JPWO2007052356A1 - 抗菌活性物質dm0507およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)を培養し、
(b)得られた培養物から上清を回収し、
(c)上清のpHを3以下に調整して生じた沈殿物を回収し、
(d)沈殿物からエタノールで抽出する
を含む製造方法により得られることを特徴とする抗菌活性物質DM0507である。
(a)バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)を培養し、
(b)得られた培養物から上清を回収し、
(c)上清のpHを3以下に調整して生じた沈殿物を回収し、
(d)沈殿物からエタノールで抽出する
を含むことを特徴とする抗菌活性物質DM0507の製造方法である。
(a)バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)を培養し、
(b)得られた培養物を遠心した後、上清を回収し、
(c)上清のpHを3以下に調整して生じた沈殿物を回収し、
(d)沈殿物からエタノールで抽出する。
(A)群(好気性・通性嫌気性微生物)
ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)
ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)
バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)ATCC6633
バチルス・セレウス バー ミコイデス(Bacillus cereus var. mycoides)
ATCC11778
アルカノバクテリウム・ピオゲネス(Arcanobacterium pyogenes)
エロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)
エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス
(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434
アクチノバチルス・プレウロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)2型
ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)
パスツレラ・ムルトシーダ(Pasteurella multocida)D型
パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)
サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)
サルモネラ・コレラスイス(Salmonella Choleraesuis)
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)ATCC10031
アシネトバクター・ジュニー(Acinetobacter junii)
アシネトバクター(Acinetobacter sp.)
ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)
レジオネラ・ニューモフィラ セロタイプ1(Legionella pneumophila serotype 1)
マイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum)
マイコプラズマ・シノビエ(Mycoplasma synoviae)
(B)群(微好気性微生物)
カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)
カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)ATCC43526
(C)群(偏性嫌気性微生物)
クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)
クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)
プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)JCM6425
バクテロイデス・フラジリス (Bacteroides fragilis)
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingvalis)JCM8525
タンネレラ・フォーサイセンシス(Tannerella forsythensis)JCM10827
ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)JCM1132
ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)JCM1255
アナエロコッカス・プレボッティ(Anaerococcus prevotii)JCM6508
フソバクテリウム・ヌクレアートム(Fusobacterium nucleatum)
(D)群(真菌)
フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)
測定は1検体当たり2系列行い、DM0507の濃度段階は10倍希釈から2倍段階希釈していき10240倍までとする。まず2価イオン調整ミュラーヒントンブロス(以下CAMHBと記す)を96ウェル、平底のマイクロプレートに100μlずつ分注する。DM0507を入れる最初のウェルにはCAMHBを180μl分注する。次に最初のウェルにDM0507を20μl入れ10倍希釈とし、100μlずつ10240倍まで2倍段階希釈していく。アシネトバクター・ジュニーは前日に分離培養し、18〜24時間MHAで培養しておく。寒天培地の新鮮培養菌を生理食塩水でマクファーランド0.5に調整後10倍希釈し、107cfu/mlに調整する。調整した菌液を5μlずつ各ウェルに接種する。最終的な接種濃度は5×105cfu/ml(5×104cfu/100μl)となる。コントロールとしてCAMHBと菌液のみのウェル及び、CAMHBだけのウェルを作成する。マイクロプレートを35℃で18時間培養後、肉眼的にみて完全に発育が阻止された最少希釈倍数をMIC値とする。
外用薬、歯磨き(練り歯磨き、粉歯磨き、水歯磨き)、歯間ブラシ、うがい剤、口内炎などの消毒薬、入れ歯用品(洗浄、粘着、殺菌、消毒、消臭)、浴用剤、薬用石鹸、口唇保護剤、爪保護剤、外皮消毒剤、うおの目・たこ用剤、傷消毒剤ただれ・あせも防止剤、ひび・あかぎれ用剤、かさつき・あれ用剤頭皮・頭皮用剤、フケ・かゆみ用剤、腋下用剤
<日用品、トイレタリー、繊維・皮革商品等>
おむつ、台所用品、トイレタリー用品、石鹸・カーボンファイバー・布・皮などに含浸した製品
<洗浄剤等>
衛生綿類(紙製品も含む)、シャンプー、リンス、生理処理用品、コンタクトレンズ洗浄剤
<化粧品等>
化粧水、乳液、クレンジング、エステ剤、パック、クリーム・ハンドクリーム、化粧用油、ひげ剃り用剤、日焼け止め剤
<消毒剤、殺菌剤等>
循環式大衆浴場・温泉殺菌剤、プール殺菌剤、チラー(冷却水)用剤、クーラーなどフィルター用剤
<建材、塗料等>
木材、紙、油性ペンキ、水性ペンキ、クロス、接着剤、たたみ、塗装保護剤
<食品添加物等>
保存料(飲料を含む)
抗菌活性物質産生菌のスクリーニング:
以下のバチルス・ズブチルス培養上清の抗菌活性をポルフィロモナス・ジンジバーリス(Porphyromonas gingivalis)JCM8525の増殖阻害活性を指標として測定した。
・DB9011株(FERM BP−3418として1991年5月21日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託済み))
・ATCC 6633株
・BN1001株(明治製菓株式会社製:ビーエヌクリーン(商品名))
・Kubota株(株式会社あさひバイオテック社製:BSK菌)
・OUV23481株(ミツカン株式会社製:金のつぶほね元気(商品名))
・MBI600株(beckerunderwood Inc.製:SUBTILEX(商品名))
抗菌活性物質DM0507の製造:
(1)DB9011株の培養
斜面培地に発育させ冷蔵庫に保存してあるDB9011株をミュラーヒントンS寒天培地(栄研化学株式会社製)に継代し、35℃で24時間培養してコロニーを形成させた。次に、ミュラーヒントンブロス(DIFCO製)10mlに上記1コロニーを接種し、35℃で24時間振盪培養した。最後に、前記培養液1mlを予め高圧蒸気滅菌しておいた3Lのミュラーヒントンブロスに接種し、35℃で30時間、200rpmの条件で振盪培養を行い培養液を得た。
上記(1)で調製した培養液3Lを4℃に維持したまま20,000rpmで30分間遠心分離し、その遠心上清を回収した。次に、遠心上清に10Nの塩酸を添加してpH3に調整後、冷蔵庫で一晩静置した。静置後の上清を更に4℃に維持したまま20,000rpmで30分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を回収した。その沈殿にエタノール(99.5質量%)10mlを加えて浮遊させ、15分程度静置して抗菌活性物質DM0507を抽出した。この抗菌活性物質DM0507は、更に4℃に維持したまま20,000rpmで30分間遠心分離し、上清に1Nの水酸化ナトリウムを添加しpH7.0に調整後、0.45μmのフィルターでろ過し、−80℃で冷凍保存した。
<IR測定>
DM0507を以下の条件でIR測定を行った結果、3060.48、2958.27、2927.41、2871.49、2856.06、1737.55、1650.77、1573.63、1558.20、1469.49、1403.92、1274.72(いずれも単位はcm−1)等にピークが認められた(図1)。
(測定条件)
測定装置:HORIBA FT−710(堀場製作所製)
測定方法:KBr法
測定温度:室温
DM0507を以下の条件でNMR測定を行った。この結果を図2に示した。
(測定条件)
測定装置:Unity INOVA600(Varian製)
測定周波数:599.898MHz
測定溶媒:重DMSO
測定温度:30℃
抗菌活性の測定:
実施例1で得られた抗菌活性物質DM0507を用いて以下の供試菌株に対する抗菌活性を測定した。
・スタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)MSSA
・スタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)MRSA
・スタヒロコッカス・ハイカス(Staphylococcus hyicus)
・ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)ATCC9341
・ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)JCM5705
・ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)
・ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)
・ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)
・エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)
・バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)DB9011
・バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis )ATCC6633
・バチルス・セレウス バー ミコイデス(Bacillus cereus var. mycoides)
ATCC11778
・アルカノバクテリウム・ピオゲネス(Arcanobacterium pyogenes)
・ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus )ATCC17802
・エロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)
・エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)
・アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434
・アクチノバチルス・プレウロニューモニエ (Actinobacillus pleuropneumoniae)2型
・ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)
・パスツレラ・ムルトシーダ (Pasteurella multocida)D型
・パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)
・パスツレラ・トレハローシ(Pasteurella trehalosi)
・エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
・サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)
・サルモネラ・コレラスイス(Salmonella Choleraesuis)
・クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)ATCC10031
・シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)
・シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)ポンプ高発現株
・シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)ポンプ欠損株
・アシネトバクター・ジュニー(Acinetobacter junii)
・アシネトバクター(Acinetobacter sp.)
・ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)
・レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)serotype 1
・マイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum)
・マイコプラズマ・シノビエ(Mycoplasma synoviae)
・カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)
・カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)
・ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)ATCC43526
・クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)
・クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)
・プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)JCM6425
・バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)
・ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingvalis)JCM8525
・タンネレラ・フォーサイセンシス(Tannerella forsythensis)JCM10827
・ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)JCM1132
・ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)JCM1255
・カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)
・クリプトコッカス(Cryptococcus sp.)
・アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)
・フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)
供試菌株は適する培地及び培養条件(表2)で3代継代培養し、下記の(2)混釈または(3)画線塗沫のいずれかの方法で培地に接種した。次に実施例1で作成した抗菌活性物質0507を直径8mmの薄型ペーパーディスク(アドバンテック製)に20μlずつしみ込ませ、シャーレのふたをずらした状態で冷蔵庫に30分間静置しエタノールを揮発させた。コントロールとしてエタノールのみのディスクも同様に操作を行った。供試菌株を接種した培地にDM0507のディスク及びコントロールのディスクを1枚ずつ置いて培養後、ディスク周囲の阻止円を測定した。
3代継代培養した菌株を1mlの滅菌生理食塩水でマクファーランド2(6.0×108/ml)に調整後、さらに10倍希釈した。次に、この菌液を予め高圧蒸気滅菌後50℃に保温しておいた寒天培地に0.1質量%の割合で添加・混合した。更に、これに予め10mlの寒天培地を流しておいたシャーレに菌液入りの培地を10ml重層した。このときの菌数は1.0×104/cm2であった。
3代継代培養した菌株を1mlの滅菌生理食塩水でマクファーランド0.5(1.5×108/ml)に調整後、それに滅菌木軸綿棒(栄研器材株式会社製)を浸漬した後、各培地に3方向から画線した。
MHA:ミュラーヒントンS寒天培地(栄研化学株式会社製)
GAM:GAM寒天培地(日水製薬株式会社製)
澤田:澤田の培地(自家調整)
B-CYEα:B-CYEα寒天培地(栄研化学株式会社製)
Fray:Frayの寒天培地(自家調整)
PDA:ポテトデキストロース寒天培地(栄研化学株式会社製)
※2:M. gallisepticum、M. synoviaeの画線塗沫
M. gallisepticum及びM. synoviaeはFrayのブロス(自家調整)を使用し、その黄変
によって増殖を確認しながら35℃で3代継代した。黄変した3代目のブロスに滅菌木軸綿棒を浸漬し、Frayの寒天培地に3方向から画線した。
※3:T. forsythensis JCM 10827の画線塗沫:
T. forsythensisは発育にN-アセチルムラミン酸を必要とするため、1.5% N-アセ
チルムラミン酸ディスクを培地中央に置いて培養した。N-アセチルムラミン酸15mg
を精製水1mlに溶解し、0.45μmのフィルターでろ過後、直径8mmのペーパー
ディスクに20μlずつしみ込ませ室温で乾燥させた。これを1.5% N-アセチルム
ラミン酸ディスクとした。
※4:A. niger、F. oxysporumの画線塗沫:
A. niger及びF. oxysporumはPDAの斜面培地を使用し、25℃で7日間培養した。
真菌が発育した斜面培地に0.1%Tween80加生理食塩水を2ml入れ軽く混合
し、胞子液を作成した。胞子液を血球計算盤に入れ胞子数を測定後、0.1%Twee
n80加生理食塩水で1×106/mlに調整した。滅菌木軸綿棒を胞子液に浸漬し、
PDA平板に3方向から画線した。
(A)群(好気性・通性嫌気性微生物)
ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)
ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)
バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)ATCC6633
バチルス・セレウス バー ミコイデス(Bacillus cereus var. mycoides)
ATCC11778
アルカノバクテリウム・ピオゲネス(Arcanobacterium pyogenes)
エロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)
エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス
(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434
アクチノバチルス・プレウロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)2型
ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)
パスツレラ・ムルトシーダ(Pasteurella multocida)D型
パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)
サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)
サルモネラ・コレラスイス(Salmonella Choleraesuis)
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)ATCC10031
アシネトバクター・ジュニー(Acinetobacter junii)
アシネトバクター(Acinetobacter sp.)
ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)
レジオネラ・ニューモフィラ セロタイプ1(Legionella pneumophila serotype 1)
マイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum)
マイコプラズマ・シノビエ(Mycoplasma synoviae)
(B)群(微好気性微生物)
カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)
カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)ATCC43526
(C)群(偏性嫌気性微生物)
クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)
クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)
プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)JCM6425
バクテロイデス・フラジリス (Bacteroides fragilis)
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)JCM8525
タンネレラ・フォーサイセンシス(Tannerella forsythensis)JCM10827
ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)JCM1132
ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)JCM1255
アナエロコッカス・プレボッティ(Anaerococcus prevotii)JCM6508
フソバクテリウム・ヌクレアートム(Fusobacterium nucleatum)
(D)群(真菌)
フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)
外用薬、歯磨き(練り歯磨き、粉歯磨き、水歯磨き)、歯間ブラシ、うがい剤、口内炎などの消毒薬、入れ歯用品(洗浄、粘着、殺菌、消毒、消臭)、浴用剤、薬用石鹸、口唇保護剤、爪保護剤、外皮消毒剤、うおの目・たこ用剤、傷消毒剤、ただれ・あせも防止剤、ひび・あかぎれ用剤、かさつき・あれ用剤、頭皮・頭皮用剤、フケ・かゆみ用剤、腋下用剤
<日用品、トイレタリー、繊維・皮革商品等>
おむつ、台所用品、トイレタリー用品、石鹸・カーボンファイバー・布・皮などに含浸した製品
<洗浄剤等>
衛生綿類(紙製品も含む)、シャンプー、リンス、生理処理用品、コンタクトレンズ洗浄剤
<化粧品等>
化粧水、乳液、クレンジング、エステ剤、パック、クリーム・ハンドクリーム、化粧用油、ひげ剃り用剤、日焼け止め剤
<消毒剤、殺菌剤等>
循環式大衆浴場・温泉殺菌剤、プール殺菌剤、チラー(冷却水)用剤、クーラーなどフィルター用剤
<建材、塗料等>
木材、紙、油性ペンキ、水性ペンキ、クロス、接着剤、たたみ、塗装保護剤
<食品添加物等>
保存料(飲料を含む)
・スタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)MSSA
・スタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)MRSA
・スタヒロコッカス・ハイカス(Staphylococcus hyicus)
・ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)ATCC9341
・ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)JCM5705
・ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)
・ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)
・ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)
・エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)
・バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)DB9011
・バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis )ATCC6633
・バチルス・セレウス バー ミコイデス(Bacillus cereus var. mycoides)
ATCC11778
・アルカノバクテリウム・ピオゲネス(Arcanobacterium pyogenes)
・ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus )ATCC17802
・エロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)
・エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)
・アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434
・アクチノバチルス・プレウロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)2型
・ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)
・パスツレラ・ムルトシーダ(Pasteurella multocida)D型
・パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)
・パスツレラ・トレハローシ(Pasteurella trehalosi)
・エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
・サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)
・サルモネラ・コレラスイス(Salmonella Choleraesuis)
・クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)ATCC10031
・シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)
・シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)ポンプ高発現株
・シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)ポンプ欠損株
・アシネトバクター・ジュニー(Acinetobacter junii)
・アシネトバクター(Acinetobacter sp.)
・ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)
・レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)serotype 1
・マイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum)
・マイコプラズマ・シノビエ(Mycoplasma synoviae)
・カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)
・カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)
・ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)ATCC43526
・クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)
・クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)
・プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)JCM6425
・バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)
・ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)JCM8525
・タンネレラ・フォーサイセンシス(Tannerella forsythensis)JCM10827
・ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)JCM1132
・ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)JCM1255
・アナエロコッカス・プレボッティ(Anaerococcus prevotii)JCM6508
・フソバクテリウム・ヌクレアートム(Fusobacterium nucleatum)
・カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)
・クリプトコッカス(Cryptococcus sp.)
・アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)
・フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)
供試菌株は適する培地及び培養条件(表2)で3代継代培養し、下記の(2)混釈または(3)画線塗沫のいずれかの方法で培地に接種した。次に実施例1で作成した抗菌活性物質DM0507を直径8mmの薄型ペーパーディスク(アドバンテック製)に20μlずつしみ込ませ、シャーレのふたをずらした状態で冷蔵庫に30分間静置しエタノールを揮発させた。コントロールとしてエタノールのみのディスクも同様に操作を行った。供試菌株を接種した培地にDM0507のディスク及びコントロールのディスクを1枚ずつ置いて培養後、ディスク周囲の阻止円を測定した。
MHA:ミュラーヒントンS寒天培地(栄研化学株式会社製)
GAM:GAM寒天培地(日水製薬株式会社製)
澤田:澤田の培地(自家調製)
B-CYEα:B-CYEα寒天培地(栄研化学株式会社製)
Fray:Frayの寒天培地(自家調製)
PDA:ポテトデキストロース寒天培地(栄研化学株式会社製)
※2:M. gallisepticum、M. synoviaeの画線塗沫
M. gallisepticum及びM. synoviaeはFrayのブロス(自家調製)を使用し、その黄変
によって増殖を確認しながら35℃で3代継代した。黄変した3代目のブロスに滅菌木軸綿棒を浸漬し、Frayの寒天培地に3方向から画線した。
※3:T. forsythensis JCM 10827の画線塗沫:
T. forsythensisは発育にN-アセチルムラミン酸を必要とするため、1.5%N-アセ
チルムラミン酸ディスクを培地中央に置いて培養した。N-アセチルムラミン酸15mg
を精製水1mlに溶解し、0.45μmのフィルターでろ過後、直径8mmのペーパー
ディスクに20μlずつしみ込ませ室温で乾燥させた。これを1.5% N-アセチルム
ラミン酸ディスクとした。
※4:A. niger、F. oxysporumの画線塗沫:
A. niger及びF. oxysporumはPDAの斜面培地を使用し、25℃で7日間培養した。
真菌が発育した斜面培地に0.1%Tween80加生理食塩水を2ml入れ軽く混合
し、胞子液を作成した。胞子液を血球計算盤に入れ胞子数を測定後、0.1%Twee
n80加生理食塩水で1×106/mlに調整した。滅菌木軸綿棒を胞子液に浸漬し、
PDA平板に3方向から画線した。
【請求項1】
次の工程(a)〜(d)
(a)バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)を培養し、
(b)得られた培養物から上清を回収し、
(c)上清のpHを3以下に調整して生じた沈殿物を回収し、
(d)沈殿物からエタノールで抽出する
を含む製造方法により得られ、図1で示すIRスペクトルおよび図2で示すNMRスペクトルを有することを特徴とする抗菌活性物質DM0507。
【請求項2】
次の微生物群(A)〜(D)に対する抗菌活性を有するものである請求項第1項記載の抗菌活性物質DM0507。
(A)群(好気性・通性嫌気性微生物)
ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)
ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)
バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)ATCC6633
バチルス・セレウス バー ミコイデス(Bacillus cereus var. mycoides)
ATCC11778
アルカノバクテリウム・ピオゲネス(Arcanobacterium pyogenes)
エロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)
エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス
(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434
アクチノバチルス・プレウロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)2型
ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)
パスツレラ・ムルトシーダ(Pasteurella multocida)D型
パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)
サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)
サルモネラ・コレラスイス(Salmonella Choleraesuis)
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)ATCC10031
アシネトバクター・ジュニー(Acinetobacter junii)
アシネトバクター(Acinetobacter sp.)
ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)
レジオネラ・ニューモフィラ セロタイプ1(Legionella pneumophila serotype 1)
マイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum)
マイコプラズマ・シノビエ(Mycoplasma synoviae)
(B)群(微好気性微生物)
カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)
カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)ATCC43526
(C)群(偏性嫌気性微生物)
クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)
クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)
プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)JCM6425
バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)JCM8525
タンネレラ・フォーサイセンシス(Tannerella forsythensis)JCM10827
ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)JCM1132
ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)JCM1255
アナエロコッカス・プレボッティ(Anaerococcus prevotii)JCM6508
フソバクテリウム・ヌクレアートム(Fusobacterium nucleatum)
(D)群(真菌)
フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)
【請求項3】
バチルス・ズブチルスが、バチルス・ズブチルスDB9011(FERM BP−3418)である請求項第1項または第2項記載の抗菌活性物質DM0507。
【請求項4】
請求項第1項ないし第3項の何れかの項記載の抗菌活性物質DM0507を有効成分とする抗菌剤。
【請求項5】
請求項第1項ないし第3項の何れかの項記載の抗菌活性物質DM0507を含有する飲食品。
【請求項6】
次の工程(a)〜(d)
(a)バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)を培養し、
(b)得られた培養物から上清を回収し、
(c)上清のpHを3以下に調整して生じた沈殿物を回収し、
(d)沈殿物からエタノールで抽出する
を含むことを特徴とする請求項1記載の抗菌活性物質DM0507の製造方法。
Claims (6)
- 次の工程(a)〜(d)
(a)バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)を培養し、
(b)得られた培養物から上清を回収し、
(c)上清のpHを3以下に調整して生じた沈殿物を回収し、
(d)沈殿物からエタノールで抽出する
を含む製造方法により得られることを特徴とする抗菌活性物質DM0507。 - 次の微生物群(A)〜(D)に対する抗菌活性を有するものである請求項第1項記載の抗菌活性物質DM0507。
(A)群(好気性・通性嫌気性微生物)
ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)
ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)
バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)ATCC6633
バチルス・セレウス バー ミコイデス(Bacillus cereus var. mycoides)
ATCC11778
アルカノバクテリウム・ピオゲネス(Arcanobacterium pyogenes)
エロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)
エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス
(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434
アクチノバチルス・プレウロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)2型
ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)
パスツレラ・ムルトシーダ(Pasteurella multocida)D型
パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)
サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)
サルモネラ・コレラスイス(Salmonella Choleraesuis)
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)ATCC10031
アシネトバクター・ジュニー(Acinetobacter junii)
アシネトバクター(Acinetobacter sp.)
ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)
レジオネラ・ニューモフィラ セロタイプ1(Legionella pneumophila serotype 1)
マイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum)
マイコプラズマ・シノビエ(Mycoplasma synoviae)
(B)群(微好気性微生物)
カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)
カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)ATCC43526
(C)群(偏性嫌気性微生物)
クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)
クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)
プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)JCM6425
バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingvalis)JCM8525
タンネレラ・フォーサイセンシス(Tannerella forsythensis)JCM10827
ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)JCM1132
ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)JCM1255
アナエロコッカス・プレボッティ(Anaerococcus prevotii)JCM6508
フソバクテリウム・ヌクレアートム(Fusobacterium nucleatum)
(D)群(真菌)
フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum) - バチルス・ズブチルスが、バチルス・ズブチルスDB9011(FERM BP−3418)である請求項第1項または第2項記載の抗菌活性物質DM0507。
- 請求項第1項ないし第3項の何れかの項記載の抗菌活性物質DM0507を有効成分とする抗菌剤。
- 請求項第1項ないし第3項の何れかの項記載の抗菌活性物質DM0507を含有する飲食品。
- 次の工程(a)〜(d)
(a)バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)を培養し、
(b)得られた培養物から上清を回収し、
(c)上清のpHを3以下に調整して生じた沈殿物を回収し、
(d)沈殿物からエタノールで抽出する
を含むことを特徴とする抗菌活性物質DM0507の製造方法。
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