KR20090119992A - Ｈｌａ 클래스 ｉ을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제 내성 암 치료제, 및 그의 이용 - Google Patents

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슈지 오자키
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Abstract

본 발명자 등은 MDR1 및 HLA 클래스 IA 단백질을 고발현하고 있는 화학요법제 내성 혈액종양 세포주로, C3B3 diabody에 의한 세포상해활성이 친주에 비해 저농도에서 유도되는 것을 명확하게 하였다. 또한, 그 화학요법제 내성 혈액종양 세포주를 C3B3 diabody 전처리하면, 화학요법제 단독에 의한 세포상해가 증강되는 것, 세포 중의 약제 흡수량이 증가하는 것을 명확하게 하였다. 즉, HLA 클래스 I을 고발현하고 있는 MDR1 발현 종양세포에 대해, C3B3 diabody가 항종양활성을 발휘하는 것, 및 약제 저항성을 극복하는 작용을 갖는 것을 발견하였다.

Description

ＨＬＡ 클래스 Ｉ을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제 내성 암 치료제, 및 그의 이용{Remedy for chemotherapy-resistant cancer containing HLA class I-recognizing antibody as the active ingredient and use of the same}
본 발명은 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제 내성 암 치료제, 및 그의 이용에 관한 것이다. 또한, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 화학요법제 내성 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
HLA는 외래성 항원, 세균, 바이러스 감염세포 등을 이물질로 인식하여 제거하는 면역반응에 있어서 중요한 분자이다. HLA 분자의 주된 역할은, 세포 중에서 만들어지는 8~10 잔기 정도의 아미노산으로 생성된 항원 펩티드를 CD8+T세포에 제시하는 것으로, 이것에 의해 유도되는 면역응답이나 면역관용에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. HLA는 α1~3의 3개의 도메인으로 되는 45 KD의 α 사슬과 12 KD의 β2 마이크로글로불린(β2M)의 헤테로 다이머에 의해서 형성되는 클래스 I과, α1, α2의 2개의 도메인으로 되는 30~34 KD의 α 사슬과 β1, β2의 2개의 도메인으로 되는 26~29 KD의 β 사슬의 헤테로 다이머에 의해서 형성되는 클래스 II로 분 류된다. 또한, HLA 클래스 I(HLA-I)에는 HLA-A, B, C 등의 존재가 알려져 있다(이하에 있어서, HLA-A를 「HLA 클래스 IA(HLA-IA)」라고도 칭한다).
지금까지, 림프구 세포에 있어서 항 HLA 클래스 IA 항체에 의한 라이게이션으로 세포증식 억제효과나 세포사 유도효과가 보고되어 있어, HLA 분자의 시그날 전달분자로서의 가능성이 시사되어 있다. 예를 들면 인간 HLA 클래스 IA의 α1 도메인에 대한 항체 B9.12.1, α2 도메인에 대한 항체 W6/32, α3 도메인에 대한 항체 TP25.99, A1.4는 활성화 림프구에 대해 세포증식을 억제한다는 보고가 있다(비특허문헌 1, 2). 또한, α1 도메인에 대한 2종류의 항체 MoAb90, YTH862는 활성화 림프구에 대해 아포토시스를 유도하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2, 3, 4). 이 2개의 항체에 의해서 유도되는 아포토시스는 카스파제를 매개로 한 반응인 것이 명확해져 있어(비특허문헌 4), 이 사실로부터 림프구 세포에서 발현하는 HLA 클래스 IA는 아포토시스의 신호전달에도 관여하고 있는 것으로 추측되고 있다.
또한, 인간 HLA 클래스 IA의 α3 도메인에 대한 항체 5H7(비특허문헌 5), 마우스 MHC 클래스 I의 α2 도메인에 대한 항체 RE2(비특허문헌 6)도 활성화 림프구 등에 세포사를 유도하는 것이 보고되어 있다.
인간 골수종세포를 면역하여 얻어진 단일클론항체 2D7(비특허문헌 8)도 HLA 클래스 IA를 인식하는 항체로서, 이 2D7을 저분자화(diabody화)함으로써, 인간 골수종 세포주에 대해 단시간에 격렬한 세포사를 유도하는 것이 보고되어 있다. 또한, 인간 HLA 클래스 IA와, 인간 β2M을 공발현시킨 세포를 마우스에 면역하여 얻어진 단일클론 항체 C3B3(특허문헌 5)는 HLA 클래스 I 항원의 α2 도메인을 인식하 는 항체로, 항 마우스 IgG 항체와 크로스링크함으로써, 강한 세포상해활성을 나타낸다. 또한 이 C3B3 항체를 저분자화 항체(C3B3 diabody)로 개변함으로써, C3B3 diabody(C3B3-DB) 단독으로 2D7 diabody 단독보다도 강한 항종양작용을 나타내었다(특허문헌 5).
2D7 diabody 및 C3B3 diabody는 각종 인간 골수종 세포주, 및 활성화 림프구 세포에 대해 강한 세포사 유도활성을 나타내, 마우스에 인간 골수종 세포주를 이식한 다발성 골수종 모델 마우스에 있어서도 유의한 연명효과를 나타내었기에, 골수종 치료제로서 개발이 진행되고 있다(특허문헌 1~5, 비특허문헌 7). 이와 같은 HLA 클래스 I 관여의 세포사 유도를 이용한 치료를 더욱 발전시키면, 골수종 등에 대한 유효성이 높은 의약품이 개발될 것으로 기대된다.
악성종양에 대한 화학요법의 문제점으로서, 종양세포에 ATP-binding cassette(ABC) transporter superfamily에 속하는 MDR1(P 당단백, Multidrug resistance protein 1, ATP-binding cassette sub-family B member 1(ABCB1))의 발현이 유도되는 것이 알려져 있다. 이 MDR1 발현은 종양세포의 약제(화학요법제) 저항성의 획득에 관여하고 있어, 그 후의 화학요법의 효과를 감약시키는 요인으로 된다. 따라서, MDR1 발현 종양에 대해서는 약제 저항성을 극복시키는 치료전략의 개발이 중요한 과제로 되어 있다. MDR1은 세포내의 약제를 세포외로 배출하는 작용을 하는 것으로부터, ABC transporter 저해제인 verapamil 등을 사용하여 그 작용을 억제하는 치료법의 시도가 이루어지고 있으나, 아직 임상적인 유효성은 확립되어 있지 않다. 한편, MDR1 발현 종양에 있어서는 HLA 클래스 I 분자가 고발현하고 있 는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9, 10).
또한, 본 출원의 발명에 관련된 선행기술문헌정보를 이하에 나타낸다.
특허문헌 1: WO2004/033499
특허문헌 2: WO2005/056603
특허문헌 3: WO2005/100560
특허문헌 4: WO2006/123724
특허문헌 5: PCT/JP2007/063946
비특허문헌 1: Fayen et al., Int. Immunol., 10: 1347-1358(1998)
비특허문헌 2: Genestier et al., Blood, 90: 3629-3639(1997)
비특허문헌 3: Genestier et al., Blood, 90: 726-735(1997)
비특허문헌 4: Genestier et al., J. Biol. Chem., 273: 5060-5066(1998)
비특허문헌 5: Woodle et al., J. Immunol., 158: 2156-2164(1997)
비특허문헌 6: Matsuoka et al., J. Exp. Med., 181: 2007-2015(1995)
비특허문헌 7: Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209(2004)
비특허문헌 8: 오카 다츠조 산쿄 생명과학재단 연구보고집 12: 46-56(1998)
비특허문헌 9: Neoplasma,(2003); 50 (2): p 91-96
비특허문헌 10: Prados J, et al. Neoplasm 53 (3): 226-231, 2006
비특허문헌 11: Journal of Internal Medicine,(2000), 247, p 521-534
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제 내성 암 치료제를 제공하는 것에 있다. 또한, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 화학요법제 내성 암을 치료하는 방법의 제공을 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자 등은 상기의 과제를 해결하기 위해, C3B3 항체의 저분자형 항체인 C3B3 diabody(C3B3-DB)의 약제 저항성 종양세포에 대한 효과에 대해서 검토하였다.
먼저, 화학요법제(Vincristine) 내성 혈액종양 세포주에서 MDR1 및 HLA-1A(HLA 클래스 IA) 단백질이 고발현되고 있는 것, 및 혈액종양 환자 유래의 종양세포를 초진시와 재발시에 비교하면 재발시가 MDR1 및 HLA-1A 단백질이 고발현되고 있는 것을 확인하였다.
다음으로, 이 화학요법제 내성 혈액종양 세포주에서는 C3B3 diabody에 의한 세포상해활성이 친주에 비해 저농도에서 유도되는 것을 명확하게 하였다. 또한, 화학요법제 내성 혈액종양 세포주를 C3B3 diabody(0.1 ㎍/mL)로 6시간 전처리하면, 전처리 없는 경우와 비교하여, 화학요법제(vincristine)에 의한 세포상해가 증강되는 것을 명확하게 하였다. 또한, 화학요법제 내성 혈액종양 세포주를 C3B3 diabody(0.1 ㎍/mL)로 전처리하면, 세포표면 상의 MDR1 단백질의 발현이 일부의 세포에서 저하되어, 세포 중의 약제 흡수량이 증가하는 것을 명확하게 하였다.
즉, HLA 클래스 I을 고발현하고 있는 MDR1 발현 종양세포에 대해, C3B3 diabody가 항종양활성을 발휘하는 것, 및 약제 저항성을 극복하는 작용을 갖는 것을 발견하고, 이것에 의해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 보다 구체적으로는 이하의 [1]~[43]을 제공하는 것이다.
[1] HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는, 화학요법제 내성 암 치료제.
[2] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 화학요법제 내성 암 치료제.
[3] 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2]에 기재된 화학요법제 내성 암 치료제.
[4] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 화학요법제 내성 암 치료제.
[5] HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는, 화학요법제의 작용 증강제.
[6] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [5]에 기재된 화학요법제의 작용 증강제.
[7] 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, [5] 또는 [6]에 기재된 화학요법제의 작용 증강제.
[8] 화학요법제에 의해서 치료하는 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는, [5] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 화학요법제의 작용 증강제.
[9] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [8]에 기재된 화학요법제의 작용 증강제.
[10] 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약조성물.
[11] 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 암치료용 의약조성물.
[12] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [10] 또는 [11]에 기재된 의약조성물.
[13] 화학요법제 및 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는, 암치료용 의약조성물.
[14] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [13]에 기재된 암치료용 의약조성물.
[15] 화학요법제에 의해서 치료하는 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는, [10] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 의약조성물.
[16] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [15]에 기재된 의약조성물.
[17] HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 화학요법제 내성 암을 치료하는 방법.
[18] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [17]에 기재된 방법.
[19] 화학요법제를 병용하는 것을 특징으로 하는, [17] 또는 [18]에 기재된 방법.
[20] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [17] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[21] HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 화학요법제의 작용을 증강하는 방법.
[22] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [21]에 기재된 방법.
[23] 화학요법제를 병용하는 것을 특징으로 하는, [21] 또는 [22]에 기재된 방법.
[24] 화학요법제에 의해서 치료하는 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는, [21] 내지 [23] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[25] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [24]에 기재된 방법.
[26] 화학요법제 및 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
[27] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [26]에 기재된 방법.
[28] 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는, [26] 또는 [27]에 기재된 방법.
[29] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [28]에 기재된 방법.
[30] 화학요법제 내성 암 치료제를 제조하기 위한, HLA 클래스 I을 인식하는 항체의 사용.
[31] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [30]에 기재된 사용.
[32] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [30] 또는 [31]에 기재된 사용.
[33] 화학요법제의 작용 증강제를 제조하기 위한, HLA 클래스 I을 인식하는 항체의 사용.
[34] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [33]에 기재된 사용.
[35] 화학요법제에 의해서 치료하는 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는, [33] 또는 [34]에 기재된 사용.
[36] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [35]에 기재된 사용.
[37] 암치료용 의약조성물을 제조하기 위한, 화학요법제 및 HLA 클래스 I을 인식하는 항체의 사용.
[38] 항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는, [37]에 기재된 사용.
[39] 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는, [37] 또는 [38]에 기재된 사용.
[40] 화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는, [39]에 기재된 사용.
[41] 화학요법제 내성 암을 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 HLA 클래스 I을 인식하는 항체.
[42] 화학요법제의 작용을 증강하기 위한 방법에 사용하기 위한 HLA 클래스 I을 인식하는 항체.
[43] 암을 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 화학요법제 및 HLA 클래스 I을 인식하는 항체.
[발명의 실시형태]
본 발명자 등은 항 HLA 클래스 I 항체가 화학요법제 내성 암에 대한 세포상해활성을 갖는 것을 발견하고, 이것에 의해 화학요법제 내성 암의 치료가 가능한 것을 발견하였다. 본 발명은 이들의 지견(知見)을 토대로 하는 것이다.
본 발명은 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는, 화학요법제 내성 암 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, HLA 클래스 I을 인식하는 항체로서는 HLA 클래스 I을 항원으로 하고, 생물학적 작용을 갖는 항체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, HLA란 인간 백혈구 항원을 의미한다. HLA 분자는 클래스 I과 클래스 II로 분류되고, 클래스 I으로서는 HLA-A, B, C, E, F, G, H, J 등이 알려져 있다. 본 발명의 항체가 인식하는 항원은 HLA 클래스 I으로 분류되는 분자라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 HLA-IA이고, 보다 바람직하게는 HLA 클래스 IA의 α2 도메인이다.
본 발명에 있어서의 항체의 유래는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 포유동물 유래이고, 보다 바람직하게는 인간 유래의 항체를 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항 HLA 클래스 I 항체는 공지의 수단을 사용하여 다중클론 또는 단일클론 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 HLA 클래스 I 항체로서, 특히 포유동물 유래의 단일클론 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 단일클론 항체로서는 하이브리도마에 생산되는 것, 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주에 생산되는 것이 있다.
이와 같은 항체로서는 C3B3 항체(일본국 특허출원 제2006-193053)나, 2D7 항체(Kimura, et al., Biochem Biophys Res Commun., 325: 1201-1209(2004)) 등을 들 수 있다.
항 HLA 클래스 I 항체 생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지 기술을 사용하여, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 즉, HLA 클래스 I을 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라서 면역하여, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법으로 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해, 단일클론 항체 생산세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다. 항원의 조제는 공지의 방법, 예를 들면 베큘로바이러스(baculovirus)를 사용한 방법(WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다. 또한, HLA 클래스 I의 유전자 서열을 공지의 발현 벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는, 배양상청 중에서 목적의 HLA 클래스 I 분자를 공지의 방법으로 정제하여, 이 정제 HLA 클래스 I 단백질을 감작항원으로서 사용하는 것도 가능하다. 또한, HLA 클래스 I 분자와 다른 단백질의 융합 단백질을 감작항원으로서 사용해도 된다.
감작항원으로 면역되는 포유동물로서는 특별히 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 랫트, 햄스터 등이 사용된다.
감작항원을 동물에 면역하는데는 공지의 방법에 따라 행해진다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내 또는, 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것을 목적에 따라 통상의 애쥬번트(adjuvant), 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트를 적량 혼합하고, 유화(乳化) 후, 포유동물에 4-21일마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체(擔體)를 사용할 수 있다.
이와 같이 면역하고, 혈청 중에 목적하는 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포가 취출(取出)되어, 세포융합 처리된다. 세포융합 처리되는 바람직한 면역세포로서는, 특히 비장세포를 들 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 다른쪽 친세포로서의 포유동물의 골수종세포는 이미 공지의 각종 세포주, 예를 들면 P3X63Ag8.653(Kearney, J. F. et al. J. Immunol.(1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 적절히 사용된다.
상기 면역세포와 골수종세포의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 밀스테인들의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 세포융합은 예를 들면, 세포융합 촉진제의 존재하에 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가적으로 목적에 따라 융합효율을 높이기 위해 디메틸설폭시드 등의 보조제를 첨가 사용하는 것도 가능하다.
면역세포와 골수종세포의 사용비율은, 예를 들면 골수종세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 골수종세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 외에 이 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하고, 추가적으로 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액(serum supplement)을 병용하는 것도 가능하다.
세포융합은 상기 면역세포와 골수종세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 사전에 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액, 예를 들면 평균분자량 1,000~6,000 정도의 PEG 용액을 통상, 30~60%(w/v)의 농도로 첨가하여, 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 계속해서, 적당한 배양액을 축차 첨가하고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거할 수 있다.
당해 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 당해 HAT 배양액에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간, 통상 수일~수주간 계속한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝이 행해진다.
이와 같이 하여 제작되는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대(繼代) 배양하는 것이 가능하고, 또한, 액체 질소 중에서 장기간 보존하는 것이 가능하다.
당해 하이브리도마로부터 단일클론항체를 취득하는데는, 당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그의 배양 상청으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하고 증식시켜, 그의 복수(腹水)로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적합한 한편, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.
본 발명에는, 단일클론항체로서, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 사용하여 생산시킨 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Borrebaeck, C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).
구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 생산하는 세포, 예를 들면 하이브리도마로부터, 항체의 가변(V)영역을 코드하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는 공지의 방법, 예를 들면 구아니딘 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의해 전 RNA를 조제하고, mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스제) 등을 사용하여 mRNA를 조제한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스제)를 사용함으로써 mRNA를 직접 조제할 수 있다.
얻어진 mRNA로부터 역전사 효소를 사용하여 항체 V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 사용하여 행할 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 행하는데는 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech제) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989) 17, 2919-2932)을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 추가적으로, 이로부터 재조합 벡터를 제작하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택해 목적하는 재조합 벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법, 예를 들면 디데옥시법에 의해 확인한다.
목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 목적하는 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터로 삽입한다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를 항체 C영역의 DNA를 포함하는 발현벡터로 삽입해도 된다.
본 발명에서 사용되는 항체를 제조하기 위해서는, 후술하는 바와 같이 항체 유전자를 발현제어영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여, 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체의 구체적인 예로서는, 서열번호 7, 8, 9에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR 1, 2, 3을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체, 또는 서열번호: 10, 11, 12에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR 1, 2, 3을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 들 수 있다.
본 발명 항체의 바람직한 예로서, 이하의 (a)~(d) 중 어느 하나에 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체를 들 수 있다.
(a) 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역
(b) 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 서열이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역으로서, (a)에 기재된 중쇄 가변영역과 기능적으로 동등한 중쇄 가변영역
(c) 서열번호: 1에 기재된 염기서열로 되는 DNA가 코드하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역
(d) 서열번호: 1에 기재된 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA가 코드하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역
또는, 본 발명의 항체로서, 이하의 (e)~(h) 중 어느 하나에 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 예로서 들 수 있다.
(e) 서열번호: 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역
(f) 서열번호: 4에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 서열이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역으로서, (e)에 기재된 경쇄 가변영역과 기능적으로 동등한 경쇄 가변영역
(g) 서열번호: 3에 기재된 염기서열로 되는 DNA가 코드하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역
(h) 서열번호: 3에 기재된 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA가 코드하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역
또한, 이와 같은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 갖는 항체의 예로서는, 이하의 (a)~(d) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체를 예로서 들 수 있다.
(a) 서열번호: 6에 기재된 아미노산 서열
(b) 서열번호: 6에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 서열이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열
(c) 서열번호: 5에 기재된 염기서열로 되는 DNA가 코드하는 아미노산 서열
(d) 서열번호: 5에 기재된 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA가 코드하는 아미노산 서열
중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 또한, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 회합시킨 경우에, 항원결합 활성을 갖는 한, 일부를 결손시켜도 되고, 다른 폴리펩티드를 부가해도 된다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다.
여기서 「기능적으로 동등」이란, 대상이 되는 항체가 서열번호: 7, 8, 9에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR 1, 2, 3을 갖는 중쇄 가변영역 또는 서열번호: 10, 11, 12에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR 1, 2, 3을 갖는 경쇄 가변영역을 갖는 항체와 동등한 활성(예를 들면, HLA-A로의 결합활성, 세포상해활성, 세포사 유도활성, 세포증식 억제활성 등)을 갖는 것을 의미한다.
어느 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용하여, 본 발명의 항체에 적절히 변이를 도입함으로써, 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에서도 발생할 수 있다. 이와 같이, 본 발명 항체의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 변이된 아미노산 서열을 가지고, 이 항체와 기능적으로 동등한 항체도 또한 본 발명의 항체에 포함된다.
변이하는 아미노산 수는 특별히 제한되지 않지만, 통상 30 아미노산 이내이고, 바람직하게는 15 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 5 아미노산 이내(예를 들면, 3 아미노산 이내)일 것으로 생각된다. 변이하는 아미노산 잔기에 있어서는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 별도의 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 일문자 표기를 나타낸다). 어느 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413).
본 발명의 항체에는, 본 발명 항체의 아미노산 서열에 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 항체도 포함된다. 또한, 이들 항체와 다른 펩티드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질도 포함된다. 융합 단백질을 제작하는 방법은, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 프레임이 일치하도록 연결하여 이것을 발현 벡터에 도입하고, 숙주에서 발현시키면 되기에, 당업자에게 공지의 수법을 사용할 수 있다. 본 발명의 항체와의 융합에 제공되는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드로서는, 예를 들면 FLAG(Hopp, T.P. et al., BioTechnology(1988) 6, 1204-1210), 6개의 His(히스티딘) 잔기로 되는 6×His, 10×His, 인플루엔자 응집소(HA), 인간 c-myc의 단편, VSV-GP의 단편, p18HIV의 단편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항원의 단편, lck tag, α-tubulin의 단편, B-tag, Protein C의 단편 등의 공지의 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와의 융합에 제공되는 다른 폴리펩티드로서는, 예를 들면 GST(글루타티온-S-트랜스퍼라아제), HA(인플루엔자 응집소), 면역글로불린 정상영역, β-갈락토시다아제, MBP(말토오스 결합 단백질) 등을 들 수 있다. 시판되어 있는 이들 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 융합시키고, 이것에 의해 조제된 융합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써, 융합 폴리펩티드를 조제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체는, 후술하는 그것을 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 의해, 아미노산 서열, 분자량, 등전점 또는 당사슬의 유무나 형태 등이 상이할 수 있다. 그러나, 얻어진 항체가 본 발명의 항체와 동등한 기능을 가지고 있는 한, 본 발명의 항체로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 원핵세포, 예를 들면 대장균에서 발현시킨 경우, 본래의 항체의 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명에서 사용되는 항체는 이와 같은 항체도 포함한다.
본 발명에는 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주에 도입하여, 유전자 재조합 기술을 사용하여 생산시킨 유전자 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는, 서열번호: 7, 8, 9에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR 1, 2, 3을 갖는 중쇄 가변영역 또는 서열번호: 10, 11, 12에 기재된 아미노산 서열로 되는 CDR 1, 2, 3을 갖는 경쇄 가변영역을 코드하는 DNA가 얻어진다면, 이것을 목적하는 항체 정상영역(C 영역)을 코드하는 DNA와 연결하여, 이것을 발현 벡터에 삽입한다. 또는, 항체의 가변영역을 코드하는 DNA를 항체 정상영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 삽입해도 된다. 발현 제어영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여, 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 항체에는, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 본 발명의 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 항체를 코드하는 한 특별히 한정되지 않고, 복수의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 등의 염기 또는 염기쌍으로 되는 중합체이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 이외의 염기를 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항체를 유전자 공학적인 수법으로 발현시킬 때 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 항체와 동등한 기능을 갖는 항체를 스크리닝할 때, 프로브로서 사용하는 것도 가능하다. 즉 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 일부를 프로브로서 사용하여, 하이브리다이제이션, 유전자 증폭기술(예를 들면 PCR) 등의 기술에 의해, 이 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하여, 또한 본 발명의 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 이와 같은 DNA도 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 하이브리다이제이션 기술(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)은 당업자에게 잘 알려진 기술이다.
스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은 당업자라면 적절히 선택할 수 있다. 일례를 나타내면, 25% 포름아미드, 보다 엄격한 조건에서는 50% 포름아미드, 4×SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10×덴하르트 용액, 20 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 하이브리다이제이션 용액 중, 42℃에서 하룻밤 프리하이브리다이제이션을 행한 후, 표지한 프로브를 첨가하여, 42℃에서 하룻밤 보온함으로써 하이브리다이제이션을 행한다. 그 후의 세정에 있어서의 세정액 및 온도조건은 「1×SSC, 0.1% SDS, 37℃」 정도이고, 보다 엄격한 조건으로서는 「0.5×SSC, 0.1% SDS, 42℃」 정도이며, 더욱 엄걱한 조건으로서는 「0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃」 정도로 실시할 수 있다. 이와 같이 하이브리다이제이션의 세정의 조건이 엄격해질수록 프로브 서열과 높은 상동성을 갖는 DNA의 단리를 기대할 수 있다. 단, 상기 SSC, SDS 및 온도 조건의 조합은 예시이며, 당업자라면, 하이브리다이제이션의 스트린젠시를 결정하는 상기 또는 다른 요소(예를 들면, 프로브 농도, 프로브의 길이, 하이브리다이제이션 반응시간 등)를 적절히 조합함으로써, 상기와 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.
이들 하이브리다이제이션 기술이나 유전자 증폭기술에 의해 얻어지는 폴리뉴클레오티드가 코드하는 본 발명의 항체와 기능적으로 동등한 항체는, 통상 이들 항체와 아미노산 서열에 있어서 높은 상동성을 갖는다. 본 발명의 항체에는, 본 발명의 항체와 기능적으로 동등하고, 또한 이 항체의 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는 항체도 포함된다. 높은 상동성이란, 아미노산 레벨에 있어서, 통상 적어도 50% 이상의 동일성, 바람직하게는 75% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 85% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가리킨다. 폴리펩티드의 상동성을 결정하기 위해서는, 문헌(Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730)에 기재된 알고리즘에 따르면 된다.
본 발명에서 사용되는 항체로서는, 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드되는 항체도 또한 바람직한 예로서 들 수 있다.
(a) 서열번호: 1, 3, 또는 5에 기재된 염기서열로 되는 폴리뉴클레오티드
(b) (a)에 기재된 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 본 발명의 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
또한, 본 발명에서는 인간에 대한 이종항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로서 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면 키메라(chimeric) 항체, 인간화(humanized) 항체 등을 사용할 수 있다. 이들의 개변항체는 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 키메라 항체는 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역으로 되는 항체로서, 마우스 항체의 가변영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하여, 이것을 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다.
키메라 항체는 상기와 같이 하여 얻은 항체 V 영역을 코드하는 DNA를 인간 항체 C 영역을 코드하는 DNA와 연결하여, 이것을 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023, 국제 특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조). 이 기지의 방법을 사용하여, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리우고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다.
구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입하고 생산시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원 공개번호 EP 239400, 국제 특허출원 공개번호 WO 96/02576 참조).
CDR을 매개로 하여 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라서, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체 가변영역의 프레임워크영역의 아미노산을 치환해도 된다(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
키메라 항체, 인간화 항체에는 인간 항체 C영역이 사용된다. 인간 항체 C영역으로서는 Cγ를 들 수 있고, 예를 들면 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그 생산의 안정성을 개선하기 위해, 인간 항체 C영역을 수식해도 된다.
키메라 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간 항체 유래의 C영역으로 되고, 또한 인간화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과 인간 항체 유래의 프레임워크영역 및 C영역으로 되며, 양자는 인간 체내에 있어서의 항원성이 저하되어 있으므로, 본 발명에 사용되는 항체로서 유용하다.
또한, 인간 항체의 취득방법도 알려져 있다. 예를 들면 인간 림프구를 인 비트로에서 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 림프구를 인간 골수종세포, 예를 들면 U266과 융합시켜, 항원으로의 결합활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 목적하는 항원으로 면역함으로써 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조). 또한 인간 항체 라이브러리를 사용하고, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 것이 가능하다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 적당한 발현벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 주지이고, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388을 참고로 할 수 있다.
상기한 바와 같이 구축한 항체 유전자는 공지의 방법에 의해 발현시킬 수 있다. 포유류 세포를 사용한 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리 A 시그널을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그를 포함하는 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터/인핸서로서는 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다.
또한, 그 외에 본 발명에서 사용되는 항체 발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서나 인간 연장인자 1α(HEF 1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하면 된다.
예를 들면, SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 멀리건들의 방법(Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114), 또한, HEF 1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 미즈시마들의 방법(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 따르면 용이하게 실시할 수 있다.
대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체 분비를 위한 시그널 서열, 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터로서는 lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우, 워드들의 방법(Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우, 베터들의 방법(Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043)에 따르면 된다.
항체 분비를 위한 시그널 서열로서는, 대장균의 페리플라즘(periplasm)에 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)을 사용하면 된다. 페리플라즘에 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold)하여 사용한다(예를 들면, WO 96/30394를 참조).
복제기원으로서는 SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용할 수 있고, 추가적으로, 숙주세포계에서 유전자 복제수 증폭을 위해, 발현벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제(APH) 유전자, 티미딘키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위해, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체 제조를 위한 생산계는 인비트로 및 인비보 생산계가 있다. 인비트로의 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.
진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 또는 진균세포를 사용하는 생산계가 있다. 동물세포로서는 (1) 포유류 세포, 예를 들면 CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, (2) 양서류 세포, 예를 들면 아프리카 발톱개구리 난모세포, 또는 (3) 곤충세포, 예를 들면 sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물세포로서는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 캘러스 배양하면 된다. 진균세포로서는 효모, 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면 아스페르길루스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.
원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는 대장균(E. coli), 고초균이 알려져 있다.
이들 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형질전환에 의해 도입하고, 형질전환된 세포를 인비트로에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 배양은 공지의 방법에 따라 행한다. 예를 들면, 배양액으로서 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있고, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용하는 것도 가능하다. 또한, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등으로 옮김으로써, 인비보에서 항체를 생산해도 된다.
한편, 인비보의 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 사용하는 생산계 등이 있다.
포유류 동물로서는 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 곤충으로서는 누에를 사용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다.
이들 동물 또는 식물에 항체 유전자를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산시켜, 회수한다. 예를 들면, 항체 유전자를 염소 β 카세인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합 유전자로서 조제한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(embryo)에 주입하고, 이 배를 암컷 염소에 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터 목적하는 항체를 얻는다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 된다(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
또한, 누에를 사용하는 경우, 목적의 항체 유전자를 삽입한 베큘로바이러스를 누에에 감염시키고, 이 누에의 체액으로부터 목적하는 항체를 얻는다(Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). 또한, 담배를 사용하는 경우, 목적하는 항체 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시키고, 본 담배의 잎으로부터 목적하는 항체를 얻는다(Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
전술한 바와 같이 인비트로 또는 인비보의 생산계로 항체를 생산하는 경우, 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA를 개별적으로 발현벡터에 삽입하여 숙주를 동시 형질전환시켜도 되고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일 발현벡터에 삽입하여, 숙주를 형질전환시켜도 된다(국제 특허출원 공개번호 WO 94-11523 참조).
본 발명에서 사용되는 항체는 저분자화 항체여도 된다. 본 발명에 있어서 저분자화 항체(minibody)란, 전장 항체(whole antibody, 예를 들면 whole IgG 등)를 친항체로 하고, 전장 항체의 일부분이 결손되어 있는 항체 단편을 포함하고, 항원으로의 결합능을 가지고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 항체 단편은, 전장 항체의 일부분이면 특별히 한정되지 않지만, 중쇄 가변영역(VH) 또는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 특히 바람직한 것은 VH와 VL의 양쪽을 포함하는 단편이다. 항체 단편의 구체예로서는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(단일사슬 Fv), sc(Fv)2 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 diabody(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883, Plickthun 「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」 Vol.113, Resenburg 및 Moore편, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))이다. 이와 같은 항체 단편을 얻기 위해서는, 항체를 효소, 예를 들면 파파인, 펩신 등으로 처리하여 항체 단편을 생성시키거나, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하여, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137 참조).
본 발명에 있어서의 저분자화 항체는 전장 항체보다도 분자량이 작아지는 것이 바람직하지만, 예를 들면 다이머, 트리머, 테트라머 등의 다량체를 형성하는 경우 등도 있어, 전장 항체보다도 분자량이 커지는 경우도 있다.
본 발명에 있어서 바람직한 저분자화 항체는, 항체의 VH를 2개 이상 및 VL을 2개 이상 포함하고, 이들 각 가변영역을 직접 또는 링커 등을 매개로 간접적으로 결합한 항체이다. 결합은 공유결합이어도 되고 비공유결합이어도 되며, 또한 공유결합과 비공유결합의 양쪽이어도 된다. 더욱 바람직한 저분자화 항체는, VH와 VL이 비공유결합에 의해 결합하여 형성되는 VH-VL쌍을 2개 이상 포함하고 있는 항체이다. 이 경우, 저분자화 항체 중의 한쪽의 VH-VL쌍과 다른 쪽의 VH-VL쌍 사이의 거리가, 전장 항체에 있어서의 거리보다도 짧아지는 항체가 바람직하다.
본 발명에 있어서 scFv는 항체의 H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에 있어서, H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 매개로 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). scFv에 있어서의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역은 상기 항체로서 기재된 것 중 어느 유래여도 된다. V 영역을 연결하는 펩티드 링커로서는, 예를 들면 아미노산 12-19 잔기로 되는 임의의 단일사슬 펩티드가 사용된다.
scFv를 코드하는 DNA는 상기 항체의 H 사슬 또는, H 사슬 V 영역을 코드하는 DNA, 및 L 사슬 또는, L 사슬 V 영역을 코드하는 DNA를 주형으로 하고, 그들의 서열 중 목적하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을, 그 양쪽 말단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 PCR법으로 증폭하고, 이어서 추가적으로 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA 및 그 양쪽 말단을 각각 H 사슬, L 사슬과 연결되도록 규정하는 프라미어쌍을 조합하여 증폭함으로써 얻어진다.
또한, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제작되면, 그들을 함유하는 발현 벡터, 및 이 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라서 얻을 수 있고, 또한, 그 숙주를 사용하여 통상적인 방법에 따라서 scFv를 얻을 수 있다.
이들 항체의 단편은, 상기와 동일하게 하여 그 유전자를 취득하여 발현시키고, 숙주에 의해 생산시킬 수 있다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체의 단편도 포함된다.
본 발명에 있어서 특히 바람직한 저분자화 항체는 디아바디(diabody)이다. 디아바디는 가변영역과 가변영역을 링커 등으로 결합한 프래그먼트(예를 들면, scFv 등)(이하, diabody를 구성하는 프래그먼트)를 2개 결합시켜서 이량체화시킨 것으로, 통상 2개의 VL과 2개의 VH를 포함한다(P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993), EP404097호, WO93/11161호, Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991), Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996), Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994), John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999), Holliger et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 6444-6448, (1993), Atwell et al., Mol. Immunol. 33, 1301-1312, (1996)). 디아바디를 구성하는 프래그먼트간의 결합은 비공유결합이어도 되고, 공유결합이어도 되지만, 바람직하게는 비공유결합이다.
또한, 디아바디를 구성하는 프래그먼트끼리를 링커 등으로 결합하여 단일사슬 디아바디(sc diabody)로 하는 것도 가능하다. 이때, 디아바디를 구성하는 프래그먼트끼리를 20 아미노산 정도의 긴 링커를 사용하여 결합하면, 동일 사슬 상에 존재하는 디아바디를 구성하는 프래그먼트끼리 비공유결합이 가능해져, 이량체를 형성한다.
디아바디를 구성하는 프래그먼트는, VL과 VH를 결합한 것, VL과 VL을 결합한 것, VH와 VH를 결합한 것 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 VH와 VL을 결합한 것이다. 디아바디를 구성하는 프래그먼트 중에 있어서, 가변영역과 가변영역을 결합하는 링커는 특별히 제한되지 않지만, 동일 프래그먼트 중의 가변영역의 사이에서 비공유결합이 일어나지 않을 정도로 짧은 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 그와 같은 링커의 길이는 당업자가 적절히 결정할 수 있지만, 통상 2~14 아미노산, 바람직하게는 3~9 아미노산, 특히 바람직하게는 4~6 아미노산이다. 이 경우, 동일 프래그먼트 상에 코드되는 VL과 VH는 그 사이의 링커가 짧기 때문에, 동일 사슬 상의 VL과 VH 사이에서 비공유결합이 일어나지 않아, 단쇄 V 영역 프래그먼트가 형성되지 않기 때문에, 다른 프래그먼트와의 비공유결합에 의한 이량체를 형성한다. 또한, 디아바디 제작과 동일한 원리로 디아바디를 구성하는 프래그먼트를 3개 이상 결합시켜서, 트리머, 테트라머 등의 다량체화시킨 항체를 제작하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서의 디아바디로서는, 서열번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 디아바디 또는 서열번호: 6에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 서열이 변이(치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가)된 아미노산 서열을 갖는 디아바디로서, 서열번호: 6에 기재된 서열을 갖는 디아바디와 기능적으로 동등한 디아바디나, 서열번호: 2의 CDR(또는 가변영역) 및 서열번호: 4의 CDR(또는 가변영역)의 아미노산 서열을 갖는 디아바디 또는 서열번호: 2의 CDR(또는 가변영역) 및 서열번호: 4의 CDR(또는 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 서열이 변이(치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가)된 아미노산 서열을 갖는 디아바디로서, 서열번호: 2의 CDR(또는 가변영역) 및 서열번호: 4의 CDR(또는 가변영역)의 서열을 갖는 디아바디와 기능적으로 동등한 디아바디를 예시할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
여기서 「기능적으로 동등」이란, 대상이 되는 디아바디가 서열번호: 6에 기재된 서열을 갖는 디아바디, 또는 서열번호: 2의 CDR(또는 가변영역) 및 서열번호: 4의 CDR(또는 가변영역)의 서열을 갖는 디아바디와 동등한 활성(예를 들면, HLA-A로의 결합 활성, 세포상해활성, 세포사 유도활성, 세포증식 억제활성 등)을 갖는 것을 의미한다.
변이하는 아미노산 수는 특별히 제한되지 않지만, 통상 30 아미노산 이내이고, 바람직하게는 15 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 5 아미노산 이내(예를 들면, 3 아미노산 이내)일 것으로 생각된다.
또한, 서열번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 디아바디 또는, 서열번호: 2의 CDR(또는 가변영역) 및 서열번호: 4의 CDR(또는 가변영역)의 서열을 갖는 디아바디를, 인간에 대한 이종항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로서 인간화, 키메라화 해도 된다.
서열번호: 2에 기재되어 있는 아미노산 서열에서, 1번째~125번째가 가변영역에 상당하고, 31번째~35번째가 CDR1, 50번째~66번째가 CDR2, 99번째~114번째가 CDR3에 상당한다(각각 서열번호 7, 8, 9). 서열번호: 4에 기재되어 있는 아미노산 서열에서, 1번째~107번째가 가변영역에 상당하고, 24번째~34번째가 CDR1, 50번째~56번째가 CDR2, 89번째~97번째가 CDR3에 상당한다(각각 서열번호 10, 11, 12).
본 발명에 있어서 HLA를 인식하는 저분자화 항체는 HLA에 특이적으로 결합하고, 생물학적 작용을 가지고 있으면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 저분자화 항체는, 당업자에게 공지의 방법으로 제작하는 것이 가능하다. 예를 들면, 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, HLA를 인식하는 항체의 서열(특히 가변영역의 서열이나 상보쇄 결정영역(CDR)의 서열)을 토대로, 당업자에게 공지의 유전자 재조합기술을 사용하여 제작하는 것이 가능하다.
HLA를 인식하는 항체의 서열은 이미 공지의 항체의 서열을 사용하는 것이 가능하고, 또한 HLA를 항원으로 하여, 당업자에게 공지의 방법으로 항 HLA 항체를 제작하고, 그 항체의 서열을 취득하여 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 항 HLA 클래스 I 항체의 활성이란, 항체가 항원에 결합함으로써 발생하는 생물학적 작용을 말한다. 예를 들면 생물학적 작용으로서는 세포상해작용, 항종양작용 등을 들 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적인 예로서는, 세포사 유도작용, 아포토시스 유도작용, 세포증식 억제작용, 세포분화 억제작용, 세포분열 억제작용, 세포증식 유도작용, 세포분화 유도작용, 세포분열 유도작용, 세포주기 조절작용 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 세포사 유도작용, 세포증식 억제작용이다.
세포사 유도작용, 세포증식 억제작용 등의 상기 작용의 대상이 되는 세포는 특별히 한정되지 않지만, 혈구계 세포나 부유세포가 바람직하다. 혈구계 세포의 구체적인 예로서는, 림프구(B세포, T세포), 호중구, 호산구, 호염기구, 단구(바람직하게는 활성화한 말초혈 단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)), 골수종세포 등을 들 수 있으나, 림프구(B세포, T세포), 골수종세포가 바람직하고, T세포 또는 B세포(특히 활성화된 B세포 또는 활성화된 T세포)가 가장 바람직하다. 부유세포는, 세포를 배양했을 때, 세포가 유리나 플라스틱 등의 배양기의 표면에 부착되지 않고, 부유상으로 증식하는 세포이다. 이에 대해, 접착세포(부착세포)란, 세포를 배양했을 때, 유리나 플라스틱 등의 배양기의 표면에 부착되는 세포이다.
일반적으로, 전장 항 HLA 항체에서는 세포사 유도활성을 증강시키기 위해 항 IgG 항체 등으로 크로스링크를 행해도 되고, 크로스링크는 당업자에게 공지의 방법으로 행할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 상기 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 투여함으로써, 예를 들면 혈액종양(조혈기 종양) 등의 종양(구체적인 예로서, 백혈병, 골수이형성 증후군, 악성 림프종, 버킷 림프종, 만성골수성 백혈병, 급성골수성 백혈병, 형질세포 이상증(골수종, 다발성 골수종, 마이크로글로불린 혈증), 골수 증식성 질환(진성 적혈구 증가증, 본태성 혈소판 혈증, 특발성 골수섬유증) 등)이나 자기면역질환(구체적인 예로서, 류머티즘, 자기면역성 간염, 자기면역성 갑상선염, 자기면역성 수포증, 자기면역성 부신피질염, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역성 위축성 위염, 자기면역성 호중구 감소증, 자기면역성 정소염, 자기면역성 뇌척수염, 자기면역성 리셉터병, 자기면역 불임, 클론병, 전신성 홍반성 루프스, 다발성 경화증, 바제도병, 연소자형 당뇨병, 애디슨병, 중증 근무력증, 수정체성 포도막염, 건선, 베체트병 등)과 같은 질환의 치료, 예방 등을 행하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항체는 생체 내에서의 안정성이 우수하다고 생각되기 때문에, 생체에 투여할 때에는 특히 유효할 것으로 생각된다.
본 발명의 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제 내성 암 치료제는, 화학요법제 내성 암의 치료에 있어서 사용하는 것이 가능하다.
암의 화학요법이란, 화학요법제를 사용하여 암을 치료하는 것을 말한다. 화학요법에 대한 반응성은 증례에 따라 상이하나 일반적으로, 복수의 상이한 작용 메커니즘을 토대로 한 약제를 조합하여 사용함으로써 상승적인 효과를 기대하면서 부작용을 최소한으로 하도록 투여가 행해진다.
또한, 화학요법제에 대한 내성 암으로서는, 치료의 초기부터 화학요법제의 효과가 보이지 않는 자연내성과, 치료를 계속해 가는 중에 처음에는 유효하였던 화학요법제가 효과가 없어져, 암이 재발하는 획득내성을 들 수 있다. 본 발명의 치료제가 사용되는 화학요법제 내성 암은 자연내성, 획득내성 중 어느 쪽이어도 되나, 바람직하게는 획득내성 암이다. 화학요법제에 대한 획득내성 암의 특징으로서는, 예를 들면, 약물 대사 효소류의 과잉발현이나 약제 표적 단백의 변이, 약제의 세포내 흡수의 감소, 약제의 세포외 배출의 증대 등을 들 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 약제의 세포외 배출에 관여하는 단백질의 구체적인 예로서는, MDR1(P 당단백)을 들 수 있다.
본 발명의 치료제가 사용되는 암으로서는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 혈액종양(조혈기 종양) 등의 종양, 구체적으로는 백혈병, 골수이형성 증후군, 악성 림프종, 버킷 림프종, 만성골수성 백혈병, 급성골수성 백혈병, 형질세포 이상증(골수종, 다발성 골수종, 마이크로글로불린 혈증) 등의 내성 암을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「화학요법제」에는 알킬화제, 대사길항제, 천연산물, 백금착체, 및 기타 약제가 포함된다. 알킬화제로서는 질소 머스타드류(Nitrogen Mustards), 에틸렌이민류(Ethylenimines), 메틸멜라민류(Methylmelamines), 설폰산알킬류(Alkyl Sulfonates), 니트로소우레아류(Nitrosoureas), 트리아젠류(Triazens)를 들 수 있다. 질소 머스타드류로서는, 예를 들면 메클로르에타민(Mechlorethamine), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 이포스파미드(Ifosfamide), 멜팔란(Melphalan), 클로람부실(Chlorambucil)을 들 수 있다. 에틸렌이민류와 메틸멜라민류로서는, 예를 들면 헥사메틸멜라민(Hexamethylmelamine), 티오테파(Thiotepa)를 들 수 있다. 설폰산알킬류로서는, 부설판(Busulfan)을 들 수 있다. 니트로소우레아류로서는, 예를 들면 카무스틴(Carmustine: BCNU), 로무스틴(Lomustine: CCNU), 세무스틴(Semustine: methyl-CCNU), 스트렙토조신(Streptozocin)을 들 수 있다. 트리아젠류로서는 다카르바진(Dacarbazine: DTIC)을 들 수 있다. 대사길항제로서는 엽산 유사 물질, 피리미딘 유사 물질, 푸린 유사 물질을 들 수 있다. 엽산 유사 물질로서는, 메토트렉세이트(Methotrexate)를 들 수 있다. 피리미딘 유사 물질로서는, 예를 들면 플루오로우라실(Fluorouracil: 5-FU), 독시플루리딘(Doxifluridine: 5'-DFUR, 상품명 푸르툴론), 카페시타빈(Capecitabine, 상품명 셀로다), 플록스우리딘(Floxuridine: FudR), 시타라빈(Cytarabine)을 들 수 있다. 푸린류 유사 물질로서는, 예를 들면 메르캅토푸린(Mercaptopurine: 6-MP), 티오구아닌(Thioguanine: TG), 펜토스타틴(Pentostatin)을 들 수 있다. 천연산물로서는, 빈카 알칼로이드류(Vinca Alkaloids), 에피포도필로톡신류(Epipodophyllotoxins), 항생물질류를 들 수 있다. 빈카 알칼로이드류로서는, 예를 들면 빈블라스틴(Vinblastine: VLB), 빈크리스틴(Vincristine: VCR)을 들 수 있다. 에피포도필로톡신류로서는, 예를 들면 에토포시드(Etoposide), 테니포시드(Teniposide)를 들 수 있다. 항생물질로서는, 예를 들면 닥티노마이신(Dactinomycin: actinomycin D), 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 블레오마이신(Bleomycin), 플리카마이신(Plicamycin), 미토마이신(Mitomycin)을 들 수 있다. 백금착체란, 플라티나 배위 복합체를 가리키고, 예를 들면 시스플라틴(Cisplatin: CDDP), 카르보플라틴(Carboplatin)을 들 수 있다. 기타 약제로서는, 탁솔류, 예를 들면 파클리탁셀, 도세탁셀, 안트라세네디온류(Anthracenediones), 예를 들면 미톡산트론(Mitoxantrone), 요소 치환체류, 예를 들면 히드록시우레아(Hydroxyurea), 메틸히드라진류(Methyl Hydrazines), 예를 들면 염산 프로카르바진(Procarbazine Hydrochloride, 상품명 나툴란), 비타민 A 대사물류, 예를 들면 트레티노인(Tretinoin, 상품명 베사노이드)을 들 수 있다.
본 발명의 항 HLA 클래스 I 항체는 화학요법제의 작용 증강제로서도 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 「작용 증강제」란, 다른 약제와 동일한 대상에 대해 사용되었을 때, 당해 다른 약제의 특정 작용을 강화하는 작용을 갖는 약제이다. 따라서, 대상이 되는 약제가 항암제(화학요법제)와 동일한 대상에 대해 사용되었을 때, 그 세포상해작용, 세포살상작용 또는 세포증식 억제작용을 강화하는 작용을 가지면, 당해 대상이 되는 약제는 「작용 증강제」이다. 항암작용을 증강하기 위한 약제는 항암제를 투여하는 환자와 동일한 환자에 대해 사용되고, 항암제 단독으로의 치료효과와 비교하여 상승적인 효과, 또는 질적으로 상이한 치료효과를 주는 것이다.
또한, 본 발명의 항 HLA 클래스 I 항체는 상기 화학요법제와 병용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 항 HLA 클래스 I 항체와 화학요법제의 병용이란, 항 HLA 클래스 I 항체와 화학요법제를 모두 투여 또는 사용(이하, 단순히 「투여」라고 기재한다.)하는 것을 의미하고, 투여의 순서나 투여간격 등으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 항 HLA 클래스 I 항체와 화학요법제를 조합시킨 키트로서 실시해도 된다. 또한, 본 발명의 항 HLA 클래스 I 항체와 화학요법제를 병용하는 경우는 어느 하나를 단독으로 사용하는 경우에 비해, 목적에 따라 각각의 투여량을 적게 하는 것도 가능하다.
본 발명의 항 HLA 클래스 I 항체와 화학요법제의 투여의 순서는 화학요법제 투여 후에 항 HLA 클래스 I 항체를 투여, 화학요법제와 항 HLA 클래스 I 항체를 동시에 투여, 항 HLA 클래스 I 항체 투여 후에 화학요법제를 투여 중 어느 순서여도 되나, 바람직하게는 항 HLA 클래스 I 항체 투여 후에 화학요법제를 투여 또는 화학요법제와 항 HLA 클래스 I 항체를 동시에 투여하는 것이고, 더욱 바람직하게는 항 HLA 클래스 I 항체투여 후에 화학요법제를 투여하는 것이다.
항 HLA 클래스 I 항체 투여 후에 화학요법제를 투여하는 경우, 화학요법제와 항 HLA 클래스 I 항체의 투여간격은 특별히 한정되지 않고, 투여경로나 제형 등의 요인을 고려하여 설정할 수 있다. 굳이 투여간격의 일례를 든다고 한다면, 통상 0시간~72시간이고, 바람직하게는 0시간~24시간이며, 더욱 바람직하게는 0시간~12시간, 더욱 바람직하게는 0시간~6시간이다.
항 HLA 클래스 I 항체는 화학요법제와 함께 하나의 의약조성물로 할 수 있다. 또한, 항 HLA 클래스 I 항체는 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는 의약조성물로 할 수 있다. 즉, 항 HLA 클래스 I 항체는 「화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, 항 HLA 클래스 I 항체 및 제제상 허용 가능한 담체를 포함하는 의약조성물」의 제조를 위해 사용할 수 있다. 또한, 화학요법제는 항 HLA 클래스 I 항체와 병용하는 것을 특징으로 하는 의약조성물로 할 수 있다. 즉, 화학요법제는 「항 HLA 클래스 I 항체와 병용하는 것을 특징으로 하는, 화학요법제 및 제제상 허용 가능한 담체를 포함하는 의약조성물」의 제조를 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 의약조성물은 세포사 유도제, 암치료제로서도 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은, 화학요법제 및 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 세포사 유도제, 화학요법제 및 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 암치료제를 제공한다. 또한, 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 세포사 유도제, 및 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 암치료제를 제공한다.
본 발명의 약제가 투여되는 대상은 포유동물이다. 포유동물은 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 약제는 의약품의 형태로 투여하는 것이 가능하고, 경구적 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 점적 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 좌제, 결장 주입, 경구성 장용제 등을 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 유효 투여량은 1회 체중 1 ㎏당 0.01 ㎎~100 ㎎의 범위에서 선택된다. 또는, 환자당 1~1000 ㎎, 바람직하게는 5~50 ㎎의 투여량을 선택할 수 있다. 바람직한 투여량, 투여방법은, 혈중에 프리의 항체가 존재하는 정도의 양이 유효 투여량이고, 구체적인 예로서는 체중 1 ㎏당 1개월(4주간)에 0.5 ㎎~40 ㎎, 바람직하게는 1 ㎎~20 ㎎을 1회에서 수회로 나누어, 예를 들면 2회/주, 1회/주, 1회/2주, 1회/4주 등의 투여 스케줄로 점적 등의 정맥내 주사, 피하 주사 등의 방법으로 투여하는 방법 등이다. 투여 스케줄은 투여 후 상태의 관찰 및 혈액 검사값의 동향을 관찰하면서 2회/주 또는 1회/주에서 1회/2주, 1회/3주, 1회/4주와 같이 투여 간격을 늘려가는 등 조정하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 약제에는 보존제나 안정제 등의 제제상 허용 가능한 담체가 첨가되어 있어도 된다. 제제상 허용 가능한 담체란, 그 자체는 상기의 세포상해활성을 갖는 재료여도 되고, 당해 활성을 갖지 않는 재료여도 되며, 상기의 약제와 함께 투여 가능한 재료를 의미한다. 또한, 세포상해활성을 갖지 않는 재료이나, 항 HLA 클래스 I 항체와 병용함으로써 상승적(相乘的) 또는 상가적(相加的)인 안정화 효과를 갖는 재료여도 된다.
제제상 허용되는 재료로서는, 예를 들면 멸균수나 생리식염수, 안정제, 부형제, 완충제, 방부제, 계면활성제, 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 계면활성제로서는 비이온 계면활성제를 들 수 있고, 예를 들면 소르비탄모노카프릴레이트, 소르비탄모노라우레이트, 소르비탄모노팔미테이트 등의 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세린모노카프릴레이트, 글리세린모노미리스테이트, 글리세린모노스테아레이트 등의 글리세린 지방산 에스테르; 데카글리세릴모노스테아레이트, 데카글리세릴디스테아레이트, 데카글리세릴모노리놀레이트 등의 폴리글리세린 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄트리올레에이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄트리스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌소르비트테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비트테트라올레에이트 등의 폴리옥시에틸렌소르비트 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌글리세릴모노스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌글리세린 지방산 에스테르; 폴리에틸렌글리콜디스테아레이트 등의 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 등의 폴리옥시에틸렌알킬에테르; 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌프로필에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌세틸에테르 등의 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르; 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르; 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유; 폴리옥시에틸렌소르비트밀랍 등의 폴리옥시에틸렌밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌라놀린 등의 폴리옥시에틸렌라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌스테아르산아미드 등의 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드 등의 HLB6~18을 갖는 것 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.
또한, 계면활성제로서는 음이온 계면활성제도 들 수 있고, 예를 들면 세틸 황산나트륨, 라우릴 황산나트륨, 올레일 황산나트륨 등의 탄소원자수 10~18의 알킬기를 갖는 알킬 황산염; 폴리옥시에틸렌라우릴 황산나트륨 등의, 에틸렌옥시드의 평균 부가몰수가 2~4이고 알킬기의 탄소원자수가 10~18인 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염; 라우릴설포숙신산에스테르나트륨 등의, 알킬기의 탄소원자수가 8~18인 알킬설포숙신산에스테르염; 천연계의 계면활성제, 예를 들면 레시틴, 글리세로 인지질; 스핑고미엘린 등의 스핑고 인지질; 탄소원자수 12~18의 지방산의 자당 지방산 에스테르 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.
본 발명의 약제에는, 이들 계면활성제의 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있다. 본 발명의 제제에서 사용하는 바람직한 계면활성제는, 폴리소르베이트 20, 40, 60 또는 80 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르이고, 폴리소르베이트 20 및 80이 특히 바람직하다. 또한, 폴록사머(플루로닉 F-68(등록상표) 등)로 대표되는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜도 바람직하다.
계면활성제의 첨가량은 사용하는 계면활성제의 종류에 따라 상이하지만, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80의 경우에는, 일반적으로는 0.001~100 ㎎/mL이고, 바람직하게는 0.003~50 ㎎/mL이며, 더욱 바람직하게는 0.005~2 ㎎/mL이다.
본 발명에 있어서 완충제로서는, 인산, 구연산 완충액, 초산, 사과산, 타르타르산, 숙신산, 젖산, 인산칼륨, 글루콘산, 카프릴산, 데옥시콜산, 살리실산, 트리에탄올아민, 푸마르산 등의 다른 유기산 등, 또는 탄산 완충액, 트리스 완충액, 히스티딘 완충액, 이미다졸 완충액 등을 들 수 있다.
또한, 용액제제의 분야에서 공지의 수성 완충액에 용해함으로써 용액제제를 조제해도 된다. 완충액의 농도는 일반적으로는 1~500 mM이고, 바람직하게는 5~100 mM이며, 더욱 바람직하게는 10~20 mM이다.
또한, 본 발명의 화학요법제 내성 암 치료제는 그 밖의 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴이나 면역 글로불린 등의 단백질, 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 당알코올을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서 아미노산으로서는, 염기성 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 등, 또는 이들 아미노산의 무기염(바람직하게는, 염산염, 인산염의 형태, 즉 인산아미노산)을 들 수 있다. 유리(遊離) 아미노산이 사용되는 경우, 바람직한 pH값은 적당한 생리적으로 허용되는 완충물질, 예를 들면 무기산, 특히 염산, 인산, 황산, 초산, 포름산 또는 이들 염의 첨가에 의해 조정된다. 이 경우, 인산염의 사용은 특히 안정한 동결건조물이 얻어지는 점에서 특히 유리하다. 조제물이 유기산, 예를 들면 사과산, 타르타르산, 구연산, 숙신산, 푸마르산 등을 실질적으로 함유하지 않는 경우 또는 대응하는 음이온(사과산 이온, 타르타르산 이온, 구연산 이온, 숙신산 이온, 푸마르산 이온 등)이 존재하지 않는 경우에 특히 유리하다. 바람직한 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘, 또는 오르니틴이다. 또한, 산성 아미노산, 예를 들면 글루타민산 및 아스파라긴산, 및 그의 염의 형태(바람직하게는 나트륨염) 또는 중성 아미노산, 예를 들면 이소류신, 류신, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린, 메티오닌, 시스테인, 또는 알라닌, 또는 방향족 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 또는 유도체의 N-아세틸트립토판을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물로서는, 예를 들면 덱스트란, 글루코오스, 푸룩토오스, 락토오스, 크실로오스, 만노오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 당알코올로서는, 예를 들면 만니톨, 소르비톨, 이노시톨 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제를 주사용의 수용액으로 하는 경우에는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제(예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)를 포함하는 등장액과 혼합할 수 있다. 또한 상기 수용액은 적당한 용해보조제(예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50) 등)와 병용해도 된다.
목적에 따라 추가적으로 희석제, 용해보조제, pH 조정제, 무통화제, 황 함유 환원제, 산화방지제 등을 함유해도 된다.
본 발명에 있어서 황 함유 환원제로서는, 예를 들면 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그의 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 및 탄소원자수 1~7의 티오알칸산 등의 설프히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 산화방지제로서는, 예를 들면 에리소르빈산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 초산토코페롤, L-아스코르브산 및 그의 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 몰식자산 트리아밀, 몰식자산 프로필 또는 에틸렌디아민 사초산 이나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
또한, 필요에 따라서 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입하거나, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980 등 참조). 또한, 약제를 서방성 약제로 하는 방법도 공지로 본 발명에 적용할 수 있다(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; 미국특허 제3,773,919호; 유럽특허출원 공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP 제133,988호).
사용되는 제제상 허용 가능한 담체는, 제형에 따라서 상기 중에서 적절히 또는 조합하여 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 화학요법제 내성 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학요법제와 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 병용하는 것을 특징으로 하는, 세포사를 유도하는 방법 및 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 「대상」이란, 본 발명의 화학요법제 내성 암 치료제를 투여하는 생물체, 이 생물체의 체내 일부분을 말한다. 생물체는 특별히 한정되는 것은 아니나, 동물(예를 들면 인간, 가축동물종, 야생동물)을 포함한다. 상기 「생물체의 체내 일부분」에 대해서는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서 「투여한다」란, 경구적, 또는 비경구적으로 투여하는 것이 포함된다. 경구적인 투여로서는, 경구제라는 형태로의 투여를 들 수 있고, 경구제로서는, 과립제, 산제, 정제, 캡슐제, 용제, 유제, 또는 현탁제 등의 제형을 선택할 수 있다.
비경구적인 투여로서는 주사제라는 형태로의 투여를 들 수 있고, 주사제로서는 정맥 주사제, 피하 주사제, 근육 주사제, 또는 복강내 주사제 등을 들 수 있다. 또한, 투여해야 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 유전자 치료의 수법을 사용하여 생체에 도입함으로써, 본 발명의 방법의 효과를 달성할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제를 처치하고자 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것도 가능하다. 예를 들면, 수술 중의 국소주입, 카테터의 사용, 또는 본 발명의 펩티드를 코드하는 DNA의 표적화 유전자 송달에 의해 투여하는 것도 가능하다.
본 발명의 약제의 대상으로의 투여는 1회여도 되고, 연속하여 투여하는 것도 가능하다.
또한, 생물체로부터 적출 또는 배출된 생물체의 일부분에 투여를 행할 때에는, 본 발명의 약제를 생물체의 일부에 「접촉」시켜도 된다.
또한, 본 발명에 있어서 「접촉」은 생물체의 상태에 따라 행한다. 예를 들면, 생물체 일부로의 본 약제의 살포, 또는 생물체 일부의 파쇄물로의 본 약제의 첨가 등을 들 수 있지만, 이들의 방법에 제한되지 않는다. 생물체의 일부가 배양세포인 경우에는, 이 세포의 배양액으로의 본 약제의 첨가 또는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 DNA를 생물체의 일부를 구성하는 세포로 도입함으로써, 상기 「접촉」을 행하는 것도 가능하다.
또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
도 1은 화학요법제 내성 세포주에 있어서의 mdr1 mRNA와 MDR1 단백질의 발현을 나타내는 사진 및 도면이다. (A) RT-PCR에 의한 mRNA 발현량을 나타내는 사진이다. (B) 항 MDR1 항체 및 FITC 표지 염소 항 마우스 IgG 항체를 사용한 유동세포분석법(flow cytometry)에 의한 세포표면의 MDR1 발현량을 나타내는 도면이다. 점선 은 대조 항체, 실선은 항 MDR1 항체를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 화학요법제 내성 세포주에 있어서의 HLA 클래스 I 분자의 과잉발현을 유동세포분석법에 의해서 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 점선은 대조 항체, 실선은 항 C3B3IgG 항체(C3B3 전장 항체)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 급성골수성 백혈병(AML) 환자의 종양세포에 있어서의 초진시 및 재발시의 MDR1의 발현량을 유동세포분석법에 의해 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 점선은 대조 항체, 실선은 초진시에 있어서의 항 MDR1 항체에 의한 측정결과, 굵은 선은 재발시에 있어서의 항 MDR1 항체에 의한 측정결과를 나타낸다.
도 4는 급성골수성 백혈병(AML) 환자의 종양세포에 있어서의 초진시 및 재발시의 HLA 클래스 I 분자의 발현량을 유동세포분석법에 의해 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 점선은 대조 항체, 실선은 항 C3B3IgG 항체(C3B3 전장 항체)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 화학요법제 내성 세포주에 있어서의 C3B3 diabody의 세포상해활성의 측정결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 화학요법제 내성 세포주에 있어서의 C3B3 diabody에 의한 vincristine의 세포상해활성의 증강작용을 나타내는 도면이다.
도 7은 화학요법제 내성 세포주에 있어서의 C3B3 diabody 처리 후의 세포표면 상의 MDR1 발현량을 나타내는 도면이다. 점선은 대조 항체, 실선은 항 MDR1 항체에 의한 측정결과, 굵은 선은 C3B3 diabody 처리 후의 항 MDR1 항체에 의한 측정결과를 나타낸다.
도 8은 C3B3 diabody 처리에 의해 화학요법제 내성 세포주에 있어서 약제 유지능이 회복되는 것을 나타내는 도면이다. 점선은 대조, 실선은 Daunorubicin만, 굵은 선은 항 C3B3 diabody 처리 후에 Daunorubicin을 첨가한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 화학요법제(Vincristine) 내성 혈액종양 세포주의 수립
Acute myeloid leukemia cell line HL60 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 및 Burkitt's lymphoma cell line BLTH(도쿠시마 다이가쿠 히로세선생으로부터 공여. Br J Cancer 56: 413-417, 1987)를 vincristine의 존재하에 배양하여, vincristine 저항성 세포주 HL60-R과 BLTH-R을 얻었다.
[실시예 2] 종양 세포주에 있어서의 mdr1 mRNA 및 HLA 클래스 I 발현량의 확인
처음에 HL60, HL60-R, BLTH 및 BLTH-R에 있어서의 mdr1 mRNA 발현에 대해서는 RT-PCR로, 세포표면 상의 MDR1 단백질 및 HLA 클래스 I 단백질 발현에 대해서는 유동세포분석법으로 확인하였다.
이들의 세포에 있어서의 mdr1 mRNA 발현은 특이적 프라이머(5'-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG(서열번호: 13), 3'-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA(서열번호: 14))를 사용한 RT-PCR로 검토하였다. 대조로서 β2-microglobulin mRNA의 발현을 특이적 프라이머(5'-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA(서열번호: 15), 3'-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG(서열번호: 16))를 사용하여 검토하였다.
세포표면의 MDR1 발현은 항 MDR1 항체(UIC-2, Chemicon, Temecula, CA, USA)와 FITC 표지 염소 항마우스 IgG 항체(Biosource, Camarillo, CA, USA)를 사용한 유동세포분석법으로 검토하였다. 대조(control) 항체로서는 마우스 IgG(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하였다.
그 결과, 친주인 HL60과 BLTH에 있어서는 mdr1 mRNA의 발현은 확인되지 않았으나, vincristine 저항성주인 HL60-R과 BLTH-R에는 mdr1 mRNA의 발현이 확인되었다(도 1).
또한, 이들 세포의 세포표면 상의 HLA 클래스 I 발현강도를 비교하였다. HLA 클래스 I의 발현은 Alexa 488(Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 표지한 C3B3 항체를 사용하여 유동세포분석법으로 측정하였다. 그 결과, 모두 vincristine 저항성주에 있어서 세포표면 상의 HLA 클래스 I의 발현이 증강하고 있는 것이 분명해졌다(도 2).
급성골수성 백혈병 환자의 초진시 및 재발시에 얻은 종양세포에 대해서도 마찬가지로 유동세포분석법에 의한 해석을 행하여, 종양세포표면 상의 MDR1 및 HLA 클래스 I 발현량을 확인하였다. 그 결과, 초진시와 비교하여 재발시에는 MDR1의 발현이 유도되어 있고(도 3), HLA 클래스 I의 발현에 대해서도 증강하고 있는 것이 확인되었다(도 4).
[실시예 3] 종양세포주에 있어서의 C3B3-DB의 세포상해활성
먼저, 이들의 종양세포를 사용하여 C3B3-DB에 대한 감수성을 검토하였다. C3B3-DB의 항종양활성(세포상해활성)에 대해서는 이들의 종양세포를 각종 농도의 C3B3-DB 존재하에서 배양한 후, WST-8(Kishida Chemicals, Osaka)을 사용한 세포증식시험으로 측정하였다.
C3B3-DB의 존재하에서 이들의 세포를 24시간 배양하고, 세포의 생존율을 비교한바, vincristine 저항성주인 HL60-R과 BLTH-R에 있어서 보다 저농도의 C3B3-DB로부터 세포상해가 유도되는 것이 명확해졌다(도 5).
또한, 이들의 세포를 C3B3-DB(0.1 ㎍/mL) 존재하 또는 비존재하에서 6시간 배양한 후 vincristine을 첨가하여, 화학요법제 내성 종양세포의 약제 저항성이 극복(개선)되는지 여부에 대해서 검토를 행하였다. 친주인 HL60과 BLTH에 있어서는 C3B3-DB에 의한 전처리 유무에 거의 영향을 받지 않고 vincristine에 의한 농도 의존적 세포상해가 유도되어, C3B3-DB 전처리에 의한 vincristine의 세포상해활성의 증강효과는 명확하지는 않았다. 한편, HL60-R과 BLTH-R에 있어서는 C3B3-DB로의 전처리에 의해 vincristine에 의한 세포상해활성이 증강되는 것이 명확해졌다(도 6).
[실시예 4]
C3B3-DB에 의한 약제(화학요법제) 저항성 극복의 메커니즘을 명확하게 하기 위해, 이들의 세포를 C3B3-DB(0.1 ㎍/mL)로 6시간 처리한 후의 세포표면 상의 MDR1 발현에 대해서 검토하였다. C3B3-DB로 처리한 후에는 일부의 세포에 있어서 MDR1의 발현이 저하되는 것이 명확해졌다(도 7). 또한, 이들의 세포를 C3B3-DB로 처리한 후, daunorubicin(0.1 ㎍/mL, 메이지제과, 도쿄)의 존재하에서 배양하여, 세포내의 daunorubicin 흡수량에 대해서 비교하였다.
구체적으로는, 약제의 세포내 흡수(accumulation phase)에 대해서는 C3B3-DB 존재하나 비존재하에서 2시간 배양한 후, daunorubicin을 첨가하여 30분간 배양하고, 세포를 세정한 후 유동세포분석법으로 PE 강도를 측정함으로써 평가하였다. 약제의 세포내 잔존(efflux phase)에 대해서는 그 후 추가적으로 30분간 배양하여, 동일하게 유동세포분석법으로 평가하였다.
그 결과, 친주에 있어서는 accumulation phase와 efflux phase에 있어서 모두 일정량의 daunorubicin이 흡수되고 있어, C3B3-DB의 전처리에 의한 영향은 확인되지 않았다. 한편, vincristine 저항성주에 있어서는 어떤 phase에 있어서도 daunorubicin의 흡수량은 현저히 감소하고 있었으나, C3B3-DB의 전처리에 의해 흡수량이 증가하는 것이 명확해졌다(도 8).
이상으로부터, 약제 저항성주나 재발한 급성골수성 백혈병 환자 유래의 종양세포에 있어서는 세포표면 상의 MDR1 발현이 유도되나, 동시에 HLA 클래스 I의 발현이 증강하고 있는 것이 확인되었다. HLA 클래스 I의 고발현의 메커니즘으로서는 MDR1의 트랜스포터 기능에 의한 가능성을 생각할 수 있다.
C3B3-DB는 HLA 클래스 I을 고발현하고 있는 약제 저항성 종양세포에 대해 특이적으로 항체 단독에 의한 세포상해를 유도하였다. 또한, 화학요법제와의 병용에서는 약제에 의한 세포상해활성을 증강시켰다. 그 메커니즘으로서, C3B3-DB가 이들 세포의 MDR1의 발현을 저하시킴으로써, 화학요법제의 세포내 흡수량을 증강시키는 것이 명확해졌다.
이상의 결과로부터, C3B3-DB를 화학요법제와 병용하여 사용함으로써, MDR1 발현 종양세포의 약제 저항성을 극복할 수 있다.
본 발명에 의해, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제 내성 암 치료제, 및 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 화학요법제 내성 암을 치료하는 방법이 제공되었다.
악성종양에 대한 화학요법에 있어서, 화학요법의 효과를 감약시키는 요인인 MDR1 발현 종양에 대해, 약제 저항성을 극복시키는 치료전략의 개발이 중요한 과제로 되어 있다. 본 발명의 치료제에 의해, 약제 저항성을 갖는 MDR1 발현 종양이라도 HLA 클래스 I 분자를 표적으로 한 면역학적인 치료법이 가능해졌다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF TOKUSHIMA CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Therapeutic agent for chemical therapy resistant cancer comprising an antibody that recognize HLA class I as an active ingredient <130> C1-A0701P <150> JP 2007-62339 <151> 2007-03-12 <160> 16 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(375) <400> 1 gaa gtg aag ctg gtg gag tct gag gga ggc tta gtg cag cct gga agt 48 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser 1 5 10 15 tcc atg aaa ctc tcc tgc aca gcc tct gga ttc act ttc agt gac cat 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 tac atg gct tgg gtc cgc cag gtt cca gaa aag ggt cta gaa tgg gtt 144 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gac att aat tat gat ggt agt aga acc tac tat ttg gac tcc ttg 192 Ala Asp Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 aag agc cgt ttc atc atc tcg aga gac aat gga aag aac att cta tac 240 Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Ile Leu Tyr 65 70 75 80 cta caa atg agc agt ctg aag tcg gag gac aca gcc acg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gat agg gtt agg tcc tcc tac tat agt aat ctc ttt gct atg 336 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 gac tac tgg ggt caa gga att tca gtc acc gtc tcc tca 375 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Ile Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 3 gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctt tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gat att gcc aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gat tat tct ctc acc atc agc aac ctg gaa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac tat tgt cag cag tat agc aag ctt ccg 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Pro Gly Ser 1 5 10 15 tcc atg aaa ctc tcc tgc aca gcc tct gga ttc act ttc agt gac cat 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 tac atg gct tgg gtc cgc cag gtt cca gaa aag ggt cta gaa tgg gtt 144 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gac att aat tat gat ggt agt aga acc tac tat ttg gac tcc ttg 192 Ala Asp Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 aag agc cgt ttc atc atc tcg aga gac aat gga aag aac att cta tac 240 Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Ile Leu Tyr 65 70 75 80 cta caa atg agc agt ctg aag tcg gag gac aca gcc acg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gat agg gtt agg tcc tcc tac tat agt aat ctc ttt gct atg 336 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 gac tac tgg ggt caa gga att tca gtc acc gtc tcc tca ggt gga ggc 384 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 ggt agc gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctt tct gcc tct 432 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gat att gcc 480 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala 145 150 155 160 aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc 528 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 165 170 175 ctg atc tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc 576 Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 180 185 190 agt ggc agt ggg tct ggg aca gat tat tct ctc acc atc agc aac ctg 624 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 195 200 205 gaa cct gaa gat att gcc act tac tat tgt cag cag tat agc aag ctt 672 Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu 210 215 220 ccg tat acg ttc gga tcg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 711 Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 6 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Ile Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 195 200 205 Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp His Tyr Met Ala 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 13 cccatcattg caatagcagg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 14 agtcctcgtc ttcaaacttg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 15 acccccactg aaaaagatga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 16 gtagtacctc caaacttcta 20

Claims (25)

  1. HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제 내성 암 치료제.
  2. 제1항에 있어서,
    항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는 화학요법제 내성 암 치료제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는 화학요법제 내성 암 치료제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는 화학요법제 내성 암 치료제.
  5. HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제의 작용 증강제.
  6. 제5항에 있어서,
    항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는 화학요법제의 작용 증강제.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는 화학요법제의 작용 증강제.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학요법제에 의해서 치료하는 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는 화학요법제의 작용 증강제.
  9. 제8항에 있어서,
    화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는 화학요법제의 작용 증강제.
  10. 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약조성물.
  11. 화학요법제와 병용하는 것을 특징으로 하는, HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 암치료용 의약조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  13. 화학요법제 및 HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 암치료용 의약조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는 암치료용 의약조성물.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학요법제에 의해서 치료하는 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  17. HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 화학요법제 내성 암을 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    화학요법제를 병용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. HLA 클래스 I을 인식하는 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 화학요법제의 작용을 증강하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    항체가 저분자화 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    화학요법제를 병용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학요법제에 의해서 치료하는 암이 화학요법제 내성 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    화학요법제 내성 암이 혈액종양인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020097021153A 2007-03-12 2008-03-12 Ｈｌａ 클래스 ｉ을 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 화학요법제 내성 암 치료제, 및 그의 이용 KR20090119992A (ko)

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