MXPA04003535A

MXPA04003535A - Proteinas de enlace para objetivos directos.

Info

Publication number: MXPA04003535A
Application number: MXPA04003535A
Authority: MX
Inventors: Rossi Edmund
Original assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2005-06-20
Also published as: PL374495A1; BR0213303A; IL161418A0; EP1448780A4; CN1604966A; WO2003033654A3; EP1448780A2; US20030148409A1; WO2003033654A2; CA2463672A1; KR20050036875A; JP2005507659A

Abstract

La presente invencion se refiere a proteinas de enlace multivalentes, monoespecificas. Estas proteinas de enlace comprenden dos o mas sitios de enlace, en donde cada sitio de enlace se enlaza especificamente al mismo tipo de celula objetivo. La presente invencion se refiere ademas a composiciones de diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos monoespecificos, y a vectores recombinantes utiles para la expresion de estas proteinas de enlace funcionales en un huesped microbial. Tambien se proporcionan metodos para usar las composiciones de la invencion en el tratamiento y/o diagnosis de tumores.

Description

PROTEÍNAS DE ENLACE PARA OBJETIVOS DIRECTOS SOLICITUDES RELACIONADAS. Esta solicitud reclama el beneficio de las Solicitudes Provisionales de Patentes Norteamericanas Nos. 60/328,835, presentada en Octubre 15, 2001, 60/341,881 presentada en Diciembre 21, 2001, 60/345,641 presentada en Enero 8, 2002 y 60/404,919, presentada en Agosto 22, 2002, cuyos contenidos de todas se encuentran incorporadas a la presente descripción en su totalidad como referencia. Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente, a proteínas de enlace multivalentes, mono-específicas. En particular, la presente invención se refiere a composiciones de diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos monoespecíficos y métodos de uso de los mismos, y a vectores recombinantes útiles para la expresión de estas proteínas de enlace funcionales en un huésped microbiano. Antecedentes de la Invención La siguiente descripción se proporciona para ayudar al entendimiento del lector. No se admite que información alguna proporcionada por las referencias citadas, sea una técnica anterior a la presente invención. Las proteínas de enlace hechas por el hombre, en particular, los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, diseñados han sido probados ampliamente y han mostrado ser de valor en la detección y tratamiento de varias enfermedades humanas, incluyendo cánceres, enfermedades auto-inmunológicas, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades cardiovasculares (Filpula y McGuire, Exp. Opin. Ther. Pátents 9: páginas 231 a 245 (1999)). Por ejemplo, los anticuerpos marcados con isótopos radioactivos han sido utilizados para visualizar tumores utilizando los detectores disponibles en la técnica, después de su inyección en un paciente. La utilidad clínica de un anticuerpo o de un agente derivado de un anticuerpo depende principalmente de su capacidad para enlazarse específicamente a un antígeno objetivo. La selectividad es valiosa para la administración efectiva de un diagnóstico o un agente terapéutico, (tales como fármacos, toxinas, citocinas, hormonas, factores de crecimiento, conjugados, radionúclidos, o metales) a una localización objetivo para la detección y/o las fases de tratamiento de una enfermedad humana, particularmente si el diagnóstico o el agente terapéutico es toxico al tejido normal del cuerpo. Las limitaciones potenciales de los sistemas de anticuerpos son conocidas en la técnica (consultar por ejemplo, la publicación de Goldenberg, en Am. J. Med. "94: páginas 297 a 312 (1993)). Los parámetros importantes en la detección y técnicas de tratamiento incluyen, por ejemplo, la cantidad de la dosis inyectada específicamente localizada en el sitio en donde están presentes las células que contienen el antígeno objetivo y el índice de asimilación, por ejemplo, la proporción de la cantidad del anticuerpo enlazado específicamente a la del anticuerpo libre presente en los tejidos que rodean a los tejidos normales (tal y como se detectan por medio de la radioactividad). Cuando un anticuerpo es inyectado en la corriente sanguínea, pasa a través de un número de compartimentos fisiológicos conforme es metabolizado y excretado. Óptimamente, el anticuerpo debe tener la capacidad para localizar y enlazar el antígeno de célula objetivo mientras que pasa a través del resto del cuerpo. Los factores que controlan la llegada al antígeno objetivo incluyen, por ejemplo, la localización y tamaño del antígeno, la densidad del antígeno, la accesibilidad del antigeno y la composición celular del tejido objetivo, así como la farmacocinéticá de los anticuerpos objetivo. Otros factores que afectan específicamente lá llegada a un objetivo de un tumor por medio de los anticuerpos, incluyen los niveles de expresión del antígeno objetivo, tanto en el tumor como en los tejidos normales, la toxicidad a la médula ósea resultante de la disociación lenta en la sangre de los anticuerpos radiomarcados. La cantidad de anticuerpos que llegan a los objetivos acrementada por las células del tumor localizadas, es infuenciada por la vascularización del tumor y las barreras a la penetración del anticuerpo de los tumores, así como a la presión intratumoral. La asimilación no especifica por los órganos que no son objetivos (tales como el hígado, ríñones o médula ósea) es otra limitación potencial de la técnica, especialmente para la radio-inmunoterapia, en donde la irradiación de la médula ósea frecuentemente ocasiona una toxicidad y limita la dosis. Un método al que nos referimos como la objetivización directa está diseñado para llegar a los antígenos del tumor objetivo utilizando anticuerpos portadores de un radioisótopo de diagnóstico o terapéutico. El método de objetivización directa requiere un anticuerpo monoespecífico antitumor radiomarcado que reconoce específicamente el antígeno objetivo localizado en o dentro del tumor. La técnica generalmente comprende la inyección del anticuerpo monoespecífico marcado dentro del paciente y permitir que el anticuerpo localice el tumor para obtener los beneficios del diagnóstico o terapéuticos, mientras el anticuerpo sin enlazarse pasa por el cuerpo. Sin embargo, el anticuerpo radiomarcado no forma un complejo muy estable con el antígeno objetivo, y por lo tanto, no permanece en el sitio del tumor por un período de tiempo prolongado. Por lo tanto, permanece una necesidad en la técnica de composiciones de anticuerpos multivalentes monoespecíficos y métodos de producción de dichos anticuerpos utilizando la tecnología del ADN recombinante para utilizarlos en un sistema de objetivización directa. Específicamente, permanece una necesidad de un anticuerpo que exhiba una asimilación mejorada del anticuerpo y el enlace a los antígenos objetivo, dejando menos anticuerpos libres en la circulación, y la protección óptima de los tejidos y células normales de los agentes tóxicos formados en complejo con el anticuerpo. Sumario de la Invención La presente invención se refiere a proteínas de enlace multivalentes monoespecíficas. Estas proteínas de enlace comprenden dos o más sitios de enlace, en donde cada uno de los sitios de enlace se enlaza específicamente al mismo tipo de célula objetivo, y de preferencia, con el mismo antígeno en dicha célula objetivo. La presente invención se refiera además a composiciones de diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos monoespecíficos, y a vectores recombinantes útiles para la expresión de estas proteínas de enlace funcionales en un huésped microbiano. También se proporcionan métodos para utilizar las composiciones de la presente invención, en el tratamiento y/o diagnosis de los tumores. Es un objeto específico de la presente invención proporcionar anticuerpos que exhiben una asimilación mejorada del anticuerpo y el enlace a los antígenos objetivos, para utilizarlo en la diagnosis y tratamiento de tumores. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan proteínas de enlace multivalentes monoespecíficas las cuales tienen dos o más sitios de enlace específicos para el mismo antígeno objetivo. Cada sitio de enlace está formado por la asociación de dos o más fragmentos de una sola cadena Fv (scFv) y cada scFv comprende por lo menos 2 dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. En varias modalidades alternativas preferidas, la proteína de enlace multivalente monoespecífica puede ser un diacuerpo monoespecífico, un triacuerpo monoespecífico, o un tetracuerpo monoespecífico. En las modalidades preferidas, el anticuerpo monoclonal humano o humanizado es específico para un antigeno asociado con un tumor, más preferentemente el antígeno carcinoembrionario (CEA). De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la proteína de enlace multivalente monoespecífica también puede contener un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, y/o una combinación de dos o más de dichos agentes. En varias modalidades, el agente de diagnóstico puede ser un conjugado, un radionúclido, un metal, un agente de contraste, un agente de rastreo, agentes de detección o combinaciones de los mismos. En varias modalidades, el agente terapéutico puede ser un radionúclido, un fármaco quimioterapéutico, una citocina, una hormona, un factor de crecimiento, una toxina, un inmuno-regulador, o una combinación de los mismos. De acuerdo todavía con otra modalidad de la presente invención, se proporcionan vectores de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las diferentes proteínas de enlace multivalentes monoespecíficas, así como las células huésped que han sido transformadas con estos vectores de expresión para la producción de las proteínas de enlace. La presente invención proporciona además, métodos para diagnosticar la presencia de un tumor y métodos de tratamiento de un tumor utilizando las proteínas de enlace de la presente invención. Las proteínas de enlace de la presente invención también sirven como un medio efectivo de administración de uno o más agentes de diagnóstico, uno o más agentes terapéuticos, o una combinación de dos o más de los mismos a un tumor en un sujeto; y puede estar provisto de manera conveniente en un equipo para el uso terapéutico y/o de diagnóstico de los practicantes. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una representación esquemática del polipéptido hMN-14scFV sintetizado en E. coli proveniente de un plásmido de expresión hMN-14-scFv-L5, y la formación de un anticuerpo hMN-14. La construcción de ácido nucleico que codifica el polipéptido sin procesar contiene secuencias que codifican el péptido de señal pe1B, y las secuencias de codificación hMN-14VH y hMN-14V|< acopladas por un enlazador de 5 aminoácidos, y una etiqueta de afinidad de histidina de la terminal carboxilo. La figura también muestra un dibujo de una figura pegada del polipéptido maduro después de la remoción proteolítica del péptido de señal pe1B, y un dibujo de una figura pegada de un diacuerpo hMN-14, incluyendo los sitios de enlace CEA. La figura 2 muestra colectivamente los resultados del análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC) de la purificación del diacuerpo hMN-14. La figura 2A es un perfil de elución de la HPLC del diacuerpo hMN-14 purificado por IMAC. Los picos de elución de la HPLC del diacuerpo hMN-14 de las figuras 2A y 2B son identificados con una flecha. La figura 2B es un perfil de elución de HPLC del diacuerpo hMN-14 purificado mediante cromatografía de afinidad de anti-idiotipo WI2. El *9.75 indicado en el eje -x de la figura B es el tiempo de retención de HPLC (9.75 minutos) de control de hMN-14-Fab'-S-NEM (MW ~ 50 kDa). La figura 3 muestra colectivamente los resultados del análisis de proteína del polipéptido hMN-14scFv. La figura 3A es un gel SDS-PAGE de reducción teñido con azul cumasi que ilustra la pureza de las muestras del diacuerpo hMN-14 después de la purificación por IMAC y la purificación de afinidad de anti-idiotipo WI2. Las posiciones de los estándares de peso molecular y el polipéptido hMN-14scFv están indicados con flechas. La figura 3B es un gel isoeléctrico de enfoque (IEF). Las posiciones de los •estándares pl y el polipéptido hMN-14scFv se indican con flechas. La fila 1 de la figura 3B contiene el hMN-14 Fab'-S-NEM utilizado como estándar. La fila 2 de la misma figura contiene el diacuerpo hMN-14 purificado por WI2. La fila 3 contiene una fracción a través del flujo sin enlazar de la columna de afinidad WI2, la cual indicó que el diacuerpo hMN-14scFv es efectivamente purificado mediante este proceso. La figura 4 muestra el nivel del diacuerpo 13 l-hMN-14 durante las primeras por 96 horas después de la inyección del diacuerpo monitoreado en un tumor y en las muestras de sangre.

La cantidad del diacuerpo 31 l-hMN-14, medido como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) está trazado contra el tiempo. Los cuadros sólidos marcan los puntos de datos para las muestras del tumor, y los cuadros abiertos marcan los de las muestras de sangre. La figura 5 muestra la biodistribución del diacuerpo 131l-hMN-14 a las 48 horas posteriores a la inyección. Las muestras fueron tomadas del tumor y de tejidos normales, incluyendo el hígado, bazo, riñon, pulmón, sangre, estómago, intestino delgado e intestino grueso. La cantidad del diacuerpo 31 l-hMN-14 está mostrada como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo del tejido (%ID/g). La figura 6 es una representación esquemática del polipéptido hMN-14-0 sintetizado en E. coli del plásmido de expresión hMN-14-0, y la formación de un triacuerpo hMN-14. La construcción de ácido nucleico que codifica el polipéptido sin procesar contiene secuencias que codifican el péptido de señal pe1B, el hMN-14 VH, y las secuencias de codificación hMN-14VK, y la marca de afinidad de histidina de la terminal carboxilo. La figura también muestra un dibujo de una figura pegada del polipéptido maduro después de la remoción proteolítica del péptido de señal pe1B, y un dibujo de una figura pegada de un triacuerpo hMN-14, incluyendo los sitios de enlace CEA. La figura 7 muestra los resultados del análisis HPLC de exclusión por tamaño de la purificación del triacuerpo hMN-14. El pico de elución de HPLC del triacuerpo hMN-14 se encuentra en 9.01 minutos. Las proteínas solubles fueron purificadas mediante Ni-NTA IMAC seguida por cromatografía de intercambio de aniones Q-Sepharose. La fracción a través del flujo de la columna Q-Sepharose fue utilizada para el análisis HPLC. Los tiempos de retención del diacuerpo hMN-14 y el hMN-14 F(ab')2 se indican con flechas. La figura 8 muestra colectivamente una comparación de la asimilación del tumor y la disociación de la sangre del diacuerpo hMN-14 (figura 8A), el triacuerpo hMN-14 (figura 8B), y el tetracuerpo hMN-14 (figura 8C) durante las primeras 96 horas después de la inyección. La cantidad de las proteínas marcadas 125l, medidas como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g), está trazada contra el tiempo. La figura 9 es una representación esquemática del polipéptido hMN-14-1G sintetizado en E. coli proveniente del plásmido de expresión hMN-14-1G, y la formación de un tetracuerpo hMN-14. La construcción de ácido nucleico que codifica el polipéptido sin procesar contiene las secuencias que codifican el péptido de señal pe1B, las secuencias codificadoras de hMN-14 VH y VK acopladas por un solo residuo de glicina y la marca de afinidad de histidina de la terminal carboxilo. La figura también muestra un dibujo de una figura pegada del polipéptido maduro después de la remoción proteolítica del péptido de señal pe1B, y un dibujo de una figura pegada de un tetracuerpo hMN-14, incluyendo los sitios de enlace CEA. La figura 10 muestra los resultados del análisis HPLC de exclusión por tamaño de la purificación del polipéptido hMN-14-1G. Las proteínas solubles fueron purificadas mediante Ni-NTA IMAC seguida por cromatografía de intercambio de aniones Q-Sepharose. La fracción a través del flujo de la columna Q-Sepharose fue utilizada para el análisis HPLC. Los picos de elusión HPLC del diacuerpo, triacuerpo y tetracuerpos están indicados con flechas. La figura 11 es una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:1), y una secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:2) de hMN-14-scFv-L5. Las bases del 1 al 66 de ácido nucleico codifican el polipéptido de señal pe1B; las bases del 70 al 423 codifican el hMN-14 VH; las bases del 424 al 438 codifican el péptido enlazador (GGGGS); las bases del 439 al 759 codifican el hMN-14 VK; y las bases del 766 al 783 codifican la marca de afinidad de histidina. La figura 12 es una secuencia de aminoácidos deducida del hMN-14 VH (SEQ ID NO:3), y del hMN-14 VK (SEQ ID NO:4). La figura 13 es una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:5), y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:6) del hMN-14-0. Las bases de ácido nucleico del 1 al 66 codifican el péptido de señal pe1B; las bases del 70 al 423 codifican el hMN-14 VH; las bases del 424 al 744 codifican el hMN-14 VK, y las bases del 751 al 768 codifican la marca de afinidad de histidina.

La figura 14 es una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:7), y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:8) del hMN-14-1G. Las bases del 1 al 66 de ácido nucleico codifican el péptido de señal pe1B; las bases del 70 al 423 codifican el hMN-14 VH; las bases del 424 al 427 codifican el péptido enlazador (G); las bases del 427 al 747 codifican el hMN-14 VK; y las bases del 754 al 771 codifican la marca de afinidad de histidina. Descripción Detallada de la Invención A menos de que se especifique lo contrario, "un" ó "una" significan "uno o más". Una modalidad de la presente invención se refiere a proteínas de enlace multivalente monoespecífico. Estas proteínas de enlace comprenden dos o más sitios de enlace en donde cada sitio de enlace tiene afinidad para el mismo antígeno objetivo simple. Cada sitio de enlace está formado por la asociación de dos o más fragmentos de una sola cadena Fv (scFv). Cada scFv comprende por lo menos dos dominios variables de derivados de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. La presente invención se refiere además a diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, monoespecíficos, los cuales pueden comprender además un agente de diagnóstico o terapéutico, o una combinación de dos o más de los mismos. Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína de enlace multivalente monoespecífica que comprende dos o más sitios de enlace que tienen afinidad para el mismo antígeno objetivo simple. En donde los sitios de enlace están formados por la asociación de dos o más fragmentos de una sola cadena Fv (scFv), y en donde cada fragmento scFv comprende por lo menos 2 dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. En ciertas modalidades, dicho anticuerpo monoclonal es específico para un antígeno asociado con el tumor. Estructuralmente, los anticuerpos completos están compuestos de dos o más copias de una unidad de forma de "Y" que contiene cuatro cadenas de polipéptidos. Dos cadenas son copias idénticas de un poli péptido , a las que nos referimos como la cadena pesada, y dos cadenas son copias idénticas de un polipéptido, a la que nos referimos como la cadena ligera. Cada polipéptido es codificado por el ADN individual, o por secuencias de ADN conectadas. Las dos cadenas pesadas son enlazadas juntas mediante uno o más enlaces de disulfuro, y cada una de las cadenas ligeras está enlazada a una de las cadenas pesadas por un enlace de disulfuro. Cada cadena tiene un dominio variable de la terminal N, al que nos referimos como VH y VL para las cadenas pesada y ligera, respectivamente, y la asociación no covalente de un par de VH y VL, a las que nos referimos como el fragmento Fv, que forma un sitio de enlace del antígeno. Los fragmentos Fv separados están propensos a la disociación en concentraciones bajas de proteína y bajo condiciones fisiológicas (Glockshuber et al., Biochemistry 29: páginas 1362 a 1367 (1990)), y por lo tanto, tienen uso limitado. Para mejorar la estabilidad y aumentar la utilidad potencial, han sido producidos y estudiados de manera extensa los fragmentos Fv (scFv) de cadena sencilla recombinante, en los cuales la terminal C del dominio VH (o VL) está unida a una terminal N del dominio VL (o VH) por medio de un enlazador péptido de longitud variable. (Para una revisión reciente, consultar la publicación de Hudson y Kortt, en J. Immunol. Meth.231: páginas 177 a 189 (1999)). Los scFvs con enlazadores mayores de 12 residuos de aminoácidos de longitud, (por ejemplo, enlazadores de 15 ó 18 residuos) permiten las interacciones entre las regiones VH y VL de la misma cadena de polipéptidos, y generalmente forman una mezcla de monómeros, dímeros (denominados diacuerpos) y cantidades pequeñas de multímeros de masa más grande (Kortt et al., Eur. J. Biochem. 221: páginas 151 a 157 (1994)). Los scFvs con enlazadores de 5 o menos residuos de aminoácidos, no obstante, prohiben la asociación intermolecular de las regiones VH y VL de la misma cadena de polipéptidos, forzando el acoplamiento con los dominios VH y VL en una cadena de polipéptidos diferente. Los enlazadores de entre 3 y 12 residuos de aminoácidos forman predominantemente dímeros (Atwell et al., Prot. Eng. 12: páginas 597 a 604 (1999)). Los scFvs con enlazadores entre 0 y 2 residuos de aminoácidos forman estructuras triméricas (denominadas triacuerpos), tetraméricas (denominados tetracuerpos) u oligoméricas más grandes; sin embargo, los patrones exactos de oligomerización parecen depender de la composición, así como de la orientación de los dominios V además de la longitud del enlazador. Por ejemplo, los scFvs del anticuerpo NC10 de anti-neuraminidasa forman predominantemente trímeros (orientación VH a VL), o tetrámeros (orientación VH a VL) con enlazadores de 0 residuos de aminoácidos (Dolezal et al., Eng. 13: páginas 565 a 574 (2000)). Los ScFvs construidos del NC10 con enlazadores de 1 y 2 residuos de aminoácidos, en la orientación VH a VL forman predominantemente diacuerpos (Atwell et al., mencionado anteriormente); en contraste, las formas de orientación VL a VH forman una mezcla de tetrámeros, trímeros, dímeros y multímeros de masa mayor (Dolezal et al., mencionado anteriormente). Los ScFvs construidos a partir de' anticuerpos HD37, anti-CD19 en la orientación VH a VL, con un enlazador de 0 residuos de aminoácidos forman exclusivamente trímeros, mientras que la misma construcción con un enlazador de un residuo de aminoácidos forma exclusivamente tetrámeros (Le Gall et al., FEBS Lett.453: páginas 164 a 168 (1999)). La asociación no covalente de dos o más moléculas scFv puede formar diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos funcionales, los cuales son multivalentes pero monoespecíficos. Los diacuerpos monoespecíficos son homodímeros de la misma scFv, en donde cada scFv comprende el dominio VH del anticuerpo seleccionado conectado a un enlazador corto del dominio VL del mismo anticuerpo. Un diacuerpo es un dímero divalente formado por la asociación no covalente de dos scFvs, produciendo dos sitios de enlace Fv. Un triacuerpo es el resultado de la formación de un trímero trivalente de tres scFvs, produciendo tres sitios de enlace, y un tetracuerpo es un tetrámero tetravalente de cuatro scFvs que da como resultado cuatro sitios de enlace. Se han hecho varios diacuerpos monoespecíficos utilizando un vector de expresión que contiene una construcción de un gen recombinante que comprende VU-VHI. (Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: páginas 6444 a 6448 (1993); Atwell et al., Mol. Immunol. 33: páginas 1301 a 1312 (1996); Holliger et al., Nature Biotechnol. 15: páginas 632 a 636 (1997); Helfrich et al., Int. J. Cáncer 76: páginas 232 a 239 (1998); Kípríyanov et al., Int. J. 77: páginas 763 a 772 (1998); Holliger et al., Cáncer Res. 59: páginas 2909 a 2916 (1-999)).. Los métodos para la construcción de las scFvs se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778 y 5,132,405. los métodos de producción de las proteínas de enlace multívalentes de proteínas monoespecíficas basadas en las scFv se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,837,242 y 5,844,094, y la Solicitud PCT WO98/44001. Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la cual los CDRs de un anticuerpo de una especie; por ejemplo, un anticuerpo de un roedor, es transferida de las cadenas pesada y ligera variables del anticuerpo del roedor a un dominio variable ligero y pesado humano. Los dominios constantes de la molécula del anticuerpo son derivados de aquellos de un anticuerpo humano. Una modalidad de la presente invención utiliza un anticuerpo monoclonal, hMN-14 para producir diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos específicos del antígeno. El hMN-14 es un anticuerpo monoclonal humanizado (MAb) que se enlaza específicamente al CEA (Shevitz et al., J. Nucí. Med. S34: página 217 (1993); y la Patente Norteamericana No. 6,254,868). Aunque el MAbs original fue múrido, los reactivos del anticuerpo humanizado son utilizados ahora para reducir la respuesta del anticuerpo anti-ratón humano. Las regiones variables de este anticuerpo fueron diseñadas en construcciones de expresión (hMN-14-scFv-L5), tal y como se describe en el ejemplo 1. Como se ilustra en la figura 1, la construcción de ácido nucleico hMN-14-scFv-L5) para expresar un diacuerpo hMN-14 codifica un polipéptido qu'e posee las siguientes características: (i) el extremo de la terminal carboxilo del VH enlazado al extremo de la terminal amino del V« mediante el enlazador péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G4S) (el uso del enlazador péptido G4S hace posible que el polipéptido secretado se dimerice en un diacuerpo formando dos sitios de enlace para CEA); (¡i) la secuencia de péptido de señal Pe1B precede el gen VH para facilitar la síntesis del polipéptido en el espacio periplásmico de E. coli; y (¡ii) seis residuos de aminoácidos de histidina (6His) son agregados a la terminal carboxilo para permitir la purificación mediante IMAC. La secuencia de codificación del ácido nucleico (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácido deducida correspondiente (SEQ ID NO:2) del hMN-14-scFv-L5 se presentan en la figura 11. La figura 1 también muestra un dibujo de figura pegada del polipéptido maduro después de la remoción proteolítica del péptido de señal pe1B, y un dibujo de figura pegada de un diacuerpo hMN-14, que incluye los sitios de enlace CEA. Un anticuerpo humano es un anticuerpo obtenido de un ratón transgénico que ha sido "diseñado" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta al reto antigénico. En esta técnica, los elementos de los lugares de la cadena pesada y ligera humanos son introducidos en cepas de ratón derivadas de las líneas de células madre embrionarias que contienen las interrupciones objetivo de los lugares de la cadena endógena pesada y ligera. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden ser utilizados para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos. Los métodos para la obtención de anticuerpos humanos de ratones transgénicos se describen en las publicaciones de Green et al., en Nature Genet. 7: página 13 (1994), Lonberg et al., en Nature 368: página 856 (1994), y Taylor et al., Int. Immun.6 página 579 (1994). Un anticuerpo completamente humano también puede ser construido mediante métodos de transfección de cromosomas o genética, así como la tecnología de despliegue del fago, y todos ellos son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, la publicación de McCafferty et al., en Nature 348 páginas 552 a 553 (1990) para la producción de anticuerpos humanos y fracciones de los mismos ¡n vitro, provenientes de los repertorios del gen del dominio variable de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. En esta técnica, los genes de dominio variable del anticuerpo son clonados en el marco dentro de, ya sea de un gen de proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, y mostrados como fragmentos de anticuerpo funcional en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de un solo hilo del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. De este modo, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. El despliegue del fago puede ser realizado en una variedad de formatos, y para su revisión, revisar la publicación de. Johnson y Chiswell, en Curr. Ópin. Struct. Biol.. 3: páginas 5564 a 5571 (1993). Los anticuerpos humanos también pueden ser generados mediante células B activadas in vitro. Ver las Patentes Norteamericanas Nos. 5,567,610 y 5,229,275, las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente descripción como referencia. Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína de enlace multivalente monoespecífica que comprende dos sitios de enlace que tienen afinidad para el mismo sitio objetivo simple (denominado un diacuerpo monoespecífico) en donde los sitios de enlace son formados por la asociación de dos fragmentos de FV (scFv) de dos cadenas simples, y en donde cada fragmento scFv comprende por lo menos 2 dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales son específicos para un antígeno asociado con el tumor. De preferencia, el antígeno asociado con el tumor es un antígeno carcinoembrionario (CEA). En modalidades adicionales, el anticuerpo monoclonal humanizado de este diacuerpo monoespecífico es el hMN-14. En dicha modalidad, cada scFv comprende de preferencia las regiones VH y VK del hMN-14. Opcionalmente, cada scFv comprende además un enlazador de aminoácidos que conecta las regiones VH y VK del hMN-14. En una modalidad preferida cada scFv comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Los vectores de expresión fueron construidos a través de una serie de procedimientos de sub-clonación señalados en la figura 1 y descritas en el ejemplo 2. El cassette de expresión para las proteínas de enlace hMN-14 monoespecíficas también se muestran esquemáticamente en la figura 1. El cassette de expresión puede estar contenido en un plásmido, el cual es un ADN de hilo doble pequeño, que forma un elemento genético de auto-duplicación extra-cromosómico en la célula huésped. Un vector de clonación es una molécula de ADN que puede duplicarse por sí misma en una célula huésped microbiana. La presente invención describe vectores que expresan diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos monoespecíficos. Una célula huésped acepta un vector para reproducción y el vector se reproduce cada vez que divide la célula huésped. Por consiguiente, la presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un diacuerpo monoespecífico, tal y como se describió. Una célula huésped generalmente utilizada es Escherichia coli (E. coli), sin embargo, otras células huésped son bien conocidas en la técnica, tales como por ejemplo, varias bacterias, células de mamíferos, células de levadura, y células de plantas. En las células de levadura, pueden ser utilizados un número de vectores conocidos para aquellos expertos en la técnica para introducir y expresar construcciones en el Saccharomyces cerevisiae (levadura de pastel), Shizosaccharomyces pombe (levadura de fisión), Pichia pastoris, y Hansenula polymorpha (levaduras metilotrópicas). Además, se consigue comercialmente una variedad de vectores de expresión de mamíferos. Además, un número de sistemas de expresión basados en víruses, tales como adenovirus y retroviruses, también pueden ser utilizados. Utilizando dichos sistemas de expresión, se pueden producir cantidades grandes de un anticuerpo recombinante utilizando los métodos de la presente invención, haciendo posible su uso como un sistema de administración viable. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una célula huésped que comprende un vector de expresión que codifica un diacuerpo monoespecífico, tal y como se describió. Cuando el cassette tal y como se muestra en la figura 1 es expresado en E. coli, algunos de los polipéptidos se duplican y forman espontáneamente diacuerpos monoespecíficos solubles. El diacuerpo monoespecífico mostrado en la figura 1 tiene dos cadenas de polipéptidos que interactúan entre ellas para formar dos sitios de enlaces CEA que tienen una afinidad para los antígenos CEA. Los antígenos son enlazados por anticuerpos específicos para formar complejos de antígeno-antícuerpo, los cuales son mantenidos juntos por las interacciones no covalentes de las moléculas del antígeno y el anticuerpo. En esta modalidad, son utilizados dos polipéptidos que comprenden la región VH del hMN-14 MAb conectados a la región VK del hMN-14 MAb por un enlazador de cinco residuos de aminoácidos. Cada polipéptido forma una mitad del diacuerpo hMN-14. La secuencia de codificación del ácido nucleico (SEQ ID NO:1), y la secuencia de aminoácidos reducida correspondiente (SEQ ID NO:2) de cada polipéptido se presentan en la figura 11.

En el caso de los triacuerpos, cuando el cassette tal y como se muestra en la figura 6 es expresado en E. coli, algunos de los polipéptidos forman espontáneamente triacuerpos monoespecíficos solubles. Los triacuerpos monoespecíficos mostrados en la figura 6 muestran tres cadenas de polipéptidos que interactúan entre ellas para formar tres sitios de enlace CEA que tienen una afinidad alta para los antígenos CEA. Cada uno de los tres polipéptidos comprende la región VH del hMN-14 MAb conectada sin enlazador con la región VK del hMN-14 MAb. Cada polipéptido forma una tercera parte del triacuerpo hMN-14. La secuencia de codificación del ácido nucleico (SEQ ID NO:5), y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente (SEQ ID NO:6), de cada polipéptido se presentan en la figura 13. Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína de enlace multivalente monoespecífica que comprende tres sitios de enlace que tiene afinidad para el mismo antígeno objetivo simple (denominada un triacuerpo monoespecífico) en donde los sitios de enlace son formados por la asociación de tres fragmentos Fv (scFv) de cadena sencilla, y en donde cada fragmento scFv comprende por lo menos dos dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. En ciertas modalidades, el anticuerpo monoclonal es específico para un antígeno asociado con el tumor. Preferentemente, el antígeno asociado con el tumor es un antígeno carcinoembrionario (CEA). En modalidades adicionales, el anticuerpo monoclonal humanizado de este triacuerpo monoespecífico es hMN-14. En dicha modalidad, cada scFv de preferencia comprende las regiones VH y VK del hMN-14. En ciertas modalidades, cada scFv comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el triacuerpo específico, y una célula huésped que comprende este vector de expresión. En el caso de los tetracuerpos, cuando el cassette es expresado en E. coli tal y como se muestra en la figura 9, algunos de los polipéptidos forman espontáneamente tetracuerpos monoespecíficos solubles. El tetracuerpo monoespecífico mostrado en la figura 9 tiene cuatro cadenas de polipéptidos que interactúan entre ellas para formar cuatro sitios de enlace CEA que tienen una alta afinidad para los antígenos CEA. Cada uno de los cuatro polipéptidos comprende el polipéptido VH del hMN-14 MAb conectado en el polipéptido VK del hMN-14 MAb por un enlazador de un solo aminoácido. Cada polipéptido forma una cuarta parte del tetracuerpo hMN-14. La secuencia de codificación de ácido nucleico (SEQ ID NO:7), y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente (SEQ ID NO.8) de cada polipéptido están contenidos en la figura 14. Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína de enlace multivalente monoespecífica que comprende cuatro sitios de enlace que tiene afinidad para el mismo antígeno objetivo simple (denominado un tetracuerpo monoespecífico), en donde los sitios de enlace son formados mediante la asociación de cuatro fragmentos Fv (scFv) de cadena simple y en donde cada fragmento scFv comprende por lo menos 2 dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. En ciertas modalidades, el anticuerpo monoclonal es específico para el antígeno asociado con el tumor. Preferentemente, el antígeno asociado con el tumor es un antígeno carcinoembrionario (CEA). En modalidades adicionales, el anticuerpo monoclonal humanizado es hMN-14. En dicha modalidad, cada scFv de preferencia comprende las regiones VH y VK del hMN-14. Opcionalmente, cada scFv comprende además un enlazador de aminoácidos que conecta las regiones VH y VK del hMN-14. En ciertas modalidades, cada scFv comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el tetracuerpo monoespecífico y una célula huésped que comprende este vector de expresión. En una modalidad preferida, los diacuerpos, triacuerpos, y tetracuerpos monoespecíficos de la presente invención son utilizados para los objetivos directos de agentes diagnósticos y terapéuticos a tumores CEA positivos. También pueden ser objetivizados otros antígenos asociados con el tumor, tales como A3, A33, BrE3, CD1, CD1a, CD3, CD5, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD45, CD74, CD79a, CEA, CSAp, EGFR, EGP-1, EGP-2, Ep-CAM, Ba 733, HER2/neu, KC4, KS-1, KS1-4, Le-Y, MAGE, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PAM-4, PSA, PSMA, RS5, S100, TAG-72, tenascina, antígeno Tn, antígenos de Thomson-Friedenreich, antígenos de necrosis de tumor, VEGF, 17-1A, un marcador de angiogénesis, una citocina, un inmuno-regulador, un marcador de oncogén y un producto de oncogén. Las moléculas monoespecíficas se enlazan selectivamente a los antígenos objetivos y conforme aumenta el número de los sitios de enlace de las moléculas, aumenta la afinidad para la célula objetivo. Una afinidad más fuerte permite que las composiciones de la presente invención permanezcan en la localización deseada que contiene el antígeno objetivo por un período de tiempo más largo. Además, las moléculas de anticuerpo libres sin enlazar son disociadas del cuerpo rápidamente, y por lo tanto minimizan la exposición de los tejidos normales a los agentes potencialmente peligrosos. Los marcadores asociados con el tumor han sido categorizados por Herberman (ver por ejemplo, "I nmunodiagnosis del Cáncer" ("Immunodiagnosis of Cáncer") en "La Bioquímica Clínica del Cáncer" ("The Clinical Biochemistry of Cáncer"), Fleisher ed., American Association of Clinical, 1979) en una cantidad de categorías que incluyen antígenos oncofetales, antígenos de placenta, oncogénicos o antígenos asociados con un virus de tumor, antígenos asociados con tejidos, antígenos asociados con órganos, hormonas ectópicas y antígenos normales o variantes de los mismos. Ocasionalmente, se utiliza de manera provechosa una sub-unidad del marcador asociado con el tumor para elevar los anticuerpos que tienen una especificidad al tumor mayor, por ejemplo, las beta-subunidades de la gonodatropina coriónica humana (HCG) o la región gama del antígeno carcinoembrionario (CEA), los cuales estimulan la producción de anticuerpos que tienen una reactividad cruzada reducida grandemente con substancias que no son del tumor, tal y como se describé en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,361,644 y 4,444,744. Los marcadores de la vasculatura del tumor (por ejemplo, VEGF), de la necrosis de tumor, de los receptores de membrana (por ejemplo, el receptor de folato, EGFR), de los antígenos transmembrana (por ejemplo, PSMA), y de los productos de los oncogenes también pueden servir como objetivos asociados con el tumor, asociados para los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos. Los marcadores de los constituyentes de la célula normal, los cuales son sobre expresados en las células del tumor tales como los antígenos de complejo de la célula B, así como las citocinas expresadas por ciertas células del tumor (por ejemplo, el receptor de IL-2 en las enfermedades de la célula T) también son objetivos adecuados para los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos de la presente invención. El anticuerpo BrE3 se describe en la publicación de Couto et al., en Cáncer Res. 55: páginas 5973s a 5977s (1995). El anticuerpo EGP-1 es descrito en la solicitud provisional de Patente Norteamericana No. 60/360,229, y algunos de los anticuerpos EGP-2 son citados en la publicación de Staib et al., en Int. J. Cáncer 92: páginas 79 a 87 (2001); y en la publicación de Schwartzberg et al., en Crit. Rev. Oncol. Hematol. 40: páginas 17 a 24 (2001 ). El anticuerpo KS-1 es citado en la publicación de Koda et al., Anticancer Res. 21: páginas 621 a 627 (2001); el anticuerpo A33 es citado en la publicación de Ritter et al., en Cáncer Res. 61: páginas 6854 a 6859 (2001); el anticuerpo B3 Le(y) se describe en la publicación de Di Cario et al., en Oncol. Rep. 8: páginas 387 a 392 (2001); y el anticuerpo A3 se describe en la publicación de Tordsson et al., en Int. J. Cáncer 87: páginas 559 a 568 (2000). También se describe el uso de anticuerpos contra marcadores o productos de oncogenes, o anticuerpos contra factores de angiogénesis, tales como VEGF. Los anticuerpos VEGF se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,342,221, 5,965,132 y 6,004,554, y están incorporadas a la presente descripción como referencia en su totalidad. Los anticuerpos contra los reguladores de ciertas respuestas inmunológicas, tales como los anticuerpos para el CD40, se describe en las publicaciones de Todryk et al., en J. Immunol. Meth. 248: páginas 139 a 147 (2001) y Turner et al., en J. Immunol. 166: páginas 89 a 94 (2001). Otros anticuerpos adecuados para la terapia de combinación incluyen anticuerpos antinecrosis, tal y como los describen Epstein et al., ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,019,368; 5,882,626; y 6,017,514.

Por consiguiente, la presente invención proporciona proteínas de enlace multivalentes monoespecíficas, tal y como se describieron, que comprenden por lo menos dos dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado específico para un antígeno asociado con el tumor asociado con la condición de enfermedad seleccionada del grupo consistente de un carcinoma, un melanoma, un sarcoma, un neuroblastoma, una leucemia, un glioma, un linfoma y un mieloma. Dichos antígenos asociados con el tumor pueden ser asociados con un tipo de cáncer seleccionado del grupo consistente de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia biliar, cáncer biliar, del pecho, cervical, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer colorrectal, del endometrio, del esófago, gástrico, de la cabeza y el cuello, linfoma de Hodgkin, del pulmón, tiroides medular, linfoma que no es de Hodgkin, cáncer del ovario, pancreático, de la próstrata y de la vesícula urinaria. Dichos antígenos asociados con el tumor pueden ser seleccionados del grupo consistente de A3, A33, BrE3, CD1, CD1a, CD3, CD5, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD45, CD74, CD79a, CEA, CSAp, EGFR, EGP-1, EGP-2, Ep-CAM, Ba 733, HER2/neu, KC4, KS-1 , KS1-4, Le-Y, MAGE, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PAM-4, PSA, PSMA, RS5, S100, TAG-72, tenascina, antígeno Tn, antígenos de Thomson-Friedenreich, antígenos de necrosis del tumor, VEGF, 17-1A, un marcador de angiogénesis, una citocina, un inmuno-regulador, un marcador del oncogén, y un producto del oncogén. En una modalidad preferida, el antígeno asociado con el tumor es un antígeno carcinoembrionario (CEA). En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal humanizado es hMN-14. Una modalidad adicional de la presente invención comprende el uso del anticuerpo de la presente invención o un fragmento del anticuerpo para la detección, diagnosis y/o tratamiento de los tejidos enfermos (por ejemplo, cánceres), que comprende la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo bivalente, trivalente o tetravalente, o un fragmento de anticuerpo que comprende por lo menos dos brazos que se enlazan específicamente al tejido objetivo. Por consiguiente, la presente invención proporciona proteínas de. enlace multivalentes monoespecíficas, tal y como se describieron, que comprenden además por lo menos un agente seleccionado del grupo consistente de un agente de diagnóstico, un agente terapéutico y combinaciones de dos o más de los mismos. Dicho agente de diagnóstico puede ser seleccionado del grupo consistente de un conjugado, un radionúclido, un metal, un agente de contraste, un agente de rastreo, un agente de detección, o combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un radionúclido de diagnóstico, dicho radionúclido es seleccionado del grupo consistente de 11C, 13N, 150, 18F, 32P, 51Mn, 52Fe, 52mMn, 55Co, 62Cu, 6 Cu, 67Cu, 67Ga, 63Ga, 72As, 5Br, 7SBr, 8 mRb, 83Sr, 8SY, 89Zr, 90?_ 94mTC i 94TCi 99mTC i 110,^ 111 , ^ 120^ 123 | > 124^ 125 | _ 131 ," 154-158Gd i 177Lu, 186Re, 188Re, un emisor gama, un emisor beta, un emisor de positrones, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas otras modalidades, dicho radionúclido es seleccionado del grupo consistente de 51Cr, 57Co, 58CO, 59Fe, 67Cu, 67Ga, 75Se, 97Ru, 99mTc, 111ln, 114mln, 123l, 125l, 131l, 169Yb, 97Hg, 201TI, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un metal, dicho metal es seleccionado del grupo consistente de gadolinio, hierro, cromo, cobre, cobalto, níquel, disporsio, renio, europio, terbío, holmio, neodimio, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un agente de contraste, el agente de contraste puede ser un agente de contraste MRI, un agente de contraste CT, o un agente de contraste de ultrasonido. Un agente de contraste puede ser seleccionado del grupo consistente de iones de agadolinio, iones de lantano, iones de manganeso, hierro, cromo, cobre, cobalto, níquel, disporsio, renio, europio, terbio, holmio, neodimio, y otros agentes de contraste que se pueden comparar o combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un agente de rastreo, el agente de rastreo es seleccionado del grupo consistente de compuestos de yoduro, compuestos de bario, compuestos de galio, compuestos de talio, bario, diatrizoato, aceite etiodizado, citrato de galio, ácido yodocármico, ácido yocetámico, yodamida, yodipamida, ácido yodoxámico, yogulamida, yohexol, yopamidol, ácido yopanóico, ácido yoprocémico, ácido yosefámico, ácido yosérico, meglubina de yosulamida, ácido yosemético, yotasul, ácido yotétrico, ácido yotalámico, ácido yotróxico, ácido yoxáglico, ácido yoxotrizoico, ipodato, meglumina, metrizamida, metrizoato, propilyodona, cloruro de talio, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un agente de detección, dicho agente de detección es seleccionado del grupo consistente de una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente, un radioisótopo, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un agente terapéutico, el agente terapéutico es seleccionado del grupo consistente de un radionúclido, un fármaco quimioterapéutico, una citocina, una hormona, un factor de crecimiento, una toxina, un inmuno-regulador y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un radionúclido terapéutico este es seleccionado del grupo consistente de 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 6 Cu, 6 Cu, 67Cu, 67Ga, 75Se, 77As, 89Sr, 90Y, "Mo, 105Rh, 109Pd, 11Ag, 111ln, 125l, 131l, 42Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 161Tb, 66Dy, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194lr, 198Au, 199Au, 2 1At, 11Pb, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra, 22 Ac, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas otras modalidades, dicho radionúclido es seleccionado del grupo consistente de 58Co, 57Ga, 80mBr, 99mTc, 103mRh, 09Pt, 111ln, 19Sb, 125l, 161IHo, 89mOs y 192lr, 152Dy> 211Ati 211Bj ( 212B¡ i 213Bi > 225Ac, 225Fm, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un fármaco quimioterapéutico, dicho fármaco quimioterapéutico es seleccionado del grupo consistente de vinca alcaloides, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabolitos, agentes de alquilación, antibióticos, inhibidores de Co.x-2, antimitóticos, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, doxorubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, campt.otecanos, mostazas de nitrógeno, sulfonatos alquilo, nitroso ureas, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complejos de coordinación de platino, hormonas, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden una toxina, dicha toxina es seleccionada del grupo consistente de ricina, abrina, ribonucleasa, , DNasa I, enterotoxina A Staphylococcal, proteína antiviral de "pokeweed", gelonina, toxina de difterina, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas, y combinaciones de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades que comprenden un inmuno-regulador, dicho inmuno-regulador es seleccionado del grupo consistente de citocinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, factores hematopoyéticos, factores de estímulo de colonias, interferones, factores de crecimiento de células madre, eritropoyetina, trombopoyetina, y combinaciones de dos o más de los mismos. Una amplia variedad de reactivos de diagnóstico y terapéuticos pueden ser conjugados de manera ventajosa a los anticuerpos de la presente invención. Los agentes terapéuticos aquí descritos son aquellos agentes que también son útiles para la administración por separado con proteínas de enlace multivalentes de la presente invención tal y como aquí se describen. Los agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos tales como vinca alcaloides, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabolitos, agentes de alquilación, antibióticos, inhibidores de Cox-2, antimitóticos, antiangiogénicos y agentes apoptóticos. Particularmente la doxorubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanos, y otros de éstas y otras clases de agentes contra el cáncer y similares. Otros fármacos quimioterapéuticos para el cáncer útiles para la preparación de los inmunoconjugados y proteínas de fusión de anticuerpos, incluyen mostazas de nitrógeno, sulfonatos alquilo, nitroso ureas, triazenos, análogos de ácido fólico, inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, complejos de coordinación de platino, hormonas y similares. Las combinaciones terapéuticas útiles pueden comprender otros agentes utilizados para el tratamiento de cánceres que producen CEA, anticuerpos HER2 (por ejemplo, Herceptina), y anticuerpos anti-EGF. Los anticuerpos para el uso combinado con las proteínas de fusión multivalentes de la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales o humanizados. En los libros "Ciencias Farmacéuticas de Remington" ("Remington Pharmaceutical Sciences") 19a Ed. (Marck Publishing Co 1995), y "Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica" ("The Pharmacological Basis Of Therapeutics") Goodman y Gilman 7a. Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985), describen agentes quimioterapéuticos adecuados adicionales, así como ediciones revisadas de estas publicaciones. Otros agentes terapéuticos adecuados, incluyen fármacos experimentales y fármacos comprendidos en los ensayos clínicos, que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. También se puede formar en complejo una toxina, tal como una Pseudomonas exotoxín, o formar una porción de agente terapéutico de un inmunoconjugado de los anticuerpos de la presente invención. Otras toxinas adecuadas empleadas en la preparación de dichos conjugados u otras proteínas de fusión, incluyen ricina, abrina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina-A Staphylococcal, proteína antivíral de "pokeweed", gelonina, toxina de difterlna, exotoxina de Pseudonomas, y endotoxina de Pseudonomas (ver por ejemplo, las publicaciones de Pastan et al., en Cell 47: páginas 641 a 648 (1986), y Goldenberg, CA Cáncer J. Clin. 44. página 43964 (1994)). Las toxinas adicionales adecuadas para utilizarlas en la presente invención son conocidas para aquellos expertos en la técnica y se describen en la Patente Norteamericana No. 6,077,499, la cual está incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia. Los agentes de diagnóstico y terapéuticos pueden incluir fármacos, toxinas, citocinas, conjugados con citocinas, hormonas, factores de crecimiento, conjugados, radionúclidos, agentes de contraste, metales, fármacos citotóxicos e inmuno-reguladores. Por ejemplo, el metal de gadolinio es utilizado para la formación de imágenes de resonancia magnética y los fiuorocromos pueden ser conjugados para la terapia fotodinámica. Además, los agentes de contraste pueden ser agentes de contraste MRI, tales como iones de gadolinio, iones de lantano, iones de manganeso, hierro, cromo, cobre, cobalto, níquel, disprosio, renio, europio, terbio, holmio, neodimio, u otros marcadores comparables, agentes de contraste CT y agentes de contraste de ultrasonido. En los métodos de la presente invención, la construcción que se puede mandar al objetivo puede comprender uno o más isótopos radioactivos útiles para la detección de tejidos enfermos. Los radionúclidos de diagnóstico particularmente útiles, incluyen pero no están limitados a 11C, 13N,150, 18F, 32P, 51Mn, 52Fe, 52mMn, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86Y, 89Zr, 90Y, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 110ln, 11ln, 20l, 123l, 124l, 125l, 131l, 54'158Gd, 177Lu, 186Re, 188Re, u otros emisores de rayos gama, beta, o de positrones, de preferencia con una energía de desintegración progresiva en el rango de 20 a 4,000 keV, más preferentemente, en un rango de 25 a 4,000 keV, y todavía más preferentemente en un rango de 2 a 1,000 keV, y aún más preferentemente en el rango de 70 a 700 keV. Las energías totales de desintegración progresiva de los radionúclidos emisores de positrones útiles, son de preferencia < 2,000 keV, más preferentemente inferiores a 1,000 keV, y aún más preferentemente de < 700 keV. Los radionúclidos útiles como agentes de diagnóstico que utilizan la detección de rayos gama incluyen, pero no están limitados a: 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 67Ga, 75Se, 97Ru, 99mTc, 1 11 | n 114m,n 123, 125? ( 131, energ¡as de desintegración progresiva de los radionúclidos emisores de rayos gama útiles son de preferencia 20-2000 keV, más preferentemente 60-600 keV, y aún más preferentemente 100-300 keV. En los métodos de la presente invención, las construcciones que se pueden mandar a un objetivo pueden comprender uno o más isótopos radioactivos útiles para el tratamiento de los tejidos de enfermos. Los radionúclidos terapéuticos particularmente útiles, incluyen pero no están limitados a, 32P, 33P, 7Sc, 59Fe, 6 Cu, 64Cu,67Cu, 67Ga, 75Se, 77As, 89Sr, 90Y, "Mo, 05Rh, 109Pd, 11Ag, 111M, 125l, 131l, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194lr, 198Au, 199Au, 211At, 11Pb, 212Bi, 212Pb, 2 Bi, 223Ra, y 225Ac. El radionúclido terapéutico preferentemente tiene una energía de desintegración progresiva en un rango de 20 a 6,000 keV, preferentemente en los rangos de 60 a 200 keV para un emisor de Barrena, de 100 a 2,500 keV para un emisor beta, y de 4,000 a 6,000 keV para un emisor alfa.

También se prefieren los radionúclidos que se desintegran substancialmente de manera progresiva con las partículas emisoras de barrena. Particularmente, dichos radionúclidos incluyen pero no están limitados a, 58Co, 67Gá, 80mBr, 99mTc, 103mRh, 109Pt, 111ln, 119Sb, 125l, 161Ho, 189mOs, y 192lr. También son preferidos los radionúclidos que tienen una desintegración substancialmente progresiva con generación de partículas alfa. Dichos radionúclidos incluyen, pero no están limitados a 152Dy, 211Ati 211 B¡ 212B j ] 213B¡ i 215p0 i 2,7^ 219Rn_ 221 ^ 223Ra 225ACi y 255Fm. Las energías de desintegración progresiva de los radionúclidos emisores de partículas alfa útiles, son de preferencia de 2,000 a 9,000 keV, más preferentemente de 3,000 a 8,000 keV, y aún más preferentemente de 4,000 a 7,000 keV. Los anticuerpos de la presente invención y los fragmentos de los mismos pueden incluir agentes de rastreo adicionales. Se utilizan radiopaco y materiales de contraste para mejorar los rayos-X y la tomografía computarizada, e incluyen compuestos de yodo, compuestos de bario, compuestos de galio, compuestos de talio, etc. Los compuestos específicos incluyen, diatrizoato, bario; aceite etiodizado, citrato de galio, ácido yocármico, ácido yocetámico, yodamida, yoditamida, ácido yodoxámico, yogulamida, yohexol, yopamidol, ácido yopanoico, ácido yoprocémico, ácido yocefámico, ácido yocérico, meglumina de yosulamida, ácido yocemétíco, yotasul, ácido yotétrico, ácido yotalámico, ácido yotróxico, ácido yoxáglico, ácido yoxotrizoico, ipodato, meglumina, metrizamida, metrizoato, propilyodona, y cloruro de talio. Los anticuerpos de la presente invención y los fragmentos de los mismos también pueden ser marcados con un compuesto fluorescente. La presencia de un MAb marcado de manera fluorescente es determinada exponiendo una proteína de enlace de antígeno objetivo a la luz de una longitud de onda apropiada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marca fluorescente incluyen, isotiocinato de fluorescina, rodamina, picoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehido y fluoroescamina. Las proteínas de enlace del antígeno marcadas de manera fluorescente son particularmente útiles para el análisis de citometría de flujo. Alternativamente, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser marcados de manera detectable acoplando la proteína de enlace a un compuesto quimioluminiscente. La presencia de un MAb marcado de manera quimioluminiscentes es determinada detectando la presencia de la luminiscencia que se origina durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de los compuestos de marca quimioluminiscente incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio, y un éster de oxalato. De manera similar, se puede utilizar un compuesto bioluminiscente para marcar los anticuerpos y fragmentos de los mismos. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrado en sistemas biológicos en los cuales la proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente es determinada detectando la presencia de la luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcado incluyen luciferina, luciferaza y aecuorina. Alternativamente, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser marcados de manera detectable enlazando el anticuerpo a una enzima. Cuando el conjugado de enzima-anticuerpo es incubado en la presencia del substrato apropiado, la porción de la enzima reacciona con el substrato para producir una porción química que puede ser detectada, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Los ejemplos de las enzimas que pueden ser utilizadas para marcar de manera detectable el anticuerpo incluyen deshidroganasa de malato, nucleasa de estafilococos, isomerasa de esteroide delta-V, deshidrogenasa de alcohol de levadura, deshidrogenasa de o glicerofosfato, isomerasa de fosfato de triosa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, esparaginasa, oxidasa de glucosa, ß-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, deshidrogenasa de glucosa-6 fosfato, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Un inmuno-regulador, tal como una citocina, puede ser también conjugado a, o formar una porción de agente terapéutico del inmunoconjugado del anticuerpo, o puede ser administrado sin conjugar a los anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos, o fragmentos de los mismos de la presente invención. Tal y como se usa en la presente descripción, el término "inmuno-regulador" incluye citocinas, factores de crecimiento de la célula madre, linfotoxinas, tales como el factor de necrosis de tumor (TNF), factores hematopoyéticos, tales como interleucinas (por ejemplo, interleucina 1 (IL-1), IL-2,. IL-3, IL-6, IL-10, IL-12 y IL-18, factores estimulantes de colonias (por ejemplo, el factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) y el factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF)), interferones, (por ejemplo interferones-a, -ß y -?), el factor de crecimiento de la célula madre designado "factor S1", eritropoyetina y trombopoyetina. Los ejemplos de las porciones inmuno-reguladoras adecuadas incluyen IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, interferón-?, TNF-a, y similares. Alternativamente, los sujetos pueden recibir anticuerpos desnudos, y una citocina administrada por separado, la cual puede ser administrada antes, concurrentemente o después de la administración de los anticuerpos desnudos. El anticuerpo también puede ser conjugado al inmuno-regulador. El inmuno-regulador también puede ser conjugado a un anticuerpo híbrido consistente de uno o más anticuerpos que se enlazan a antígenos diferentes. Un agente terapéutico o de diagnóstico puede ser adherido a la región de articulación de un componente de anticuerpo reducida por medio de la formación de un enlace de disulfuro. Como una alternativa, dichos péptidos pueden ser adheridos al componente del anticuerpo utilizando un reticulador heterobifuncional, tal como /V-succinil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), (Yu et al., Int. J. Cáncer 56: páginas 244 a 248 (1994)). Las técnicas generales para dicha conjugación son bien conocidas en el arte. Ver por ejemplo, el libro de Wong "Química de la Conjugación de Proteínas y Reticulación" ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking") (CRC Press 1991); el artículo de Upeslacis et al., en "Modificación de los Anticuerpos por Métodos Químicos" ("Modification of Antibodies by Chemical Methods"), en Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al. (eds.), páginas 187 a 230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); la publicación de Price, en "Producción y Caracterización de Anticuerpos Sintéticos Derivados de Péptidos" ("Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies") en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), páginas 60 a 84 (Cambridge University Press 1995). Alternativamente, el agente terapéutico o de diagnóstico puede ser conjugado mediante una porción de carbohidratos en la región Fe del anticuerpo. El grupo de carbohidratos puede ser utilizado para aumentar la carga del mismo péptido que está enlazado a un grupo tiol, o la porción de carbohidratos que puede ser utilizada para enlazar un péptido diferente. Estos agentes están diseñados para la diagnosis y/o el tratamiento de enfermedades en los mamíferos. Los mamíferos pueden incluir humanos, animales domésticos, mascotas, tales como perros y gatos. Las enfermedades de los mamíferos pueden incluir cánceres, tales como carcinomas, melanomas, sarcomas, neuroblastomas, leucemias, gliomas y mielomas. Los tipos de cánceres de ejemplo incluyen, pero no están limitados a cáncer biliar, del pecho, cervical, colorrectal, del endometrio, del esófago, gástrico, de la cabeza y cuello, del pulmón, de la tiroides medular, del ovario, pancreático, de la próstata y de la vesícula urinaria. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de diagnosis de la presencia de un tumor, comprendiendo el método la administración a un sujeto que se sospecha que tiene un tumor de una cantidad detectable de una proteína de enlace multivalente monoespecífica, tal y como se describió anteriormente, que comprende un agente de diagnóstico tal y como se describió, y el monitoreo del sujeto para detectar cualquier enlace de la proteína de enlace a un tumor. La presente invención proporciona además un método para el tratamiento de un tumor, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad efectiva de una proteína de enlace multivalente monoespecífica tal y como se describió, que comprende un agente de diagnóstico tal y como se describió, al sujeto que la necesita. La presente invención proporciona además un método de diagnosis de la presencia de un tumor, comprendiendo el método la administración al sujeto que se sospecha que tiene el tumor de una cantidad detectable de. una proteína de enlace multivalente monoespecífica tal y como se describió, en combinación con una porción que se puede detectar que tiene la capacidad de enlace con la proteína de enlace, y el monitoreo del sujeto para detectar cualquier enlace de la proteína de enlace a un tumor. La presente invención proporciona además un método de tratamiento de un tumor, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad efectiva de una proteína de enlace multivalente monoespecífica tal y como se describió, en combinación con un agente terapéutico al sujeto que la necesita. En las modalidades preferidas, los agentes terapéuticos son seleccionados del grupo consistente de un fármaco quimioterapéutico, una toxina, radiación externa, un agente de radiación de braquiterapia, una proteína radiomarcada, un fármaco anticáncer y un anticuerpo anticáncer. La presente invención proporciona además un método para administrar uno o más agentes de diagnóstico, uno o más agentes terapéuticos, o una combinación de dos o más de los mismos a un tumor, comprendiendo el método la administración al sujeto que necesita dicho tratamiento de una proteína de enlace multivalente monoespecífica tal y como se describió, y comprendiendo además por lo menos un agente seleccionado del grupo consistente de un agente de diagnóstico, un agente terapéutico y combinaciones de dos o mas de los mismos. La administración de un agente de diagnóstico o terapéutico a un objetivo para la diagnosis o el tratamiento de acuerdo con la presente invención, incluye proporcionar la proteína de enlace con un agente de diagnóstico terapéutico y administrar una proteína de enlace al sujeto que la necesita. La diagnosis requiera además el paso de detección de las proteínas enlazadas con técnicas conocidas. La administración de la proteína de enlace con agentes terapéuticos o de diagnóstico de la presente invención a un mamífero, puede ser por medio de inyección intravenosa, intraarterial , intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intrarraquídea, por medio de perfusión a través de un catéter regional, o por medio de la inyección intralesional directa. Cuando se administra la proteína de enlace por medio de inyección, la administración puede ser por medio de infusión continua, o por bolos simples o múltiples. La proteína de enlace con el agente terapéutico o de diagnóstico puede ser proporcionada en la forma de un equipo para el uso de diagnóstico y terapéutico de un humano o un mamífero en un vehículo de inyección farmacéuticamente aceptable, preferentemente solución salina regulada por fosfato (PBS) en un pH y concentración fisiológicos. La preparación de preferencia será estéril, especialmente si se pretende para uso en los humanos. Los componentes opcionales para dichos equipos incluyen estabilizadores, reguladores, reactivos de marca, radioisótopos, compuestos paramagnéticos, un segundo anticuerpo para una disociación mejorada, y jeringas, columnas, frascos convencionales y similares.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona un equipo para el uso terapéutico y/o de diagnóstico comprendiendo el equipo por lo menos una proteína de enlace multivalente monoespecífica tal y como se describió, comprendiendo además por lo menos un agente seleccionado del grupo consistente de agentes de diagnóstico, un agente terapéutico, y combinaciones de dos o más de los mismos, y reactivos adicionales, equipo e instrucciones de uso. EJEMPLOS Los ejemplos siguientes son ilustrativos de las modalidades de la presente invención, y no deben de ser utilizados para limitar el alcance de las reivindicaciones de modo alguno. Ejemplo 1. Construcción de plásmidos para la administración del diacuerpo hMN-14 en E. co//. Se utilizaron métodos de ADN recombinante estándar para obtener el hMN-14-scFv-L5 de la manera siguiente. Las secuencias hMN-14 VH y VK fueron amplificadas a partir de un vector construido para expresar el hMN-14 Fab' (Leung et al., Cáncer Res. 55: páginas 5968s a 5972s (1995)) utilizando la reacción de cadena de polimerasa (PCR) con polimerasa Pfu. La secuencia hMN-14VH fue amplificada utilizando los cebadores de oligonucleótidos especificados a continuación: H MN-14VH- izquierdo. 5'- CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA -3' (SEQ ID NO:9) hMN-14VH-derecho- (G4S) 5'- CATAGGATCCACCGCCTCCGGAGACGGTGACCGGGGT- 3' (SEQ ID NO:10) El cebador PCR izquierdo contiene un sitio de restricción 5' Ncol. El cebador PCR derecho contiene una secuencia para un enlazador de 5 residuos de aminoácidos (G4S) y un. sitio de restricción BamHI. El producto PCR fue digerido con Ncol y BamHI y ligado en la estructura con la secuencia de péptidos de señal pe1B, dentro de un vector pET-26b digerido por Ncol/BamHI para generar el hMN-14VHL5-pET26, la secuencia hMN-15VK fue amplificada utilizando cebadores de oligonucleotidos especificados a continuación: hMN-14VK-izquierdo 5' - CTGAGGATCCGACATCCAGCTGACCCAGAG - 3' (SEQ ID NO:11) hMN-14VK-derecho 5' - GCTACTCGAGACGTTTGATTTCCACCTTGG - 3' (SEQ ID NO:12) Los cebadores PCR izquierdo y derecho contienen los sitios de restricción BamHI y Xhol, respectivamente. El producto PCR fue digerido con Xhol y BamHI y ligado en la estructura con el enlazador hMN-14VH, G S y la secuencia 6His, dentro de una construcción de hMN-14VHL5-pET26 digerida en Xhol/BamHI, para generar el hMN-14scFv-L5 de construcción de expresión. La secuencia de ADN de esta construcción fue verificada por la elaboración de secuencias de ADN automática, y se encuentra en la lista de la figura 11. La construcción de ácido nucleico hMN-14-scFv-L5, está ilustrada en la figura 1. Ejemplo 2. Expresión del diacuerpo hMN-14 en E. coli. Se utilizó la construcción hMN-14-scFv-L5 para transformar el BL21(P-LysS) E. coli. Las condiciones del cultivo, inducción y purificación se llevaron a cabo tal y como se describirá más adelante. Las células competentes de E. coli BL21 (P-Lys-S) fueron transformadas con hMN-14-scFv-L5, por métodos estándar. Los cultivos fueron agitados en un medio 2xYT suplementado con 100 µg/ml de sulfato de canamicina, y 34 µg/ml de cloramfenicol y cultivados a una temperatura de 37°C hasta OD60o de 1.6 a 1.8. Se agrego a los cultivos un volumen igual del medio 2xYT a temperatura ambiente y suplementado con antibióticos, y sacarosa 0.8 M, los cuales fueron entonces transferidos a una temperatura de 20°C. Después de 30 minutos a una temperatura de 20°C, la expresión fue inducida mediante la adición de 40 µ?? de IPTG, y se continuó a una temperatura de 20°C durante un período de 15 a 18 horas. La expresión del diacuerpo hMN-14 fue examinada en (1) un medio condicionado para un cultivo celular; (2) proteínas solubles extractadas bajo condiciones de no desnaturalización a partir de los gránulos de células después de la centrifugación; y (3) el material insoluble permaneció en los gránulos después de varios ciclos de extracción y centrifugación. Las proteínas solubles fueron extractadas en los gránulos de las células bacterianas de la manera siguiente. Los gránulos fueron congelados y deshelados, luego se volvieron a suspender en el regulador de lisis (2% Tritón X-100; 300 mM NaCI; 10 mM de imidazol; 5 mM de MgS04; 25 unidades/ml de benzonasa; 50 mM de 'NaH2P04 (pH 8.0)) utilizando un volumen igual al 1% del volumen del cultivo. La suspensión fue homogeneizada mediante sonicación, clarificada por centrifugación y cargada sobre columnas IMAC Ni-NTA. Después de haber sido lavadas con el regulador que contiene 20 mM de imidazol, las columnas fueron eluidas con 100 mM de regulador de imidazol (100 mM imidazol; 50 mM NACI; 25 mM Tris (pH 7.5)) y el eluído fue purificado adicionalmente mediante cromatografía de afinidad por medio de enlace a un anticuerpo anti-id inmovilizado en gel Affi. El material del gránulo insoluble fue solubilizado en un regulador de enlace Ni-NTA de desnaturalización (8 M urea; 10 mM imidazol; 0.1 M NaH2P04; 10 mM Tris (pH 8.0)) y mezclados con 1 mi de agarosa Ni-NTA (Oiagen, Inc.). La mezcla fue balanceada a la temperatura ambiente durante 1 hora, y luego la resina fue layada una vez con 50 mi del mismo regulador y cargado en una columna. La columna fue lavada con 20 mi del mismo regulador seguido por 20 mi de regulador del lavado (8 M urea; 20 mM imidazol; 0.1 M NaH2P04; 10 mM Tris (pH 8.0)). Las proteínas enlazadas fueron eluidas por 5 mi de regulador de elusión de desnaturalización (8 M urea; 250 mM imidazol; 0.1 M NaH2P04; 10 mM Tris (pH 8.0)).

Las proteínas solubles que se enlazaron a y fueron eluidas de la resina Ni-NTA fueron cargadas en una columna de afinidad anti-idiotipo WI2. La columna fue lavada con PBS y los péptidos enlazados fueron eluídos con 0.1 M de glicina; 0.1 M de NaCI (pH 2.5), e inmediatamente neutralizados. Aunque la mayor parte del hMN-14scFv expresado estaba presente como una proteína insoluble, aproximadamente 1.5 mg/L del cultivo del hMN-14scFv soluble fue purificado a partir de la fracción soluble. Como se muestra por medio de la cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC), se observó un pico predominante (ver figuras 2A y 2B) a los 9.8 minutos para el IMAC purificado, así como para el material purificado por afinidad. El tiempo de retención del h.MN-14 Fab', el cual tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, fue de 9.75 minutos tal y como se indicó en el eje-x de la figura 2B. Un tiempo de retención muy similar del hMN-14scFv indica que existe la solución como un dímero o diacuerpo, ya que el peso molecular calculado del hMN-14scFv monomérico es de 26kDa. El análisis de ¦gel SDS-PAGE (ver la figura 3A) muestra una sola banda de un tamaño pronosticado en 26 kDa, el análisis del gel (IEF) con enfoque isoeléctrico (ver figura 3B) produce una banda con Pl de 8.2, cerca al pl de 7.9 calculado. Un análisis de ELISA competitivo mostró que el diacuerpo hMN-14 es funcional y que muestra excelentes propiedades de enlace. Los ratones desnudos portadores del tumor CEA GW-39 positivo fueron inyectados con e! diacuerpo hMN-14 marcados 31l, y la biodistribución fue analizada en diferentes tiempos después de la inyección. Aunque una cantidad importante del diacuerpo permaneció asociado con el tumor por más de 9'6 horas, mucho del diacuerpo libre disoció la sangre rápidamente, tal y como se ilustra en la figura 4. La figura 5 muestra el porcentaje de la dosis inyectada que está asociada con el tumor y con el tejido normal, tal como del hígado, bazo, riñon, pulmones, sangre, estómago, intestino delgado e intestino grueso, a las 48 horas posteriores a la inyección. La cantidad de la dosis inyectada en cada tejido normal es muy baja cuando se compara con la cantidad del tumor. La tabla 1 resume las cantidades relativas de actividad aumentada en el tumor sobre los tejidos de tumor de la lista en las horas 24, 48 y 72 (por ejemplo, a las 24 horas, el tumor tenía 22.47 veces de radioactividad de la que tenia el hígado). Tabla 1. Proporciones de tumor a no tumor 24 horas 48 horas 72 horas Tumor 1.00 1.00 1.00 Hígado 22.47 31.85 28.32 Bazo 25.41 39.51 41.03 Riñon 9.12 12.12 10.54 Pulmón 15.49 25.70 . 31.75 Sangre 9.84 17.32 21.80 Estómago 9.98 17.50 23.13 Intestino Delgado 37.23 65.60 50.58 Intestino Grueso 35.87 66.54 45.66 Ejemplo 3 - Construcción de un plásmido para la expresión del triacuerpo hMN-14 Fue diseñada, producida y probada una construcción del plásmido hMN-14scFv, hMN-14-0. El plásmido de expresión de E. coli dirige la síntesis de un solo péptido que posee las siguientes características: (1) el extremo de la terminal carboxilo del hMN- 14VH está enlazado directamente al extremo de la terminal amino del hMN-14VK sin aminoácidos adicionales algunos (el uso del enlazador cero hace posible que el polipéptido secretado forme una estructura trimérica denominada un triacuerpo, formando tres sitios de enlace para CEA) (2) una secuencia del péptido de señal pe1B precede al gen VH para facilitar la síntesis del polipéptido en el espacio periplásmico del E. coli; (3) se agregan seis residuos de histidina (6His) a la terminal carboxilo para permitir la purificación · por medio de IMAC. La figura 6 se muestra en una representación esquemática del polipéptido y el triacuerpo. Se utilizaron métodos estándar de ADN recombinante para obtener la construcción hMN-14-0. Las secuencias del hMN-14 VH y V« fueron purificadas a partir de la construcción hMN-14scFv-L5, utilizando PCR con polimerasa Pfu. La secuencia del hMN-14VH fue amplificada utilizando los cebadores de oligonucleótidos especificados a continuación. hMN-14VH- Izquierdo 5'-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3' (SEQ ID NO:13) hMN-14VH-0 Derecho 5'-GATATCGGAGACGGTGACCGGG-3' (SEQ ID NO:14) El cebador PCR izquierdo, el cual fue utilizado anteriormente para la construcción del hMN-14scFv-L5 contiene un sitio de restricción 5' Ncol. El cebador PCR derecho contiene el sitio de restricción EcoRV. El producto PCR fue clonado dentro de un vector pGemT de clonación PCR (Promega). La secuencia del hMN-14VK fue amplificadA utilizando los cebadores de oligonucleótidos especificados a continuación: hMN-14VK-0 Izquierdo 5'-GATATCCAGCTGACCCAGAGCC-3' (SEQ ID NO:15) h N-14VK Derecho 5'-GCTACTCGAGACGTTTGATTTCCACCTTGG-3' (SEQ ID NO:16) El cebador PCR izquierdo contiene un sitio de restricción EcoRV. El cebador derecho, el cual fue utilizado anteriormente para la construcción del hMN-14scFv-L5 contiene un sitio de restricción Xhol. El producto PCR fue clonado dentro del vector pGemT. La secuencia VK-0 fue suprimida a partir de la construcción VK-0-pGemT con EcoRV y Salí y ligado dentro de los mismos sitios de la construcción VH-0-pGemT para generar el hMN-14-0 en el pGemT. La secuencia VH-VK fue suprimida con Ncol y transferida al Pet26B para generar la construcción de expresión del triacuerpo hMN- 4 hMN-14-0. La secuencia de ADN de esta construcción fue verificada por medio de la formación automatizada de las secuencias de ADN, y se encuentra en la lista de la figura 13. La construcción de ácido nucleico, hMN-14scFv-0 está ilustrada en la figura 6. Ejemplo 4- Expresión del triacuerpo hMN-14 en E.coli La construcción hMN-14-0 fue utilizada para transformar el BL21(P-LysS) E. coli. Las condiciones del cultivo, inducción y purificación se llevaron a cabo de manera similar a las que se describieron para el diacuerpo hMN-14 del ejemplo 2, excepto que el triacuerpo hMN-14-0 fue purificado por medio de cromatografía de intercambio de aniones Q-Sepharose, en vez de cromatografía de afinidad. Tal y como se esperaba el hMN-14-0 formó predominantemente triacuerpos (~80kDa). Se purificaron aproximadamente 2.4 mg/L del cultivo de la solución del triacuerpo hMN-14 a partir de una fracción soluble de la célula de los cultivos inducidos. Tal y como lo muestra la HPLC por exclusión de tamaño (ver Figura 7), se observó un pico predominante a los 9.01 minutos para el material purificado por IMAC, y la cromatografía de intercambio de aniones mono-Q. Para comparación, los tipos de retención del diacuerpo hMN-14 (-52 kDa) y hMN-14 F(as')2 (-100 kDa) fueron de 9.6 minutos y 8.44 minutos, respectivamente. El hecho de que el tiempo de retención del hMN-14-0 sea exactamente de la mitad entre aquellos de las proteínas de 52 kDa y 100 kDa indica que existe en la solución un trímero o triacuerpo; debido a que el peso molecular calculado del polipéptido hMN-14-0 monomérico es de -26 kDa.

Indudablemente, el análisis SDS-PAGE muestra una sola banda del péptido de 26 kDa pronosticado. Los ratones desnudos portadores del tumor GW-39 CEA positivos fueron inyectados con el triacuerpo hMN-14 marcado 131l, y la biodistribución fue analizada en diferentes tiempos después de la inyección. La figura 8, muestra la asimilación del tumor del triacuerpo hMN-14 y la retención que son notoriamente más altas que las del diacuerpo hMN-14. Después de una hora, el triacuerpo se acumula en el tumor en aproximadamente 60% del nivel del diacuerpo. Sin embargo, aunque el diacuerpo disminuye establemente después de una hora, la asimilación del tumor del triacuerpo aumenta un nivel máximo logrado entre las 24 y las 48 horas. La asimilación del tumor máxima del cuerpo (de 24 a 48 horas) es más de dos veces la asimilación del diacuerpo (1 hora). La retención del tumor también es significativamente más larga para el triacuerpo comparada con el diacuerpo, ya que el triacuerpo puede exhibir enlaces trivalentes del tumor utilizando todos los tres sitios de enlace CEA. Un factor adicional que probablemente tenga una influencia importante en la asimilación del tumor, es. el tamaño molecular. Tal y como se ilustra en la figura 8, la disociación en la sangre para el triacuerpo de 80 kDa es mucho más lenta que la del triacuerpo de 54 kDa. Esto le permite al triacuerpo un tiempo mucho más largo para interactuar con el tumor, comparado con el diacuerpo, y por lo tanto, lograr niveles más altos de asimilación en el tumor. La disociación en la sangre demorada del triacuerpo indudablemente contribuye a su residencia superior en el tumor. Sin embargo, también pueden contribuir otros factores, incluyendo la avidez aumentada de vida a la multivalencia o la estabilidad mejorada ¡n vivo. Las proporciones de tumor a no tumor aumentaron con el tiempo para todos los tejidos (tabla 2). Las proporciones fueron substanciales en los puntos del último tiempo. Tabla 2. Proporciones de tumor a no tumor para el triacuerpo hMN-14 24 horas 48 horas 72 horas Hígado 15.7 45.9 110.3 Bazo 13.7 39.9 96.9 Riñon 8.4 25.2 52.8 Pulmón 6.0 18.7 44.4 Sangre 3.4 12.4 54.8 Estómago 11.3 15.0 62.4 Intestino Delgado 28.3 78.5 204.7 Intestino Grueso 40.3 105.0 195.1 Ejemplo 5 - Construcción de plásmidos para la expresión de los tetracuerpos hMN-14. Se diseñó, produjo y probó una construcción de plásmido hMN-14scFv, hMN-14-IG. El plásmido de expresión E. coli dirige la síntesis de un solo polipéptido que posee las siguientes características: (1) el extremo de la terminal carboxílo de la hMN-14VH está enlazado al extremo de la terminal amino de la hMN-14VK por un solo residuo de glicina (el uso del enlazador IG hace posible que algo del polipéptido secretado forme una estructura tetramérica denominada un tetracuerpo, formando cuatro sitios de enlace para CEA); (2) una secuencia del péptido de señal pe1B precede al gen VH para facilitar la síntesis del polipéptido en el espacio periplásmico del E. coli; y (3) se agregan tres residuos de histidina (6His) a la terminal carboxilo para permitir la purificación por IMAC. En la figura 9 se muestran representaciones esquemáticas del polipéptido y el tetracuerpo. Se utilizaron métodos estándar de ADN recombinante para obtener la construcción del hMN-14-1 G. Las secuencias hMN-14-VH y VK fueron amplificadas a partir de la construcción hMN-14-14scFv-L5, utilizando PCR con polimerasa Pfu. La secuencia hMN-14VH fue amplificada utilizando los cebadores de oligonucleótidos que se especifican a continuación: hMN-14VH-lzquierdo 5'-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3' (SEQ ID NO:17) hMN-14VH-1G Derecho 5'-GCTGGATATCACCGGAGACGGTGACCGGGGTCC-3' (SEQ ID NO:18) El cebador PCR izquierdo, el cual fue utilizado anteriormente para la construcción del hMN-14scFv-L5, contiene un sitio de restricción 5' Ncol. El cebador PCR derecho contiene la secuencia de codificación por una sola glicina y un sitio de restricción EcoRV. El producto PCR fue clonado dentro del vector pGemT de clonación PCR (Promega). La secuencia del hMN-14VK-0 (ver ejemplo 3) fue suprimida a partir de la construcción hMN-14VK-0-pGemT con EcoRV y Salí y ligado dentro de los mismos sitios de la construcción hMN-14VH-0-pGemT para generar el hMN-14-1G en el pGemT. La secuencia VH-1G-VK fue suprimida con Ncol y Xhol y transferida al pET26b para generar la construcción de expresión del tetracuerpo hMN-14, hMN-14-1 G. La secuencia de ADN de esta construcción fue verificada por el formador automatizado de secuencias de ADN, y se encuentra en la lista de la figura 14. La construcción del ácido nucleico, hMN-14scFv-1 G, se ilustra en la figura 9. Ejemplo 6 - Expresión de tetracuerpos hMN-14 en E. coli Fue usada la construcción hMN-14-1G para transformar el BL21(P-LysS) E. coli. Las condiciones del cultivo, inducción y purificación se llevaron a cabo de manera similar a las que se describen para el diacuerpo hMN-14 del ejemplo 2, excepto que el tetracuerpo hMN-14 fue purificado por cromatografía de intercambio de aniones Q-Sepharose, en vez de cromatografía por afinidad. Los niveles de expresión soluble fueron altos, niveles mayores de 2 mg del producto soluble fue aislado por litro del cultivo. El análisis HPLC de exclusión por tamaño (ver figura 10) demostró que el producto hMN-14-1G existe como una mezcla de diacuerpo (53 kDa), triacuerpo (80 kDa) y tetracuerpo (105 a 120 kDa). El tetracuerpo podría ser aislado en una forma relativamente pura mediante cromatografía de filtración de gel.

Sin embargo, después de varios días a una temperatura de 2 a 8°C, éste se revirtió gradualmente a una mezcla del diacuerpo, triacuerpo y tetracuerpo similar a la que se muestra en la figura 10. Ejemplo 7 - Asimilación del Tumor del Diacuerpo, Triacuerpo y Tetracuerpo hMN-14 La llegada al objetivo del tumor fue evaluada en ratones portadores de xenoinjertos del tumor de colon humano CEA positivos utilizando muestras radioyodinadas. A las 24 horas, el diacuerpo (obtenido del hMN-14-L5) mostró el 2.7% de la dosis por gramo inyectado (ID/g) en el tumor, 0.3% en la sangre y del 0.1 al 0.4% en todos los otros órganos. Para el triacuerpo (obtenido del hMN-14-0), la asimilación del tumor fue de 12.0, 12.2, 11.1 y 7.1% ID/g a las 24, 48, 72 y 96 horas, respectivamente, aumentando las proporciones de tumor a sangre de 3.4 a las 24 horas, a 12.4 a las 48 horas, y hasta 55 a las 96 horas. El tetracuerpo (obtenido del hMN-14-1G) mostró la asimilación del tumor más alta entre las tres, alcanzando el 25.4% ID/G a las 24 horas, con una proporción de tumor a sangre de 3.9, y disminuyendo a 17.1% a las 72 horas, con una proporción de tumor a sangre de 29.3. Estos resultados de biodistribución están de acuerdo con el tamaño molecular respectivo y la multivalencia de los tres agentes basados en scFv, todos ellos y en particular, el triacuerpo hMN-14, son especialmente útiles para la formación de imagen y aplicaciones terapeúticas.

Aunque la presente invención ha sido descrita y ejemplificada con suficiente detalle para aquellos expertos en la técnica para que la puedan hacer y utilizar, se podrán apreciar varias alternativas, modificaciones y mejoras sin salirse del espíritu y alcance de la presente invención. La presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y para obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos inherentes a los mismos. Los ejemplos aquí proporcionados son representativos de las modalidades preferidas, son de ejemplo, y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán modificaciones y otros usos de los mismos. Estas modificaciones están comprendidas dentro del espíritu de la presente invención, y están definidos por el alcance de las reivindicaciones. La descripción de todas las publicaciones citadas anteriormente están expresamente incorporadas a la presente descripción en su totalidad hasta el mismo punto como si cada una de ellas fuera incorporada como referencia individualmente.

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Una proteína de enlace multivalente monoespecífica que comprende dos o más sitios de enlace que tienen afinidad para el mismo antígeno objetivo simple, en donde los sitios de enlace son formados por la asociación de dos o más fragmentos Fv (scFv) de una sola cadena, y en donde cada fragmento scFv comprende por lo menos 2 dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humanizado o humano.
2.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo monoclonal es específico para un antígeno asociado con un tumor.
3. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor está asociado con una condición de enfermedad seleccionada del grupo consistente de un carcinoma, un melanoma, un sarcoma, un neuroblastoma, una leucemia, un glioma, un linfoma y un mieloma.
4. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor está asociado con un tipo de cáncer seleccionado del grupo consistente de leucemia aguda linfoblástica, leucemia aguda mielógena, cáncer biliar, del pecho, cervical, leucemia crónica linfocí.tica, leucemia crónica mielógena, cáncer colorrectal, del endometrio, del esófago, gástrico, cabeza y cuello, linfoma de Hodgkin, cáncer de pulmón, de la tiroides medular, linfoma que no es de Hodgkin, cáncer del ovario, pancreático, de la próstata y vesícula urinaria.
5.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor es seleccionado del tipo consistente de A3, A33, BrE3, CD1, CD1a, CD3, CD5, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD45, CD74, CD79a, CEA, CSAp, EGFR, EGP-1, EGP-2, Ep-CAM, Ba 733, HER2/neu, KC4, KS-1, KS1-4, Le-Y, MAGE, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PASM-4, PSA, PSMA, RS5, S100, T101, TAG-72, tenascina, antígeno Tn, antígenos de Thomson, Friedenreich, antígenos de necrosis de tumor, VEGF, 17-1A, un marcador de angiogénesis, una citocina, un inmuno-regulador, un marcador del oncogén y un producto del oncogén.
6.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor es un antígeno carcinoembrionario (CEA).
7. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizada porque el anticuerpo monoclonal humanizado es hMN-14.
8. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 1, la cual comprende además por lo menos un agente seleccionado del grupo consistente de un agente de diagnóstico, un agente terapéutico y combinaciones de dos o más de los mismos.
9. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque el agente de diagnóstico es seleccionado del grupo consistente de un conjugado, un radionúclido, un metal, un agente de contraste, un agente de rastreo, un agente de detección y combinaciones de dos o más de los mismos.
10. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el radionúclido es seleccionado del grupo consistente de 11C, 13N, 150, 8F, 32P, 51Mn, 52Fe, 52mMn, 55Co, 6 Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 75Br, 82mRb, 83Sr, 86Y, 89Zr, 90Y, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 110ln, 111ln, 120l, 1 3l, 124l, 125| i 131 , ( 154-158Gd ] up emjs£)r gamai un emiSOr beta, un emisor de positrones, y combinaciones de dos o más de los mismos.
11.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el radionúclido es seleccionado del grupo consistente de 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, "Ga, 75Se, 97Ru, 99mTc, 111ln, 114mln, 123l, 125l, 131l, 169Yb, 197Hg, 201T1, y combinaciones de dos o más de los mismos.
12.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el metal es seleccionado del grupo consistente de gadolinio, hierro, cromo, cobre, cobalto, níquel, disprosio, renio, europio, terbio, holmio, neodimio, y combinaciones de dos o más de los mismos.
13.-. La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el agente de contraste es un agente de contraste MRI.
14. - La proteina de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el agente de contraste es un agente de contraste CT.
15. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el agente de contraste es un agente de contraste de ultrasonido.
16. -. La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el agente de contraste es seleccionado del grupo consistente de iones de gadolinio, iones de lantano, iones de manganeso, hierro, cromo, cobre, cobalto, níquel, disprosio, renio, europio, terbio, holmio, neodimio, otros agentes de contraste comparables y combinaciones de dos o más de los mismos.
17. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el agente de rastreo es seleccionado del grupo consistente de compuestos de yoduro, compuesto de bario, compuestos de galio, compuestos de ta I i o , bario, dlatrizoato, aceite etiodizado, citrato de galio, ácido yocármico, ácido yocetámico, yodamida, yodipamida, ácido yodoxamico, yogulamida, yohexol, yopamidol, ácido yopanoico, ácido yoprocémico, ácido yosefámico, ácido yoséríco, meglumina de yosulamina, ácido yosémico, yotasul, ácido yotétríco, ácido yotalámico, ácido yotróxico, ácido yoxáglico, ácido yoxotrizoico, i pod ato , meglumina, metrizamida, metriozoato, propilyodona, cloruro de talio, y combinaciones de dos o más de los mismos.
18. - La protema de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque el agente de detección es seleccionado del grupo consistente de una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente, un radioisótopo y combinaciones de dos o más de los mismos.
19. - La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el agente terapéutico es seleccionado del grupo consistente de un radionúclido, un fármaco quimioterapéutico, una citocina, una hormona, un factor de crecimiento, una toxina, un inmuno-regulador, y combinaciones de dos o más de los mismos.
20.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el radionúclido es seleccionado del grupo consistente de 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 62Cu, 6 Cu, 67Cu, 67Ga, 75Se, 77As, 89Sr, 90Y, "Mo, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 1 1 n , 125l, 131l, 142Pr, 1 3Pr, 149Pm, 53Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 169Er, 177Lu, 86Re, 188Re, 189Re, 19 lr, 198Au, 199Au, 1At, 211Pb, 12Bi, 2 2Pb, 2 3Bi, 23Ra, 2 5Ac, y combinaciones de dos o más de los mismos.
21.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el radionúclido es seleccionado del grupo que consiste de 58Co, 67Ga, 80mBr, 99mTc, 103mRh, 109Pt, 111ln, 119Sb, 125l, 161Ho, 189mOs, y 192lr, 152Dy, 211At, 211Bi, 212Bi, 2 3Bi, 15Po, 7At, 219Rn, 22 Fr, 223Ra, 225Ac, 255Fm, y combinaciones de dos o más de los mismos.
22.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el fármaco quimioterapéutico es seleccionado del grupo consistente de vinca alcaloides, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabolitos, agentes de alquilación, antibióticos, inhibidores de Cox-2, antimicóticos, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, doxorubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanos, mostazas de nitrógeno, sulfonatos alquilo, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complejos de coordinación de platino, hormonas y combinaciones de dos o más de los mismos.
23.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizada porque la toxina es seleccionada del grupo consistente de ricina, abrina, ribonucleasa, DNasa I, enterotoxina A Staphyloicoccal, proteína antiviral de "pokeweed" , gelonina, toxina de difterina, exotoxina de Pseudomonas, endotoxinas de Pseudomobnas y combinaciones de dos o más de los mismos.
24.- La proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizada porque el inmuno-regulador es seleccionado del grupo consistente de citocinas, factores de crecimiento de la célula madre, línfotoxínas, factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias, interferones, factores de crecimiento de células madre, . eritropoyetina, trombopoyetina, y combinaciones de dos o más de los mismos.
25. - Una proteína de enlace multivalente monoespecífica que comprende dos sitios de enlace que tienen afinidad para el mismo antígeno objetivo simple (denominada un diacuerpo monoespecífico), en donde los sitios de enlace son formados mediante la asociación de dos fragmentos Fv (scFv) de una sola cadena, y en donde cada fragmento scFv comprende por lo menos dos dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humanizado o humano.
26. -- El diacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es específico para un antígeno asociado con el tumor.
27.- El diacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque el antígeno asociado con el tumor es un antígeno carcinoembrionario (CEA).
28. -. El diacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal humanizado es hMN-14.
29. - El diacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizado porque el scFv comprende las regiones VHy VK del hMN-14.
30. - El diacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque cada scFv comprende además un enlazador de aminoácidos que conecta las regiones VH y VK del h'MN-14.
31. - El diacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 30, caracterizado porque cada scFv comprendeja secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
32. - Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el diacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 25.
33. - Una célula huésped que comprende el vector de expresión tal y como se describe en la reivindicación 32.
34. - Una proteína de enlace multivalente monoespecífica que comprende tres sitios de enlace que tienen afinidad para el mismo antígeno objetivo simple (denominada un triacuerpo monoespecífico), en donde los sitios de enlace son formados mediante la asociación de tres fragmentos Fv (scFv) de una cadena simple, y en donde cada fragmento scFv comprende por lo menos dos dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humanizado o humano.
35. - El triacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es específico para un antígeno asociado con el tumor.
36. - El triacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 35, caracterizado porque el antígeno asociado con el tumor es un antígeno carcinoembrionario (CEA).
37.- El triacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal humanizado es hMN-14.
38. - El triacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 37, caracterizado porque cada scFv comprende las regiones VH y VK del hMN-14.
39. - El triacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque cada scFv comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.
40. - Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican el triacuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 34.
41. - Una célula huésped que comprende el vector de expresión tal y como se describe en la reivindicación 40.
42. - Una proteína de enlace multivalente monoespecífica que comprende cuatro sitios de enlace que tienen afinidad para el mismo antígeno objetivo simple (denominada un tetracuerpo monoespecífico), en donde los sitios de enlace son formados mediante la asociación de cuatro fragmentos Fv (scFv) de cadena simple, en donde cada fragmento scFv comprende al menos 2 dominios variables derivados de un anticuerpo monoclonal humanizado o humano.
43. - El tetracuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 42, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es específico para un antígeno asociado con el tumor.
44.- El tetracuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque el antígeno asociado con el tumor es un antígeno carcinoembrionario (CEA).
45. - El tetracuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 42, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal humanizado es hMN-14.
46. - El tetracuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque cada scFv comprende las regiones VH y VK del hMN-14.
47. - El tetracuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque cada scFv comprende además un enlazador de aminoácidos que conecta las regiones VH y VK del hMN-14.
48. - El tetracuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 47, caracterizado porque cada scFv comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8.
49. - Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican el tetracuerpo monoespecífico tal y como se describe en la reivindicación 42.
50. - Una célula huésped que comprende el vector de expresión tal y como se describe en la reivindicación 49.
51. - Un método de diagnosis de la presencia de un tumor, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad detectable de la proteina de enlace tal y como se describe en la reivindicación 9 a un sujeto que se sospecha que tiene un tumor, y el monitoreo del sujeto para detectar cualquier enlace de la proteína de enlace a un tumor.
52. - Un método de tratamiento de un tumor, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad efectiva de la proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 19, a un sujeto que necesita la misma.
53. - Un método de diagnosis de la presencia de un tumor, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad de la proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 1, en combinación con una porción que se puede detectar que tiene la capacidad de enlace con la proteína de enlace, a un sujeto que sospecha que tiene un tumor, y el monitoreo del sujeto para detectar cualquier enlace de la proteína de enlace a un tumor.
54. - Un método de tratamiento de un tumor, comprendiendo el método la administración de una cantidad efectiva de la proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 1 en combinación con un agente terapéutico, a un sujeto que necesita dicho tratamiento.
55. - Un método tal y como se describe en la reivindicación 54, caracterizado porque el agente terapéutico es seleccionado del grupo consistente de un fármaco quimioterapéutico, una toxina, radiación externa, un agente de radiación de braquiterapia, una proteína radiomarcada, un fármaco anticáncer y un anticuerpo anticáncer.
56. - Un método para administrar uno o más agentes de. diagnóstico, uno o más agentes terapéuticos, o una combinación de dos o más de los mismos a un tumor, comprendiendo el método la administración de la proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 8, a un sujeto que necesita dicha administración.
57.- Un equipo para el uso terapéutico y/o diagnóstico, comprendiendo el equipo por lo menos una proteína de enlace tal y como se describe en la reivindicación 8, y reactivos adicionales, equipo e instrucciones para el uso.