JPWO2004035180A1 - 親水性微多孔膜 - Google Patents

Abstract

熱可塑性樹脂を含み、親水化処理を施された、最大孔径１０〜１００ｎｍの親水性微多孔膜であって、単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ２／ｈ）（グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たし、かつ、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ２／ｈ）（グロブリン透過速度Ｂと略称する）が下記式（２）を満たす上記親水性微多孔膜：グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）２．７５（１）グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）。

Description

本発明は、ウイルス等の微粒子の除去に適した親水性微多孔膜に関する。

近年、血漿分画製剤やバイオ医薬品の精製工程において、ウイルスや病原性タンパク質等の病原体を除去し、安全性を高める技術が求められている。ウイルス等の病原体を除去する方法に膜濾過法がある。この膜濾過法は、ふるい分け原理により、粒子の大きさに応じて分離操作を行うため、病原体の種類、及び病原体の化学的な性質や熱的性質に拘わらず、全ての病原体に有効である。したがって、近年、膜濾過法による病原体除去の工業的な実用化が広まってきている。
病原体の中でも、感染性ウイルスによる感染は重篤な疾病を引き起こすため、混入ウイルス除去の必要性が極めて高い。ウイルスの種類は、最も小さいもので直径１８〜２４ｎｍ程度のパルボウイルス等があり、中程度のものでは直径約４０〜４５ｎｍ程度の日本脳炎ウイルス、比較的大きいものでは直径８０〜１００ｎｍ程度のＨＩＶ等がある。このようなウイルス群を膜濾過法によって物理的に除去するためには孔径１０〜１００ｎｍ程度の微多孔膜が必要であり、近年、特にパルボウイルス等の小型ウイルスの除去に対するニーズが高まっている。
一方、血漿分画製剤やバイオ医薬品の精製工程において膜濾過法を適用する場合、ウイルス除去能力を高めるばかりでなく、生産性を向上させるために、生理活性物質が高速かつ大量に透過することが望まれる。
しかしながら、除去すべき対象物がパルボウイルスのような小ウイルスである場合、その大きさが１８〜２４ｎｍと極めて小さいために、これまでの技術では、ウイルス除去性と生理活性物質の透過量や透過速度を両立させることは困難であった。
即ち、従来の微多孔膜は、ヒト免疫グロブリンや血液凝固ＶＩＩＩ因子等の高分子量の生理活性物質が十分な透過速度で透過するが、パルボウイルス等の小ウイルスは除去できないという欠点を有しているか、或いは、パルボウイルス等の小ウイルスは除去できるが、ヒト免疫グロブリンや血液凝固ＶＩＩＩ因子等の高分子量の生理活性物質が実質的な透過速度で透過しないという欠点を有している。
国際公開第９１／１６９６８号パンフレットには、重合開始剤と親水性モノマーを含む溶液を膜に含浸させ、細孔中で重合させることにより高分子量化し、親水性樹脂を細孔表面に付着させる方法が開示されている。しかしながら該方法では、細孔表面に親水性樹脂が付着しているに過ぎないため、反応によって生成した低分子量体を洗浄する際に、付着していた親水性樹脂の一部が溶出し、膜の親水性が失われやすいといった欠点がある。また、溶出を防ぐために架橋剤を多量に用いて共重合を行うと、タンパク溶液の高い透過性が得られない。
特開平０７−２６５６７４号公報には、小さな粒子を溶液から効果的に除去し得る、ヤギ免疫グロブリンに対する吸着性の小さいポリフッ化ビニリデン膜が記載されている。この膜は、溶液からのウイルス除去には有用であると記載されている。しかしながら、実施例によると、この親水性膜はヤギ免疫グロブリンに対して少量の吸着性を示しており、本発明のようなグロブリン等の生理活性物質に対する充分な透過性を有していない。
特開昭６２−１７９５４０号公報には、ポリオレフィンからなる中空糸状多孔膜に中性ヒドロキシル基を含む側鎖がグラフトされた親水性中空糸状多孔膜が記載されている。しかしながら、実施例には平均孔径０．１〜０．１６μｍの親水性微多孔膜の記載があるのみであり、最大孔径が１０〜１００ｎｍのような小孔径の微多孔膜についての記載はない。
特表平０７−５０５８３０号公報には、ポリオレフィンや部分的にフッ素化されたポリオレフィン等の疎水性微多孔膜に紫外線等を照射し、２個の反応性基を有する２官能性モノマーを重合する方法が記載されている。しかし上記の方法では、親水性の散漫層が架橋されることにより親水性が失われ、十分なタンパク質溶液の濾過速度が得られない。
国際公開第０１／１４０４７号パンフレットには、パルボウイルスの対数除去率が３以上であり、かつ、単量体の占める割合が８０％以上のウシ免疫グロブリンの透過率が７０％以上である生理活性物質用濾過膜が記載されている。しかしながら、ここで開示されている主たる膜はセルロースを素材とした中空糸であり、水に濡れた状態での力学強度は低いために、濾過圧を高くすることができないため、高い透過速度を実現することは極めて難しい。

本発明は、パルボウイルス等の小ウイルスに対する高い除去能を有し、かつ、グロブリンや血液凝固第ＶＩＩＩの因子のような高分子量の生理活性物質を高速かつ大量に透過し得る親水性微多孔膜を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の通りである。
１．熱可塑性樹脂を含み、親水化処理を施された、最大孔径１０〜１００ｎｍの親水性微多孔膜であって、単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たし、かつ、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ｂと略称する）が下記式（２）を満たす上記親水性微多孔膜：
グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）。
２．水の後退接触角が０〜２０度である上記１の親水性微多孔膜。
３．濾過開始から５５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率が３以上である上記１又は２に記載の親水性微多孔膜。
４．濾過開始から５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率と５０リットル／ｍ^２透過した後更に５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率がいずれも３以上である上記１〜３のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
５．単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から３時間の積算透過量が５０リットル／ｍ^２以上である上記１〜４のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
６．前記熱可塑性樹脂を含む微多孔膜が、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが２μｍ以上、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であり、かつ該粗大構造層と該緻密構造層層が一体化している微多孔膜である上記１〜５のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
７．前記粗大構造層の厚みが３μｍ以上である上記６記載の親水性微多孔膜。
８．前記粗大構造層の厚みが５μｍ以上である上記６記載の親水性微多孔膜。
９．前記熱可塑性樹脂がポリフッ化ビニリデンである上記１〜８のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
１０．前記親水化処理が、ビニル基を１個有する親水性ビニルモノマーの微多孔膜の細孔表面へのグラフト重合反応である上記１〜９のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
１１．前記親水性ビニルモノマーが、ヒドロキシル基を含む上記１０に記載の親水性微多孔膜。
１２．０．０１ｗｔ％ウシ免疫グロブリン溶液を用いて０．３ＭＰａで定圧デッドエンド濾過を行い、濾過開始から５０リットル／ｍ^２の濾液を分取したときの膜１ｇ当りの吸着量が３ｍｇ以下である上記１〜１１のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
１３．生理活性物質を含有する液体中からウイルスを除去することに用いられる上記１〜１２のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
１４．濾過開始から５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率と５０リットル／ｍ^２透過した後更に５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率がいずれも３以上であり、かつ単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たし、かつ、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ｂと略称する）が下記式（２）を満たすことを特徴とする親水性微多孔膜：
グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）。
発明を実施するための形態
本発明の親水性微多孔膜において、バブルポイント法で求めた最大孔径は、グロブリン等の生理活性物質の透過性や濾過速度の点から１０ｎｍ以上が好ましく、より好ましくは１５ｎｍ以上である。また、バブルポイント法で求めた最大孔径の上限は１００ｎｍ以下が好ましく、除去対象であるウイルス等のサイズによって変化するが、日本脳炎ウイルス等の中型ウイルスを除去するためには７０ｎｍ以下、特にパルボウイルス等の小ウイルスを除去対象とする場合は３６ｎｍ以下であることが好ましい。ここで言う最大孔径は、ＡＳＴＭ Ｆ３１６−８６に準拠したバブルポイント法で測定した値である。
本発明の親水性微多孔膜の表面にはスキン層が存在しないことが好ましい。スキン層が存在すると、タンパク等の生理活性物質を含有する溶液に含まれる懸濁物質が膜表面において堆積するため、透過性能の急激な低下が起きる可能性がある。ここで言うスキン層とは、膜表面に隣接して存在し、孔径が膜内部に比べて小さい層を指し、その厚みは通常１μｍ以下である。
本発明の親水性微多孔膜は、単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（以下、グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たすものである。
グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
即ち、本発明の親水性微多孔膜は、グロブリン透過速度Ａは、０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５より大きいことが必要であり、好ましくは０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．８０以上、より好ましくは０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．８５以上、最も好ましくは０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．９０以上である。グロブリン濾過速度Ａが０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５より大きければ、血漿分画製剤やバイオ医薬品等の製造におけるウイルス除去を工業規模で実施するに充分な透過速度を確保することができる。
また、本発明の親水性微多孔膜は、グロブリン濾過速度Ａと単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（以下、グロブリン濾過速度Ｂと略称する）とが下記式（２）を満たすことが必要である。
グロブリン濾過速度Ｂ／グロブリン濾過速度Ａ＞０．２ （２）
本発明の親水性微多孔膜において、グロブリン濾過速度Ｂ／グロブリン濾過速度Ａ（以下、濾過速度の比と略称す）は、好ましくは０．３以上、より好ましくは０．４以上である。濾過速度の比が０．２より大きければ、濾過速度の維持が充分となり、血漿分画製剤やバイオ医薬品等の製造におけるウイルス除去を工業規模で実施することができる。
本発明の親水性微多孔膜のウイルス除去能は、濾過開始時から５５リットル／ｍ^２濾過時（以下、０〜５５リットル／ｍ^２濾過時と称す）におけるブタパルボウイルス対数除去率が３以上であることが好ましく、より好ましくは３．５以上、そして最も好ましくは４以上である。０〜５５リットル／ｍ^２濾過時におけるブタパルボウイルス対数除去率が３以上であれば、生理活性物質を含む溶液からヒトパルボウイルスＢ１９やポリオウイルス等の小ウイルスを除去するウイルス除去フィルターとしての使用に耐え得る。更に、ヒトパルボウイルスＢ１９やポリオウイルス等の小ウイルスを除去できると言うことは、更に大きなＣ型肝炎ウイルスや、ヒト後天性免疫不全ウイルス等は、更に高い確率で除去できることを示している。
また、濾液中のウイルス濃度は、濾過量によって変化する場合があるが、当然ながら、濾過量が増えた場合でもウイルス除去能の低下のない、低下しても低下率の小さい膜が望まれる。本発明の親水性微多孔膜は、濾過開始時から５リットル／ｍ^２濾過時（以下、０〜５リットル／ｍ^２濾過時と称す）と５０リットル／ｍ^２濾過した後更に５リットル／ｍ^２濾過時（以下、５０〜５５リットル／ｍ^２濾過時と称す）におけるブタパルボウイルス対数除去率がいずれも３以上であることが好ましく、より好ましくはいずれも３．５以上、最も好ましくはいずれも４以上である。０〜５リットル／ｍ^２濾過時と５０〜５５リットル／ｍ^２濾過時におけるブタパルボウイルスがいずれも３以上であるということは、膜のウイルス除去能の持続性が充分に高いことを表す指標となる。
血漿分画製剤やバイオ医薬品中のタンパク質は、疎水性の膜に吸着しやすい、即ち親水性の膜には吸着し難いといった性質を持ち、膜の親水性の度合いは、水の接触角によって評価することができる。接触角の測定法には、静的接触角法と動的接触角法の２つがあるが、表面のダイナミクスに対する知見が得られる動的接触角法が好ましい。動的接触角法の中でもウェルヘルミ法による測定法が試料形状の自由度が高くより好ましい。
水の接触角でも水の後退接触角は水中での膜表面の親水性を直接反映するため、膜の親水性を判断する上で重要な指標となる。本発明の親水性微多孔膜は、水の後退接触角が０〜２０度であることが好ましく、より好ましくは０〜１５度、更に好ましくは０〜１０度、そして最も好ましくは０〜５度である。水の後退接触角が２０度を超えると、膜の親水性が不十分であり、タンパク質の吸着による濾過速度の急激な低下を引き起こす。
本発明の親水性微多孔膜の形態は、平膜状、中空糸状等、いずれの形状でも適用可能であるが、製造し易さの観点から中空糸状が好ましい。
本発明の親水性微多孔膜の膜厚は、好ましくは１５μｍ〜１０００μｍ、より好ましくは１５μｍ〜５００μｍ、そして最も好ましくは２０μｍ〜１００μｍである。膜厚が１５μｍ以上であれば、微多孔膜の強度が充分であるばかりでなく、ウイルス除去の確実性も充分である。１０００μｍを超えると透過性能が低下する傾向にあるので好ましくない。
本発明における親水性微多孔膜の空孔率は、２０〜９０％であり、好ましくは３０〜８５％、そしてより好ましくは４０〜８０％である。空孔率が２０％未満であると濾過速度が充分でなく、９０％を超えるとウイルス除去の確実性が低下するとともに、微多孔膜の強度が充分でなくなる傾向にあり好ましくない。
本発明の親水性微多孔膜の透水量は、孔径によって変化するが、好ましくは２×１０^−１１〜３×１０^−８であり、更に好ましくは４×１０^−１１〜１．５×１０^−８であり、最も好ましくは５×１０^−１１〜８．５×１０^−９である。該透水量の単位はｍ^３／ｍ^２／秒／Ｐａである。透水量が２×１０^−１１以上であれば分離膜として使用し得る充分な透水量が得られることから好ましい。また、親水性微多孔膜の強度の保持、あるいはウイルス等の除去の確実性を勘案すると３×１０^−８を超える透水量は現実性に乏しい。
本発明の親水性微多孔膜の表面及び細孔表面は、グロブリン等のタンパク質に対して殆ど吸着性を示さないことが好ましい。吸着性の度合いは、代表的な血漿タンパク質であるグロブリンの希薄溶液を透過させ、濾過原液及び濾液中に含まれるタンパク質を吸光度計で定量することで評価できる。１００質量ｐｐｍに希釈したウシ免疫グロブリン溶液を透過させたときの膜１ｇ当りの吸着量が３ｍｇ以下であることが好ましく、より好ましくは２ｍｇ以下、そして最も好ましくは１ｍｇ以下である。
本発明の親水性微多孔膜は、最大孔径が１０〜１００ｎｍであることが好ましく、下記式（１）及び式（２）を満足すればどのような構造の微多孔膜であってもよいが、開孔率が大きい粗大構造層と開孔率が小さい緻密構造層を有し、かつ上記粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが２μｍ以上であり、上記緻密構造層が膜厚全体の５０％以上である微多孔膜であって、該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している構造の微多孔膜であることが好ましい。これは、そのような構造であれば、式（１）を満足する初期濾過速度と式（２）を満足する濾過速度の維持を確保し易くなるからである。
グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）
好ましい構造の微多孔膜を以下に説明する。
該微多孔膜において、粗大構造層は少なくとも一方の膜表面に存在することが好ましく、該粗大構造層の厚みは２μｍ以上が好ましく、より好ましくは３μｍ以上、更に好ましくは５μｍ以上、特に好ましくは８μｍ以上である。粗大構造層は、プレフィルター機能を有し、夾雑物の閉塞による濾過速度の低下を緩和する。孔径の小さな微多孔膜ほど、生理活性物質中に含まれる夾雑物が濾過速度の低下を引き起こしやすいため、粗大構造層の厚みが厚いことが好ましい。
また、緻密構造層の厚みは膜厚全体の５０％以上が好ましい。緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であれば、ウイルス等の除去性能を低下させることなく使用できる。より好ましくは５５％以上であり、特に好ましくは６０％以上である。
上記粗大構造層は膜厚全体の中で相対的に開孔率が大きい部分であり、タンパク溶液等に含まれる懸濁物質に対してプレフィルター機能を発揮することにより膜の処理能力を向上させる。また、上記緻密構造層は膜厚全体の中で相対的に開孔率が小さく、実質的に膜の孔径を規定している部分である。ウイルス等の微粒子を除去する目的の微多孔膜においては該微粒子の除去機能を有する層である。
本発明において空孔率及び開孔率は、いずれも微多孔膜における空隙部分の容積比率に対応するもので基本概念は同じであるが、空孔率は、膜の断面積及び長さから求めた見かけ体積と該膜の質量及び膜素材の真密度から求めた数値であるのに対し、開孔率は、膜の断面において、膜断面に対する空隙部分が占める面積比率であって、膜断面の電子顕微鏡写真の画像解析から求められる。本発明においては、開孔率は、膜厚方向に一定の厚み毎に測定され、膜厚方向の空隙部分の容積比率の変化を調べるために用いられ、測定の精度から厚み１μｍ毎に測定している。
具体的には、開孔率は、微多孔膜の膜表面に垂直な方向の断面構造の観察結果を厚み方向に厚み１μｍ毎に分割し、画像処理解析によって各分割領域において求めた開孔率をある一定の膜厚領域で平均した開孔率であり、膜厚全体の平均開孔率は各分割領域において求めた開孔率を膜厚全体で平均して求めた開孔率である。
本発明において、粗大構造層とは、膜表面に隣接して存在する開孔率の大きい層であり、好ましくは（Ａ）開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋２．０％以上の層（以下、（Ａ）の粗大構造層という）であり、より好ましくは＋２．５％以上の層であり、特に好ましくは＋３．０％以上の層である。粗大構造層の開孔率の上限は、膜厚全体の平均開孔率＋３０％以下が好ましく、より好ましくは膜厚全体の平均開孔率＋２５％以下、特に好ましくは平均開孔率２０％以下である。粗大構造層の開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋２．０％以上であれば、緻密構造層との構造差も充分に大きく、プレフィルター効果を発現でき、微多孔膜の処理能力を増大させる効果がある。また、粗大構造層の開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋３０％より大きい場合は、粗大構造層の構造が必要以上に粗になり、充分なプレフィルター機能を有しない傾向があり好ましくない。
また、粗大構造層は、膜表面から緻密構造層に向かって開孔率が連続的に減少する傾斜構造であることが好ましい。この好ましい理由は、開孔率が連続的に減少するとともに孔径も連続的に小さくなることにより、表面近傍で大きな懸濁物質が除去され、内部に入るにつれて小さな懸濁物質が段階的に除去されることにより、粗大構造層のプレフィルター機能を向上させているものと推察される。開孔率が粗大構造層と緻密構造層の境界で不連続に大きく変化する場合は、境界近傍に懸濁物質が堆積することによって濾過速度の低下を招くために好ましくない。ここで言う開孔率が連続的に減少する傾斜構造とは、膜厚方向における全体的な傾向を指しており、構造ムラや測定誤差に起因する開孔率の局所的な多少の逆転があってもよい。
粗大構造層は、開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋５．０％以上である層を含むことが好ましく、膜厚全体の平均開孔率＋８．０％以上の層を含むことが更に好ましい。粗大構造層が、開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋５．０％以上である層を含む場合は、緻密構造層より充分に大きな孔径の層を有していることを示しており、粗大構造層は充分なプレフィルター機能を発揮することが可能となる。開孔率の最大値を有する層は、膜表面に存在するか、或いは膜表面近傍に存在することが好ましい。
また、該微多孔膜においては、粗大構造層が隣接する膜表面の平均孔径は、少なくともバブルポイント法で求めた最大孔径の２倍以上であることが好ましく、より好ましくは、バブルポイント法で求めた最大孔径の３倍以上である。粗大構造層の隣接する膜表面の平均孔径が、バブルポイント法で求めた最大孔径の２倍未満である場合は、孔径が小さすぎるため、表面で懸濁物質の堆積が起こり、濾過速度が低下する傾向があることから好ましくない。該微多孔膜がウイルス等の微粒子除去用に用いられる場合には、粗大構造層の隣接する膜表面の平均孔径は３μｍ以下であることが好ましく、２μｍ以下であることがより好ましい。該平均孔径が３μｍを超えると、プレフィルター機能が低下する傾向にあり好ましくない。
緻密構造層とは、開孔率が小さい層であり、好ましくは（Ｂ）開孔率が、膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満であって、かつ（膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満の層の開孔率の平均値）±２．０％（両端を含む）の範囲内にある層（以下、（Ｂ）の緻密構造層という）である。緻密構造層の開孔率が、（膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満の層の開孔率の平均値）±２．０％（両端を含む）の範囲内にあるということは、緻密構造層が比較的均質な構造を持っていることを意味し、このことはデプス濾過によってウイルス等を除去する際に重要である。緻密構造層の均質性は高いほど好ましく、開孔率の変動幅は±２％の範囲内であることが好ましく、更に好ましくは±１％の範囲内である。緻密構造層の構造例としては、国際公開第０１／２８６６７号パンフレットに開示されている球晶内ボイド構造などが好ましく適用できる。
また、該微多孔膜において、上記の（Ａ）の粗大構造層及び（Ｂ）の緻密構造層のいずれにも属さない中間的領域が存在してもよい。ここで言う中間的領域とは、開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満であるが、［膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満の層の開孔率の平均値］±２．０％（両端を含む）の範囲内に入らない層に対応する。このような層は、通常は（Ａ）の粗大構造層と（Ｂ）の緻密構造層の境界部分に存在する。
また、該微多孔膜は、粗大構造層と緻密構造層が一体化していることが好ましい。この粗大構造層と緻密構造層が一体化しているとは、微多孔膜の製造時に粗大構造層と緻密構造層が、同時に形成されることを言う。この際、粗大構造層と緻密構造層の境界部分に中間的領域が存在してもよい。大孔径の支持体上に比較的小孔径な層をコートすることによって製造される膜や、孔径の異なる膜を重ね合わせた積層膜よりも、粗大構造層と緻密構造層が一体化していることが好ましい。コートすることによって製造される膜や、孔径の異なる膜を重ね合わせた積層膜は、二つの層の間で、孔の連結性が低くなったり、孔径が大きく不連続に変化するため、支持体とコート層の間に懸濁物質が堆積しやすいという欠点を有する。
本発明の親水性微多孔膜の製造方法を以下に説明する。
本発明の微多孔膜を製造するのに使用される熱可塑性樹脂は、通常の圧縮、押出、射出、インフレーション、及びブロー成型に使用される結晶性を有する熱可塑性樹脂であり、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ４−メチル１−ペンテン樹脂等のポリオレフィン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリエチレンテレナフタレート樹脂、ポリブチレンナフタレート樹脂、ポリシクロヘキシレンジメチレンテレフタレート樹脂等のポリエステル樹脂、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン４６等のポリアミド樹脂、ポリフッ化ビニリデン樹脂、エチレン／テトラフルオロエチレン樹脂、ポリクロロトリフルオロエチレン樹脂等のフッ素系樹脂、ポレフェニレンエーテル樹脂、及びポリアセタール樹脂等が使用できる。
上記の熱可塑性樹脂の中で、ポリオレフィン樹脂やフッ素系樹脂は、耐熱性と成型加工性のバランスが良いために好ましく、なかでもポリフッ化ビニリデン樹脂は特に好ましい。ここで言うポリフッ化ビニリデン樹脂とは、基本骨格にフッ化ビニリデン単位を含むフッ素系樹脂を指すものであり、一般にはＰＶＤＦの略称で呼ばれる樹脂である。このようなポリフッ化ビニリデン樹脂としては、フッ化ビニリデン（ＶＤＦ）のホモ重合体や、ヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）、ペンタフルオロプロピレン（ＰＦＰ）、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、クロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）、及びパーフルオロメチルビニルエーテル（ＰＦＭＶＥ）のモノマー群から選んだ１種又は２種のモノマーとフッ化ビニリデン（ＶＤＦ）との共重合体を使用することができる。また、該ホモ重合体及び該共重合体を混合して使用することもできる。本発明においては、ホモ重合体を３０〜１００ｗｔ％含むポリフッ化ビニリデン樹脂を使用すると微多孔膜の結晶性が向上し高強度となるために好ましく、ホモ重合体のみを使用すると更に好ましい。
本発明において使用する熱可塑性樹脂の平均分子量は、５万〜５００万であることが好ましく、より好ましくは１０万〜２００万、更に好ましくは１５万〜１００万である。該平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定により得られる重量平均分子量を指すものであるが、一般に平均分子量が１００万を超えるような樹脂については、正確なＧＰＣ測定が困難であるので、その代用として粘度法による粘度平均分子量を採用することができる。重量平均分子量が５万より小さいと、溶融成型の際のメルトテンションが小さくなり成形性が悪くなったり、膜の力学強度が低くなったりするので好ましくない。重量平均分子量が５００万を超えると、均一な溶融混練が難しくなるために好ましくない。
本発明において使用する熱可塑性樹脂のポリマー濃度は、熱可塑性樹脂及び可塑剤を含む組成物中２０〜９０ｗｔ％が好ましく、より好ましくは３０〜８０ｗｔ％、そして最も好ましくは３５〜７０ｗｔ％である。ポリマー濃度が２０ｗｔ％未満になると、製膜性が低下する、充分な力学強度が得られない等の不都合が発生する。また、ウイルス除去用の膜としては、得られる微多孔膜の孔径が大きくなりウイルス除去性能が不充分となる。ポリマー濃度が９０ｗｔ％を超えると、得られる微多孔膜の孔径が小さくなりすぎるとともに、空孔率が小さくなるため、濾過速度が低下し、実用に耐えない。
本発明において使用する可塑剤としては、微孔膜を製造する組成で熱可塑性樹脂と混合した際に樹脂の結晶融点以上において均一溶液を形成し得る不揮発性溶媒を用いる。ここでいう不揮発性溶媒とは、大気圧下において２５０℃以上の沸点を有するものである。可塑剤の形態は、概ね常温２０℃において、液体であっても固体であっても差し支えない。また、熱可塑性樹脂との均一溶液を冷却した際に、常温以上の温度において熱誘起型固液相分離点を持つような、いわゆる固液相分離系の可塑剤を用いることが、ウイルス除去に用いられるような小孔径かつ均質な緻密構造層を有する膜を製造する上で好ましい。可塑剤の中には、熱可塑性樹脂との均一溶液を冷却した際に、常温以上の温度において熱誘起型液液相分離点を有するものもあるが、一般に、液液相分離系の可塑剤を用いた場合は、得られた微多孔膜は大孔径化する傾向がある。ここで用いられる可塑剤は単品又は複数の物質の混合物であってもよい。
熱誘起型固液相分離点を測定する方法は、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む所定濃度の組成物を予め溶融混練したものを試料として用い、熱分析（ＤＳＣ）により該樹脂の発熱ピーク温度を測定することにより求めることができる。また、該樹脂の結晶化点を測定する方法は、予め該樹脂を溶融混練したものを試料として用い、同様に熱分析により求めることができる。
ウイルス除去に用いられるような小孔径かつ均質な緻密構造層を有する膜を製造する際に好ましく用いられる可塑剤としては、国際公開第０１／２８６６７号パンフレットに開示されている可塑剤が挙げられる。即ち、下記の式で定義する組成物の相分離点降下定数が０〜４０℃である可塑剤であり、好ましくは１〜３５℃の可塑剤、更に好ましくは５〜３０℃の可塑剤である。相分離点降下定数が４０℃を超えると、孔径の均質性や強度が低下してしまうために好ましくない。
α＝１００×（Ｔ_ｃ ^０−Ｔ_ｃ）÷（１００−Ｃ）
（式中、αは相分離温度降下定数（℃）、Ｔ_ｃ ^０は熱可塑性樹脂の結晶化温度（℃）、Ｔ_ｃは組成物の熱誘起固液相分離点（℃）、Ｃは組成物中の熱可塑性樹脂の濃度（ｗｔ％）を表す。）
例えば熱可塑性樹脂としてポリフッ化ビニリデン樹脂を選択した場合には、フタル酸ジシクロヘキシル（ＤＣＨＰ）、フタル酸ジアミル（ＤＡＰ）、リン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、リン酸ジフェニルクレジル（ＣＤＰ）、リン酸トリクレジル（ＴＣＰ）等が特に好ましい。
本発明において、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を均一溶解させる第一の方法は、該樹脂を押出機等の連続式樹脂混練装置に投入し、樹脂を加熱溶融させながら任意の比率で可塑剤を導入してスクリュー混練することにより、均一溶液を得る方法である。投入する樹脂の形態は、粉末状、顆粒状、ペレット状の何れでもよい。また、このような方法によって均一溶解させる場合は、可塑剤の形態は常温液体であることが好ましい。押出機としては、単軸スクリュー式押出機、二軸異方向スクリュー式押出機、二軸同方向スクリュー式押出機等が使用できる。
熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を均一溶解させる第二の方法は、ヘンシェルミキサー等の撹拌装置を用いて、樹脂と可塑剤を予め混合して分散させ、得られた組成物を押出機等の連続式樹脂混練装置に投入して溶融混練することにより、均一溶液を得る方法である。投入する組成物の形態については、可塑剤が常温液体である場合はスラリー状とし、可塑剤が常温固体である場合は粉末状や顆粒状等とすればよい。
熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を均一溶解させる第三の方法は、ブラベンダーやミル等の簡易型樹脂混練装置を用いる方法や、その他のバッチ式混練容器内で溶融混練する方法である。該方法によれば、バッチ式の工程となるため生産性は良好とは言えないが、簡易でかつ柔軟性が高いという利点がある。
本発明において、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を熱可塑性樹脂の結晶融点以上の温度に加熱均一溶解させた後、Ｔダイやサーキュラーダイ、環状紡口の吐出口から平膜状、中空糸状の形状に押出した後に、冷却固化させて膜を成型する（（ａ）の工程）。冷却固化させて膜を成型する（ａ）の工程において、緻密構造層を形成すると共に膜表面に隣接して粗大構造層を形成する。
本発明においては、均一に加熱溶解した熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を吐出口から吐出させ、下記に定義するドラフト比が１以上１２以下となるような引取速度で該膜を引取りながら、該熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を有する不揮発性液体を、該温度が１００℃以上に加熱された状態で、膜の一方の表面に接触させ、他方の膜表面を冷却することによって粗大構造層と緻密構造層を形成させる。
ドラフト比＝（膜の引取速度）／（組成物の吐出口における吐出速度）
上記ドラフト比は好ましくは１．５以上９以下、より好ましくは１．５以上７以下である。ドラフト比が１未満では膜にテンションがかからないために成型性が低下し、１２を超える場合は、膜が引伸ばされるために、充分な厚みの粗大構造層を形成させることが難しい。ここで言う組成物の吐出口における吐出速度は次式で与えられる。
組成物の吐出口における吐出速度＝（単位時間当りに吐出されるの組成物の体積）／（吐出口の面積）
吐出速度の好ましい範囲は１〜６０ｍ／分であり、より好ましくは３〜４０ｍ／分である。吐出速度が１ｍ／分未満の場合は、生産性が低下することに加えて、吐出量の変動が大きくなる等の問題が発生する。反対に、吐出速度が６０ｍ／分を超える場合は、吐出量が多いために吐出口で乱流が発生し、吐出状態が不安定になる場合がある。
引取速度は吐出速度に合わせて設定することができるが、好ましくは１〜２００ｍ／分であり、より好ましくは３〜１５０ｍ／分である。引取速度が１ｍ／分未満の場合は、生産性、成型性が低下し、引取速度が２００ｍ／分を超える場合は、冷却時間が短くなる、膜にかかるテンションが大きくなることによって膜の断裂が起き易くなる。
粗大構造層を形成させる好ましい方法は、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を押出し口から平膜状又は中空糸状の膜に押出して形成された未硬化の膜の一方の表面を、熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性液体に接触させる方法である。この場合、接触液体の膜内部への拡散と熱可塑性樹脂の部分的な溶解によって粗大構造層が形成される。ここで言う熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ液体とは、５０ｗｔ％の濃度で熱可塑性樹脂と混合した際に１００℃以上の温度で初めて均一溶液を形成し得る液体であって、１００℃以上２５０℃以下の温度で均一溶液を形成し得る液体が好ましく、１２０℃以上２００℃以下の温度で均一溶液を形成し得る液体が更に好ましい。１００℃未満の温度で均一溶解する液体を接触液体として使用した場合は、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物溶液の冷却固化が妨げられるために成型性が低下したり、粗大構造層が必要以上に厚くなったり、或いは孔径が大きくなり過ぎる等の不都合が発生する場合がある。２５０℃未満の温度で均一溶液を形成できない液体の場合は、熱可塑性樹脂に対する溶解性が低いために充分な厚みの粗大構造層を形成させることが難しい。また、ここで言う不揮発性の液体とは、１０１３２５Ｐａにおける沸点が２５０℃を超える液体である。
例えば、熱可塑性樹脂としてポリフッ化ビニリデン樹脂を選択した場合には、エステル鎖の炭素鎖長が７以下のフタル酸エステル類、アジピン酸エステル類、セバシン酸エステル類、エステル鎖の炭素鎖長が８以下のリン酸エステル類、クエン酸エステル類等が好適に使用でき、特にフタル酸ジヘプチル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジメチル、アジピン酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、リン酸トリ（２−エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリブチル等が好適に使用できる。
但し、例外的にエステル鎖にフェニル基、クレジル基、シクロヘキシル基等の環状構造を有する可塑剤、即ちフタル酸ジシクロヘキシル（ＤＣＨＰ）、フタル酸ジアミル（ＤＡＰ）、リン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、リン酸ジフェニルクレジル（ＣＤＰ）、リン酸トリクレジル（ＴＣＰ）等は粗大構造層を形成させる能力が小さく好ましくない。
また、粗大構造層を導入させるために使用される接触液体の温度は１００℃以上、好ましくは１２０℃以上、熱可塑性樹脂と可塑剤の均一溶液の温度以下、更に好ましくは１３０℃以上、（熱可塑性樹脂と可塑剤の均一溶液の温度−１０℃）以下である。該接触液体の温度が１００℃未満である場合は、熱可塑性樹脂に対する溶解性が低いために充分な厚みの粗大構造層を形成することが難しくなる傾向にある。熱可塑性樹脂と可塑剤の均一溶液の温度を超える場合には、成型性が低下する。
微多孔膜の片面のみに粗大構造層を導入する場合、緻密構造層側に相当する他方の表面の冷却方法は従来の方法に従うことができる。即ち、熱伝導体に接触させて冷却することにより行う。熱伝導体としては、金属、水、空気、又は可塑剤自身が使用できる。具体的には、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む均一溶液をＴダイ等を介してシート状に押し出し、金属製のロールに接触冷却させ、かつロールと接触しない側の膜面を熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性の液体に接触させることによって粗大構造層を導入する方法が可能である。また、樹脂と可塑剤の均一溶液をサーキュラーダイや環状紡口等を介して円筒状ないし中空糸状に押し出し、該円筒ないし中空糸の内側に熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性の液体を通すことによって内表面側に粗大構造層を形成させ、外側を水などの冷却媒体に接触させて冷却する方法も可能である。
微多孔膜の両面に粗大構造層を導入する場合は、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む均一溶液をＴダイやサーキュラーダイ環状紡口等を介して所定の形状に押出し、溶液の両面に熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性の液体を接触させて粗大構造層を形成させた後冷却固化させる。この際の冷却方法は従来の方法に従うことができる。熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性の液体を接触させてから冷却を開始するまでの時間が長くなると、成型性が低下する、膜の強度が低下する等の不都合が発生するため、接触液体を接触させてから冷却を開始するまでの時間は３０秒以下が好ましく、より好ましくは２０秒以下、特に好ましくは１０秒以下である。
本発明の微多孔膜の製造方法において、小孔径で均質な緻密構造層を形成させるには、冷却固化させる際の冷却速度を充分に速くすることが好ましい。冷却速度は５０℃／分以上が好ましく、より好ましくは１００〜１×１０^５℃／分、さらに好ましくは２００〜２×１０^４℃／分である。具体的な方法としては金属製の冷却ロールや水に接触させる方法が好適に用いられるが、特に、水に接触させる方法が、水の蒸発によって急速な冷却を達成することができるため好ましい。
該可塑剤の実質的な部分を除去する工程（ｂ）においては、可塑剤を除去するために抽出溶剤を使用する。抽出溶剤は熱可塑性樹脂に対して貧溶媒であり、かつ可塑剤に対して良溶媒であり、沸点が微多孔膜の融点より低いことが好ましい。このような抽出溶剤としては、例えば、ヘキサンやシクロヘキサン等の炭化水素類、塩化メチレンや１，１，１−トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、エタノールやイソプロパノール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、又は水が挙げられる。
本発明において、可塑剤を除去する第一の方法は、抽出溶剤が入った容器中に所定の大きさに切り取った微多孔膜を浸漬し充分に洗浄した後に、付着した溶剤を風乾させるか又は熱風によって乾燥させることにより行う。この際、浸漬の操作や洗浄の操作を多数回繰り返して行うと微多孔膜中に残留する可塑剤が減少するので好ましい。また、浸漬、洗浄、乾燥の一連の操作中に微多孔膜の収縮が抑えられるために、微多孔膜の端部を拘束することが好ましい。
可塑剤を除去する第二の方法は、抽出溶剤で満たされた槽の中に連続的に微多孔膜を送り込み、可塑剤を除去するのに充分な時間をかけて槽中に浸漬し、しかる後に付着した溶剤を乾燥させることにより行う。この際、槽内部を多段分割することにより濃度差がついた各槽に順次微多孔膜を送り込む多段法や、微多孔膜の走行方向に対し逆方向から抽出溶剤を供給して濃度勾配をつけるための向流法のような公知の手段を適用すると、抽出効率が高められ好ましい。第一、第二の方法においては、何れも可塑剤を微多孔膜から実質的に除去することが重要である。実質的に除去するとは、分離膜としての性能を損なわない程度に微多孔膜中の可塑剤を除去することを指し、微多孔膜中に残存する可塑剤の量は１ｗｔ％以下となることが好ましく、さらに好ましくは１００質量ｐｐｍ以下である。微多孔膜中に残存する可塑剤の量は、ガスクロマトグラフィや液体クロマトグラフィ等で定量することができる。また、抽出溶剤の温度を、該溶剤の沸点未満の温度、好ましくは（沸点−５℃）以下の範囲内で加温すると、可塑剤と溶剤との拡散を促進することができるので抽出効率を高められ更に好ましい。
本発明においては、可塑剤を除去する工程の前若しくは後、又は両方において、微多孔膜に加熱処理を施すと、可塑剤を除去した際の微多孔膜の収縮の低減、微多孔膜の強度の向上、及び耐熱性の向上といった効果が得られる。加熱処理の方法としては、熱風中に微多孔膜を配して行う方法、熱媒中に微多孔膜を浸漬して行う方法、又は加熱温調した金属製のロール等に微多孔膜を接触させて行う方法がある。寸法を固定した状態で加熱処理を行うと、特に微細な孔の閉塞を防ぐことができるために好ましい。
加熱処理の温度は、目的や熱可塑性樹脂の融点によって変化するが、ウイルス除去用途に使用するフッ化ビニリデン膜の場合は、１２１〜１７５℃が好ましく、１２５〜１７０℃であることがより好ましい。１２１℃は一般的な高圧蒸気滅菌で用いられる温度であり、この温度以上で加熱処理を行えば高圧蒸気滅菌の際の収縮や変形を防ぐことができる。１７５℃を超えると、フッ化ビニリデンの融点に近いために、加熱処理中に膜が破断する、細孔が潰れる等の不都合が発生する可能性がある。
物理的強度に優れた疎水性樹脂からなる微多孔膜は、高いろ過圧に耐え得る点では、セルロース等の親水性樹脂からなる微多孔膜と比較して優れる反面、タンパク質等の吸着、膜の汚染や目詰まり等が生じやすく、濾過速度の急激な低下を引き起こす。そのため、疎水性樹脂からなる微多孔膜を用いる場合、タンパク等の吸着による閉塞を防ぐために、膜へ親水性を付与することが好ましい。本発明の製造方法においては、グラフト重合法によって疎水性膜の細孔表面に親水性官能基を導入し、タンパク等の吸着性を低減させることが好ましい。
グラフト重合法とは、電離性放射線や化学反応等の手段によって高分子微多孔膜にラジカルを生成させ、そのラジカルを開始点として、該膜にモノマーをグラフト重合させる反応である。
本発明において、高分子微多孔膜にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用し得るが、膜全体に均一なラジカルを生成させるためには、電離性放射線の照射が好ましい。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が最も好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、最も好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。１ｋＧｙ未満ではラジカルが均一に生成せず、１０００ｋＧｙを超えると膜強度の低下を引き起こすことがある。
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に膜にラジカルを生成した後、次いでそれを反応性化合物と接触させる前照射法と、膜を反応性化合物と接触させた状態で膜にラジカルを生成させる同時照射法に大別される。本発明においては、いかなる方法も適用し得るが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
本発明においては、反応性化合物として１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーと、必要に応じて架橋剤を用い、ラジカルを生成した高分子微多孔膜に接触させる。該接触させる方法は気相でも液相でも行うことができるが、グラフト反応が均一に進む液相で接触させる方法が好ましい。グラフト反応を更に均一に進めるために、１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーをあらかじめ溶媒中に溶解させてから、架橋剤を用いる場合は該親水性ビニルモノマーと架橋剤をあらかじめ溶媒中に溶解させてから、高分子微多孔膜と接触させることが好ましい。
上記したように、本発明の親水性微多孔膜は、高分子微多孔膜に、１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーをグラフト重合し、細孔表面に親水性を付与し、タンパク質等の生理活性物質の吸着を低減させる。本発明における１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーとは、大気圧下で、２５℃の純水に１体積％混合させた時に均一溶解する１個のビニル基を有するモノマーである。該親水性ビニルモノマーとしては、例えば、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシブチルアクリレート等のヒドロキシル基を有する、又はその前駆体となる官能基を有するビニルモノマー、ビニルピロリドン等のアミド結合を有するビニルモノマー、アクリルアミド等のアミノ基を有するビニルモノマー、ポリエチレングリコールモノアクリレート等のポリエチレングリコール鎖を有するビニルモノマー、メタクリル酸トリエチルアンモニウムエチル等のアニオン交換基を有するビニルモノマー、メタクリル酸スルホプロピル等のカチオン交換基を有するビニルモノマー等が挙げられる。
本発明においては、上記の親水性ビニルモノマーの中でも、１個以上のヒドロキシル基、又はその前駆体となる官能基を有するビニルモノマーを用いることが、膜の後退接触角を低下させ好ましい。より好ましくは、ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等のアクリル酸又はメタクリル酸と多価アルコールのエステル類、アリルアルコール等の不飽和結合を有するアルコール類、及び酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のエノールエステル類等を用い、最も好ましくはヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等のアクリル酸又はメタクリル酸と多価アルコールのエステル類を用いる。ヒドロキシプロピルアクリレートをグラフトした親水性微多孔膜は、後退接触角が低く、かつ充分なグロブリン透過性能を得ることができる。
２個以上のビニル基を有するビニルモノマーは、たとえ親水性であっても共重合することにより親水性の散漫層が架橋され、タンパクの透過性を低下させる傾尚があることからタンパクの透過性の点からは好ましくないが、膜同士の固着を抑制したり、膜からの溶出を低減させる等の効果があることから、架橋剤として必要に応じて使用することが可能である。
架橋剤として使用する２個以上のビニル基を有するビニルモノマーは、細孔表面のタンパク質の吸着性を考慮すると後退接触角が低い方が有利であるため、親水性の架橋剤を用いることが好ましい。親水性架橋剤とは、大気圧下で、２５℃の純水に１体積％混合させた時に均一溶解する、ビニル基を２個以上有するモノマーである。
これらの架橋剤、つまり２個以上のビニル基を有するビニルモノマーを使用する場合は、１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーに対して、好ましくは１０ｍｏｌ％以下、より好ましくは０．０１〜１０ｍｏｌ％、更に好ましくは０．０１〜７ｍｏｌ％、最も好ましくは０．０１〜５ｍｏｌ％の割合で用いて共重合させる。１０ｍｏｌ％を超えるとタンパクの透過性が充分ではない。
本発明において使用する架橋剤は、数平均分子量２００以上、２０００以下であることが好ましく、より好ましくは数平均分子量２５０以上、１０００以下、最も好ましくは数平均分子量３００以上、６００以下である。架橋剤の数平均分子量が２００以上、２０００以下であることがタンパク質溶液の濾過速度の点から好ましい。
本発明で用いられる架橋剤、つまり２個以上のビニル基を有するビニルモノマーの具体例としては、例えば、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート等が挙げられ、それ以外の２個以上のビニル基を有するビニルモノマーとしては、ジビニルベンゼン誘導体、トリメチロールプロパントリメタクリレートのような３個の反応性基を有する架橋剤も用いることができる。これらの架橋剤は２種類以上の混合物も用いることができるが、親水性であることが好ましい。特にポリエチレングリコールジアクリレートが後退接触角やタンパク透過性の点から好ましい。
１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマー、及び必要に応じて用いる架橋剤を溶解する溶媒は、均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマー、及び必要に応じて用いる架橋剤を溶解させる際の濃度は、３体積％から３０体積％までが好ましく、より好ましくは３体積％から２０体積％、最も好ましくは３体積％から１５体積％である。３体積％以上の濃度であれば十分な親水性が得られ好ましい。３０体積％を超えると親水化層によって孔が埋まる場合があり、透過性能が低下する傾向があり好ましくない。
グラフト重合時に用いる、１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマー、及び必要に応じて用いる架橋剤を溶媒に溶解させた反応液の量は、高分子微多孔膜１ｇに対して１×１０^−５ｍ^３〜１×１０^−３ｍ^３が好ましい。反応液の量が１×１０^−５ｍ^３〜１×１０^−３ｍ^３であれば均一性が充分な膜が得られる。
グラフト重合時の反応温度は、一般的に２０℃〜８０℃で行われるが、特に限定されるものではない。
本発明は、疎水性微多孔膜に最適な親水化層を導入し、高いタンパク透過性を実現する。そのために、疎水性微多孔膜にグラフトされるグラフト率は、好ましくは３％以上、５０％以下、更に好ましくは４％以上、４０％以下、最も好ましくは６％以上、３０％以下である。グラフト率が３％未満であると膜の親水性が不足し、タンパク質の吸着に伴うろ過速度の急激な低下を引き起こす。５０％を超えると、比較的小さな孔が親水化層によって埋まってしまい、充分なろ過速度が得られない。ここで言うグラフト率とは、以下の式で定義される値である。
グラフト率（％）＝１００×｛（グラフト後の膜質量−グラフト前の膜質量）／グラフト前の膜質量｝
本発明の親水性微多孔膜を構成する組成物には、更に目的に応じて、酸化防止剤、結晶核剤、帯電防止剤、難燃剤、滑剤、紫外線吸収剤等の添加剤を混合しても差し支えない。
本発明の耐熱性を有する親水性微多孔膜は、ウイルスや細菌等の除去、濃縮、又は培地等に利用できる医用分離膜、薬液や処理水等から微粒子を除去する産業プロセス用フィルター、油水分離や液ガス分離用の分離膜、上下水の浄化を目的とする分離膜、リチウムイオン電池等のセパレーター、及びポリマー電池用の固体電解質支持体等の広範囲な用途に利用できるものである。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例において示される試験方法は次の通りである。
（１）中空糸の外径、内径、膜厚
中空糸形状の微多孔膜の外径、内径は、該膜の垂直割断面を実体顕微鏡（モリテック（株）製 ＳＣＯＰＥＭＡＮ５０３）を使用して２１０倍の倍率で撮影することにより求めた。膜厚は中空糸の外直径と内直径との差の１／２として計算した。
（２）空孔率
微多孔膜の体積と質量を測定し、得られた結果から次式を用いて気孔率を計算した。
空孔率（％）＝（１−質量÷（樹脂の密度×体積））×１００
（３）透水量
定圧デッドエンド濾過による温度２５℃の純水の透過量を測定し、膜面積、濾過圧力（０．１ＭＰａ）、及び濾過時間から、次式の通りに計算して透水量とした。
透水量（ｍ^３／ｍ^２／秒／Ｐａ）＝透過量÷（膜面積×差圧×濾過時間）
（４）最大孔径
ＡＳＴＭ Ｆ３１６−８６に準拠したバブルポイント法により求まるバブルポイント（Ｐａ）を最大孔径（ｎｍ）として換算した。膜を浸漬する試験液として表面張力が１２ｍＮ／ｍの炭化フッ素液体（住友スリーエム社製 パーフルオロカーボンクーラントＦＸ−３２５０商品名）を用いた。バブルポイントは、有効長８ｃｍの中空糸膜一本をバブルポイント測定装置にセットした後、中空部側の徐々に圧力を上げ、膜を透過するガス流量が２．４Ｅ−３リットル／分となった時の圧力とした。
（５）微多孔膜の構造観察
適当な大きさに切り取った微多孔膜を導電性両面テープにより試料台に固定し、金コーティングを施して検鏡用試料とした。高分解能走査型電子顕微鏡装置（ＨＲＳＥＭ）（日立製作所（株）製 Ｓ−９００）を用い、加速電圧５．０ｋＶ、及び所定倍率で微多孔膜の表面及び断面の構造観察を行った。
（６）開孔率、平均開孔率
開孔率は、微多孔膜の断面構造の観察結果を厚み方向に厚み１μｍ毎に分割し、画像処理解析によって各分割領域において空隙が占める面積分率として求めた。このときの電子顕微鏡撮影は倍率１５０００倍で行った。平均開孔率は膜厚全体について測定した開孔率の平均値である。
（７）粗大構造層の厚み、緻密構造層の膜厚全体に占める割合
上記の開孔率の測定において、各分割領域が本文に定義する緻密構造層及び粗大構造層の定義に合致するかを判定した。即ち、粗大構造層は、膜表面に隣接して存在し、厚み方向に測定した開孔率が膜厚全体における開孔率の平均値より２％以上大きい連続した領域であり、緻密構造層は、粗大構造部分以外の領域において、厚み方向に測定した開孔率が粗大構造層を除いた領域の開孔率の平均値に対して±２％未満の範囲内にある領域である。緻密構造部分の膜厚全体に占める割合は、合致する分割領域の厚みの和を全体の膜厚で割った値である。
（８）粗大構造層側表面の平均孔径
粗大構造層側表面の構造観察結果から、画像処理解析によって、表面に存在する孔の数と面積を計測し、孔を真円と仮定して孔１個当りの平均面積から円相当径を求めた。この円相当径を粗大構造層側表面の平均孔径とした。このときの電子顕微鏡（日立製作所（株）製 Ｓ−９００）撮影は倍率６０００倍で行った。
（９）膜の接触角測定
膜の水に対する後退接触角は、注射用水（大塚製薬（株）製 日本薬局方）を用い、動的接触角測定器（ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ社製 ＤＣＡＴ１１）で測定した。中空糸状膜を約２ｃｍに切断し、該装置に装着した。後退接触角はウィルヘルミ法の原理を用いて測定した。測定時のモータースピードは０．１０ｍｍ／秒、浸漬深さは１０ｍｍで、前進及び後退を１サイクルとして、５サイクルの測定を行った。後退接触角は５回測定によって得られた値の平均値を用いた。
（１０）ウシ免疫グロブリンの吸着量
ウシ免疫グロブリンは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のウシ免疫グロブリン溶液を、生理食塩液（大塚製薬（株）製 日本薬局方）で希釈して０．０１ｗｔ％とし、濾過原液として用いた。該濾過原液を濾過圧力０．３ＭＰａ、濾過温度２５℃の条件で定圧デッドエンド濾過を行い、濾過開始から５０リットル／ｍ^２の濾液を分取した。濾過原液及び濾液の、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、次式からウシ免疫グロブリンの吸着量を算出した。
ウシ免疫グロブリン吸着量（ｍｇ／ｇ）＝（濾過原液吸光度−濾液吸光度）／濾過原液吸光度）×０．００５／膜重量
（１１）３ｗｔ％ウシ免疫ブロブリン溶液の濾過試験
ウシ免疫グロブリンは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のウシ免疫グロブリン溶液を、日本薬局方の生理食塩液（大塚製薬（株）製）で希釈して３ｗｔ％とし、更に濾過膜（旭化成（株）製、ＰＬＡＮＯＶＡ３５Ｎ）で前濾過して夾雑物を除いたものを濾過原液として用いた。該濾過原液中のウシ免疫グロブリンの分子量分布を液体クロマトグラフィー（東ソー社製 ＣＣＰ＆８０２０シリーズ、アマシャムバイオサイエンス社製 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０）を用いて測定した結果、２量体以上の多量体の占める割合は２０ｗｔ％以下であった。該濾過原液を濾過圧力０．３ＭＰａ、濾過温度２５℃の条件で定圧デッドエンド濾過を行い、濾過開始時から５分間、濾過開始時から５５〜６０分の透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）を測定した。
（１２）ブタパルボウイルスの対数除去率
濾過元液として、５％牛胎児血清（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を含むダルベッコＭＥＭ培地溶液（日本生物医薬研究所製）で培養したＥＳＫ細胞（ブタ腎臓細胞）に、ブタパルボウイルスを感染させた時の培養上清を微多孔膜（旭化成（株）製、ＰＬＡＮＯＶＡ３５Ｎ）で前濾過したものを用いた。該濾過元液を濾過圧力０．３ＭＰａ、濾過温度２５℃の条件で定圧デッドエンド濾過を行った。濾液は５ｍｌ（５リットル／ｍ^２）毎に１１フラクションを採取し、濾過開始時から５５リットル／ｍ^２濾過時におけるブタパルボウイルス対数除去率を測定するために、各フラクションから１ｍｌずつ採取し混合した。濾過元液と濾液（混合液と最初及び最後のフラクション）中のブタパルボウイルス濃度の測定は、それぞれの液をＥＳＫ細胞に加えて１０日間培養した後、ニワトリ新鮮赤血球（日本バイオテスト研究所製）の凝集反応を利用して、ＴＣＩＤ_５０測定法により行った。

ポリフッ化ビニリデン樹脂（ＳＯＬＶＡＹ社製、ＳＯＦＥＦ１０１２、結晶融点１７３℃）４９ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル（大阪有機化学工業（株）製 工業品）５１ｗｔ％からなる組成物を、ヘンシェルミキサーを用いて７０℃で攪拌混合した後、冷却して粉体状としたものをホッパーより投入し、二軸押出機（東洋精機（株）製 ラボプラストミル ＭＯＤＥＬ ５０Ｃ １５０）を用いて２１０℃で溶融混合し均一溶解した。続いて、中空内部に温度が１３０℃のフタル酸ジブチル（三建化工（株）製）を８ｍｌ／分の速度で流しつつ、内直径０．８ｍｍ、外直径１．１ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度１７ｍ／分で中空糸状に押し出し、４０℃に温調された水浴中で冷却固化させて、６０ｍ／分の速度でカセに巻き取った。その後、９９％メタノール変性エタノール（今津薬品工業（株）製 工業品）でフタル酸ジシクロヘキシル及びフタル酸ジブチルを抽出除去し、付着したエタノールを水で置換した後、水中に浸漬した状態で高圧蒸気滅菌装置（平山製作所（株）製 ＨＶ−８５）を用いて１２５℃の熱処理を１時間施した。その後、付着した水をエタノールで置換した後、オーブン中で６０℃の温度で乾燥することにより中空糸状の微多孔膜を得た。抽出から乾燥にかけての工程では、収縮を防止するために膜を定長状態に固定して処理を行った。
続いて、上記の微多孔膜に対し、グラフト法による親水化処理を行った。反応液は、ヒドロキシプロピルアクリレート（東京化成（株）製 試薬グレード）を８体積％となるように、３−ブタノール（純正科学（株）試薬特級）の２５体積％水溶液に溶解させ、４０℃に保持した状態で、窒素バブリングを２０分間行ったものを用いた。まず、窒素雰囲気下において、該微多孔膜をドライアイスで−６０℃に冷却しながら、Ｃｏ６０を線源としてγ線を１００ｋＧｙ照射した。照射後の膜は、１３．４Ｐａ以下の減圧下に１５分間静置した後、上記反応液と該膜を４０℃で接触させ、１時間静置した。その後、膜をエタノールで洗浄し、６０℃真空乾燥を４時間行い、微多孔膜を得た。得られた膜は水に接触させた時に自発的に細孔内に水が浸透することを確認した。得られた膜の性能を評価した結果、表１に示すように高い性能を示した。

ポリフッ化ビニリデン樹脂３９ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル６１ｗｔ％からなる組成物を、内直径０．８ｍｍ、外直径１．２ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出した以外は実施例１に従って中空糸状の微多孔膜を得た。
続いて、上記の微多孔膜に対し、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表１に示すように高い性能を示した。

ポリフッ化ビニリデン樹脂４６ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル５４ｗｔ％からなる組成物を均一溶解し、続いて、中空内部にリン酸ジフェニルクレジル（大八化学（株）製 工業品）を７ｍｌ／分の速度で流しつつ、内直径０．８ｍｍ、外直径１．２ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度５．５ｍ／分で中空糸状に押し出した以外は実施例２に従って中空糸状の微多孔膜を得た。
続いて、上記の微多孔膜に対し、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表１に示すように高い性能を示した。

実施例１で得られた膜に対し、親水化処理を行った。反応液としてヒドロキシプロピルアクリレートを７．５２体積％、ポリエチレングリコールジアクリレート（アルドリッチ社製、平均分子量２５８）を０．１５体積％（ヒドロキシプロピルアクリレートに対して１ｍｏｌ％）、ポリエチレングリコールジアクリレート（アルドリッチ社製、平均分子量５７５）を０．３３体積％（ヒドロキシプロピルアクリレートに対して１ｍｏｌ％）となるように、３−ブタノールの２５体積％水溶液に溶解させたものを用いた以外は実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表１に示すように高い性能を示した。

実施例１で得られた膜に対し、親水化処理を行った。反応液として４−ヒドロキシブチルアクリレート（東京化成工業（株）製）を８体積％となるように、３−ブタノールの２５体積％水溶液に溶解させたものを用いた以外は、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表２に示すように高い性能を示した。

ポリフッ化ビニリデン樹脂４８ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル５２ｗｔ％からなる組成物を均一溶解し、続いて、中空内部にフタル酸ジブチルを１０ｍｌ／分の速度で流しつつ、内直径０．８ｍｍ、外直径１．０５ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度２０ｍ／分で中空糸状に押し出した以外は実施例１に従って中空糸状の微多孔膜を得た。続いて、上記の微多孔膜に対し、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表２に示すように高い性能を示した。

ポリフッ化ビニリデン樹脂５０ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル５０ｗｔ％からなる組成物を用いた以外は実施例１に従って中空糸状の微多孔膜を得た。
続いて、上記の微多孔膜に対し、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表２に示すように高い性能を示した。
比較例１
実施例１で得られた膜に対して、反応液としてヒドロキシプロピルアクリレートを１．２３体積％、ポリエチレングリコールジアクリレート（アルドリッチ社製、平均分子量２５８）を０．６１体積％（ヒドロキシプロピルアクリレートに対して２５ｍｏｌ％）、ポリエチレングリコールジアクリレート（アルドリッチ社製、平均分子量５７５）を１．３６体積％（ヒドロキシプロピルアクリレートに対して２５ｍｏｌ％）となるように、３−ブタノールの２５体積％水溶液に溶解させたものを用いた以外、実施例１と同様の親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表３に示すように、３％ウシ免疫グロブリン溶液の濾過速度の経時的な低下が激しいことがわかる。これは、多量の架橋剤を含む反応液を用いて親水化したため、膜に充分な粗大構造層が存在しても、グロブリンの吸着により濾過速度を低下させたためであると考えられる。
比較例２
ポリフッ化ビニリデン樹脂とフタル酸ジシクロヘキシルからなる組成物を均一溶解し、続いて、中空内部にフタル酸ジヘプチルを７ｍｌ／分の速度で流しつつ、内直径０．８ｍｍ、外直径１．２ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度５．５ｍ／分で中空糸状に押し出した以外は実施例１に従って中空糸状の微多孔膜を得た。
続いて、上記の微多孔膜に対し、親水化処理を行った。反応液として、ヒドロキシプロピルアクリレートとポリエチレングリコールジメタクリレート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製 平均分子量５５０）を、それぞれ１．１体積％及び０．６体積％となるように、３−ブタノールの２５体積％水溶液に溶解させたものを用いた以外は実施例１にしたがって親水化処理を行った。得られた膜は水に接触させたときに自発的に細孔内に水が浸透することを確認した。得られた膜の性能を評価した結果、表３に示すように３％ウシグロブリンの透過能が極めて低かった。

実施例１で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。

実施例４で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。

実施例５で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。

実施例６で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。

実施例７で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。

産業上の利用の可能性

本発明の親水性微多孔膜によれば、ウイルス混入の危険性のある医薬品又はその原料の生理活性物質溶液の濾過において、ウイルスの除去性能と生理活性物質の透過性能を実用的なレベルで両立し得る分離膜を提供できる。

【書類名】明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス等の微粒子の除去に適した親水性微多孔膜に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血漿分画製剤やバイオ医薬品の精製工程において、ウイルスや病原性タンパク質等の病原体を除去し、安全性を高める技術が求められている。ウイルス等の病原体を除去する方法に膜濾過法がある。この膜濾過法は、ふるい分け原理により、粒子の大きさに応じて分離操作を行うため、病原体の種類、及び病原体の化学的な性質や熱的性質に拘わらず、全ての病原体に有効である。したがって、近年、膜濾過法による病原体除去の工業的な実用化が広まってきている。
【０００３】
病原体の中でも、感染性ウイルスによる感染は重篤な疾病を引き起こすため、混入ウイルス除去の必要性が極めて高い。ウイルスの種類は、最も小さいもので直径１８〜２４ｎｍ程度のパルボウイルス等があり、中程度のものでは直径約４０〜４５ｎｍ程度の日本脳炎ウイルス、比較的大きいものでは直径８０〜１００ｎｍ程度のＨＩＶ等がある。このようなウイルス群を膜濾過法によって物理的に除去するためには孔径１０〜１００ｎｍ程度の微多孔膜が必要であり、近年、特にパルボウイルス等の小型ウイルスの除去に対するニーズが高まっている。
【０００４】
一方、血漿分画製剤やバイオ医薬品の精製工程において膜濾過法を適用する場合、ウイルス除去能力を高めるばかりでなく、生産性を向上させるために、生理活性物質が高速かつ大量に透過することが望まれる。
しかしながら、除去すべき対象物がパルボウイルスのような小ウイルスである場合、その大きさが１８〜２４ｎｍと極めて小さいために、これまでの技術では、ウイルス除去性と生理活性物質の透過量や透過速度を両立させることは困難であった。
即ち、従来の微多孔膜は、ヒト免疫グロブリンや血液凝固VIII因子等の高分子量の生理活性物質が十分な透過速度で透過するが、パルボウイルス等の小ウイルスは除去できないという欠点を有しているか、或いは、パルボウイルス等の小ウイルスは除去できるが、ヒト免疫グロブリンや血液凝固VIII因子等の高分子量の生理活性物質が実質的な透過速度で透過しないという欠点を有している。
【０００５】
国際公開第９１／１６９６８号パンフレット（特許文献１）には、重合開始剤と親水性モノマーを含む溶液を膜に含浸させ、細孔中で重合させることにより高分子量化し、親水性樹脂を細孔表面に付着させる方法が開示されている。しかしながら該方法では、細孔表面に親水性樹脂が付着しているに過ぎないため、反応によって生成した低分子量体を洗浄する際に、付着していた親水性樹脂の一部が溶出し、膜の親水性が失われやすいといった欠点がある。また、溶出を防ぐために架橋剤を多量に用いて共重合を行うと、タンパク溶液の高い透過性が得られない。
【０００６】
特開平０７−２６５６７４号公報（特許文献２）には、小さな粒子を溶液から効果的に除去し得る、ヤギ免疫グロブリンに対する吸着性の小さいポリフッ化ビニリデン膜が記載されている。この膜は、溶液からのウイルス除去には有用であると記載されている。しかしながら、実施例によると、この親水性膜はヤギ免疫グロブリンに対して少量の吸着性を示しており、本発明のようなグロブリン等の生理活性物質に対する充分な透過性を有していない。
【０００７】
特開昭６２−１７９５４０号公報（特許文献３）には、ポリオレフィンからなる中空糸状多孔膜に中性ヒドロキシル基を含む側鎖がグラフトされた親水性中空糸状多孔膜が記載されている。しかしながら、実施例には平均孔径０．１〜０．１６μｍの親水性微多孔膜の記載があるのみであり、最大孔径が１０〜１００ｎｍのような小孔径の微多孔膜についての記載はない。
【０００８】
特表平０７−５０５８３０号公報（特許文献４）には、ポリオレフィンや部分的にフッ素化されたポリオレフィン等の疎水性微多孔膜に紫外線等を照射し、２個の反応性基を有する２官能性モノマーを重合する方法が記載されている。しかし上記の方法では、親水性の散漫層が架橋されることにより親水性が失われ、十分なタンパク質溶液の濾過速度が得られない。
【０００９】
国際公開第０１／１４０４７号パンフレット（特許文献５）には、パルボウイルスの対数除去率が３以上であり、かつ、単量体の占める割合が８０％以上のウシ免疫グロブリンの透過率が７０％以上である生理活性物質用濾過膜が記載されている。しかしながら、ここで開示されている主たる膜はセルロースを素材とした中空糸であり、水に濡れた状態での力学強度は低いために、濾過圧を高くすることができないため、高い透過速度を実現することは極めて難しい。
【特許文献１】 国際公開第９１／１６９６８号パンフレット
【特許文献２】 特開平０７−２６５６７４号公報
【特許文献３】 特開昭６２−１７９５４０号公報
【特許文献４】 特表平０７−５０５８３０号公報
【特許文献５】 国際公開第０１／１４０４７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、パルボウイルス等の小ウイルスに対する高い除去能を有し、かつ、グロブリンや血液凝固第VIII因子のような高分子量の生理活性物質を高速かつ大量に透過し得る親水性微多孔膜を提供することを目的とする。
【発明を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の通りである。
１．熱可塑性樹脂を含み、親水化処理を施された、最大孔径１０〜１００ｎｍの親水性微多孔膜であって、単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たし、かつ、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ｂと略称する）が下記式（２）を満たす上記親水性微多孔膜：
グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）。
２．最大孔径が１０〜７０ｎｍである上記１に記載の親水性微多孔膜。
３．最大孔径が１０〜３６ｎｍである上記１に記載の親水性微多孔膜。
４．水の後退接触角が０〜２０度である上記１〜３のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
５．濾過開始から５５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率が３以上である上記１〜４のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
６．濾過開始から５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率と５０リットル／ｍ^２透過した後更に５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率がいずれも３以上である上記１〜５のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
７．単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から３時間の積算透過量が５０リットル／ｍ^２以上である上記１〜６のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
８．前記熱可塑性樹脂を含む微多孔膜が、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが２μｍ以上、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であり、かつ該粗大構造層と該緻密構造層層が一体化している微多孔膜である上記１〜７のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
９．前記粗大構造層の厚みが３μｍ以上である上記８記載の親水性微多孔膜。
１０．前記粗大構造層の厚みが５μｍ以上である上記８記載の親水性微多孔膜。
１１．前記熱可塑性樹脂がポリフッ化ビニリデンである上記１〜１０のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
１２．前記親水化処理が、ビニル基を１個有する親水性ビニルモノマーの微多孔膜の細孔表面へのグラフト重合反応である上記１〜１１のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
１３．前記親水性ビニルモノマーが、ヒドロキシル基を含む上記１２に記載の親水性微多孔膜。
１４．０．０１ｗｔ％ウシ免疫グロブリン溶液を用いて０．３ＭＰａで定圧デッドエンド濾過を行い、濾過開始から５０リットル／ｍ^２の濾液を分取したときの膜１ｇ当りの吸着量が３ｍｇ以下である上記１〜１３のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
１５．生理活性物質を含有する液体中からウイルスを除去することに用いられる上記１〜１４のいずれかに記載の親水性微多孔膜。
１６．濾過開始から５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率と５０リットル／ｍ^２透過した後更に５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率がいずれも３以上であり、かつ単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たし、かつ、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ｂと略称する）が下記式（２）を満たすことを特徴とする親水性微多孔膜：
グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、パルボウイルス等の小ウイルスに対する高い除去能を有し、かつ、グロブリンや血液凝固第VIII因子のような高分子量の生理活性物質を高速かつ大量に透過し得る親水性微多孔膜を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の親水性微多孔膜において、バブルポイント法で求めた最大孔径は、グロブリン等の生理活性物質の透過性や濾過速度の点から１０ｎｍ以上が好ましく、より好ましくは１５ｎｍ以上である。また、バブルポイント法で求めた最大孔径の上限は１００ｎｍ以下が好ましく、除去対象であるウイルス等のサイズによって変化するが、日本脳炎ウイルス等の中型ウイルスを除去するためには７０ｎｍ以下、特にパルボウイルス等の小ウイルスを除去対象とする場合は３６ｎｍ以下であることが好ましい。ここで言う最大孔径は、ＡＳＴＭ Ｆ３１６−８６に準拠したバブルポイント法で測定した値である。
【００１４】
本発明の親水性微多孔膜の表面にはスキン層が存在しないことが好ましい。スキン層が存在すると、タンパク等の生理活性物質を含有する溶液に含まれる懸濁物質が膜表面において堆積するため、透過性能の急激な低下が起きる可能性がある。ここで言うスキン層とは、膜表面に隣接して存在し、孔径が膜内部に比べて小さい層を指し、その厚みは通常１μｍ以下である。
【００１５】
本発明の親水性微多孔膜は、単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３
ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（以下、グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たすものである。
グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
即ち、本発明の親水性微多孔膜は、グロブリン透過速度Ａは、０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５より大きいことが必要であり、好ましくは０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．８０以上、より好ましくは０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．８５以上、最も好ましくは０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．９０以上である。グロブリン濾過速度Ａが０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５より大きければ、血漿分画製剤やバイオ医薬品等の製造におけるウイルス除去を工業規模で実施するに充分な透過速度を確保することができる。
【００１６】
また、本発明の親水性微多孔膜は、グロブリン濾過速度Ａと単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（以下、グロブリン濾過速度Ｂと略称する）とが下記式（２）を満たすことが必要である。
グロブリン濾過速度Ｂ／グロブリン濾過速度Ａ＞０．２ （２）
【００１７】
本発明の親水性微多孔膜において、グロブリン濾過速度Ｂ／グロブリン濾過速度Ａ（以下、濾過速度の比と略称す）は、好ましくは０．３以上、より好ましくは０．４以上である。濾過速度の比が０．２より大きければ、濾過速度の維持が充分となり、血漿分画製剤やバイオ医薬品等の製造におけるウイルス除去を工業規模で実施することができる。
【００１８】
本発明の親水性微多孔膜のウイルス除去能は、濾過開始時から５５リットル／ｍ^２濾過時（以下、０〜５５リットル／ｍ^２濾過時と称す）におけるブタパルボウイルス対数除去率が３以上であることが好ましく、より好ましくは３．５以上、そして最も好ましくは４以上である。０〜５５リットル／ｍ^２濾過時におけるブタパルボウイルス対数除去率が３以上であれば、生理活性物質を含む溶液からヒトパルボウイルスＢ１９やポリオウイルス等の小ウイルスを除去するウイルス除去フィルターとしての使用に耐え得る。更に、ヒトパルボウイルスＢ１９やポリオウイルス等の小ウイルスを除去できると言うことは、更に大きなＣ型肝炎ウイルスや、ヒト後天性免疫不全ウイルス等は、更に高い確率で除去できることを示している。
【００１９】
また、濾液中のウイルス濃度は、濾過量によって変化する場合があるが、当然ながら、濾過量が増えた場合でもウイルス除去能の低下のない、低下しても低下率の小さい膜が望まれる。本発明の親水性微多孔膜は、濾過開始時から５リットル／ｍ^２濾過時（以下、０〜５リットル／ｍ^２濾過時と称す）と５０リットル／ｍ^２濾過した後更に５リットル／ｍ^２濾過時（以下、５０〜５５リットル／ｍ^２濾過時と称す）におけるブタパルボウイルス対数除去率がいずれも３以上であることが好ましく、より好ましくはいずれも３．５以上、最も好ましくはいずれも４以上である。０〜５リットル／ｍ^２濾過時と５０〜５５リットル／ｍ^２濾過時におけるブタパルボウイルスがいずれも３以上であるということは、膜のウイルス除去能の持続性が充分に高いことを表す指標となる。
【００２０】
血漿分画製剤やバイオ医薬品中のタンパク質は、疎水性の膜に吸着しやすい、即ち親水性の膜には吸着し難いといった性質を持ち、膜の親水性の度合いは、水の接触角によって評価することができる。接触角の測定法には、静的接触角法と動的接触角法の２つがあるが、表面のダイナミクスに対する知見が得られる動的接触角法が好ましい。動的接触角法の中でもウェルヘルミ法による測定法が試料形状の自由度が高くより好ましい。
【００２１】
水の接触角でも水の後退接触角は水中での膜表面の親水性を直接反映するため、膜の親水性を判断する上で重要な指標となる。本発明の親水性微多孔膜は、水の後退接触角が０〜２０度であることが好ましく、より好ましくは０〜１５度、更に好ましくは０〜１０度、そして最も好ましくは０〜５度である。水の後退接触角が２０度を超えると、膜の親水性が不十分であり、タンパク質の吸着による濾過速度の急激な低下を引き起こす。
【００２２】
本発明の親水性微多孔膜の形態は、平膜状、中空糸状等、いずれの形状でも適用可能であるが、製造し易さの観点から中空糸状が好ましい。
【００２３】
本発明の親水性微多孔膜の膜厚は、好ましくは１５μｍ〜１０００μｍ、より好ましくは１５μｍ〜５００μｍ、そして最も好ましくは２０μｍ〜１００μｍである。膜厚が１５μｍ以上であれば、微多孔膜の強度が充分であるばかりでなく、ウイルス除去の確実性も充分である。１０００μｍを超えると透過性能が低下する傾向にあるので好ましくない。
【００２４】
本発明における親水性微多孔膜の空孔率は、２０〜９０％であり、好ましくは３０〜８５％、そしてより好ましくは４０〜８０％である。空孔率が２０％未満であると濾過速度が充分でなく、９０％を超えるとウイルス除去の確実性が低下するとともに、微多孔膜の強度が充分でなくなる傾向にあり好ましくない。
【００２５】
本発明の親水性微多孔膜の透水量は、孔径によって変化するが、好ましくは２×１０^−１１〜３×１０^−８であり、更に好ましくは４×１０^−１１〜１．５×１０^−８であり、最も好ましくは５×１０^−１１〜８．５×１０^−９である。該透水量の単位はｍ^３／ｍ^２／秒／Ｐａである。透水量が２×１０^−１１以上であれば分離膜として使用し得る充分な透水量が得られることから好ましい。また、親水性微多孔膜の強度の保持、あるいはウイルス等の除去の確実性を勘案すると３×１０^−８を超える透水量は現実性に乏しい。
【００２６】
本発明の親水性微多孔膜の表面及び細孔表面は、グロブリン等のタンパク質に対して殆ど吸着性を示さないことが好ましい。吸着性の度合いは、代表的な血漿タンパク質であるグロブリンの希薄溶液を透過させ、濾過原液及び濾液中に含まれるタンパク質を吸光度計で定量することで評価できる。１００質量ｐｐｍに希釈したウシ免疫グロブリン溶液を透過させたときの膜１ｇ当りの吸着量が３ｍｇ以下であることが好ましく、より好ましくは２ｍｇ以下、そして最も好ましくは１ｍｇ以下である。
【００２７】
本発明の親水性微多孔膜は、最大孔径が１０〜１００ｎｍであることが好ましく、下記式（１）及び式（２）を満足すればどのような構造の微多孔膜であってもよいが、開孔率が大きい粗大構造層と開孔率が小さい緻密構造層を有し、かつ上記粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが２μｍ以上であり、上記緻密構造層が膜厚全体の５０％以上である微多孔膜であって、該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している構造の微多孔膜であることが好ましい。これは、そのような構造であれば、式（１）を満足する初期濾過速度と式（２）を満足する濾過速度の維持を確保し易くなるからである。
グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）
【００２８】
好ましい構造の微多孔膜を以下に説明する。
該微多孔膜において、粗大構造層は少なくとも一方の膜表面に存在することが好ましく、該粗大構造層の厚みは２μｍ以上が好ましく、より好ましくは３μｍ以上、更に好ましくは５μｍ以上、特に好ましくは８μｍ以上である。粗大構造層は、プレフィルター機能を有し、夾雑物の閉塞による濾過速度の低下を緩和する。孔径の小さな微多孔膜ほど、生理活性物質中に含まれる夾雑物が濾過速度の低下を引き起こしやすいため、粗大構造層の厚みが厚いことが好ましい。
【００２９】
また、緻密構造層の厚みは膜厚全体の５０％以上が好ましい。緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であれば、ウイルス等の除去性能を低下させることなく使用できる。より好ましくは５５％以上であり、特に好ましくは６０％以上である。
【００３０】
上記粗大構造層は膜厚全体の中で相対的に開孔率が大きい部分であり、タンパク溶液等に含まれる懸濁物質に対してプレフィルター機能を発揮することにより膜の処理能力を向上させる。また、上記緻密構造層は膜厚全体の中で相対的に開孔率が小さく、実質的に膜の孔径を規定している部分である。ウイルス等の微粒子を除去する目的の微多孔膜においては該微粒子の除去機能を有する層である。
【００３１】
本発明において空孔率及び開孔率は、いずれも微多孔膜における空隙部分の容積比率に対応するもので基本概念は同じであるが、空孔率は、膜の断面積及び長さから求めた見かけ体積と該膜の質量及び膜素材の真密度から求めた数値であるのに対し、開孔率は、膜の断面において、膜断面に対する空隙部分が占める面積比率であって、膜断面の電子顕微鏡写真の画像解析から求められる。本発明においては、開孔率は、膜厚方向に一定の厚み毎に測定され、膜厚方向の空隙部分の容積比率の変化を調べるために用いられ、測定の精度から厚み１μｍ毎に測定している。
【００３２】
具体的には、開孔率は、微多孔膜の膜表面に垂直な方向の断面構造の観察結果を厚み方向に厚み１μｍ毎に分割し、画像処理解析によって各分割領域において求めた開孔率をある一定の膜厚領域で平均した開孔率であり、膜厚全体の平均開孔率は各分割領域において求めた開孔率を膜厚全体で平均して求めた開孔率である。
【００３３】
本発明において、粗大構造層とは、膜表面に隣接して存在する開孔率の大きい層であり、好ましくは（Ａ）開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋２．０％以上の層（以下、（Ａ）の粗大構造層という）であり、より好ましくは＋２．５％以上の層であり、特に好ましくは＋３．０％以上の層である。粗大構造層の開孔率の上限は、膜厚全体の平均開孔率＋３０％以下が好ましく、より好ましくは膜厚全体の平均開孔率＋２５％以下、特に好ましくは平均開孔率２０％以下である。粗大構造層の開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋２．０％以上であれば、緻密構造層との構造差も充分に大きく、プレフィルター効果を発現でき、微多孔膜の処理能力を増大させる効果がある。また、粗大構造層の開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋３０％より大きい場合は、粗大構造層の構造が必要以上に粗になり、充分なプレフィルター機能を有しない傾向があり好ましくない。
【００３４】
また、粗大構造層は、膜表面から緻密構造層に向かって開孔率が連続的に減少する傾斜構造であることが好ましい。この好ましい理由は、開孔率が連続的に減少するとともに孔径も連続的に小さくなることにより、表面近傍で大きな懸濁物質が除去され、内部に入るにつれて小さな懸濁物質が段階的に除去されることにより、粗大構造層のプレフィルター機能を向上させているものと推察される。開孔率が粗大構造層と緻密構造層の境界で不連続に大きく変化する場合は、境界近傍に懸濁物質が堆積することによって濾過速度の低下を招くために好ましくない。ここで言う開孔率が連続的に減少する傾斜構造とは、膜厚方向における全体的な傾向を指しており、構造ムラや測定誤差に起因する開孔率の局所的な多少の逆転があってもよい。
【００３５】
粗大構造層は、開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋５．０％以上である層を含むことが好ましく、膜厚全体の平均開孔率＋８．０％以上の層を含むことが更に好ましい。粗大構造層が、開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋５．０％以上である層を含む場合は、緻密構造層より充分に大きな孔径の層を有していることを示しており、粗大構造層は充分なプレフィルター機能を発揮することが可能となる。開孔率の最大値を有する層は、膜表面に存在するか、或いは膜表面近傍に存在することが好ましい。
【００３６】
また、該微多孔膜においては、粗大構造層が隣接する膜表面の平均孔径は、少なくともバブルポイント法で求めた最大孔径の２倍以上であることが好ましく、より好ましくは、バブルポイント法で求めた最大孔径の３倍以上である。粗大構造層の隣接する膜表面の平均孔径が、バブルポイント法で求めた最大孔径の２倍未満である場合は、孔径が小さすぎるため、表面で懸濁物質の堆積が起こり、濾過速度が低下する傾向があることから好ましくない。該微多孔膜がウイルス等の微粒子除去用に用いられる場合には、粗大構造層の隣接する膜表面の平均孔径は３μｍ以下であることが好ましく、２μｍ以下であることがより好ましい。該平均孔径が３μｍを超えると、プレフィルター機能が低下する傾向にあり好ましくない。
【００３７】
緻密構造層とは、開孔率が小さい層であり、好ましくは（Ｂ）開孔率が、膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満であって、かつ（膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満の層の開孔率の平均値）±２．０％（両端を含む）の範囲内にある層（以下、（Ｂ）の緻密構造層という）である。緻密構造層の開孔率が、（膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満の層の開孔率の平均値）±２．０％（両端を含む）の範囲内にあるということは、緻密構造層が比較的均質な構造を持っていることを意味し、このことはデプス濾過によってウイルス等を除去する際に重要である。緻密構造層の均質性は高いほど好ましく、開孔率の変動幅は±２％の範囲内であることが好ましく、更に好ましくは±１％の範囲内である。緻密構造層の構造例としては、国際公開第０１／２８６６７号パンフレットに開示されている球晶内ボイド構造などが好ましく適用できる。
【００３８】
また、該微多孔膜において、上記の（Ａ）の粗大構造層及び（Ｂ）の緻密構造層のいずれにも属さない中間的領域が存在してもよい。ここで言う中間的領域とは、開孔率が膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満であるが、［膜厚全体の平均開孔率＋２．０％未満の層の開孔率の平均値］±２．０％（両端を含む）の範囲内に入らない層に対応する。このような層は、通常は（Ａ）の粗大構造層と（Ｂ）の緻密構造層の境界部分に存在する。
【００３９】
また、該微多孔膜は、粗大構造層と緻密構造層が一体化していることが好ましい。この粗大構造層と緻密構造層が一体化しているとは、微多孔膜の製造時に粗大構造層と緻密構造層が、同時に形成されることを言う。この際、粗大構造層と緻密構造層の境界部分に中間的領域が存在してもよい。大孔径の支持体上に比較的小孔径な層をコートすることによって製造される膜や、孔径の異なる膜を重ね合わせた積層膜よりも、粗大構造層と緻密構造層が一体化していることが好ましい。コートすることによって製造される膜や、孔径の異なる膜を重ね合わせた積層膜は、二つの層の間で、孔の連結性が低くなったり、孔径が大きく不連続に変化するため、支持体とコート層の間に懸濁物質が堆積しやすいという欠点を有する。
【００４０】
本発明の親水性微多孔膜の製造方法を以下に説明する。
本発明の微多孔膜を製造するのに使用される熱可塑性樹脂は、通常の圧縮、押出、射出、インフレーション、及びブロー成型に使用される結晶性を有する熱可塑性樹脂であり、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ４−メチル１−ペンテン樹脂等のポリオレフィン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリエチレンテレナフタレート樹脂、ポリブチレンナフタレート樹脂、ポリシクロヘキシレンジメチレンテレフタレート樹脂等のポリエステル樹脂、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン４６等のポリアミド樹脂、ポリフッ化ビニリデン樹脂、エチレン／テトラフルオロエチレン樹脂、ポリクロロトリフルオロエチレン樹脂等のフッ素系樹脂、ポレフェニレンエーテル樹脂、及びポリアセタール樹脂等が使用できる。
【００４１】
上記の熱可塑性樹脂の中で、ポリオレフィン樹脂やフッ素系樹脂は、耐熱性と成型加工性のバランスが良いために好ましく、なかでもポリフッ化ビニリデン樹脂は特に好ましい。ここで言うポリフッ化ビニリデン樹脂とは、基本骨格にフッ化ビニリデン単位を含むフッ素系樹脂を指すものであり、一般にはＰＶＤＦの略称で呼ばれる樹脂である。このようなポリフッ化ビニリデン樹脂としては、フッ化ビニリデン（ＶＤＦ）のホモ重合体や、ヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）、ペンタフルオロプロピレン（ＰＦＰ）、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、クロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）、及びパーフルオロメチルビニルエーテル（ＰＦＭＶＥ）のモノマー群から選んだ１種又は２種のモノマーとフッ化ビニリデン（ＶＤＦ）との共重合体を使用することができる。また、該ホモ重合体及び該共重合体を混合して使用することもできる。本発明においては、ホモ重合体を３０〜１００ｗｔ％含むポリフッ化ビニリデン樹脂を使用すると微多孔膜の結晶性が向上し高強度となるために好ましく、ホモ重合体のみを使用すると更に好ましい。
【００４２】
本発明において使用する熱可塑性樹脂の平均分子量は、５万〜５００万であることが好ましく、より好ましくは１０万〜２００万、更に好ましくは１５万〜１００万である。該平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定により得られる重量平均分子量を指すものであるが、一般に平均分子量が１００万を超えるような樹脂については、正確なＧＰＣ測定が困難であるので、その代用として粘度法による粘度平均分子量を採用することができる。重量平均分子量が５万より小さいと、溶融成型の際のメルトテンションが小さくなり成形性が悪くなったり、膜の力学強度が低くなったりするので好ましくない。重量平均分子量が５００万を超えると、均一な溶融混練が難しくなるために好ましくない。
【００４３】
本発明において使用する熱可塑性樹脂のポリマー濃度は、熱可塑性樹脂及び可塑剤を含む組成物中２０〜９０ｗｔ％が好ましく、より好ましくは３０〜８０ｗｔ％、そして最も好ましくは３５〜７０ｗｔ％である。ポリマー濃度が２０ｗｔ％未満になると、製膜性が低下する、充分な力学強度が得られない等の不都合が発生する。また、ウイルス除去用の膜としては、得られる微多孔膜の孔径が大きくなりウイルス除去性能が不充分となる。ポリマー濃度が９０ｗｔ％を超えると、得られる微多孔膜の孔径が小さくなりすぎるとともに、空孔率が小さくなるため、濾過速度が低下し、実用に耐えない。
【００４４】
本発明において使用する可塑剤としては、微孔膜を製造する組成で熱可塑性樹脂と混合した際に樹脂の結晶融点以上において均一溶液を形成し得る不揮発性溶媒を用いる。ここでいう不揮発性溶媒とは、大気圧下において２５０℃以上の沸点を有するものである。可塑剤の形態は、概ね常温２０℃において、液体であっても固体であっても差し支えない。また、熱可塑性樹脂との均一溶液を冷却した際に、常温以上の温度において熱誘起型固液相分離点を持つような、いわゆる固液相分離系の可塑剤を用いることが、ウイルス除去に用いられるような小孔径かつ均質な緻密構造層を有する膜を製造する上で好ましい。可塑剤の中には、熱可塑性樹脂との均一溶液を冷却した際に、常温以上の温度において熱誘起型液液相分離点を有するものもあるが、一般に、液液相分離系の可塑剤を用いた場合は、得られた微多孔膜は大孔径化する傾向がある。ここで用いられる可塑剤は単品又は複数の物質の混合物であってもよい。
【００４５】
熱誘起型固液相分離点を測定する方法は、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む所定濃度の組成物を予め溶融混練したものを試料として用い、熱分析（ＤＳＣ）により該樹脂の発熱ピーク温度を測定することにより求めることができる。また、該樹脂の結晶化点を測定する方法は、予め該樹脂を溶融混練したものを試料として用い、同様に熱分析により求めることができる。
【００４６】
ウイルス除去に用いられるような小孔径かつ均質な緻密構造層を有する膜を製造する際に好ましく用いられる可塑剤としては、国際公開第０１／２８６６７号パンフレットに開示されている可塑剤が挙げられる。即ち、下記の式で定義する組成物の相分離点降下定数が０〜４０℃である可塑剤であり、好ましくは１〜３５℃の可塑剤、更に好ましくは５〜３０℃の可塑剤である。相分離点降下定数が４０℃を超えると、孔径の均質性や強度が低下してしまうために好ましくない。
α＝１００×（Ｔ_ｃ ^０−Ｔ_ｃ）÷（１００−Ｃ）
（式中、αは相分離温度降下定数（℃）、Ｔ_ｃ ^０は熱可塑性樹脂の結晶化温度（℃）、Ｔ_ｃは組成物の熱誘起固液相分離点（℃）、Ｃは組成物中の熱可塑性樹脂の濃度（ｗｔ％）を表す。）
例えば熱可塑性樹脂としてポリフッ化ビニリデン樹脂を選択した場合には、フタル酸ジシクロヘキシル（ＤＣＨＰ）、フタル酸ジアミル（ＤＡＰ）、リン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、リン酸ジフェニルクレジル（ＣＤＰ）、リン酸トリクレジル（ＴＣＰ）等が特に好ましい。
【００４７】
本発明において、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を均一溶解させる第一の方法は、該樹脂を押出機等の連続式樹脂混練装置に投入し、樹脂を加熱溶融させながら任意の比率で可塑剤を導入してスクリュー混練することにより、均一溶液を得る方法である。投入する樹脂の形態は、粉末状、顆粒状、ペレット状の何れでもよい。また、このような方法によって均一溶解させる場合は、可塑剤の形態は常温液体であることが好ましい。押出機としては、単軸スクリュー式押出機、二軸異方向スクリュー式押出機、二軸同方向スクリュー式押出機等が使用できる。
【００４８】
熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を均一溶解させる第二の方法は、ヘンシェルミキサー等の撹拌装置を用いて、樹脂と可塑剤を予め混合して分散させ、得られた組成物を押出機等の連続式樹脂混練装置に投入して溶融混練することにより、均一溶液を得る方法である。投入する組成物の形態については、可塑剤が常温液体である場合はスラリー状とし、可塑剤が常温固体である場合は粉末状や顆粒状等とすればよい。
【００４９】
熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を均一溶解させる第三の方法は、ブラベンダーやミル等の簡易型樹脂混練装置を用いる方法や、その他のバッチ式混練容器内で溶融混練する方法である。該方法によれば、バッチ式の工程となるため生産性は良好とは言えないが、簡易でかつ柔軟性が高いという利点がある。
本発明において、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を熱可塑性樹脂の結晶融点以上の温度に加熱均一溶解させた後、Ｔダイやサーキュラーダイ、環状紡口の吐出口から平膜状、中空糸状の形状に押出した後に、冷却固化させて膜を成型する（（ａ）の工程）。冷却固化させて膜を成型する（ａ）の工程において、緻密構造層を形成すると共に膜表面に隣接して粗大構造層を形成する。
【００５０】
本発明においては、均一に加熱溶解した熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を吐出口から吐出させ、下記に定義するドラフト比が１以上１２以下となるような引取速度で該膜を引取りながら、該熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を有する不揮発性液体を、該温度が１００℃以上に加熱された状態で、膜の一方の表面に接触させ、他方の膜表面を冷却することによって粗大構造層と緻密構造層を形成させる。
ドラフト比＝（膜の引取速度）／（組成物の吐出口における吐出速度）
【００５１】
上記ドラフト比は好ましくは１．５以上９以下、より好ましくは１．５以上７以下である。ドラフト比が１未満では膜にテンションがかからないために成型性が低下し、１２を超える場合は、膜が引伸ばされるために、充分な厚みの粗大構造層を形成させることが難しい。ここで言う組成物の吐出口における吐出速度は次式で与えられる。
組成物の吐出口における吐出速度＝（単位時間当りに吐出されるの組成物の体積）／（吐出口の面積）
【００５２】
吐出速度の好ましい範囲は１〜６０ｍ／分であり、より好ましくは３〜４０ｍ／分である。吐出速度が１ｍ／分未満の場合は、生産性が低下することに加えて、吐出量の変動が大きくなる等の問題が発生する。反対に、吐出速度が６０ｍ／分を超える場合は、吐出量が多いために吐出口で乱流が発生し、吐出状態が不安定になる場合がある。
【００５３】
引取速度は吐出速度に合わせて設定することができるが、好ましくは１〜２００ｍ／分であり、より好ましくは３〜１５０ｍ／分である。引取速度が１ｍ／分未満の場合は、生産性、成型性が低下し、引取速度が２００ｍ／分を超える場合は、冷却時間が短くなる、膜にかかるテンションが大きくなることによって膜の断裂が起き易くなる。
【００５４】
粗大構造層を形成させる好ましい方法は、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物を押出し口から平膜状又は中空糸状の膜に押出して形成された未硬化の膜の一方の表面を、熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性液体に接触させる方法である。この場合、接触液体の膜内部への拡散と熱可塑性樹脂の部分的な溶解によって粗大構造層が形成される。ここで言う熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ液体とは、５０ｗｔ％の濃度で熱可塑性樹脂と混合した際に１００℃以上の温度で初めて均一溶液を形成し得る液体であって、１００℃以上２５０℃以下の温度で均一溶液を形成し得る液体が好ましく、１２０℃以上２００℃以下の温度で均一溶液を形成し得る液体が更に好ましい。１００℃未満の温度で均一溶解する液体を接触液体として使用した場合は、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む組成物溶液の冷却固化が妨げられるために成型性が低下したり、粗大構造層が必要以上に厚くなったり、或いは孔径が大きくなり過ぎる等の不都合が発生する場合がある。２５０℃未満の温度で均一溶液を形成できない液体の場合は、熱可塑性樹脂に対する溶解性が低いために充分な厚みの粗大構造層を形成させることが難しい。また、ここで言う不揮発性の液体とは、１０１３２５Ｐａにおける沸点が２５０℃を超える液体である。
【００５５】
例えば、熱可塑性樹脂としてポリフッ化ビニリデン樹脂を選択した場合には、エステル鎖の炭素鎖長が７以下のフタル酸エステル類、アジピン酸エステル類、セバシン酸エステル類、エステル鎖の炭素鎖長が８以下のリン酸エステル類、クエン酸エステル類等が好適に使用でき、特にフタル酸ジヘプチル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジメチル、アジピン酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、リン酸トリ（２−エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリブチル等が好適に使用できる。
但し、例外的にエステル鎖にフェニル基、クレジル基、シクロヘキシル基等の環状構造を有する可塑剤、即ちフタル酸ジシクロヘキシル（ＤＣＨＰ）、フタル酸ジアミル（ＤＡＰ）、リン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、リン酸ジフェニルクレジル（ＣＤＰ）、リン酸トリクレジル（ＴＣＰ）等は粗大構造層を形成させる能力が小さく好ましくない。
【００５６】
また、粗大構造層を導入させるために使用される接触液体の温度は１００℃以上、好ましくは１２０℃以上、熱可塑性樹脂と可塑剤の均一溶液の温度以下、更に好ましくは１３０℃以上、（熱可塑性樹脂と可塑剤の均一溶液の温度−１０℃）以下である。該接触液体の温度が１００℃未満である場合は、熱可塑性樹脂に対する溶解性が低いために充分な厚みの粗大構造層を形成することが難しくなる傾向にある。熱可塑性樹脂と可塑剤の均一溶液の温度を超える場合には、成型性が低下する。
【００５７】
微多孔膜の片面のみに粗大構造層を導入する場合、緻密構造層側に相当する他方の表面の冷却方法は従来の方法に従うことができる。即ち、熱伝導体に接触させて冷却することにより行う。熱伝導体としては、金属、水、空気、又は可塑剤自身が使用できる。具体的には、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む均一溶液をＴダイ等を介してシート状に押し出し、金属製のロールに接触冷却させ、かつロールと接触しない側の膜面を熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性の液体に接触させることによって粗大構造層を導入する方法が可能である。また、樹脂と可塑剤の均一溶液をサーキュラーダイや環状紡口等を介して円筒状ないし中空糸状に押し出し、該円筒ないし中空糸の内側に熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性の液体を通すことによって内表面側に粗大構造層を形成させ、外側を水などの冷却媒体に接触させて冷却する方法も可能である。
【００５８】
微多孔膜の両面に粗大構造層を導入する場合は、熱可塑性樹脂と可塑剤を含む均一溶液をＴダイやサーキュラーダイ環状紡口等を介して所定の形状に押出し、溶液の両面に熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性の液体を接触させて粗大構造層を形成させた後冷却固化させる。この際の冷却方法は従来の方法に従うことができる。熱可塑性樹脂に対して部分的な溶解性を持つ不揮発性の液体を接触させてから冷却を開始するまでの時間が長くなると、成型性が低下する、膜の強度が低下する等の不都合が発生するため、接触液体を接触させてから冷却を開始するまでの時間は３０秒以下が好ましく、より好ましくは２０秒以下、特に好ましくは１０秒以下である。
【００５９】
本発明の微多孔膜の製造方法において、小孔径で均質な緻密構造層を形成させるには、冷却固化させる際の冷却速度を充分に速くすることが好ましい。冷却速度は５０℃／分以上が好ましく、より好ましくは１００〜１×１０^５℃／分、さらに好ましくは２００〜２×１０^４℃／分である。具体的な方法としては金属製の冷却ロールや水に接触させる方法が好適に用いられるが、特に、水に接触させる方法が、水の蒸発によって急速な冷却を達成することができるため好ましい。
【００６０】
該可塑剤の実質的な部分を除去する工程（ｂ）においては、可塑剤を除去するために抽出溶剤を使用する。抽出溶剤は熱可塑性樹脂に対して貧溶媒であり、かつ可塑剤に対して良溶媒であり、沸点が微多孔膜の融点より低いことが好ましい。このような抽出溶剤としては、例えば、ヘキサンやシクロヘキサン等の炭化水素類、塩化メチレンや１，１，１−トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、エタノールやイソプロパノール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、又は水が挙げられる。
【００６１】
本発明において、可塑剤を除去する第一の方法は、抽出溶剤が入った容器中に所定の大きさに切り取った微多孔膜を浸漬し充分に洗浄した後に、付着した溶剤を風乾させるか又は熱風によって乾燥させることにより行う。この際、浸漬の操作や洗浄の操作を多数回繰り返して行うと微多孔膜中に残留する可塑剤が減少するので好ましい。また、浸漬、洗浄、乾燥の一連の操作中に微多孔膜の収縮が抑えられるために、微多孔膜の端部を拘束することが好ましい。
【００６２】
可塑剤を除去する第二の方法は、抽出溶剤で満たされた槽の中に連続的に微多孔膜を送り込み、可塑剤を除去するのに充分な時間をかけて槽中に浸漬し、しかる後に付着した溶剤を乾燥させることにより行う。この際、槽内部を多段分割することにより濃度差がついた各槽に順次微多孔膜を送り込む多段法や、微多孔膜の走行方向に対し逆方向から抽出溶剤を供給して濃度勾配をつけるための向流法のような公知の手段を適用すると、抽出効率が高められ好ましい。第一、第二の方法においては、何れも可塑剤を微多孔膜から実質的に除去することが重要である。実質的に除去するとは、分離膜としての性能を損なわない程度に微多孔膜中の可塑剤を除去することを指し、微多孔膜中に残存する可塑剤の量は１ｗｔ％以下となることが好ましく、さらに好ましくは１００質量ｐｐｍ以下である。微多孔膜中に残存する可塑剤の量は、ガスクロマトグラフィや液体クロマトグラフィ等で定量することができる。また、抽出溶剤の温度を、該溶剤の沸点未満の温度、好ましくは（沸点−５℃）以下の範囲内で加温すると、可塑剤と溶剤との拡散を促進することができるので抽出効率を高められ更に好ましい。
【００６３】
本発明においては、可塑剤を除去する工程の前若しくは後、又は両方において、微多孔膜に加熱処理を施すと、可塑剤を除去した際の微多孔膜の収縮の低減、微多孔膜の強度の向上、及び耐熱性の向上といった効果が得られる。加熱処理の方法としては、熱風中に微多孔膜を配して行う方法、熱媒中に微多孔膜を浸漬して行う方法、又は加熱温調した金属製のロール等に微多孔膜を接触させて行う方法がある。寸法を固定した状態で加熱処理を行うと、特に微細な孔の閉塞を防ぐことができるために好ましい。
【００６４】
加熱処理の温度は、目的や熱可塑性樹脂の融点によって変化するが、ウイルス除去用途に使用するフッ化ビニリデン膜の場合は、１２１〜１７５℃が好ましく、１２５〜１７０℃であることがより好ましい。１２１℃は一般的な高圧蒸気滅菌で用いられる温度であり、この温度以上で加熱処理を行えば高圧蒸気滅菌の際の収縮や変形を防ぐことができる。１７５℃を超えると、フッ化ビニリデンの融点に近いために、加熱処理中に膜が破断する、細孔が潰れる等の不都合が発生する可能性がある。
【００６５】
物理的強度に優れた疎水性樹脂からなる微多孔膜は、高いろ過圧に耐え得る点では、セルロース等の親水性樹脂からなる微多孔膜と比較して優れる反面、タンパク質等の吸着、膜の汚染や目詰まり等が生じやすく、濾過速度の急激な低下を引き起こす。そのため、疎水性樹脂からなる微多孔膜を用いる場合、タンパク等の吸着による閉塞を防ぐために、膜へ親水性を付与することが好ましい。本発明の製造方法においては、グラフト重合法によって疎水性膜の細孔表面に親水性官能基を導入し、タンパク等の吸着性を低減させることが好ましい。
グラフト重合法とは、電離性放射線や化学反応等の手段によって高分子微多孔膜にラジカルを生成させ、そのラジカルを開始点として、該膜にモノマーをグラフト重合させる反応である。
【００６６】
本発明において、高分子微多孔膜にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用し得るが、膜全体に均一なラジカルを生成させるためには、電離性放射線の照射が好ましい。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が最も好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
【００６７】
電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、最も好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。１ｋＧｙ未満ではラジカルが均一に生成せず、１０００
ｋＧｙを超えると膜強度の低下を引き起こすことがある。
【００６８】
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に膜にラジカルを生成した後、次いでそれを反応性化合物と接触させる前照射法と、膜を反応性化合物と接触させた状態で膜にラジカルを生成させる同時照射法に大別される。本発明においては、いかなる方法も適用し得るが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
【００６９】
本発明においては、反応性化合物として１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーと、必要に応じて架橋剤を用い、ラジカルを生成した高分子微多孔膜に接触させる。該接触させる方法は気相でも液相でも行うことができるが、グラフト反応が均一に進む液相で接触させる方法が好ましい。グラフト反応を更に均一に進めるために、１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーをあらかじめ溶媒中に溶解させてから、架橋剤を用いる場合は該親水性ビニルモノマーと架橋剤をあらかじめ溶媒中に溶解させてから、高分子微多孔膜と接触させることが好ましい。
【００７０】
上記したように、本発明の親水性微多孔膜は、高分子微多孔膜に、１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーをグラフト重合し、細孔表面に親水性を付与し、タンパク質等の生理活性物質の吸着を低減させる。本発明における１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーとは、大気圧下で、２５℃の純水に１体積％混合させた時に均一溶解する１個のビニル基を有するモノマーである。該親水性ビニルモノマーとしては、例えば、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシブチルアクリレート等のヒドロキシル基を有する、又はその前駆体となる官能基を有するビニルモノマー、ビニルピロリドン等のアミド結合を有するビニルモノマー、アクリルアミド等のアミノ基を有するビニルモノマー、ポリエチレングリコールモノアクリレート等のポリエチレングリコール鎖を有するビニルモノマー、メタクリル酸トリエチルアンモニウムエチル等のアニオン交換基を有するビニルモノマー、メタクリル酸スルホプロピル等のカチオン交換基を有するビニルモノマー等が挙げられる。
【００７１】
本発明においては、上記の親水性ビニルモノマーの中でも、１個以上のヒドロキシル基、又はその前駆体となる官能基を有するビニルモノマーを用いることが、膜の後退接触角を低下させ好ましい。より好ましくは、ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等のアクリル酸又はメタクリル酸と多価アルコールのエステル類、アリルアルコール等の不飽和結合を有するアルコール類、及び酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のエノールエステル類等を用い、最も好ましくはヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等のアクリル酸又はメタクリル酸と多価アルコールのエステル類を用いる。ヒドロキシプロピルアクリレートをグラフトした親水性微多孔膜は、後退接触角が低く、かつ充分なグロブリン透過性能を得ることができる。
【００７２】
２個以上のビニル基を有するビニルモノマーは、たとえ親水性であっても共重合することにより親水性の散漫層が架橋され、タンパクの透過性を低下させる傾向があることからタンパクの透過性の点からは好ましくないが、膜同士の固着を抑制したり、膜からの溶出を低減させる等の効果があることから、架橋剤として必要に応じて使用することが可能である。
【００７３】
架橋剤として使用する２個以上のビニル基を有するビニルモノマーは、細孔表面のタンパク質の吸着性を考慮すると後退接触角が低い方が有利であるため、親水性の架橋剤を用いることが好ましい。親水性架橋剤とは、大気圧下で、２５℃の純水に１体積％混合させた時に均一溶解する、ビニル基を２個以上有するモノマーである。
【００７４】
これらの架橋剤、つまり２個以上のビニル基を有するビニルモノマーを使用する場合は、１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマーに対して、好ましくは１０ｍｏｌ％以下、より好ましくは０．０１〜１０ｍｏｌ％、更に好ましくは０．０１〜７ｍｏｌ％、最も好ましくは０．０１〜５ｍｏｌ％の割合で用いて共重合させる。１０ｍｏｌ％を超えるとタンパクの透過性が充分ではない。
【００７５】
本発明において使用する架橋剤は、数平均分子量２００以上、２０００以下であることが好ましく、より好ましくは数平均分子量２５０以上、１０００以下、最も好ましくは数平均分子量３００以上、６００以下である。架橋剤の数平均分子量が２００以上、２０００以下であることがタンパク質溶液の濾過速度の点から好ましい。
【００７６】
本発明で用いられる架橋剤、つまり２個以上のビニル基を有するビニルモノマーの具体例としては、例えば、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート等が挙げられ、それ以外の２個以上のビニル基を有するビニルモノマーとしては、ジビニルベンゼン誘導体、トリメチロールプロパントリメタクリレートのような３個の反応性基を有する架橋剤も用いることができる。これらの架橋剤は２種類以上の混合物も用いることができるが、親水性であることが好ましい。特にポリエチレングリコールジアクリレートが後退接触角やタンパク透過性の点から好ましい。
【００７７】
１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマー、及び必要に応じて用いる架橋剤を溶解する溶媒は、均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
【００７８】
１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマー、及び必要に応じて用いる架橋剤を溶解させる際の濃度は、３体積％から３０体積％までが好ましく、より好ましくは３体積％から２０体積％、最も好ましくは３体積％から１５体積％である。３体積％以上の濃度であれば十分な親水性が得られ好ましい。３０体積％を超えると親水化層によって孔が埋まる場合があり、透過性能が低下する傾向があり好ましくない。
【００７９】
グラフト重合時に用いる、１個のビニル基を有する親水性ビニルモノマー、及び必要に応じて用いる架橋剤を溶媒に溶解させた反応液の量は、高分子微多孔膜１ｇに対して１×１０^−５ｍ^３〜１×１０^−３ｍ^３が好ましい。反応液の量が１×１０^−５ｍ^３〜１×１０^−３ｍ^３であれば均一性が充分な膜が得られる。
グラフト重合時の反応温度は、一般的に２０℃〜８０℃で行われるが、特に限定されるものではない。
【００８０】
本発明は、疎水性微多孔膜に最適な親水化層を導入し、高いタンパク透過性を実現する。そのために、疎水性微多孔膜にグラフトされるグラフト率は、好ましくは３％以上、５０％以下、更に好ましくは４％以上、４０％以下、最も好ましくは６％以上、３０％以下である。グラフト率が３％未満であると膜の親水性が不足し、タンパク質の吸着に伴うろ過速度の急激な低下を引き起こす。５０％を超えると、比較的小さな孔が親水化層によって埋まってしまい、充分なろ過速度が得られない。ここで言うグラフト率とは、以下の式で定義される値である。
グラフト率（％）＝１００×｛（グラフト後の膜質量−グラフト前の膜質量）／グラフト前の膜質量｝
【００８１】
本発明の親水性微多孔膜を構成する組成物には、更に目的に応じて、酸化防止剤、結晶核剤、帯電防止剤、難燃剤、滑剤、紫外線吸収剤等の添加剤を混合しても差し支えない。
【００８２】
本発明の耐熱性を有する親水性微多孔膜は、ウイルスや細菌等の除去、濃縮、又は培地等に利用できる医用分離膜、薬液や処理水等から微粒子を除去する産業プロセス用フィルター、油水分離や液ガス分離用の分離膜、上下水の浄化を目的とする分離膜、リチウムイオン電池等のセパレーター、及びポリマー電池用の固体電解質支持体等の広範囲な用途に利用できるものである。
【００８３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例において示される試験方法は次の通りである。
（１）中空糸の外径、内径、膜厚
中空糸形状の微多孔膜の外径、内径は、該膜の垂直割断面を実体顕微鏡（モリテック（株）製 ＳＣＯＰＥＭＡＮ５０３）を使用して２１０倍の倍率で撮影することにより求めた。膜厚は中空糸の外直径と内直径との差の１／２として計算した。
【００８４】
（２）空孔率
微多孔膜の体積と質量を測定し、得られた結果から次式を用いて気孔率を計算した。
空孔率（％）＝（１−質量÷（樹脂の密度×体積））×１００
【００８５】
（３）透水量
定圧デッドエンド濾過による温度２５℃の純水の透過量を測定し、膜面積、濾過圧力（０．１ＭＰａ）、及び濾過時間から、次式の通りに計算して透水量とした。
透水量（ｍ^３／ｍ^２／秒／Ｐａ）＝透過量÷（膜面積×差圧×濾過時間）
【００８６】
（４）最大孔径
ＡＳＴＭ Ｆ３１６−８６に準拠したバブルポイント法により求まるバブルポイント（Ｐａ）を最大孔径（ｎｍ）として換算した。膜を浸漬する試験液として表面張力が１２ｍＮ／ｍの炭化フッ素液体（住友スリーエム社製 パーフルオロカーボンクーラントFX―３２５０ 商品名）を用いた。バブルポイントは、有効長８ｃｍの中空糸膜一本をバブルポイント測定装置にセットした後、中空部側の徐々に圧力を上げ、膜を透過するガス流量が２．４Ｅ−３リットル／分となった時の圧力とした。
【００８７】
（５）微多孔膜の構造観察
適当な大きさに切り取った微多孔膜を導電性両面テープにより試料台に固定し、金コーティングを施して検鏡用試料とした。高分解能走査型電子顕微鏡装置（ＨＲＳＥＭ）（日立製作所（株）製 Ｓ−９００）を用い、加速電圧５．０ｋＶ、及び所定倍率で微多孔膜の表面及び断面の構造観察を行った。
【００８８】
（６）開孔率、平均開孔率
開孔率は、微多孔膜の断面構造の観察結果を厚み方向に厚み１μｍ毎に分割し、画像処理解析によって各分割領域において空隙が占める面積分率として求めた。このときの電子顕微鏡撮影は倍率１５０００倍で行った。平均開孔率は膜厚全体について測定した開孔率の平均値である。
【００８９】
（７）粗大構造層の厚み、緻密構造層の膜厚全体に占める割合
上記の開孔率の測定において、各分割領域が本文に定義する緻密構造層及び粗大構造層の定義に合致するかを判定した。即ち、粗大構造層は、膜表面に隣接して存在し、厚み方向に測定した開孔率が膜厚全体における開孔率の平均値より２％以上大きい連続した領域であり、緻密構造層は、粗大構造部分以外の領域において、厚み方向に測定した開孔率が粗大構造層を除いた領域の開孔率の平均値に対して±２％未満の範囲内にある領域である。緻密構造部分の膜厚全体に占める割合は、合致する分割領域の厚みの和を全体の膜厚で割った値である。
【００９０】
（８）粗大構造層側表面の平均孔径
粗大構造層側表面の構造観察結果から、画像処理解析によって、表面に存在する孔の数と面積を計測し、孔を真円と仮定して孔１個当りの平均面積から円相当径を求めた。この円相当径を粗大構造層側表面の平均孔径とした。このときの電子顕微鏡（日立製作所（株）製 Ｓ−９００）撮影は倍率６０００倍で行った。
【００９１】
（９）膜の接触角測定
膜の水に対する後退接触角は、注射用水（大塚製薬（株）製 日本薬局方）を用い、動的接触角測定器（ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ社製 ＤＣＡＴ１１）で測定した。中空糸状膜を約２ｃｍに切断し、該装置に装着した。後退接触角はウィルヘルミ法の原理を用いて測定した。測定時のモータースピードは０．１０ｍｍ／秒、浸漬深さは１０ｍｍで、前進及び後退を１サイクルとして、５サイクルの測定を行った。後退接触角は５回測定によって得られた値の平均値を用いた。
【００９２】
（１０）ウシ免疫グロブリンの吸着量
ウシ免疫グロブリンは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のウシ免疫グロブリン溶液を、生理食塩液（大塚製薬（株）製 日本薬局方）で希釈して０．０１ｗｔ％とし、濾過原液として用いた。該濾過原液を濾過圧力０．３ＭＰａ、濾過温度２５℃の条件で定圧デッドエンド濾過を行い、濾過開始から５０リットル／ｍ^２の濾液を分取した。濾過原液及び濾液の、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、次式からウシ免疫グロブリンの吸着量を算出した。
ウシ免疫グロブリン吸着量（ｍｇ／ｇ）＝（濾過原液吸光度−濾液吸光度）／濾過原液吸光度）×０．００５／膜重量
【００９３】
（１１）３ｗｔ％ウシ免疫ブロブリン溶液の濾過試験
ウシ免疫グロブリンは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のウシ免疫グロブリン溶液を、日本薬局方の生理食塩液（大塚製薬（株）製）で希釈して３ｗｔ％とし、更に濾過膜（旭化成（株）製、ＰＬＡＮＯＶＡ３５Ｎ）で前濾過して夾雑物を除いたものを濾過原液として用いた。該濾過原液中のウシ免疫グロブリンの分子量分布を液体クロマトグラフィー（東ソー社製 ＣＣＰ＆８０２０シリーズ、アマシャムバイオサイエンス社製 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０）を用いて測定した結果、２量体以上の多量体の占める割合は２０ｗｔ％以下であった。該濾過原液を濾過圧力０．３ＭＰａ、濾過温度２５℃の条件で定圧デッドエンド濾過を行い、濾過開始時から５分間、濾過開始時から５５〜６０分の透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）を測定した。
【００９４】
（１２）ブタパルボウイルスの対数除去率
濾過元液として、５％牛胎児血清（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を含むダルベッコMEM培地溶液（日本生物医薬研究所製）で培養したＥＳＫ細胞（ブタ腎臓細胞）に、ブタパルボウイルスを感染させた時の培養上清を微多孔膜（旭化成（株）製、ＰＬＡＮＯＶＡ３５Ｎ）で前濾過したものを用いた。該濾過元液を濾過圧力０．３ＭＰａ、濾過温度２５℃の条件で定圧デッドエンド濾過を行った。濾液は５
ｍｌ（５リットル／ｍ^２）毎に１１フラクションを採取し、濾過開始時から５５リットル／ｍ^２濾過時におけるブタパルボウイルス対数除去率を測定するために、各フラクションから１ｍｌずつ採取し混合した。濾過元液と濾液（混合液と最初及び最後のフラクション）中のブタパルボウイルス濃度の測定は、それぞれの液をＥＳＫ細胞に加えて１０日間培養した後、ニワトリ新鮮赤血球（日本バイオテスト研究所製）の凝集反応を利用して、ＴＣＩＤ_５０測定法により行った。
【実施例１】
【００９５】
ポリフッ化ビニリデン樹脂（ＳＯＬＶＡＹ社製、ＳＯＦＥＦ１０１２、結晶融点１７３℃）４９ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル（大阪有機化学工業（株）製 工業品）５１ｗｔ％からなる組成物を、ヘンシェルミキサーを用いて７０℃で攪拌混合した後、冷却して粉体状としたものをホッパーより投入し、二軸押出機（東洋精機（株）製 ラボプラストミル ＭＯＤＥＬ ５０Ｃ １５０）を用いて２１０℃で溶融混合し均一溶解した。続いて、中空内部に温度が１３０℃のフタル酸ジブチル（三建化工（株）製）を８ｍｌ／分の速度で流しつつ、内直径０．８ｍｍ、外直径１．１ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度１７ｍ／分で中空糸状に押し出し、４０℃に温調された水浴中で冷却固化させて、６０ｍ／分の速度でカセに巻き取った。その後、９９％メタノール変性エタノール（今津薬品工業（株）製 工業品）でフタル酸ジシクロヘキシル及びフタル酸ジブチルを抽出除去し、付着したエタノールを水で置換した後、水中に浸漬した状態で高圧蒸気滅菌装置（平山製作所（株）製 ＨＶ−８５）を用いて１２５℃の熱処理を１時間施した。その後、付着した水をエタノールで置換した後、オーブン中で６０℃の温度で乾燥することにより中空糸状の微多孔膜を得た。抽出から乾燥にかけての工程では、収縮を防止するために膜を定長状態に固定して処理を行った。
続いて、上記の微多孔膜に対し、グラフト法による親水化処理を行った。反応液は、ヒドロキシプロピルアクリレート（東京化成（株）製 試薬グレード）を８体積％となるように、３−ブタノール（純正科学（株）試薬特級）の２５体積％水溶液に溶解させ、４０℃に保持した状態で、窒素バブリングを２０分間行ったものを用いた。まず、窒素雰囲気下において、該微多孔膜をドライアイスで−６０℃に冷却しながら、Ｃｏ６０を線源としてγ線を１００ｋＧｙ照射した。照射後の膜は、１３．４Ｐａ以下の減圧下に１５分間静置した後、上記反応液と該膜を４０℃で接触させ、１時間静置した。その後、膜をエタノールで洗浄し、６０℃真空乾燥を４時間行い、微多孔膜を得た。得られた膜は水に接触させた時に自発的に細孔内に水が浸透することを確認した。得られた膜の性能を評価した結果、表１に示すように高い性能を示した。
【実施例２】
【００９６】
ポリフッ化ビニリデン樹脂３９ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル６１ｗｔ％からなる組成物を、内直径０．８ｍｍ、外直径１．２ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出した以外は実施例１に従って中空糸状の微多孔膜を得た。
続いて、上記の微多孔膜に対し、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表１に示すように高い性能を示した。
【実施例３】
【００９７】
ポリフッ化ビニリデン樹脂４６ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル５４ｗｔ％からなる組成物を均一溶解し、続いて、中空内部にリン酸ジフェニルクレジル（大八化学（株）製 工業品）を７ｍｌ／分の速度で流しつつ、内直径０．８
ｍｍ、外直径１．２ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度５．５ｍ／分で中空糸状に押し出した以外は実施例２に従って中空糸状の微多孔膜を得た。
続いて、上記の微多孔膜に対し、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表１に示すように高い性能を示した。
【実施例４】
【００９８】
実施例１で得られた膜に対し、親水化処理を行った。反応液としてヒドロキシプロピルアクリレートを７．５２体積％、ポリエチレングリコールジアクリレート（アルドリッチ社製、平均分子量２５８）を０．１５体積％（ヒドロキシプロピルアクリレートに対して１ｍｏｌ％）、ポリエチレングリコールジアクリレート（アルドリッチ社製、平均分子量５７５）を０．３３体積％（ヒドロキシプロピルアクリレートに対して１ｍｏｌ％）となるように、３−ブタノールの２５体積％水溶液に溶解させたものを用いた以外は実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表１に示すように高い性能を示した。
【実施例５】
【００９９】
実施例１で得られた膜に対し、親水化処理を行った。反応液として４−ヒドロキシブチルアクリレート（東京化成工業（株）製）を８体積％となるように、３−ブタノールの２５体積％水溶液に溶解させたものを用いた以外は、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表２に示すように高い性能を示した。
【実施例６】
【０１００】
ポリフッ化ビニリデン樹脂４８ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル５２ｗｔ％からなる組成物を均一溶解し、続いて、中空内部にフタル酸ジブチルを１０ｍｌ／分の速度で流しつつ、内直径０．８ｍｍ、外直径１．０５ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度２０ｍ／分で中空糸状に押し出した以外は実施例１に従って中空糸状の微多孔膜を得た。続いて、上記の微多孔膜に対し、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表２に示すように高い性能を示した。
【実施例７】
【０１０１】
ポリフッ化ビニリデン樹脂５０ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル５０ｗｔ％からなる組成物を用いた以外は実施例１に従って中空糸状の微多孔膜を得た。
続いて、上記の微多孔膜に対し、実施例１に従って親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表２に示すように高い性能を示した。
【比較例１】
【０１０２】
実施例１で得られた膜に対して、反応液としてヒドロキシプロピルアクリレートを１．２３体積％、ポリエチレングリコールジアクリレート（アルドリッチ社製、平均分子量２５８）を０．６１体積％（ヒドロキシプロピルアクリレートに対して２５ｍｏｌ％）、ポリエチレングリコールジアクリレート（アルドリッチ社製、平均分子量５７５）を１．３６体積％（ヒドロキシプロピルアクリレートに対して２５ｍｏｌ％）となるように、３−ブタノールの２５体積％水溶液に溶解させたものを用いた以外、実施例１と同様の親水化処理を行った。得られた膜の性能を評価した結果、表３に示すように、３％ウシ免疫グロブリン溶液の濾過速度の経時的な低下が激しいことがわかる。これは、多量の架橋剤を含む反応液を用いて親水化したため、膜に充分な粗大構造層が存在しても、グロブリンの吸着により濾過速度を低下させたためであると考えられる。
【比較例２】
【０１０３】
ポリフッ化ビニリデン樹脂とフタル酸ジシクロヘキシルからなる組成物を均一溶解し、続いて、中空内部にフタル酸ジヘプチルを７ｍｌ／分の速度で流しつつ、内直径０．８ｍｍ、外直径１．２ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度５．５ｍ／分で中空糸状に押し出した以外は実施例１に従って中空糸状の微多孔膜を得た。
続いて、上記の微多孔膜に対し、親水化処理を行った。反応液として、ヒドロキシプロピルアクリレートとポリエチレングリコールジメタクリレート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製 平均分子量５５０）を、それぞれ１．１体積％及び０．６体積％となるように、３−ブタノールの２５体積％水溶液に溶解させたものを用いた以外は実施例１にしたがって親水化処理を行った。得られた膜は水に接触させたときに自発的に細孔内に水が浸透することを確認した。得られた膜の性能を評価した結果、表３に示すように３％ウシグロブリンの透過能が極めて低かった。
【実施例８】
【０１０４】
実施例１で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。
【実施例９】
【０１０５】
実施例４で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。
【実施例１０】
【０１０６】
実施例５で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。
【実施例１１】
【０１０７】
実施例６で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。
【実施例１２】
【０１０８】
実施例７で得られた親水性微多孔膜について、ブタパルボウイルスの除去能を評価した結果、表４に示すように高い性能を示した。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
【表４】
【産業上の利用の可能性】
【０１１３】
本発明の親水性微多孔膜によれば、ウイルス混入の危険性のある医薬品又はその原料の生理活性物質溶液の濾過において、ウイルスの除去性能と生理活性物質の透過性能を実用的なレベルで両立し得る分離膜を提供できる。

Claims (14)

1. 熱可塑性樹脂を含み、親水化処理を施された、最大孔径１０〜１００ｎｍの親水性微多孔膜であって、単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たし、かつ、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ｂと略称する）が下記式（２）を満たす上記親水性微多孔膜：
   グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
   グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）。
2. 水の後退接触角が０〜２０度である請求項１記載の親水性微多孔膜。
3. 濾過開始から５５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率が３以上である請求項１又は２に記載の親水性微多孔膜。
4. 濾過開始から５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率と５０リットル／ｍ^２透過した後更に５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率がいずれも３以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載の親水性微多孔膜。
5. 単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から３時間の積算透過量が５０リットル／ｍ^２以上である請求項１〜４のいずれか一項に記載の親水性微多孔膜。
6. 前記熱可塑性樹脂を含む微多孔膜が、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが２μｍ以上、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であり、かつ該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している微多孔膜である請求項１〜５のいずれか一項に記載の親水性微多孔膜。
7. 前記粗大構造層の厚みが３μｍ以上である請求項６記載の親水性微多孔膜。
8. 前記粗大構造層の厚みが５μｍ以上である請求項６記載の親水性微多孔膜。
9. 前記熱可塑性樹脂がポリフッ化ビニリデンである請求項１〜８のいずれか一項に記載の親水性微多孔膜。
10. 前記親水化処理が、ビニル基を１個有する親水性ビニルモノマーの微多孔膜の細孔表面へのグラフト重合反応である請求項１〜９のいずれか一項に記載の親水性微多孔膜。
11. 前記親水性ビニルモノマーが、ヒドロキシル基を含む請求項１０に記載の親水性微多孔膜。
12. ０．０１ｗｔ％ウシ免疫グロブリン溶液を用いて０．３ＭＰａで定圧デッドエンド濾過を行い、濾過開始から５０リットル／ｍ^２の濾液を分取したときの膜１ｇ当りの吸着量が３ｍｇ以下である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の親水性微多孔膜。
13. 生理活性物質を含有する液体中からウイルスを除去することに用いられる請求項１〜１２のいずれか一項に記載の親水性微多孔膜。
14. 濾過開始から５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率と５０リットル／ｍ^２透過した後更に５リットル／ｍ^２透過時におけるブタパルボウイルスの対数除去率がいずれも３以上であり、かつ単量体の占める割合が８０ｗｔ％以上である３ｗｔ％ウシ免疫グロブリンを０．３ＭＰａで定圧濾過した時の、濾過開始時から５分間の平均透過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ａと略称する）が下記式（１）を満たし、かつ、濾過開始後５５分経過時から５分間の平均濾過速度（リットル／ｍ^２／ｈ）（グロブリン透過速度Ｂと略称する）が下記式（２）を満たすことを特徴とする親水性微多孔膜：
    グロブリン透過速度Ａ＞０．００１５×最大孔径（ｎｍ）^２．７５ （１）
    グロブリン透過速度Ｂ／グロブリン透過速度Ａ＞０．２ （２）。