いられる）、HLAクラスIを認識する抗体。
〔１７〕疾患が骨髄腫または血液癌である、〔１６〕に記載の抗体。
〔１８〕骨髄腫または血液癌の治療後に用いられる、〔１７〕に記載の抗体。
〔１９〕骨髄腫または血液癌の再発防止のために用いられる、〔１８〕に記載の抗体。
〔２０〕HLAクラスIを認識する抗体がHLA-Aを認識する抗体である〔１６〕～〔１９〕いずれかに記載の抗体。
〔２１〕疾患の治療後の状態を維持するための、HLAクラスIを認識する抗体の使用。
〔２２〕疾患が骨髄腫または血液癌である、〔２１〕に記載の使用。
〔２３〕骨髄腫または血液癌の治療後に用いられる、〔２２〕に記載の使用。
〔２４〕骨髄腫または血液癌の再発防止のために用いられる、〔２３〕に記載の使用。
〔２５〕HLAクラスIを認識する抗体がHLA-Aを認識する抗体である〔２１〕～〔２４〕いずれかに記載の使用。
骨髄腫細胞株でのSP細胞の存在を示す図である。上段は、３種の骨髄腫細胞株（RPMI 8226、U266、 MM.1S）に Hoechst33342 存在下で培養した後の細胞内に取り込まれた色素をフローサイトメトリーにより解析した図である。下段は、Hoechst33342 +Verapamil存在下で培養した後の細胞内に取り込まれた色素をフローサイトメトリーにより解析した図である。 RPMI 8226細胞のSP fractionとNon-SP fractionをソーティングし、それぞれの細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーにて測定した結果を示す図である（SP cell: 上段、 Non-SP cell: 下段）。 RPMI 8226のSP fractionとnon-SP fractionを、ABCG2抗体とFITC標識２次抗体にて染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した結果を示す図である。 RPMI 8226のSP fractionとnon-SP fraction細胞の細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。 RPMI 8226細胞をC3B3-DB やmelphalan の存在下で48時間培養した後、SP fractionの割合をフローサイトメトリーで測定した図である。 骨髄腫患者の骨髄より採取した骨髄腫細胞をC3B3-DB やmelphalan の存在下で48時間培養した後、SP fractionの割合をフローサイトメトリーで測定した図である。 RPMI 8226をSP fractionとnon-SP fractionにソーティングし、各々をC3B3-DB 、bortezomib 、melphalan 存在下に48時間培養した後に、Annexin V-PI染色を行い，apoptosisの割合を測定した図である。 RPMI 8226をSP fractionとnon-SP fractionにソーティングし、C3B3-DB 存在下、非存在下での培養後のコロニー数を示した図である。 SCIDマウスを用いて腫瘍増殖の抑制効果を検討した結果を示す図および写真である。
　本発明は、HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、維持療法用医薬組成物に関する。
　本発明において、HLAとは、ヒト白血球抗原を意味する。HLA分子はクラスIとクラスIIに分類され、クラスIとしてはHLA-A、B、C、E、F、G、H、Jなどが知られている。本発明の抗体が認識する抗原はHLAクラスIに分類される分子であれば特に制限されないが、好ましくはHLAクラスIAであり、より好ましくはHLAクラスIAのα1ドメインおよび／またはα2ドメインである。
　本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはマウス由来の抗体またはヒト由来の抗体を挙げることができる。本発明に用いられるHLAクラスIを認識する抗体（抗HLAクラスI抗体）は、HLAクラスIに特異的に結合することが好ましい。
　本発明で使用される抗HLAクラスI抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗HLAクラスI抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生される抗体、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生される抗体、等がある。
　このような抗体の例としては、C3B3抗体（WO2008/007755）や、2D7抗体（Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209 (2004)）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　抗HLAクラスI抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、HLAクラスIを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウィルスを用いた方法（WO98/46777など）等に準じて行うことができる。また、HLAクラスIの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のHLAクラスI分子を公知の方法で精製し、この精製HLAクラスI蛋白質を感作抗原として用いることもできる。また、HLAクラスI分子と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
　感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
　感作抗原による動物の免疫は、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
　このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) 、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519 ）、MPC-11（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133 ）等が適宜使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C. 、Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1～10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000～6000程度のPEG溶液を通常、30～60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
　当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日～数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
　本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
　具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
　得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
　目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
　本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　本発明で使用される抗体の具体的な例としては、配列番号：７、８、９に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域を含む抗体、または、配列番号：１０、１１、１２に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む抗体を挙げることができる。
　本発明の抗体の具体例として、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の重鎖可変領域を含む抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する重鎖可変領域であって、(ａ)に記載の重鎖可変領域と機能的に同等な重鎖可変領域
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAがコードするアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
　または、本発明の抗体として、以下の（ｅ）～（ｈ）のいずれかに記載の軽鎖可変領域を含む抗体が例として挙げられる。
（ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（ｆ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域であって、(ｅ)に記載の軽鎖可変領域と機能的に同等な軽鎖可変領域
（ｇ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるDNAがコードするアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（ｈ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
　さらに、このような重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体の例としては、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する抗体が例として挙げられる。
（ａ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるDNAがコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするアミノ酸配列
　重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
　ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が、配列番号：７、８、９に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域または配列番号：１０、１１、１２に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を有する抗体と同等の活性（例えば、HLA-Aへの結合活性、細胞傷害活性、細胞死誘導活性、細胞増殖抑制活性など）を有することを意味する。
　あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
　変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。
　本発明の抗体には、本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。
　また、抗体と他のペプチドまたはタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチドまたはポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン－S－トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
　本発明で使用される抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明の抗体として使用することができる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明で使用される抗体はこのような抗体も包含する。
　本発明には、抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には、重鎖可変領域または軽鎖可変領域コードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体の可変領域をコードするDNAを、抗体定常領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　また、本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（chimeric）抗体、ヒト化（humanized）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
　キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
　具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。
　CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
　キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体C領域が使用される。ヒト抗体C領域としては、Cγが挙げられ、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3またはCγ4を使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。
　キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域からなり、両者はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
　前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
　また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40)等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
　例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) 、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ）に従えば容易に実施することができる。
　大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546；Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。
　抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。
　複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
　真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Veroなど、(2)両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
　原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。
　これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
　一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
　哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
　これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。
　また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994)24, 131-138）。
　上述のようにin vitroまたはin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）または軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時に形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。
　本発明で使用される抗体は、低分子化抗体であってもよい。本発明において低分子化抗体(minibody)とは、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)を親抗体とし、全長抗体の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（VH）または軽鎖可変領域（VL）を含んでいることが好ましく、特に好ましいのはVHとVLの両方を含む断片である。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（シングルチェインFv）、sc（Fv２）などを挙げることができるが、好ましくはdiabody (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg および Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))である。このような抗体断片を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
　本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
　本発明において好ましい低分子化抗体は、抗体のVHを２つ以上およびVLを２つ以上含み、これら各可変領域を直接あるいはリンカー等を介して間接的に結合した抗体である。結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、また、共有結合と非共有結合の両方でよい。さらに好ましい低分子化抗体は、VHとVLが非共有結合により結合して形成されるVH-VL対を２つ以上含んでいる抗体である。この場合、低分子化抗体中の一方のVH-VL対と他方のVH-VL対との間の距離が、全長抗体における距離よりも短くなる抗体が好ましい。
　本発明においてscFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域を連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖または、H鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖または、L鎖V領域をコードするDNAを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNAおよびその両端を各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
　また、一旦scFvをコードするDNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、scFvを得ることができる。
　これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
　本発明において特に好ましい低分子化抗体はdiabodyである。diabodyは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、scFv等）（以下、diabodyを構成するフラグメント）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのVLと２つのVHを含む(P.Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 6444-6448 (1993)、EP404097号、WO93/11161号、Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991)、Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996)、Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994)、John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999)、Holliger et al,. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 6444-6448, (1993)、Atwell et al., Mol.Immunol. 33, 1301-1312, (1996))。diabodyを構成するフラグメント間の結合は非共有結合でも、共有結合でよいが、好ましくは非共有結合である。
　また、diabodyを構成するフラグメント同士をリンカーなどで結合して、一本鎖diabody（sc diabody）とすることも可能である。その際、diabodyを構成するフラグメント同士を20アミノ酸程度の長いリンカーを用いて結合すると、同一鎖上に存在するdiabodyを構成するフラグメント同士で非共有結合が可能となり、二量体を形成する。
　diabodyを構成するフラグメントは、VLとVHを結合したもの、VLとVLを結合したもの、VHとVHを結合したもの等を挙げることができるが、好ましくはVHとVLを結合したものである。diabodyを構成するフラグメント中において、可変領域と可変領域を結合するリンカーは特に制限されないが、同一フラグメント中の可変領域の間で非共有結合がおこらない程度に短いリンカーを用いることが好ましい。そのようなリンカーの長さは当業者が適宜決定することができるが、通常2～14アミノ酸、好ましくは3～9アミノ酸、特に好ましくは4～6アミノ酸である。この場合、同一フラグメント上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため、同一鎖上のVLとVHの間で非共有結合がおこらず、単鎖V領域フラグメントが形成されないため、他のフラグメントとの非共有結合による二量体を形成する。さらに、diabody作製と同じ原理で、diabodyを構成するフラグメントを３つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体化させた抗体を作製することも可能である。diabodyの例としては、上述のC3B3 diabody（WO2008/007755）や、2D7 diabody（Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209 (2004)）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において使用される抗体は、抗HLAクラスI 抗体の活性を有していることが好ましい。本発明において、抗HLAクラスI抗体の活性とは、抗体が抗原に結合することにより生じる生物学的作用をいう。例えば生物学的作用としては細胞傷害作用、抗腫瘍作用などが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに具体的な例としては、細胞死誘導作用、アポトーシス誘導作用、細胞増殖抑制作用、細胞分化抑制作用、細胞分裂抑制作用、細胞増殖誘導作用、細胞分化誘導作用、細胞分裂誘導作用、細胞周期調節作用などを挙げることができるが、好ましくは細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用である。
　細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用などの上記作用の対象となる細胞は特に限定されないが、血球系細胞や浮遊細胞が好ましい。血球系細胞の具体的な例としては、リンパ球（B細胞、T細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、単球（好ましくは活性化した末梢血単核球(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)）、ミエローマ細胞などを挙げることができるが、リンパ球（B細胞、T細胞）、ミエローマ細胞が好ましく、T細胞またはB細胞（特に活性化したB細胞または活性化したT細胞）が最も好ましい。浮遊細胞は、細胞を培養した際、細胞がガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着することなく、浮遊状で増殖する細胞である。これに対し、接着細胞（付着細胞）とは、細胞を培養した際、ガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着する細胞である。
　一般的に、抗HLAクラスI抗体、例えば全長抗HLA抗体では細胞死誘導活性を増強させるために抗IgG抗体などでクロスリンクを行ってもよく、クロスリンクは当業者に公知の方法により行うことができる。
　本発明の医薬組成物は維持療法、特に癌における維持療法に用いることが可能である。維持療法は通常、現在の状態（病気の治療後の状態）を維持するために行われる治療方法である。例えば、病気などが治療（手術、投薬治療、など）により治った後、再発を予防（防止）するために行われる治療である。このような治療の例として例えば、病気の治療後に低用量の薬剤の服用を続けることが挙げられるが、これに限定されない。本発明の維持療法の対象となる疾患は特に限定されないが、好ましくは癌であり、より好ましくは骨髄腫または血液癌である。例えば、癌の治療において癌細胞が取り除かれた若しくは癌細胞を死滅させたと考えられる場合でも、観察されない癌細胞が残っていることがある。そのような癌細胞が残っている場合には、一定期間後に癌が再発、転移することがあり、癌の治療後に癌の再発や転移を予防あるいは抑制するための治療を行う必要がある。本発明の医薬組成物はそのような癌の治療後に癌の再発や転移を予防あるいは抑制するために用いることが可能である。
　本発明において癌治療とは、癌組織の物理的な除去、抗癌剤を用いる化学療法、放射線療法、経皮的エタノール注入療法、経皮的ラジオ波照射熱凝固療法、経カテーテル肝動脈塞栓療法など、癌細胞の増殖抑制・癌細胞の死滅、癌細胞の減少、癌細胞の除去などを目的とする限り、如何なる治療でもよい。癌治療後とは、これらの治療が行われた後のことをいう。なお、本発明においては、癌治療後とは、必ずしも癌が治癒されたことを意味しないが、癌が治癒されたと判断された後であることが好ましい。
　特に限定されないが、癌治療の具体的な例としては、化学療法剤による治療、骨髄移植などを挙げることができる。「化学療法剤」には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然産物、白金錯体、およびその他の薬剤が含まれる。アルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード類(Nitrogen Mustards)、エチレンイミン類(Ethylenimines)、メチルメラミン類(Methylmelamines)、スルホン酸アルキル類(Alkyl Sulfonates)、ニトロソウレア類(Nitrosoureas)、トリアゼン類(Triazens)が挙げられる。ナイトロジェンマスタード類としては、例えば、メクロルエタミン(Mechlorethamine)、シクロフォスファミド(Cyclophosphamide)、イフォスファミド(Ifosfamide)、メルファラン(Melphalan)、クロラムブシル(Chlorambucil)が挙げられる。エチレンイミン類とメチルメラミン類としては、例えば、ヘキサメチルメラミン(Hexamethylmelamine)、チオテパ(Thiotepa)が挙げられる。スルホン酸アルキル類としては、ブスルファン(Busulfan)が挙げられる。ニトロソウレア類としては、例えば、カルムスチン(Carmustine: BCNU)、ロムスチン(Lomustine: CCNU)、セムスチン(Semustine: methyl-CCNU)、ストレプトゾシン(Streptozocin)が挙げられる。トリアゼン類としては、ダカルバジン(Dacarbazine: DTIC)が挙げられる。代謝拮抗剤としては、葉酸類似物質、ピリミジン類似物質、プリン類似物質が挙げられる。葉酸類似物質としては、メトトレキセート(Methotrexate)が挙げられる。ピリミジン類似物質としては、例えば、フルオロウラシル(Fluorouracil: 5-FU)、ドキシフルリジン(Doxifluridine: 5'-DFUR、商品名　フルツロン)、カペシタビン(Capecitabine、商品名　ゼローダ)、フロクスウリジン(Floxuridine: FudR)、シタラビン(Cytarabine)が挙げられる。プリン類似物質としては、例えば、メルカプトプリン(Mercaptopurine: 6-MP)、チオグアニン(Thioguanine: TG)、ペントスタチン(Pentostatin)が挙げられる。天然産物としては、ビンカアルカロイド類(Vinca Alkaloids)、エピポドフィロトキシン類(Epipodophyllotoxins)、抗生物質類が挙げられる。ビンカアルカロイド類としては、例えば、ビンブラスチン(Vinblastine: VLB)、ビンクリスチン(Vincristine: VCR)が挙げられる。エピポドフィロトキシン類としては、例えば、エトポシド(Etoposide)、テニポシド(Teniposide)が挙げられる。抗生物質としては、例えば、ダクチノマイシン(Dactinomycin: actinomycin D)、ダウノルビシン(Daunorubicin)、ドキソルビシン(Doxorubicin)、ブレオマイシン(Bleomycin)、プリカマイシン(Plicamycin)、マイトマイシン(Mitomycin)が挙げられる。白金錯体とは、プラチナ配位複合体を指し、例えば、シスプラチン(Cisplatin: CDDP)、カルボプラチン(Carboplatin)が挙げられる。その他の薬剤としては、タキソール類、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、アントラセネジオン類(Anthracenediones)、例えばミトキサントロン(Mitoxantrone)、尿素置換体類、例えばヒドロキシウレア(Hydroxyurea)、メチルヒドラジン類(Methyl Hydrazines)、例えば塩酸プロカルバジン(Procarbazine Hydrochloride、商品名　ナツラン)、ビタミンＡ代謝物類、例えばトレチノイン(Tretinoin、商品名　ベサノイド)が挙げられる。
　なお、特に限定されないが、好ましくは化学療法剤にはHLAクラスIを認識する抗体は含まれず、より好ましくは化学療法剤には抗体は含まれない。
　本発明の医薬組成物が投与される時期は特に限定されず、如何なる時期に投与されてもよい。例えば、癌の治療終了後すぐに投与を開始してもよいし、癌の治療後、一定期間経過してから投与を開始してもよい。さらに、癌の治療と本発明の医薬組成物による維持療法が重複する期間があってもよい。
　本発明において好ましい投与タイミングは癌治療後から癌再発までの間である。例えば、治療後12週間以内や6週間以内に投与を開始されることが一般的である。癌が再発したか否かは当業者に公知の方法により判断することができ、例えば、肉眼所見や病理所見により腫瘍が確認できるか否かで判断することができる。腫瘍の確認は各種腫瘍マーカーを指標とする方法やイメージングなど、当業者に公知の方法により行うことが可能である。
　本発明の維持療法は、アジュバント療法、術後補助療法と呼ばれる方法であってもよい。
　本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、癌種は特に限定されず、骨髄腫、血液癌（血液腫瘍）、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、胆管癌など、如何なる癌でもよい。癌は原発性および続発性のどちらでもよい。好ましい癌としては、骨髄腫または血液癌（血液腫瘍）を挙げることができる。血液癌（血液腫瘍）の具体的な例として、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、形質細胞異常症（骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症）、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症）などを挙げることができる。本発明の医薬組成物は維持療法のための他の薬剤と併用してもよい。
　さらに、本発明はHLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する癌幹細胞の増殖抑制剤を提供する。本発明において癌幹細胞は特に限定されないが、例としてSP fractionに存在する癌幹細胞を挙げることができる。癌幹細胞の増殖抑制剤は癌の維持療法などに有用である。
　本発明の医薬組成物が投与される対象は哺乳動物である。哺乳動物は、好ましくはヒトである。
　本発明の医薬組成物は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、１回につき体重1kgあたり0.01mgから100mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり1～1000mg、好ましくは5～50mgの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重1kgあたり１ヶ月（４週間）に0.5mgから40mg、好ましくは1mgから20mgを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
　本発明において医薬組成物には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、それ自体は上記の細胞傷害活性を有する材料であってもよいし、当該活性を有さない材料であってもよく、本発明の医薬組成物とともに投与可能な材料を意味する。また、細胞傷害活性を有さない材料であるが、抗HLAクラスI抗体と併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。
　製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。
　本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６～１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
　また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０～１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２～４でアルキル基の炭素原子数が１０～１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８～１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質；炭素原子数１２～１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
　本発明の医薬組成物には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合せて添加することができる。本発明の医薬組成物で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート20、40、60または80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート20および80が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ-68（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
　界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルベート20またはポリソルベート80の場合では、一般には0.001～100mg/mLであり、好ましくは0.003～50mg/mLであり、さらに好ましくは0.005～2mg/mLである。
　本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸などの他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることができる。
　また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には1～500mMであり、好ましくは5～100mMであり、さらに好ましくは10～20mMである。
　また、本発明の医薬組成物は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖および単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
　本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることができる。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいpH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸またはこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオルニチンである。さらに、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸、およびその塩の形（好ましくはナトリウム塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、システイン、またはアラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体のＮ－アセチルトリプトファンを使用することもできる。
　本発明において、多糖および単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
　本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
　本発明の医薬組成物を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液と混合することができる。また該水溶液は適当な溶解補助剤（例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等）と併用してもよい。所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
　本発明において、含硫還元剤としては、例えば、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１～７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。
　また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸およびその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることができる。
　また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
　使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組み合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
　本発明は、HLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、疾患の治療後の状態を維持する方法に関する。
　さらに、本発明はHLAクラスIを認識する抗体を対象に投与する工程を含む、疾患の再発を予防する方法に関する。
　本発明の方法の対象となる疾患は特に限定されないが、好ましくは癌であり、より好ましくは骨髄腫または血液癌である。
　本発明において、「対象」とは、本発明の医薬組成物を投与する生物体、該生物体の体内の一部分をいう。生物体は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む。上記の「生物体の体内の一部分」については特に限定されない。
　「対象」は通常、疾患の治療を受けた後の生物体または該生物体の体内の一部分である。例えば、疾患が癌の場合、通常、本発明の「対象」は癌治療後の生物体または該生物体の体内の一部分である。癌治療とは、癌組織の物理的な除去、抗癌剤を用いる化学療法、放射線療法、経皮的エタノール注入療法、経皮的ラジオ波照射熱凝固療法、経カテーテル肝動脈塞栓療法など、癌細胞の増殖抑制・癌細胞の死滅、癌細胞の減少、癌細胞の除去などを目的とする限り、如何なる治療でもよい。好ましい癌治療として抗癌剤を用いる化学療法を挙げることができる。癌治療後とは、これらの治療が行われた後のことをいう。なお、本発明においては、癌治療後とは、必ずしも癌が治癒されたことを意味しないが、癌が治癒されたと判断された後であることが好ましい。
　HLAクラスIを認識する抗体が投与される時期は特に限定されず、如何なる時期に投与されてもよい。例えば、疾患の治療終了後すぐに投与を開始してもよいし、疾患の治療後、一定期間経過してから投与を開始してもよい。さらに、疾患の治療とHLAクラスIを認識する抗体による維持療法が重複する期間があってもよい。
　本発明において好ましい投与タイミングは疾患治療後から疾患再発までの間である。例えば、疾患が癌の場合、治療後12週間以内や6週間以内に投与を開始されることが一般的である。癌が再発したか否かは当業者に公知の方法により判断することができ、例えば、肉眼所見や病理所見により腫瘍が確認できるか否かで判断することができる。腫瘍の確認は各種腫瘍マーカーを指標とする方法やイメージングなど、当業者に公知の方法により行うことが可能である。
　さらに本発明は、癌幹細胞の増殖を抑制する必要がある対象に、HLAクラスIを認識する抗体を投与する工程を含む、癌幹細胞の増殖を抑制する方法に関する。
　本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含まれる。経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。
　非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、静脈注射剤、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。また、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することができる。また、本発明の医薬組成物を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明のペプチドをコードするDNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。
　本発明の医薬組成物の対象への投与は、１回であってもよいし、複数回であってもよい。
　また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に投与を行う際には、本発明の医薬組成物を生物体の一部に「接触」させてもよい。
　また、本発明において「接触」は、生物体の状態に応じて行う。例えば、生物体の一部への本発明の医薬組成物の散布、あるいは、生物体の一部の破砕物への本発明の医薬組成物の添加等を挙げることができるが、これらの方法に制限されない。生物体の一部が培養細胞の場合には、該細胞の培養液への発明の医薬組成物の添加あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドを含むDNAを、生物体の一部を構成する細胞へ導入することにより、上記「接触」を行うことも可能である。
　なお本発明の「疾患の治療後の状態を維持する方法」は「疾患の再発を予防する方法」と表現することもできる。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下の実施例では、腫瘍細胞のSP (side population) fractionに対する細胞障害活性を検討することにより、維持療法としての抗HLAクラスI抗体の有効性について評価した。
　なお、SP(side population)細胞は造血幹細胞の一種と考えられており、癌細胞においてもその存在が報告されている。以下の実施例に示すように、本発明において血液癌幹細胞の一種であるSP細胞に抗HLAクラスI抗体が有効であることが見出されたことから、抗HLAクラスI抗体は癌の維持療法に有効であると考えられる。
１．SP fraction in MM cell line
　骨髄腫細胞株であるRPMI 8226 (Health Science Resources Bank, Osaka, Japan)、U266 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)、MM.1S (Dr. Steven Rosen, Northwestern University, Chicago, ILより供与)をチューブに分注（1×106個）し、遠心後上清を除き、Hoechst33342 (final 5μg/mL, Sigma, St. Louis, MO)およびPI（final 1μg/mL, Sigma）を含むPBS/3% FBSを3mLずつ加え、37℃で90分培養した。なお、100μM verapamil (Sigma)を加えたものをSP fractionのnegative controlとした。遠心、洗浄を３回繰り返し、PBS/3% FBS 1mLに浮遊させFACS（Coultar）により解析した。
　RPMI 8226とU266細胞においては、verapamilの添加により抑制されるSP fractionの存在が確認された（それぞれ0.2％、0.08％。図１）。
２．Expression of cell surface antigens
　RPMI 8226細胞を用い、SP fractionとNon-SP fractionをソーティングした。細胞表面マーカーに対する蛍光標識モノクローナル抗体（P-glycoprotein抗体，Coulter #IM2370；ABCG2抗体，Chemicon #MAB4146；VLA-4抗体，Pharmingen #31475；CD138抗体，Immunotech #IM2759；HLA-A, C3B3 IgG抗体）で染色し、FACSにて解析した（図２。グレーはnegative control抗体）。薬剤耐性に関与するp-glycoproteinはいずれの細胞も発現していなかったが、ABCG2はSP fractionの一部の細胞に高発現していた。骨髄腫細胞の間質細胞との接着に関与するVLA-4については両者に差はなかったが、分化抗原であるCD138はSP fractionが低発現であった。なお、HLA-Aについてはいずれの細胞も高発現しており、これらの細胞はC3B3-DBの治療標的となりうる可能性が示唆された。
３．Expression of ABCG2 protein
　薬剤耐性に関与するABC transporterの１種であるABCG2の発現についてサイトスピン標本をABCG2抗体とFITC標識２次抗体（Zymed, San Francisco, CA）にて染色し、共焦点レーザー顕微鏡（Nikon, Tokyo, Japan）にて観察した。RPMI 8226のSP fractionはnon-SP fractionと比較し、ABCG2を細胞表面に高発現していた（図３）。
４．Growth curves
　ソーティングしたSP fractionとnon-SP fractionを培養し、それぞれの細胞数を経時的に測定した（図４）。SP fractionはnon-SP fractionよりも増殖速度が遅いことが明らかとなった。
　以上のことから、SP fractionはABCG2を高発現し薬剤耐性でdormantなcancer stem cellに類似した特徴を有していることが明らかとなった。このSP fractionは化学療法後も残存し、再発をきたすと考えられることから、SP fractionに対するC3B3-DBの効果を検討した。
５．Effect of C3B3 diabody on SP cell fraction
　RPMI 8226細胞をC3B3-DB (1 μg/ml)やmelphalan (10 μM; Sigma)の存在下で48時間培養した後、SP fractionの割合をフローサイトメトリーで測定した（図５）。コントロールと比較し、C3B3-DBで処理した細胞はSP fractionが0.3%と減少し、non-SP fractionも4.0%と減少した。一方、melphalanで処理した細胞はnon-SP fractionが3.9%と減少したものの、SP fractionは0.7%と変わらなかった。このことから、SP fractionは抗癌剤に抵抗性であるがC3B3-DBには感受性があることが示唆された。
６．Effect of C3B3 diabody on SP cell fraction
　骨髄腫患者の骨髄よりhuman multiple myeloma cell enrichment cocktail (StemCell technologies, Vancouver, British Columbia, Canada)を用いて骨髄腫細胞を純化し、同様の検討を行ったところ、melphalanではnon-SP fractionのみが傷害されたが、C3B3-DBではSP fractionとnon-SP fractionの両者が傷害された（図６）。
７．Apoptosis assay
　RPMI 8226をSP fractionとnon-SP fractionにソーティングし、各々をC3B3-DB (1 μg/ml)やbortezomib (5, 10, 20 nM; (Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, MA)）、melphalan (5, 10, 20 μM)の存在下に48時間培養した。その後、Annexin V-PI染色(MBL, Nagoya, Japan)を行い、apoptosisの割合を測定し、コントロールを100%として生細胞率を示した（図７）。
　bortezomibやmelphalanではSP fractionよりもnon-SP fractionの方が強く傷害されたが、C3B3-DBではSP fraction、non-SP fractionともに強い細胞障害が誘導された。
８．Colony assay
　RPMI 8226をSP fractionとnon-SP fractionにソーティングし、各々をC3B3-DB (1 μg/ml)存在下のもと、メチルセルロース培地（MethoCult, StemCell technologies）にて11日間培養した。50個以上の細胞からなる集団をコロニーとして、コロニー数を測定した（図８）。
　SP fractionはnon-SP fractionよりも多くのコロニーを形成したが、C3B3-DBによりほぼ完全に抑制された。Non-SP fractionはコロニー形成が乏しかったが、同様にC3B3-DBによりコロニー形成はほぼ完全に抑制された。
９．Effect of C3B3-DB on tumor growth in SCID mice
　さらに、SCIDマウスを用いて腫瘍増殖の抑制効果を検討した。RPMI 8226のSP fraction (5x106 cells)をC3B3-DB (1μg/mL)で48時間処理し、4匹のSCIDマウスの右側胸部の皮下へ移植した。同時に未処理のSP fractionを左側に移植し、経時的に腫瘍の大きさを測定した。C3B3-DB未処理の細胞では、４週目より急速な腫瘍の増大を認めたが、C3B3-DB処理の細胞では、増殖速度は著明に抑制された（図９（ａ））。その後、それぞれの腫瘍を摘出し、SP細胞解析を行うと、C3B3-DB未処理の腫瘍ではSP fractionを0.33％認めたのに対し、C3B3-DB処理した腫瘍ではSP fractionは0.01%と著明に減少していた（図９（ｂ））。
　さらに、腫瘍の増殖率を検討するために病理標本のKi-67染色を実施した。C3B3-DB未処理の腫瘍ではKi-67陽性細胞を多く認めたのに対し、C3B3-DB処理した腫瘍ではKi-67陽性細胞は減少していた（図９（ｃ））。
　このことから，C3B3-DBはin vivoにおける腫瘍の増殖を抑制することが明らかとなった。
　このことから、melphalanやbortezomibは主に腫瘍細胞のnon-SP fractionを障害するが、C3B3-DBはnon-SPのみならずSP fractionに対しても細胞傷害を誘導することが明らかとなった。従って、従来の抗癌剤治療後に抗HLAクラスI抗体による治療を追加することは、残存する抗癌剤抵抗性のcancer stem cellを障害し、再発を抑制につながる維持療法として効果が期待できるものと考えられた。
　本発明により、骨髄腫等の癌の再発を予防するための維持療法用医薬組成物が提供された。血液癌や骨髄腫等の癌においては、化学療法により癌細胞が確認されなくなった場合であっても、一定期間経過後に癌が再発することがある。これは、化学療法により障害されなかった癌幹細胞が増殖するためと考えられる。癌の再発を抑制するために、癌細胞が確認されなくなった後も薬剤の投与を継続する維持療法が行われることがあるが、癌幹細胞に対しては従来の化学療法剤は効果が低いのが実情であった。一方本発明の組成物は、従来の化学療法剤によって障害することが困難な癌幹細胞に対して、障害作用を有する。従って、本発明の医薬組成物を従来の抗癌剤による治療後に投与することにより、残存する抗癌剤抵抗性の癌幹細胞を障害することが可能である。
　このように本発明の医薬組成物は、抗癌剤のみでは完治の困難な腫瘍の治療や再発の防止に有用である。

Claims (5)

  1. HLAクラスIを認識する抗体を有効成分として含有する、維持療法用医薬組成物。
  2. 骨髄腫または血液癌における維持療法に用いられることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 骨髄腫または血液癌の治療後に用いられることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 骨髄腫または血液癌の再発防止のために用いられる請求項３に記載の医薬組成物。
  5. HLAクラスIを認識する抗体がHLA-Aを認識する抗体である請求項１～４いずれかに記載の医薬組成物。
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