JPWO2016175307A1

JPWO2016175307A1 - 癌の治療及び／又は予防用医薬組成物

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Publication number: JPWO2016175307A1
Application number: JP2016539232A
Authority: JP
Inventors: 祥栗原; 賢基全; 貴之藤田; 文義岡野
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2018-02-22
Anticipated expiration: 2036-04-28
Also published as: PT3290051T; RU2714205C2; JP6862828B2; AU2016255255A1; KR20170141660A; ES2762979T3; RU2017135005A; US20180085453A1; EP3290051B1; MX2017013480A; CA2983232A1; EP3290051A4; CN107530426A; BR112017022390A2; EP3290051A1; HUE047272T2; AU2016255255B2; WO2016175307A1; RU2017135005A3; US11129893B2

Abstract

本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。配列番号８、４、６、１０、１２で表されるいずれかのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、からなるＣＳＰＧ５タンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸からなるその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。

Description

本発明は、ＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントの癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。

癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体類、細胞傷害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類等が同定されており、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている。

癌治療法においては、副作用を軽減する理由から抗原として認識されるペプチド（ポリペプチドを含む）は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが望ましい。１９９１年、ベルギー国Ｌｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献１）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する癌抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定するＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎｓｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（特許文献１、非特許文献２）、この方法により、正常細胞にはほとんど発現がなく、癌に特異的に発現するいくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献３）。さらに、その癌抗原のアミノ酸配列の一部をターゲットにして該癌抗原に特異的に反応する免疫細胞を用いた細胞療法や、癌抗原を含むワクチン等の癌特異的免疫療法の臨床試験が実施されている。

一方、癌細胞上の特定の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。標的となる抗原タンパク質の多くは、癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ、注目されているが、複数の正常細胞にも発現する。そのため、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、正常細胞までも傷害してしまうことから、副作用が大きな問題になっている。したがって、正常細胞には発現せず、癌細胞表面にのみ特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。

米国特許第５６９８３９６号

ＢｒｕｇｇｅｎＰ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２：９６５−９７１（１９９７）

本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。

本発明者らは、イヌの精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法で癌に特異的に発現する抗原の単離を行った結果、ＣＳＰＧ５タンパク質をコードするｃＤＮＡを取得した。ＣＳＰＧ５タンパク質は、様々な担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合できる。また、本発明者らは、ＣＳＰＧ５タンパク質が乳癌、肺癌、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、腺癌、肥満細胞腫、扁平上皮癌、メラノーマ又は神経芽腫細胞に特異的に発現していること、ＣＳＰＧ５タンパク質の一部がそれら癌細胞の細胞表面に特異的に発現していることを見出した。ＣＳＰＧ５（ＣｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎＳｕｌｆａｔｅＰｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ５）タンパク質は、1型の膜貫通タンパク質であり、ニューレグリンファミリータンパク質の１つである。また、ＥｒｂＢ３タンパク質に結合して増殖因子として作用すること、ＢＲＣＡ１タンパク質に変異がある卵巣癌において、発現が上昇していることが報告されている（Ｋｉｎｕｇａｓａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３２１：１０４５；Ｐｒｅｓｓ，Ｊ.Ｚ．，ｅｔａｌ．，2010，Neoplasia．，１２（１２）：９９３−１００２）。さらに、ＣＳＰＧ５タンパク質は、網膜神経節細胞やプルキンエ細胞、海馬等の神経系の組織で高発現しており、神経細胞の増殖・分化因子として作用することで神経軸索突起の伸長に関与することが知られている（Ｙａｓｕｄａ，Ｙ．ｅｔａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，３２：３１３；Ａｏｎｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，２００６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，８３：１１０；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：２４９７０）。しかし、ＣＳＰＧ５タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質が癌の治療や予防に有用であるという報告はない。

また、取得したイヌＣＳＰＧ５遺伝子及びそのヒト、ネコ、マウス相同性遺伝子を基にして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６の配列番号で表されるアミノ酸配列からなるＣＳＰＧ５タンパク質及びそれらのＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体を作製した。そして、それらＣＳＰＧ５タンパク質の各癌細胞の細胞表面に発現する部分、すなわち細胞外領域に対する抗体が、ＣＳＰＧ５タンパク質を発現する癌細胞を傷害することを見出し、本発明を完成させるに至った。

したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）ＣＳＰＧ５タンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸残基からなるその断片と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
（２）前記ＣＳＰＧ５タンパク質が配列番号８、４、６、１０、及び１２で表されるいずれかのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる、（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記癌が白血病又は悪性リンパ腫である、（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
（４）前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-093640号の開示内容を包含する。

本発明で用いられるＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体は、癌細胞を傷害する。したがって、ＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体は、癌の治療や予防に有用である。

同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、イヌ腫瘍組織又は癌細胞株での発現パターンを示す図である。図中、参照番号１はイヌＣＳＰＧ５遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターンを示し、参照番号２はイヌＧＡＰＤＨ遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターンを示す。同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、ヒト腫瘍組織又は癌細胞株での発現パターンを示す図である。同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、マウス腫瘍組織又は癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号３はマウスＣＳＰＧ５遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターンを示し、参照番号４はマウスＧＡＰＤＨ遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターンを示す。ＣＳＰＧ５遺伝子を発現する白血病細胞株（Ｋ５６２）及び悪性リンパ腫細胞（Ｌ−１２３６）に対するＣＳＰＧ５タンパク質に対するポリクローナル抗体（抗ＣＳＰＧ５ポリクローナル抗体）の細胞傷害活性を示す図である。図中、参照番号５はコントロールポリクローナル抗体を添加したときのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示し、参照番号６は抗ＣＳＰＧ５ポリクローナル抗体を添加したときのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示し、参照番号７はコントロールポリクローナル抗体を添加したときのＬ−１２３６細胞に対する細胞傷害活性を示し、そして参照番号８は抗ＣＳＰＧ５ポリクローナル抗体を添加したときのＬ−１２３６細胞に対する細胞傷害活性を示す。ＣＳＰＧ５遺伝子を発現する白血病細胞株（Ｋ５６２）及び悪性リンパ腫細胞（Ｌ−１２３６）に対するＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体（抗ＣＳＰＧ５モノクローナル抗体）の細胞傷害活性を示す図である。図中、参照番号９はコントロールモノクローナル抗体を添加したときのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示し、参照番号１０は抗ＣＳＰＧ５モノクローナル抗体を添加したときのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示し、参照番号１１はコントロールモノクローナル抗体を添加したときのＬ−１２３６細胞に対する細胞傷害活性を示し、そして参照番号１２は抗ＣＳＰＧ５モノクローナル抗体を添加したときのＬ−１２３６細胞に対する細胞傷害活性を示す。

本発明で用いられる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞傷害活性を示すか否かを調べることによって、評価することができる。

なお、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示されている。

本発明が開示する配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列は、イヌ精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして、また配列番号４、６、８、１０、１２で表されるアミノ酸配列は、そのヒト相同因子（ホモログ）として、配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、そのネコ相同因子として、配列番号１６で表されるアミノ酸配列は、そのマウス相同因子として単離された、ＣＳＰＧ５タンパク質のアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。

ＣＳＰＧ５タンパク質は、アミノ酸配列から１型の膜貫通タンパク質であることが知られており、その配列より予測される細胞外領域が神経細胞表面に発現することが知られていたが、本願により、ＣＳＰＧ５タンパク質の細胞外領域が各種癌細胞の細胞表面で実際に発現（存在）していることが明らかになった。本発明では、ＣＳＰＧ５タンパク質において、癌細胞の細胞外領域、又は該細胞外領域のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに結合する抗体が好ましく用いられる。

本発明で用いられる上記ＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体は、抗腫瘍活性を発揮し得る限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦＶ）、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ）等を含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、当業者に公知の方法により調製することが可能である。本発明においては、ＣＳＰＧ５タンパク質と特異的に結合することが可能な抗体が望ましく、モノクローナル抗体であることが好ましいが、均質な抗体を安定に生産できるかぎり、ポリクローナル抗体であっても良い。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避又は抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。

ここで、「ＣＳＰＧ５タンパク質と特異的に結合する」とは、ＣＳＰＧ５タンパク質に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。

さらにまた、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験体は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物等の哺乳動物であり、好ましい被験体は、ヒトである。

以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、及び医薬組成物について説明する。

＜抗体作製用抗原の作製＞
本発明で用いられるＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体（抗ＣＳＰＧ５抗体）を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ニワトリ等、その由来となる動物種に制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましい。一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＣＳＰＧ５タンパク質がヒトＣＳＰＧ５タンパク質の場合、ヒトＣＳＰＧ５タンパク質やその部分ポリペプチド、及びヒトＣＳＰＧ５タンパク質を発現する細胞等を用いることができる。

ＣＳＰＧ５タンパク質及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）を利用することによって入手することができる。

例えば、ヒトＣＳＰＧ５タンパク質を基準とした場合、ヒトＣＳＰＧ５タンパク質をコードする塩基配列（配列番号３、５、７、９又は１１）、及びその塩基配列と７０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、さらに好ましくは９５％〜１００％、例えば９７％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％又は９９．５％〜１００％の塩基同一性を有する核酸がターゲットになる。また、ヒトＣＳＰＧ５タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４、６、８、１０又は１２）、及びそのアミノ酸配列と７０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、さらに好ましくは９５％〜１００％、例えば９７％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％又は９９．５％〜１００％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドがターゲットになる。ここで、「塩基同一性」は、２つの塩基配列を、最大の類似度となるように適宜ギャップを導入し、アラインメント（整列）したとき、塩基の総数に対する同一塩基のパーセンテージ（％）を意味する。同様に、「アミノ酸同一性」は、２つのアミノ酸配列を、最大の類似度となるように適宜ギャップを導入し、アラインメント（整列）したとき、アミノ酸の総数に対する同一アミノ酸のパーセンテージ（％）を意味する。

ＣＳＰＧ５タンパク質の断片は、エピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長以上、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗体が認識する最小単位で、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その長さは、約７〜１２アミノ酸、例えば８〜１１アミノ酸からなるアミノ酸配列が挙げられる。

上記した、ヒトＣＳＰＧ５タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｇｒｅｅｎ, Ｍ.Ｒ. ａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ, J., ２０１２, ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ４ｔｈＥｄ．, ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ, ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ, ＮｅｗＹｏｒk、Ａｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３版，ＡｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９５），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ等）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。

上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡライブラリー又はヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号３に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ等）及びＭｇ^２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件等を挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３版，ＡｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９５），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。

また、本明細書中の配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５で表される塩基配列情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒト等のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、精巣、又は白血病、乳癌、リンパ腫、脳腫瘍、肺癌、大腸癌、肥満細胞腫、メラノーマ、及び神経芽腫細胞等の癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織であるがこれに限定されない。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニング等の操作は当業者に既知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ, Ｍ.Ｒ. ａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ（上記）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ＣＳＰＧ５タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。

上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌、真核細胞の例としては、出芽酵母や分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞等の昆虫細胞、アフリカツメガエル卵細胞、又はサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３等の哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム等が例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換した後、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。

宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換した後、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）_６〜（Ｈｉｓ）_１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰ等各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。

発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合等の周知の方法を用いることができる。

宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素等の変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。

＜抗体の構造＞
抗体は、通常少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭを除いた他の４種の免疫グロブリンは、原則として２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は種々の免疫グロブリンアイソタイプにより変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖は、また鎖内ジスルフィド結合も有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、他端に定常領域を１つ有する。軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列しており、また軽鎖の定常領域は、重鎖の可変ドメインに続く最初の定常領域と整列している。抗体の可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの特定の領域が可変性を示して、抗体に結合特異性を付与する。可変領域において相対的に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲ（Ｎ末端側から順にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含む。前記３つのＣＤＲは、そのＮ末端側から順に、重鎖ではＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と呼ばれ、軽鎖ではＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は、抗体が抗原に結合することに直接寄与はしないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す。

＜抗体の作製＞
本発明における抗ＣＳＰＧ５抗体とは、ＣＳＰＧ５タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。

ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とＣＳＰＧ５抗原とが結合する特性を意味する。このような結合を介して腫瘍を傷害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＣＳＰＧ５タンパク質と結合して腫瘍、例えば、乳癌、肺癌、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、腺癌、肥満細胞腫、扁平上皮癌、メラノーマ又は神経芽腫細胞等を傷害することができるならば、その種類を問わない。

抗体の例は、前述のように、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、遺伝子組換え抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）_２）等を含む。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等である。

抗体はさらに、グリコシル化の他に、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（ＰＥＧ）化等によって修飾されていてもよい。

以下に、種々の抗体の作製例を示す。
（１）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体等）等が含まれる。

抗体が、モノクローナル抗体であるときには、所望の抗原（ここではＣＳＰＧ５タンパク質）や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。

まず、公知の方法に従って、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物、例えばマウスの腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原であるＣＳＰＧ５タンパク質をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物、例えばマウスに４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。あるいはＣＳＰＧ５遺伝子を発現する白血病細胞株Ｋ５６２等を免疫動物に投与して免疫してもよい。

このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製のため、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付す。ハイブリドーマの作製に好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。

より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とすることができる。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

（２）ポリクローナル抗体
抗体がポリクローナル抗体である場合は、天然のＣＳＰＧ５タンパク質、ＧＳＴ等との融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させた組換えＣＳＰＧ５タンパク質、又はその部分ペプチドをマウス、ヒト抗体産生マウス、ウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＣＳＰＧ５タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。後述の実施例では、ＣＳＰＧ５タンパク質のアミノ酸配列中、癌細胞の細胞外領域に対するマウスポリクローナル抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認されている。

ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えばＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている（例えば、国際公開第０２／４３４７８号、同第０２／０９２８１２号等）。このようなマウスをＣＳＰＧ５タンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。

抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７−５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開第９８／４６７７７号等）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。

（３）組換え抗体
抗体が遺伝子組み換え抗体の場合、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ＰｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍｂｙＭＡＣＭＩＬＬＡＮＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、得られたＤＮＡを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、遺伝子組換え抗体を発現させることができる。

遺伝子組換え抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体等の多重鎖抗体が挙げられる。

「キメラ抗体」は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体等である。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。一例として、ヒト以外の動物（例えばマウス等）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、ヒト−マウスキメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。

「ヒト化抗体」は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法等により作製し、ＫａｂａｔＥＵｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。続いて、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第２３９４００号、国際公開第９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（ＳａｔｏＫ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３：８５１−８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開第９９／５１７４３号参照）。

ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（ＳａｔｏＫ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ１９９３，５３：８５１−８５６）。

キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。

アミノ酸の置換は、例えば１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類しうる。

抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を傷害する機能、を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。

あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔａｌ．，（１９９５）Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７５：Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ．，ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔａｌ．，（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄＦｒｉｔｚ，ＨＪ．，（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，８５，２７６３−２７６６）等を用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。

抗ＣＳＰＧ５抗体が認識するＣＳＰＧ５タンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＣＳＰＧ５抗体が認識するＣＳＰＧ５タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピング等）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＣＳＰＧ５抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法等により得ることができる。

本発明の抗ＣＳＰＧ５抗体と癌細胞表面上のＣＳＰＧ５タンパク質との親和定数（結合定数）Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、あるいは、少なくとも１０^１３Ｍ^−１である。結合親和性は高い程、より強い抗腫瘍活性が得られる。したがって、ＣＳＰＧ５タンパク質と高い結合親和性を有する抗ＣＳＰＧ５抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。

「単鎖抗体」は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、いずれもヒト抗体由来のものであるか、又はＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリ等）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものが好ましい。また、リンカーは、１２〜１９アミノ酸からなり、例えば１５アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）３（Ｇ．Ｂ．Ｋｉｍら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＤｅｓｉｇｎａｎｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ，２００７，２０（９）：４２５−４３２）が挙げられる。

「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば、重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリ等）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものが好ましい。

上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞等）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＥＳＳＥＮＴＩＡＬＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７ＷＩＬＥＹ、Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄａｎｄＣ．Ｄｅａｎ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００ＯＸＦＯＲＤＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＰＲＥＳＳ；Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３ＡＣＡＤＥＭＩＣＰＲＥＳＳ）。

上記抗体は、好ましくは、細胞傷害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。

本発明の抗体は、他の抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基等と反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２−ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基等）をもつスペーサーを介して行うことができる。

抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。

あるいは、本発明の抗体には、文献等で公知の、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１２Ｂｉ、^３２Ｐ、^１７５Ｌｕ、^１７６Ｌｕ等の放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。

本発明の抗体は、ＣＳＰＧ５タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体、又はＣＳＰＧ５タンパク質を特異的に認識する抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのよう抗体としては、例えば対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えばヒト−マウスキメラ抗体）等が挙げられる。

また、ヒトＣＳＰＧ５タンパク質に対するヒト抗体又は非ヒト動物抗体（例えばマウス抗体）を産生し得るハイブリドーマを作製する。そのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収して、ヒトＣＳＰＧ５タンパク質との免疫学的結合性及び細胞傷害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別し、選択する。その後、上記の通り、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを調製して塩基配列決定し、該ＤＮＡの塩基配列情報を別の抗体の作製のために利用する。

本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ、又は上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。

これらのＤＮＡにコードされるＣＤＲは、抗体の特異性を決定する領域である。抗体のＣＤＲ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする塩基配列は他の抗体由来の塩基配列であってもよい。ここで他の抗体とは、ヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。

本発明の有効成分である抗体のＤＮＡは、例えば上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。

本発明で用いられる抗ＣＳＰＧ５抗体によるＣＳＰＧ５タンパク質発現癌細胞に対する抗腫瘍効果は、エフェクター細胞を介した抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、及び補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）の機序により起こると考えられる。

したがって、本発明で用いられる抗ＣＳＰＧ５抗体の活性評価は、実施例に具体的で表されるように、生体外でＣＳＰＧ５タンパク質を発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定することで評価することができる。

本発明で用いられる抗ＣＳＰＧ５抗体は、癌細胞表面上に存在するＣＳＰＧ５タンパク質の細胞外領域と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＣＳＰＧ５抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＣＳＰＧ５抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。

＜抗原発現細胞への結合＞
抗体がＣＳＰＧ５タンパク質に結合する能力は、実施例で述べられるような、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析等を用いた結合アッセイを利用して特定することができる。

＜免疫組織化学染色＞
ＣＳＰＧ５タンパク質を認識する抗体は、当業者に周知の免疫組織化学染色法により、ＣＳＰＧ５タンパク質との反応性に関して、各種組織や切片を試験することができる。例えば、外科手術の間に患者から得た組織、自然に、又はトランスフェクション後にＣＳＰＧ５タンパク質を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織、パラホルムアルデヒド又はアセトン固定した凍結切片、又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用できる。

免疫組織化学染色のため、ＣＳＰＧ５タンパク質に対して反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体やヤギ抗ウサギ抗体を反応させることにより、可視化することができる。

＜医薬組成物＞
本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＣＳＰＧ５タンパク質を細胞表面に発現する癌（細胞）であれば特に限定されない。

本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。

本発明において対象となる癌としては、ＣＳＰＧ５遺伝子を発現している癌、具体的には配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、及び１６で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において７以上の連続アミノ酸からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であることが好ましく、より好ましくは、卵巣癌を除く癌であり、さらに好ましくは乳癌、肺癌、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、肥満細胞腫、メラノーマ又は神経芽腫細胞であり、特に好ましくは白血病又は悪性リンパ腫である。

これらの特定の癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌が包含されるが、これらに限定されない。

また、本発明の医薬組成物の対象となる動物は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物等を含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌ及びネコが好ましい。

本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水又はそれ以外の薬学的に許容し得る液体との無菌性溶液の形で、又は懸濁液剤の注射剤の形で、非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０^（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型等が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。

また、患者の年齢、体重、性別、症状等により適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状等により変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

以下、本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。
＜実施例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパク質の同定＞
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム法（Ａｃｉｄｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ｍＲＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡＲＮＡを精製した。

この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ，ＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ，ＺＡＰ−ｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄＣｌｏｎｉｇＫｉｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは７．７３×１０^５ｐｆｕ／ｍＬであった。

（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２２１０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（ＨｙｂｏｎｄＣＥｘｔｒａ：ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ−Ｓｃｉｎｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．５）に浸し、４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。

上記患犬血清には、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢｌｕｒｅＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５ＭＮａＣｌを含む０．２ＭＮａＨＣＯ_３ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク質固定化カラムに前記患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。

かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（ＧｏａｔａｎｔｉＤｏｇＩｇＧ−ｈ＋ＩＨＲＰｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：ＢＥＴＨＹＬＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌＳＯ_４、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％ゼラチンｐＨ７．５）５００μＬに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する９１１０個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。

（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ_６００が１．０となるよう調製した溶液２００μＬと、精製したファージ溶液１００μＬさらにＥｘＡｓｓｉｓｔｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１μＬを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍＬ添加し、３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ_６００が１．０となるよう調製した溶液２００μＬと、精製したファージ溶液１０μＬを混合した後、３７℃で１５分間反応させ、５０μＬをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮｐｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ(キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。

精製したプラスミドは、配列番号１７に記載のＴ３プライマーと配列番号１８に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号１に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＣＳＰＧ５遺伝子であることが判明した。イヌＣＳＰＧ５遺伝子のヒト相同因子であるヒトＣＳＰＧ５遺伝子では塩基配列同一性が８７％、またヒトＣＳＰＧ５タンパク質ではアミノ酸配列同一性が８７％であり、ネコＣＳＰＧ５遺伝子では塩基配列同一性が９２％、またネコＣＳＰＧ５タンパク質ではアミノ酸配列同一性が９１％であり、そしてマウス相同因子であるマウスＣＳＰＧ５遺伝子では塩基配列同一性が８４％、またマウスＣＳＰＧ５タンパク質ではアミノ酸配列同一性が８５％であった。ヒトＣＳＰＧ５遺伝子の塩基配列を配列番号３、５、７、９及び１１に、またヒトＣＳＰＧ５タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４、６、８、１０及び１２に、ネコＣＳＰＧ５遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、またネコＣＳＰＧ５タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に、そしてマウスＣＳＰＧ５遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、またマウスＣＳＰＧ５タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。

（４）各組織での遺伝子発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの各種ヒト正常組織、及び各種癌組織及び癌細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０^６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＱＵＩＣＫ−ＣｌｏｎｅｃＤＮＡ（クロンテック社製）及びＬａｒｇｅ−ＩｎｓｅｒｔｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ（クロンテック社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１９及び２０、ヒトプライマーは配列番号２１及び２２、マウスプライマーは配列番号２３及び２４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μＬ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μＬとし、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ(ＢＩＯＲＡＤ社製）を用いて、９４℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−１分のサイクルを３０回繰り返して行った。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（イヌ及びヒトＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２５及び２６、マウスＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２７及び２８に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、イヌＣＳＰＧ５遺伝子は、健常なイヌ組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方イヌ腫瘍組織では強い発現が見られた。ヒト及びマウスＣＳＰＧ５遺伝子の発現も、イヌＣＳＰＧ５遺伝子と同様、ヒト及びマウス正常組織ではほとんど発現が確認できず、癌細胞では乳癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、白血病、悪性リンパ腫の細胞株で発現が検出された（図２、３）。

＜実施例２：ヒトＣＳＰＧ５タンパク質の作製＞
（１）ヒトＣＳＰＧ５をコードする全長ｃＤＮＡ及びヒトＣＳＰＧ５の細胞外領域をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトＣＳＰＧ５遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡは、実施例１で取得した配列番号７の遺伝子を基に、以下の方法にてクローニングした。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μＬ、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２９及び３０に記載）を各０．４μＭ，０．２ｍＭｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μＬとし、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、６８℃−２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号７のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。上記のＰＣＲ反応により得られた増幅産物はｐｃＤＮＡ３．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に挿入した（以下、ＣＳＰＧ５／ｐｃＤＮＡ３．１）。また、ＤＮＡシーケンサーを用いたシークエンシングによって、ヒトＣＳＰＧ５遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列であることを確認した。配列番号７で表される配列はヒトＣＳＰＧ５遺伝子の塩基配列を、配列番号８で表される配列はヒトＣＳＰＧ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。

また、配列番号７を基に、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２９及び３０に記載）を各０．４μＭ，０．２ｍＭｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μＬとし、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、６８℃−２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号７のうちＣＳＰＧ５タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。上記のＰＣＲ反応により得られた増幅産物はマウスＩｇＧ２ａＦｃタンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されたｐｃＤＮＡ３．１に連結し、ヒトＣＳＰＧ５細胞外領域／マウスＩｇＧ２ａＦｃ融合タンパク質（以下、ｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）をコードする発現ベクターとした（以下、ｐｃＤＮＡ−ｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ＩｇＧ２ａＦｃ）。また、ＤＮＡシーケンサーを用いたシークエンシングによって、ｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃをコードするｃＤＮＡ配列であることを確認した。配列番号３２で表される配列はｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃをコードする塩基配列を、配列番号３３で表される配列はｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃのアミノ酸配列を示す。

（２）ｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃの作製
ＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体を作製するための免疫抗原としてｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃを作製した。

発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃをヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３細胞へリポフェクション法により導入し、導入７日後の培養上清よりｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃの精製を実施した。培養上清をＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＧＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）カラムにアプライし、結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム (ｐＨ７．０）にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ (ｐＨ２．７)）で溶出した。溶出液は中和バッファー（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ９．０)）を加えたチューブに溶出することにより直ちに中和した。次に、上記方法によって得られた該溶出液を、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ１０ＫＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ社製）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。

＜実施例３：ＣＳＰＧ５の細胞外領域に結合するポリクローナル抗体の作製＞
（１）ＣＳＰＧ５に対するポリクローナル抗体の作製
ＣＳＰＧ５の細胞外領域に結合する抗体を得るために、上記で作製したｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃの０．１ｍｇを抗原として、等容量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）溶液と混合し、これを２週間毎に４回、マウスの皮下に投与を行った。その後血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。さらにこの抗血清を、プロテインＧ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製し、ｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃに対するポリクローナル抗体を得た。また、抗原を投与していないマウスの血清を上記と同様にしてプロテインＧ担体を用いて精製したものをコントロール抗体とした。

（２）全長ヒトＣＳＰＧ５定常発現細胞の樹立
上記で作製したＣＳＰＧ５／ｐｃＤＮＡ３．１をＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ社）へリポフェクション法により導入し、５００ μｇ/ｍＬのＧ４１８（ナカライ社）による選抜により、全長ヒトＣＳＰＧ５を定常的に発現するＣＨＯ細胞株を樹立した（ＣＨＯ−ＣＳＰＧ５）。また、ＣＳＰＧ５をコードするｃＤＮＡが挿入されていない発現ベクター（以下、ｅｍｐ/ｐｃＤＮＡ３．１）を上記と同様に導入して選抜した細胞をコントロール細胞とした（以下、ＣＨＯ−ｅｍｐ）。

同様に、マウス白血病細胞株ＥＬ４（ＡＴＣＣ社）にＣＳＰＧ５／ｐｃＤＮＡ３．１をリポフェクション法により導入し、５００ μｇ/ｍＬのＧ４１８（ナカライ社）による選抜により、全長ヒトＣＳＰＧ５遺伝子を定常的に発現するＥＬ４細胞株を樹立した（ＥＬ４−ＣＳＰＧ５）。また、ＣＳＰＧ５遺伝子をコードするｃＤＮＡが挿入されていない発現ベクター（以下、ｅｍｐ/ｐｃＤＮＡ３．１）を上記と同様に導入して選抜した細胞をコントロール細胞とした（以下、ＥＬ４−ｅｍｐ）。

（３）細胞表面上での抗原タンパク質の発現解析
次に（２）で樹立した細胞表面上に発現するＣＳＰＧ５タンパク質特異的に（１）で作製したポリクローナル抗体が反応するかどうかを調べた。ＣＨＯ−ＣＳＰＧ５細胞及びＣＨＯ−ｅｍｐ細胞それぞれ１０^６個細胞を１．５ｍＬのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに上記（１）で調製したＣＳＰＧ５タンパク質に対するポリクローナル抗体２μｇ（５μＬ）を添加し、さらに９５μＬの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）及び９５μＬの０．１％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ社製）にて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＣＳＰＧ５タンパク質対するポリクローナル抗体の代わりに上記（１）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗ヒトＣＳＰＧ５抗体を添加されたＣＨＯ−ＣＳＰＧ５細胞は、コントロールに比べて、蛍光強度が２２１％の増強を示した。一方、同様の操作をＣＨＯ−ｅｍｐ細胞に対して実施した。その結果、抗ヒトＣＳＰＧ５抗体を添加されたＣＨＯ−ｅｍｐ細胞は、コントロールと同じ蛍光強度を示した。このことから、抗ヒトＣＳＰＧ５抗体は、細胞膜表面上に発現するＣＳＰＧ５タンパク質特異的に結合することが明らかとなった。

なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。
平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＣＳＰＧ５抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）−（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００

次にＣＳＰＧ５遺伝子の発現が多く確認された白血病細胞株２種（Ｋ５６２，ＴＨＰ−１）及び悪性リンパ腫細胞株２種（Ｌ−１２３６，Ｐ３ＨＲ−１）について、その細胞表面上にＣＳＰＧ５タンパク質が発現しているかどうかを調べた。上記で遺伝子発現が認められた各ヒト細胞株それぞれ１０^６個細胞を１．５ｍＬのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに上記（１）で調製したＣＳＰＧ５タンパク質に対するポリクローナル抗体２μｇ（５μＬ）を添加し、さらに９５μＬの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）及び９５μＬの０．１％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ社製）にて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＣＳＰＧ５タンパク質に対するポリクローナル抗体の代わりに上記（１）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗ヒトＣＳＰＧ５抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が３０％以上強かった。具体的には、Ｋ５６２が１８４％、ＴＨＰ―１が５１％、Ｌ−１２３６が１１５％、Ｐ３ＨＲ−１が８２％の蛍光強度の増強を示した。このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＣＳＰＧ５タンパク質が発現していることが確認された。

＜実施例４：ＣＳＰＧ５タンパク質に対するポリクローナル抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）＞
次にＣＳＰＧ５タンパク質に対するポリクローナル抗体が、ＣＳＰＧ５タンパク質を発現する腫瘍細胞を傷害することができるかどうかを検討した。実施例３で調製したヒトＣＳＰＧ５に対するポリクローナル抗体を用いて評価を行った。ＣＳＰＧ５タンパク質の発現が確認されているヒト白血病細胞株Ｋ５６２及び悪性リンパ腫細胞株Ｌ−１２３６それぞれ１０^６個を５０ｍＬ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０^３個ずつ添加した。これに、上記ヒトＣＳＰＧ５タンパク質に対するポリクローナル抗体をそれぞれ１μｇずつ添加し、さらにウサギの末梢血から分離したリンパ球をそれぞれ２×１０^５個ずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、傷害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム（Ｃｒ）５１の量を測定し、ヒトＣＳＰＧ５タンパク質に対するポリクローナル抗体による各癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、Ｋ５６２及びＬ−１２３６細胞それぞれに対して、それぞれ２３．２％及び１８．７％のＡＤＣＣ活性が確認された（図４参照）。一方、抗原が免疫されていないマウスの末梢血から調製したコントロール抗体（実施例３）を用いて同様の操作を行った場合、及び抗体を添加しなかった場合には、活性はほとんど認められなかった（図４参照）。したがって、ＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体を用いたＡＤＣＣ活性により、ＣＳＰＧ５タンパク質を発現する腫瘍細胞を傷害することができることが明らかになった。

なお、細胞傷害活性は、上記のように、本発明で用いられるＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体、ウサギリンパ球及びクロミウム５１を取り込ませた１０^３個の各細胞株を混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出した各白血病細胞株に対する細胞傷害活性を示した結果である。
＊式：細胞傷害活性（％）＝ＣＳＰＧ５タンパク質に対する抗体及びウサギリンパ球を加えた際のＫ５６２及びＬ−１２３６からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００

＜実施例５：ＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製＞
実施例２で調製した配列番号３３で表される、抗原タンパク質（ｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）１００μｇを等量のＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（シグマ社製）と混合し、これをマウス１匹当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に投与後、１週間毎にさらに４回投与を行い免疫を完了した。最後の免疫から３日後に摘出したそれぞれの脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）とを５：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μＬを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ選択培地）１５０ｍＬで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μＬずつ、プレート１５枚に播種した。７日間、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。

作製したハイブリドーマが産生する抗体のｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃタンパク質溶液１μｇ／ｍＬを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。

選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＳＰＧ５タンパク質に対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したｈＣＳＰＧ５ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃタンパク質溶液１μｇ／ｍＬを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＳＰＧ５タンパク質に反応性を示すモノクローナル抗体を産生する３１２個のハイブリドーマ株を得た。

次にそれらモノクローナル抗体の内、ＣＳＰＧ５タンパク質を発現する細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、実施例２で樹立した１０^６個のＣＳＰＧ５タンパク質を発現する細胞（ＣＨＯ−ＣＳＰＧ５）を１．５ｍＬ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μＬを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ社製）にて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＣＳＰＧ５タンパク質を発現していないＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｅｍｐ）を用いて行い、コントロールとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、ＣＳＰＧ５タンパク質を発現する細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体１８個（＃１〜＃１８）を選抜した。

＜実施例６：選抜した抗体の特徴付け＞
（１）ＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
上記で選抜したＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体＃１の癌細胞に対する細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を評価した。モノクローナル抗体を産生する各ハイブリドーマをハイブリドーマＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）培地を用いて培養し、得られた上清をＨｉｔｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを活性測定用の抗体として用いた。ヒト白血病細胞株Ｋ５６２及び悪性リンパ腫細胞株Ｌ−１２３６それぞれ１０^６個の細胞を５０ｍＬ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０^３個ずつ添加して標的細胞とした。これに、上記精製抗体をそれぞれ１μｇ添加し、さらにマウス脾臓から分離したマウスリンパ球を２×１０^５個添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、傷害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＳＰＧ５モノクローナル抗体による癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。

（２）ＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＣＤＣ活性）
上記で選抜した＃１のＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体の癌細胞に対する細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を評価した。ウサギから採血した血液をエッペンドルフチューブに入れ、室温で６０分間、静置した後３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離することで、ＣＤＣ活性測定用の血清を調製した。ヒト白血病細胞株Ｋ５６２及び悪性リンパ腫細胞株Ｌ−１２３６のそれぞれを５０ｍＬ容の遠心チューブに１０^５個集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。その後上記で調製したウサギ血清を５０％含むＲＰＭＩ培地で懸濁し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０^３個ずつ添加した。これに上述（１）で使用した＃１のモノクローナル抗体をそれぞれ１μｇずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、傷害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、ハイブリドーマ上清中の抗ＣＳＰＧ５モノクローナル抗体によるＫ５６２及びＬ−１２３６に対するＣＤＣ活性を算出した。その結果、＃１のモノクローナル抗体は、２６％のＣＤＣ活性を示した。一方、実施例５で作製した、ＣＳＰＧ５タンパク質自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体を用いて同様の操作を行った場合、細胞傷害活性は認められなかった。したがって、ＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体（＃１）は、ＣＤＣ活性によっても、ＣＳＰＧ５タンパク質を発現する腫瘍細胞を傷害することができることが明らかになった。

＜実施例７：マウス生体内における抗ＣＳＰＧ５モノクローナル抗体の抗腫瘍効果＞
次に、取得した＃１のＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体の担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。使用した抗体は上記と同様に各ハイブリドーマの培養上清をカラム精製したものを用いた。

実施例３−（２）で樹立したＣＳＰＧ５タンパク質を発現するマウス由来の白血病細胞株ＥＬ４−ＣＳＰＧ５を移植した担癌マウスを用いて、ＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体（＃１）の抗腫瘍効果を検討した。３０匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本ＳＬＣ社製）の背部皮下に、１匹あたり１０^６個のＥＬ４−ＣＳＰＧ５を移植し、腫瘍が直径７ｍｍ程度の大きさになるまで成長させた。その内、１０匹の担癌マウスに対して、＃１のＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体を１匹あたり１００μｇ（１００μＬ）ずつ腹腔内投与した。また、別の１０匹には実施例５で作製したＣＳＰＧ５タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体を１匹あたり１００μｇ（１００μＬ）ずつ腹腔内投与した。その後、２日おきに１回、計３回同量の各抗体を各担癌マウスの腹腔に投与し、毎日腫瘍の大きさを計測し、抗腫瘍効果を観察した。一方、残り１０匹の担癌マウスに対して、抗体の代わりにＰＢＳ（−）を投与し、これをコントロール群とした。抗腫瘍効果の観察の結果、＃１のＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体を投与した検討群は、腫瘍が抗体投与開始時の腫瘍体積を１００％とした場合に、１０日目には９０％程度に縮小し、２０日目には７０％程度、３０日目には６０数％に腫瘍が縮小した。一方、コントロール群では、１０日目、２０日目、３０日目、にはそれぞれ、約２６０％、３５０％、５５０％にまで腫瘍が増大した。また、ＣＳＰＧ５タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体を投与した群では、抗腫瘍効果は得られず、コントロール群と同様に腫瘍が増大した。この結果から、取得した＃１のＣＳＰＧ５タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ＣＳＰＧ５タンパク質を発現する白血病癌細胞に対して、生体内で強い抗腫瘍効果を発揮することが示された。なお、腫瘍の大きさは、長径×短径×短径×０．５の計算式を用いて、体積を算出した。

本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

ＣＳＰＧ５タンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸残基からなるその断片と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
前記ＣＳＰＧ５タンパク質が
配列番号８、４、６、１０、及び１２で表されるいずれかのアミノ酸配列、又は
該アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
前記癌が白血病又は悪性リンパ腫である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。