JPWO2004019024A1 - 塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法 - Google Patents
塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
導電性の検出極（２）と、この検出極（２）の表面を被覆するように形成され、検出極（２）表面への挿入剤の吸着を低減するブロッキング分子（２１）と、直鎖状有機分子からなるスペーサ部材（２２）を介して検出極（２）に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補核酸プローブ（２３）と、導電性の対照極（３）と、この対照極（３）の表面を被覆するように形成され、該対照極（３）表面への挿入剤の吸着を低減するブロッキング分子（３１）とを備える。
Description
技術分野
本発明は試料中に存在する特定の遺伝子を特異的に検出するための塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法に関する。
背景技術
近年の遺伝子工学の発展により、医療分野では遺伝子による病気の診断や予防が可能となってきている。遺伝子工学を用いた診断は遺伝子診断とよばれている。この遺伝子診断では、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥や変化を検出することにより、病気の発症前やその初期段階で診断や予測を行うことができる。また、感染したウィルスや病原菌の遺伝子を検出することにより、正確な診断が可能になる。
従来用いられている一般的な遺伝子検出法は次の通りである。
まず、試料から遺伝子を抽出する。必要があれば、適当な制限酵素で切断した後、電気泳動及びサザンプロットを行う。次に、検出の目的とする標的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを、プロットされた遺伝子とハイブリダイズさせる。なお、この核酸プローブは、通常蛍光色素でラベルされている。次いで、レーザ光で蛍光色素を励起する。これにより、ハイブリダイズされた核酸プローブを検出し、標的遺伝子の存在を確認する。
しかしながら、この蛍光色素を用いた検出方法では、遺伝子の検出までに少なくとも２〜３日間を要する。また、核酸プローブを高価な蛍光色素でラベルしなければならない。さらには、蛍光色素を励起させるためのレーザ発生装置が必要となり、装置が大型化してしまう。
前述した蛍光色素を用いた検出方法の問題を解決するため、電気化学的手法を用いた遺伝子検出方法が考案されている。この電気化学的手法を用いた検出方法は、本発明者らにより考案された特許第２５７３４４３号に開示されており、その内容は参考のためにここに組み込まれる。この電気化学的手法によれば、プローブが固定化された電極からの電気化学的信号を検出することにより、標的遺伝子の存在を確認することができる。
しかしながら、電気化学的手法を用いた遺伝子検出では、電流検出時にバックグラウンド電流が発生する。従って、電極から検出される電流値には、プローブとの由来による電流とバックグラウンド電流が含まれる。そのため、検出結果からプローブ由来の電流のみを抽出することが困難であった。
発明の開示
本発明の目的は、標的塩基配列との相互作用に基づく電流の検出を高精度に行う塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法を提供することにある。
この発明の一の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを具備してなる塩基配列検出電極が提供される。
この発明の別の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、前記検出極から検出された電気化学信号から前記対照極から検出された電気化学信号を減算する減算器とを具備してなる塩基配列検出装置が提供される。
また、この発明のさらに別の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを備えた塩基配列検出装置の前記検出極及び対照極における電気化学信号を検出し、前記検出極で検出された電気化学信号から前記対照極で検出された電気化学信号を減算する塩基配列検出方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、図面を参照しながら本発明の一実施形態を説明する。
図１は本発明の一実施形態に係る塩基配列検出装置の全体構成の概念を示すブロック図である。図１に示すように、電気化学セル１内に、検出極２及び対照極３が配置されている。これら検出極２及び対照極３における電流は、ポテンシオ・スタット４０及び５０でそれぞれ検出される。得られた電気化学信号は、それぞれ信号処理装置６０及び７０に出力される。信号処理装置６０及び７０は、ピーク電流値の算出等の信号処理を行い、その信号処理されたデータを減算器８０に出力する。
減算器８０は、信号処理装置６０から得られたデータから、信号処理装置７０から得られたデータを減算し、減算結果をコンピュータ９０に出力する。
電気化学セル１、検出極２、対照極３、ポテンシオ・スタット４０及び５０は塩基配列を検出するための半導体基板１０１（チップ）に形成される。また、検出極２、対照極３、ポテンシオ・スタット４０及び５０は、その半導体チップの集積回路により構成される。減算器８０はその半導体基板１０１に形成された集積回路として実現されてもよいし、半導体基板１０１とは別個に設けられたコンピュータや減算器により実現されてもよい。減算器８０は、コンピュータとそのコンピュータを制御するソフトウェアにより実現されてもよいし、ＲＯＭなどに減算処理内容が記録されるファームウェアとして実現されてもよいし、ハードウェアのみで実現されてもよい。
コンピュータ９０は、例えばパーソナルコンピュータなど、一般的な演算処理が可能なコンピュータであれば何でもよい。コンピュータ９０は、通信インタフェース９１、ＣＰＵ９２及び表示装置９３を備える。通信インタフェース９１は、減算器８０からの減算結果を受信し、ＣＰＵ９２に出力する。ＣＰＵ９２は、減算結果を表示装置９３に表示させる。
図２Ａ及び図２Ｂは検出極２及び対照極３の詳細な構成を示す図である。図２Ａは検出極２の詳細を、図２Ｂは対照極３の詳細を示している。
図２Ａに示すように、ブロッキング分子２１が検出極２の表面を被覆するように形成されている。ブロッキング分子２１は、検出極２表面よりも単位面積当たりの挿入剤の吸着が少ない分子により構成される。具体的には、例えばメルカプトヘキサノールやメルカプトオクタノールなどから構成されている。検出極２は完全に被覆されていなくてもよく、少なくとも検出極２表面の一部が被覆されていればよい。このように、検出極２表面をブロッキング分子２１が被覆する構成とすることにより、挿入剤分子の検出極２表面への吸着を低減することができる。
ブロッキング分子２１は特に上述の物質に限定されるものではないが、例えば直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、エステル、ケトン類が好ましく、さらにこれらの分子が酸素、窒素、イオウ等の原子を介して複数個鎖状に結合した分子でも構わない。また、これらに官能基として例えばアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、フェニル基、アミノ基、チオール基、ハロゲン等の中で、挿入剤分子と相互作用しにくいものが導入されている分子がより好ましい。また、これらのブロッキング分子２１は、チオール基、アミノ基等を介して検出極２表面に吸着させ、自己組織単分子膜を作製するのが好ましい。この他にも、無機酸化物層、高分子層などを形成させてもよい。
また、このブロッキング分子２１が形成されていない検出極２表面にはスペーサ部材２２の末端が固定化されている。このスペーサ部材２２は検出極２表面よりも単位面積当たりの挿入剤の吸着が少ない材料からなる。具体的には、スペーサ部材２２は直鎖状有機分子からなり、例えばエチレングリコールが該当する。スペーサ部材２２の材料は特に限定されるものではないが、例えば直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、エステル、ケトン類が好ましく、さらにこれらの分子が酸素、窒素、イオウ等の原子を介して複数個鎖状に結合した分子でも構わない。
さらに、このスペーサ部材２２の他の末端には、標的相補核酸プローブ２３が固定化されている。標的相補核酸プローブ２３は、検出の目的とする標的核酸配列と相補的な塩基配列を有する核酸からなるプローブである。このように、スペーサ部材２２を介して検出極２に標的相補核酸プローブ２３が固定化される構成をとることにより、試料と標的相補核酸プローブ２３との結合の効率を向上させることができる。
従来、スペーサ部材には挿入剤分子が相互作用し、バックグラウンド電流を増加させる原因となっていたが、本実施形態のようにスペーサ部材２２の構成として、挿入剤分子が相互作用しにくい分子を選択することにより、バックグラウンド電流を減少させることができる。バックグラウンド電流とは、検出極２に配置した標的相補核酸プローブ２３と挿入剤との相互作用に起因する電流以外のノイズ等の原因となる電流を指す。このバックグラウンド電流は、例えば検出極２表面と挿入剤との相互作用や、ブロッキング分子２１と挿入剤との相互作用、スペーサ部材２２と挿入剤との相互作用に起因する電流を含む。標的相補核酸プローブ２３と挿入剤との相互作用に起因する電流をプローブ電流と呼ぶ。
上述したような直鎖状有機分子から構成される標的相補核酸プローブ２３を使用する場合には、バックグラウンド電流は、ほぼ検出極２表面に挿入剤が相互作用することに起因する電流のみとなる。このため、後述する対照極３の構成は、ブロッキング分子層のみでよくなり、非常に好ましい。このような効果のあるスペーサ分子としては、例えばエチレングリコールが１つあるいは多数連結された直鎖状分子がある。この他にも、挿入剤分子と相互作用しない分子であれば、その材料は限定されない。
図２Ｂに示すように、対照極３では、ブロッキング分子３１が対照極３の表面を被覆するように形成されている。このブロッキング分子３１は、検出極２表面を被覆するブロッキング分子２１と同じ材料により構成されるのが好ましいが、類似の性質を示す分子であれば特に限定されない。対照極３を完全に被覆してなくてもよく、少なくとも対照極３表面の一部が被覆されていればよい。このように、対照極３表面を、ブロッキング分子２１と同じ材料のブロッキング分子３１が被覆する構成とすることにより、挿入剤分子の検出極２表面への吸着を低減することができるとともに、検出極２と対照極３の双方におけるバックグラウンド電流に対する影響の低減効果を同じにすることができる。
図３〜図１４は、この検出極２及び対照極３を含む電極構造の上面模式図である。図３〜図１４に示すように、電極の種類には、検出極２及び対照極３の他に、対極４及び参照極５がある。これら検出極２、対照極３、対極４及び参照極５は導電性の材料により構成され、いずれも電気化学セル１内に配置される。これら検出極２、対照極３、対極４及び参照極５が配置された電気化学セル１には、検出極２や対照極３に固定化されたプローブとの間のハイブリダイゼーションを行わせるための検体塩基配列を有する試料や、挿入剤、バッファなどが充填され、電気化学反応が実行される。
検出極２及び対照極３は、セル１内の反応電流を検出するための電極である。
検出極２には、標的塩基配列とは相補的な標的相補塩基配列を有するＤＮＡプローブが固定化され、標的相補核酸プローブと挿入剤との相互作用に起因するプローブ電流が検出される。
対照極３は、ノイズなどのバックグラウンド電流を検出し、後にそのバックグラウンド電流で検出極２で検出される電流から差し引くことによりノイズ等の影響を低減するための電極である。対照極３は、プローブが固定されずに用いられるか、あるいは後述の図１６に示すようにダミープローブが固定化されて用いられる。
対極４は、検出極２あるいは対照極３との間に所定の電圧を印加してセル１内に電流を供給する電極である。
参照極５は、参照極５と検出極２あるいは参照極５と対照極３の間の電圧を所定の電圧特性に制御すべく、その電極電圧を対極４に負帰還させる電極である。この参照極５により、対極４による電圧が制御され、セル１内の各種検出条件に左右されない精度の高い酸化電流検出が行える。
図３は、検出極２、対極４及び参照極５からなる検出極側３電極系３１と、対照極３、対極４及び参照極５からなる対照極側３電極系３２からなる。
検出極側３電極系３１は、円形の検出極２に対して所定の間隔をおいて、所定の方向に長手方向を有する長方形の対極４が配置されている。また、検出極２に対して所定の間隔をおいて、対極４の長手方向とはほぼ垂直な方向に長手方向を有する長方形の参照極５が配置されている。検出極２と対極４との距離と、検出極２と参照極５との距離はほぼ等しく配置される例を示しているが、これに限定されず、異なる距離で配置してもよい。
対照極側３電極系３２は、検出極側３電極系３１の検出極２を対照極３に置換した構成となっている。これら３電極系３１や３２を１組の電極系として、ポテンシオ・スタット４０や５０が接続される。
図４は図３の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図４に示すように、図３に示したのと同様の３電極系３１及び３２が交互にマトリクス配置されている。図４では列方向に同じ３電極系が並び、行方向に異なる３電極系が交互に配置される例を示しているが、行方向に同じ３電極系を配置し、列方向に異なる３電極系を交互に配置してもよい。また、行方向及び列方向共に異なる３電極系が交互に配置されるように配置してもよい。この場合、マトリクスの斜め方向に共通する３電極系が並んで配置される。
図５は図３と同一形状の電極の別の配置例を示している。長方形の対極４に対して長手方向が同一の参照極５が対極４を挟んで等しい間隔をおいて配置されている。対極４及び一方の参照極５の間には対照極３が配置され、さらにその参照極５の対照極３が設けられた側とは反対側には検出極２が配置されている。また、対極３及び他方の参照極５の間には検出極２が配置され、さらにその参照極５の対照極３が設けられた側とは反対側には対照極３が配置されている。対極４あるいは参照極５と検出極２あるいは対照極３の距離は等間隔である。また、検出極２と対照極３は、参照極５を挟んで対称の位置に配置されている。さらに、検出極２と対照極３は対極４を挟んで対称の位置に配置されている。
図６は図５の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図６に示すように、図５に示したのと同様の電極構造を有しているが、検出極２及び対照極３は、対極４や参照極５の長手方向に沿って等間隔に複数配置され、それぞれ検出極群２０及び対照極群３をなす。また、検出極２や対照極３は、参照極５や対極４を挟んで対称の位置に配置されている。対称の位置に配置される検出極２と対照極３同士が減算の対象となる電極である。すなわち、参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２あるいは対照極３と、その参照極５と、さらにはその検出極２あるいは対照極３に近接して設けられた対極４により３電極系をなす。各検出極２から対極４及び参照極５までの距離は等しく、各対照極３から対極４及び参照極５までの距離は等しい。その３電極系にポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。１つの検出極群２０、１つの対照極群３０、１つの対極４及び１つの参照極５からなる電極セットが、それら電極あるいは電極群の長手方向と異なる方向（望ましくはほぼ垂直な方向）に複数配置される。
図７は図３や図５と同一形状の電極の別の配置例を示している。対極４の中心近傍から所定の間隔をおいて、かつ対極４に対して長手方向がほぼ垂直となるように参照極５が配置されている。参照極５から所定の間隔をおいて検出極２が配置され、またこの検出極２と参照極５に対して対称の位置に対照極３が配置されている。
図８は図７の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図８に示すように、図７に示したのと同様の電極構造を有しており、かつ検出極２及び対照極３は、参照極５を挟んで対称の位置に、参照極５の長手方向に沿って等間隔に複数配置され、それぞれ検出極群２０及び対照極群３をなす。参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２と対照極３が減算の対称となる電極である。すなわち、参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２あるいは対照極３と、その参照極５と、さらには参照極５に垂直に設けられた対極４により３電極系をなす。その３電極系にポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。各検出極２から参照極５までの距離は等しく、各対照極３から参照極５までの距離は等しい。
図９は図３，５や７と同一形状の電極の別の配置例を示している。対極４から所定の間隔をおいて、かつ対極４の長手方向とほぼ平行に長手方向を有する参照極５１，５２が配置されている。その一方の参照極５１と対極４との間には検出極２が、他方の参照極５２と対極４の間には対照極３が配置されている。検出極２に対する参照極５１及び対極４に対する位置関係と、対照極３に対する参照極５２及び対極４に対する位置関係は等しい。検出極２と、この検出極２に対応して設けられた参照極５１の組を検出極側電極群５１０、対照極３と、この対照極３に対応して設けられた参照極５２の組を対照極側電極群５２０と呼ぶ。１つの検出極側電極群５１０と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット４０が接続される。１つの対照極側電極群５２０と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット５０が接続される。
図１０は図９の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１０に示すように、図９に示したのと同様の電極構造を有しており、検出極側電極群５１０が列方向に複数等間隔で配置され、対照極側電極群５２０が列方向に複数等間隔で配置され、これら電極群同士が互いに行方向に交互に配置されているマトリクス構造である。この電極群５１０，５２０の各々と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。なお、列方向には同一の電極群が配置される例を示しているが、列方向にも検出極側電極群５１０と対照極側電極群５２０が交互に配置される構成としてもよい。また、行方向と列方向は互いにほぼ垂直な場合を示しているが、これに限定されるものではなく、列方向は行方向に対して垂直ではない角度を有していてもよい。
図１１は図３，５，７や９と同一形状の検出極２及び対照極３と、円形の対極４及び円環形状の参照極５による電極構造の一例を示す図である。図１１に示すように円形の対極４の中心を同じくする円環形状の参照極５が対極４を囲むように配置されている。さらに、対極４に対して対称の位置であって参照極５の外周から所定の間隔をおいて検出極２及び対照極３が配置されている。
図１２は図１１の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１２に示すように、図１１に示すのと同様の電極構造を有しており、かつ検出極２及び対照極３が対極４に対して対称の位置に複数配置されている。また、複数の検出極２及び複数の対照極３の各々は対極４から同じ位置に配置されているため、対極４を中心とする円周４００上に検出極２及び対極３が交互に複数配置される構成をなす。対極４に対して対称の位置にある検出極２及び対照極３同士を減算の対象としてもよいし、隣り合う検出極２及び対照極３同士を減算の対象としてもよい。
図１３は図３，５，７や９と同一形状の検出極２及び対照極３と、正方形の対極４及び十字形状の参照極５による電極構造の一例を示す図である。図１３に示すように、長手方向が互いにほぼ垂直に交差する２つの長方形の電極が重なるように構成された十字形状の参照極５が配置されている。この参照極５の十字により仕切られる４つの領域の各々に、参照極５から所定の間隔をおいて対極４が１つずつ配置されている。また、これら４つの領域の各々のうち、２つの領域には、検出極２が１つずつ配置され、他の２つの領域には対照極３が１つずつ配置されている。これら検出極２及び対照極３は、対極４よりも参照極５から離れた位置に配置される。参照極５からの各対極４への距離は等しく、また参照極５からの各検出極２及び各対照極３への距離は等しい。
図１４は図１３の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１４に示すように、対極４と参照極５の構成は図１３と共通する。この図１４の場合、参照極５で仕切られる４つの領域４０１〜４０４の各々に、検出極２が複数配置され、あるいは対照極３が複数配置される。より具体的には、互いに隣接する領域４０１と４０４には検出極２が複数配置され、互いに隣接する領域４０２と４０３には対照極３が複数配置される。参照極５との間隔が等しい検出極２及び対照極３同士が減算の対象となる。なお、４つの領域４０１〜４０４のうちの少なくとも１つの領域に検出極２が配置され、また少なくとも１つの領域に対照極３が配置されていればよい。従って、３つの領域に検出極２が配置されていても、１つの領域のみに検出極２が配置されていてもよい。また、対極４は各領域に１つずつ、計４つ配置する場合を示したが、各領域に２つ以上の対極４を配置してもよい。また、１つの領域に検出極２と対照極３を混在して配置してもよい。
以上に示した図３〜図１４の電極配置は一例にすぎず、各電極の形状、大きさ、位置関係などを種々変更することができる。図３〜図１４に示す電極構造は、１つの半導体やガラス等の基板に配置することができる。従って、検出極２と対照極３は同一基板内に配置される。検出極２は１つでも複数でもよい。対照極３は１つでも複数でもよい。また、検出極２に対して減算の対象となる対照極３は１つでも複数でもよい。また、対照極３に対して減算の対象となる検出極２は１つでも複数でもよい。もちろん、各電極を別の基板上に配置してもよい。
次に、前述した塩基配列検出装置の動作を図１５のフローチャートに沿って説明する。
まず、電気化学セル１内に検出極２及び対照極３を配置し、セル１内に検査の対象となる核酸を含む試料（検体溶液）で充填する。そして、セル１を所定の温度に保持し、試料と検出極２に固定化された標的相補核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を促進させる。ハイブリダイゼーション反応が終了した後、セル１内から試料を送出し、バッファ剤で充填した後、セル１内を挿入剤で充填する。この挿入剤が充填されたセル１内の検出極２及び対照極３と対極４との間に参照極５による電圧のフィードバックの下で所定の電圧を印加することにより、検出極２及び対照極３でそれぞれ並行してポテンシオ・スタット４０及び５０により電気化学測定が行われる（ｓ１）。
次に、電気化学測定により得られた検出極２及び対照極３からの電流値のピーク電流値を検出する（ｓ２）。このピーク電流値の検出は、検出極２及び対照極３の双方で並行して行われる。ピーク電流値の検出は、信号処理装置６０及び７０で実行される。信号処理装置６０及び７０は、ポテンシオ・スタット４０及び５０から得られる電流波形あるいは電流波形を電流電圧変換した電圧波形のピーク値を抽出する。なお、得られるピーク電流値は、Ａ／Ｄ変換されていてもよいし、また複数の検出極２や複数の対照極３の平均値算出等の統計処理を行った後に得てもよい。得られたピーク電流値は減算器８０に出力される。
減算器８０は、検出極２についてのピーク電流値から対照極３についてのピーク電流値を減算する（ｓ３）。検出極２についてのピーク電流値は、標的相補核酸プローブに挿入剤分子が相互作用することに起因するプローブ電流と、意図しないノイズとして検出されるバックグラウンド電流を加算した電流に基づいて得られる。バックグラウンド電流としては、検出極２表面と挿入剤分子が相互作用することに起因する電流値と、核酸プローブ部分と基板表面とをつなぐスペーサ部材２２に挿入剤分子が相互作用することに起因する電流値が含まれる。
対照極３についてのピーク電流値は、意図しないノイズとして検出されるバックグラウンド電流に基づいて得られる。従って、減算により、バックグランド電流による電流値を差し引くことができ、プローブによる電流を検出することができる。
減算器８０は、減算結果をコンピュータ９０に出力する。コンピュータ９０は、減算結果を表示装置９３に表示する。オペレータは、この表示された減算結果により、試料に含まれる塩基配列を特定することができる。もちろん、減算結果に基づき試料に含まれる塩基配列の有無の判定などを行う判定回路を設け、その判定結果を表示装置９３に表示してもよい。
このように本実施形態によれば、本発明においては、検出極２としての従来の遺伝子検出電極のほかに、対照極３としてバックグラウンド電流のみを検出できる電極を具備する。両電極２、３における電流値を検出した後、基板上の集積回路上で演算を行うことによって検出極２の電流値から対照極３の電流値を差し引き、バックグラウンド電流を除去した標的遺伝子由来の電流値のみを検出することが可能である。ブロッキング分子が検出極２及び対照極３の表面を被覆するように形成されているため、電極表面と挿入剤の相互作用によるバックグラウンド電流の影響を低減できる。また、スペーサ部材として直鎖状有機分子を用いることにより、スペーサ起因のバックグラウンド電流を大幅に低減できる。従って、対照極３はプローブを設けなくてもスペーサの有無によるバックグラウンド電流の差がほとんど生じない。従って、スペーサ及びプローブを固定化させる手間が省ける。
従来の電流検出型の遺伝子検出法においては、標的遺伝子由来の電流値のみを抽出し、解析することが困難であった。特に一塩基多型を判別する際には、非特異的にハイブリダイズした遺伝子によって電流値が増加し、バックグラウンド電流との判別が困難であったが、本実施形態によれば、このような課題を解決することができる。
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
検出極２に固定化させるプローブは、標的塩基配列と相補的な塩基配列である標的相補塩基配列を有するプローブが用いられたが、これに限定されるものではない。例えば、標的相補塩基配列とは一塩基、あるいは数塩基異なる塩基配列を有し、標的相補塩基配列よりも標的塩基配列との相補性が低いプローブ（以下、標的準相補核酸プローブと呼ぶ）を用いてもよい。また、標的相補核酸プローブと標的準相補核酸プローブの双方を検出極に固定化して用いてもよい。
また、上記実施形態では対照極３表面にブロッキング分子３１を被覆し、スペーサ及びプローブを設けない例を示したが、これに限定されない。図１６は図２Ｂに示す対照極３の変形例を示す図である。この変形例に係る対照極３００は、ブロッキング分子３１を介して直鎖状有機分子からなるスペーサ部材３０１の末端が固定化されている。このスペーサ部材３０１は検出極２に設けられたスペーサ部材２２と同一の材料により構成される。
スペーサ部材３０１の他の末端には、ダミープローブ３０２が固定化されている。ダミープローブ３０２は、標的核酸配列と相補的な塩基配列を有さず、非相補的な塩基配列を有する核酸からなるプローブである。
このように、対照極３側にもスペーサを介してプローブを固定化することができる。これにより、検出極２側のスペーサ部材２２に起因するバックグラウンド電流を対照極３側の電流で差し引くことが出来る。
また、検出極２側では、スペーサ部材２２を介して検出極２に標的核酸プローブ２３を固定化する例を示したが、これに限定されない。例えば図２２Ａ及び図２２Ｂに示すように、標的核酸プローブ２３をスペーサ部材２２を介さずに検出極２に固定化させるものでもよい。
また、図１では特に示さなかったが、コンピュータ９０が半導体基板１０１に形成された各回路を自動制御するものでもよい。この場合、コンピュータ９０は、通信インタフェース９１を介してポテンシオ・スタット４０，５０、信号処理装置６０，７０、減算器８０の動作を制御するための制御指令を出力する。これら各回路は、受信した制御指令に基づき動作し、動作結果や演算結果をさらにコンピュータ９０に送信する。これにより、塩基配列の検出を自動化することができる。また、図１では、半導体基板１０１に信号処理装置６０、７０及び減算器８０を設ける場合を示したが、これらと同様の機能をコンピュータ９０側で実現してもよい。この場合、ポテンシオ・スタット４０及び５０の出力信号がコンピュータ９０に送信され、コンピュータ９０側で信号処理及び減算処理が実行される。
以上説明したように本発明は、標的塩基配列との相互作用に基づく電流の検出を高精度に行うことができる。
（実施例）
以下に、本発明による塩基配列検出装置のより具体的な実施例を説明する。
この実施例では、上述した本実施形態の実施例と、その実施例との比較のための従来例を説明する。
（従来例）
この従来例では、対照極３を用いずに核酸の検出を行った。検出極２として、検出極２０１、２０２及び２０３の３つのＡｕ電極が用いられた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸の配列番号１と相補的な配列２を持つプローブとして、一本鎖の核酸プローブを１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬する。これにより、検出極２０１への標的相補核酸プローブ２１１の固定化を行った。同様に標的核酸と相補的な塩基配列と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖核酸プローブ（以下、標的準相補核酸プローブ２１２，２１３と呼ぶ）を検出極２０２及び２０３にそれぞれ固定化した。これら一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、塩基（シトシン）２０個からなるスペーサを介して検出極２０１〜２０３にそれぞれ固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３を浸漬することにより、標的相補核酸プローブ２１１や標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３が固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を図１７に示す。検出極２０１と比較すると検出極２０２及び２０３の電流値は低いが、バックグラウンド電流との区別が付かない。
（実施例１）
この実施例１では、対照極３を用いて従来例と同様な核酸の検出を行った。検出極２として、検出極２０１、２０２及び２０３の３つのＡｕ電極が用いられた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖核酸プローブを１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって標的相補核酸プローブ２１１の固定化を行った。同様に配列２と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖標的準相補核酸プローブを検出極２０２及び２０３に固定化した。さらに配列２とは非相補的な配列５を持つ一本鎖核酸プローブ（以下、標的非相補核酸プローブと呼ぶ）を対照極３に固定化した。一本鎖核酸プローブは、塩基（シトシン）２０個からなるスペーサ部材を介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図１８に示す。検出極２０２は検出目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的とする遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。この実施例１により、対照極３を用いた遺伝子検出を行うことによって目的遺伝子由来の電流のみを抽出できていることが明らかになった。
（実施例２）
従来例１及び実施例１においては、核酸プローブのスペーサ部材に、挿入剤分子と相互作用しやすい塩基列を用いた。そのため、対照極３にも核酸プローブを固定化した。この実施例２においては、核酸プローブのスペーサ部材に、挿入剤分子と相互作用しないエチレングリコール分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブの固定化を行った。同様に標的核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、エチレングリコール分子３０個からなるスペーサを介して各電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１及び２０２および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１及び２０２および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図１９に示す。検出極２０２は検出の目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。この実施例２により、検出極２に固定化させる核酸プローブのスペーサとしてエチレングリコールを用いることによって、対照極３には核酸プローブを固定化せずにブロッキング分子のみで構成することが可能であることが明らかになった。
（実施例３）
この実施例３においては、従来例、実施例１及び２とは別なブロッキング分子を用いた。核酸プローブのスペーサ部材には、エチレングリコール分子が５個結合した分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この試料核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブの固定化を行った。同様に試料核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、エチレングリコール分子３０個からなるスペーサを介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトオクタノール水溶液中に各検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図２０に示す。検出極２０２は検出の目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。
（実施例４）
この実施例４においては、核酸プローブのスペーサ部材に、直鎖アルカン分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この試料核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブ２１１の検出極２０１への固定化を行った。同様に試料核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１及び標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３は、炭素数９６個の直鎖アルカン分子からなるスペーサを介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図２１に示す。検出極２０２は検出目的遺伝子由来の電流値があまりなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。この実施例４により、核酸プローブのスペーサとして直鎖アルカン分子を用いることによっても、対照極３には核酸プローブを固定化せずにブロッキング分子のみで構成することが可能であることが明らかになった。
付加的な長所及び改変は当該技術に長けた者にとって容易に思い浮かぶであろう。従って、そのより広範な観点における本発明は、ここで示され説明される具体的な詳細及び代表的な実施形態に限定されない。従って、添付されるクレーム及びその均等物により定義される一般的な発明概念の精神あるいは視野から離れることなく様々な改変がなされ得る。
産業上の利用可能性
以上説明したようにこの発明は、塩基配列を検出するための検出電極の技術分野、塩基配列を検出するための検出装置の技術分野及び塩基配列を検出するための検出方法の分野に有効である。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の一実施形態に係る塩基配列検出装置の全体構成の概念を示すブロック図。
図２Ａ及び図２Ｂは同実施形態に係る検出極及び対照極の詳細な構成を示す図。
図３は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図４は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図５は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図６は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図７は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図８は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図９は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１０は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１１は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１２は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１３は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１４は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１５は同実施形態に係る塩基配列検出装置の動作のフローチャートを示す図。
図１６は同実施形態に係る塩基配列検出装置の対照極の変形例を示す図。
図１７は従来の塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図１８は対照極を含む塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図１９はスペーサ部材にエチレングリコール分子を用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図２０はメルカプトオクタノールをブロッキング分子として用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図２１はスペーサ部材に直鎖アルカン分子を用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図２２Ａ及び図２２Ｂはスペーサ部材を用いずに標的核酸プローブを固定化する変形例を示す図。
【配列表】
本発明は試料中に存在する特定の遺伝子を特異的に検出するための塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法に関する。
背景技術
近年の遺伝子工学の発展により、医療分野では遺伝子による病気の診断や予防が可能となってきている。遺伝子工学を用いた診断は遺伝子診断とよばれている。この遺伝子診断では、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥や変化を検出することにより、病気の発症前やその初期段階で診断や予測を行うことができる。また、感染したウィルスや病原菌の遺伝子を検出することにより、正確な診断が可能になる。
従来用いられている一般的な遺伝子検出法は次の通りである。
まず、試料から遺伝子を抽出する。必要があれば、適当な制限酵素で切断した後、電気泳動及びサザンプロットを行う。次に、検出の目的とする標的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを、プロットされた遺伝子とハイブリダイズさせる。なお、この核酸プローブは、通常蛍光色素でラベルされている。次いで、レーザ光で蛍光色素を励起する。これにより、ハイブリダイズされた核酸プローブを検出し、標的遺伝子の存在を確認する。
しかしながら、この蛍光色素を用いた検出方法では、遺伝子の検出までに少なくとも２〜３日間を要する。また、核酸プローブを高価な蛍光色素でラベルしなければならない。さらには、蛍光色素を励起させるためのレーザ発生装置が必要となり、装置が大型化してしまう。
前述した蛍光色素を用いた検出方法の問題を解決するため、電気化学的手法を用いた遺伝子検出方法が考案されている。この電気化学的手法を用いた検出方法は、本発明者らにより考案された特許第２５７３４４３号に開示されており、その内容は参考のためにここに組み込まれる。この電気化学的手法によれば、プローブが固定化された電極からの電気化学的信号を検出することにより、標的遺伝子の存在を確認することができる。
しかしながら、電気化学的手法を用いた遺伝子検出では、電流検出時にバックグラウンド電流が発生する。従って、電極から検出される電流値には、プローブとの由来による電流とバックグラウンド電流が含まれる。そのため、検出結果からプローブ由来の電流のみを抽出することが困難であった。
発明の開示
本発明の目的は、標的塩基配列との相互作用に基づく電流の検出を高精度に行う塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法を提供することにある。
この発明の一の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを具備してなる塩基配列検出電極が提供される。
この発明の別の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、前記検出極から検出された電気化学信号から前記対照極から検出された電気化学信号を減算する減算器とを具備してなる塩基配列検出装置が提供される。
また、この発明のさらに別の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを備えた塩基配列検出装置の前記検出極及び対照極における電気化学信号を検出し、前記検出極で検出された電気化学信号から前記対照極で検出された電気化学信号を減算する塩基配列検出方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、図面を参照しながら本発明の一実施形態を説明する。
図１は本発明の一実施形態に係る塩基配列検出装置の全体構成の概念を示すブロック図である。図１に示すように、電気化学セル１内に、検出極２及び対照極３が配置されている。これら検出極２及び対照極３における電流は、ポテンシオ・スタット４０及び５０でそれぞれ検出される。得られた電気化学信号は、それぞれ信号処理装置６０及び７０に出力される。信号処理装置６０及び７０は、ピーク電流値の算出等の信号処理を行い、その信号処理されたデータを減算器８０に出力する。
減算器８０は、信号処理装置６０から得られたデータから、信号処理装置７０から得られたデータを減算し、減算結果をコンピュータ９０に出力する。
電気化学セル１、検出極２、対照極３、ポテンシオ・スタット４０及び５０は塩基配列を検出するための半導体基板１０１（チップ）に形成される。また、検出極２、対照極３、ポテンシオ・スタット４０及び５０は、その半導体チップの集積回路により構成される。減算器８０はその半導体基板１０１に形成された集積回路として実現されてもよいし、半導体基板１０１とは別個に設けられたコンピュータや減算器により実現されてもよい。減算器８０は、コンピュータとそのコンピュータを制御するソフトウェアにより実現されてもよいし、ＲＯＭなどに減算処理内容が記録されるファームウェアとして実現されてもよいし、ハードウェアのみで実現されてもよい。
コンピュータ９０は、例えばパーソナルコンピュータなど、一般的な演算処理が可能なコンピュータであれば何でもよい。コンピュータ９０は、通信インタフェース９１、ＣＰＵ９２及び表示装置９３を備える。通信インタフェース９１は、減算器８０からの減算結果を受信し、ＣＰＵ９２に出力する。ＣＰＵ９２は、減算結果を表示装置９３に表示させる。
図２Ａ及び図２Ｂは検出極２及び対照極３の詳細な構成を示す図である。図２Ａは検出極２の詳細を、図２Ｂは対照極３の詳細を示している。
図２Ａに示すように、ブロッキング分子２１が検出極２の表面を被覆するように形成されている。ブロッキング分子２１は、検出極２表面よりも単位面積当たりの挿入剤の吸着が少ない分子により構成される。具体的には、例えばメルカプトヘキサノールやメルカプトオクタノールなどから構成されている。検出極２は完全に被覆されていなくてもよく、少なくとも検出極２表面の一部が被覆されていればよい。このように、検出極２表面をブロッキング分子２１が被覆する構成とすることにより、挿入剤分子の検出極２表面への吸着を低減することができる。
ブロッキング分子２１は特に上述の物質に限定されるものではないが、例えば直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、エステル、ケトン類が好ましく、さらにこれらの分子が酸素、窒素、イオウ等の原子を介して複数個鎖状に結合した分子でも構わない。また、これらに官能基として例えばアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、フェニル基、アミノ基、チオール基、ハロゲン等の中で、挿入剤分子と相互作用しにくいものが導入されている分子がより好ましい。また、これらのブロッキング分子２１は、チオール基、アミノ基等を介して検出極２表面に吸着させ、自己組織単分子膜を作製するのが好ましい。この他にも、無機酸化物層、高分子層などを形成させてもよい。
また、このブロッキング分子２１が形成されていない検出極２表面にはスペーサ部材２２の末端が固定化されている。このスペーサ部材２２は検出極２表面よりも単位面積当たりの挿入剤の吸着が少ない材料からなる。具体的には、スペーサ部材２２は直鎖状有機分子からなり、例えばエチレングリコールが該当する。スペーサ部材２２の材料は特に限定されるものではないが、例えば直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、エステル、ケトン類が好ましく、さらにこれらの分子が酸素、窒素、イオウ等の原子を介して複数個鎖状に結合した分子でも構わない。
さらに、このスペーサ部材２２の他の末端には、標的相補核酸プローブ２３が固定化されている。標的相補核酸プローブ２３は、検出の目的とする標的核酸配列と相補的な塩基配列を有する核酸からなるプローブである。このように、スペーサ部材２２を介して検出極２に標的相補核酸プローブ２３が固定化される構成をとることにより、試料と標的相補核酸プローブ２３との結合の効率を向上させることができる。
従来、スペーサ部材には挿入剤分子が相互作用し、バックグラウンド電流を増加させる原因となっていたが、本実施形態のようにスペーサ部材２２の構成として、挿入剤分子が相互作用しにくい分子を選択することにより、バックグラウンド電流を減少させることができる。バックグラウンド電流とは、検出極２に配置した標的相補核酸プローブ２３と挿入剤との相互作用に起因する電流以外のノイズ等の原因となる電流を指す。このバックグラウンド電流は、例えば検出極２表面と挿入剤との相互作用や、ブロッキング分子２１と挿入剤との相互作用、スペーサ部材２２と挿入剤との相互作用に起因する電流を含む。標的相補核酸プローブ２３と挿入剤との相互作用に起因する電流をプローブ電流と呼ぶ。
上述したような直鎖状有機分子から構成される標的相補核酸プローブ２３を使用する場合には、バックグラウンド電流は、ほぼ検出極２表面に挿入剤が相互作用することに起因する電流のみとなる。このため、後述する対照極３の構成は、ブロッキング分子層のみでよくなり、非常に好ましい。このような効果のあるスペーサ分子としては、例えばエチレングリコールが１つあるいは多数連結された直鎖状分子がある。この他にも、挿入剤分子と相互作用しない分子であれば、その材料は限定されない。
図２Ｂに示すように、対照極３では、ブロッキング分子３１が対照極３の表面を被覆するように形成されている。このブロッキング分子３１は、検出極２表面を被覆するブロッキング分子２１と同じ材料により構成されるのが好ましいが、類似の性質を示す分子であれば特に限定されない。対照極３を完全に被覆してなくてもよく、少なくとも対照極３表面の一部が被覆されていればよい。このように、対照極３表面を、ブロッキング分子２１と同じ材料のブロッキング分子３１が被覆する構成とすることにより、挿入剤分子の検出極２表面への吸着を低減することができるとともに、検出極２と対照極３の双方におけるバックグラウンド電流に対する影響の低減効果を同じにすることができる。
図３〜図１４は、この検出極２及び対照極３を含む電極構造の上面模式図である。図３〜図１４に示すように、電極の種類には、検出極２及び対照極３の他に、対極４及び参照極５がある。これら検出極２、対照極３、対極４及び参照極５は導電性の材料により構成され、いずれも電気化学セル１内に配置される。これら検出極２、対照極３、対極４及び参照極５が配置された電気化学セル１には、検出極２や対照極３に固定化されたプローブとの間のハイブリダイゼーションを行わせるための検体塩基配列を有する試料や、挿入剤、バッファなどが充填され、電気化学反応が実行される。
検出極２及び対照極３は、セル１内の反応電流を検出するための電極である。
検出極２には、標的塩基配列とは相補的な標的相補塩基配列を有するＤＮＡプローブが固定化され、標的相補核酸プローブと挿入剤との相互作用に起因するプローブ電流が検出される。
対照極３は、ノイズなどのバックグラウンド電流を検出し、後にそのバックグラウンド電流で検出極２で検出される電流から差し引くことによりノイズ等の影響を低減するための電極である。対照極３は、プローブが固定されずに用いられるか、あるいは後述の図１６に示すようにダミープローブが固定化されて用いられる。
対極４は、検出極２あるいは対照極３との間に所定の電圧を印加してセル１内に電流を供給する電極である。
参照極５は、参照極５と検出極２あるいは参照極５と対照極３の間の電圧を所定の電圧特性に制御すべく、その電極電圧を対極４に負帰還させる電極である。この参照極５により、対極４による電圧が制御され、セル１内の各種検出条件に左右されない精度の高い酸化電流検出が行える。
図３は、検出極２、対極４及び参照極５からなる検出極側３電極系３１と、対照極３、対極４及び参照極５からなる対照極側３電極系３２からなる。
検出極側３電極系３１は、円形の検出極２に対して所定の間隔をおいて、所定の方向に長手方向を有する長方形の対極４が配置されている。また、検出極２に対して所定の間隔をおいて、対極４の長手方向とはほぼ垂直な方向に長手方向を有する長方形の参照極５が配置されている。検出極２と対極４との距離と、検出極２と参照極５との距離はほぼ等しく配置される例を示しているが、これに限定されず、異なる距離で配置してもよい。
対照極側３電極系３２は、検出極側３電極系３１の検出極２を対照極３に置換した構成となっている。これら３電極系３１や３２を１組の電極系として、ポテンシオ・スタット４０や５０が接続される。
図４は図３の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図４に示すように、図３に示したのと同様の３電極系３１及び３２が交互にマトリクス配置されている。図４では列方向に同じ３電極系が並び、行方向に異なる３電極系が交互に配置される例を示しているが、行方向に同じ３電極系を配置し、列方向に異なる３電極系を交互に配置してもよい。また、行方向及び列方向共に異なる３電極系が交互に配置されるように配置してもよい。この場合、マトリクスの斜め方向に共通する３電極系が並んで配置される。
図５は図３と同一形状の電極の別の配置例を示している。長方形の対極４に対して長手方向が同一の参照極５が対極４を挟んで等しい間隔をおいて配置されている。対極４及び一方の参照極５の間には対照極３が配置され、さらにその参照極５の対照極３が設けられた側とは反対側には検出極２が配置されている。また、対極３及び他方の参照極５の間には検出極２が配置され、さらにその参照極５の対照極３が設けられた側とは反対側には対照極３が配置されている。対極４あるいは参照極５と検出極２あるいは対照極３の距離は等間隔である。また、検出極２と対照極３は、参照極５を挟んで対称の位置に配置されている。さらに、検出極２と対照極３は対極４を挟んで対称の位置に配置されている。
図６は図５の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図６に示すように、図５に示したのと同様の電極構造を有しているが、検出極２及び対照極３は、対極４や参照極５の長手方向に沿って等間隔に複数配置され、それぞれ検出極群２０及び対照極群３をなす。また、検出極２や対照極３は、参照極５や対極４を挟んで対称の位置に配置されている。対称の位置に配置される検出極２と対照極３同士が減算の対象となる電極である。すなわち、参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２あるいは対照極３と、その参照極５と、さらにはその検出極２あるいは対照極３に近接して設けられた対極４により３電極系をなす。各検出極２から対極４及び参照極５までの距離は等しく、各対照極３から対極４及び参照極５までの距離は等しい。その３電極系にポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。１つの検出極群２０、１つの対照極群３０、１つの対極４及び１つの参照極５からなる電極セットが、それら電極あるいは電極群の長手方向と異なる方向（望ましくはほぼ垂直な方向）に複数配置される。
図７は図３や図５と同一形状の電極の別の配置例を示している。対極４の中心近傍から所定の間隔をおいて、かつ対極４に対して長手方向がほぼ垂直となるように参照極５が配置されている。参照極５から所定の間隔をおいて検出極２が配置され、またこの検出極２と参照極５に対して対称の位置に対照極３が配置されている。
図８は図７の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図８に示すように、図７に示したのと同様の電極構造を有しており、かつ検出極２及び対照極３は、参照極５を挟んで対称の位置に、参照極５の長手方向に沿って等間隔に複数配置され、それぞれ検出極群２０及び対照極群３をなす。参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２と対照極３が減算の対称となる電極である。すなわち、参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２あるいは対照極３と、その参照極５と、さらには参照極５に垂直に設けられた対極４により３電極系をなす。その３電極系にポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。各検出極２から参照極５までの距離は等しく、各対照極３から参照極５までの距離は等しい。
図９は図３，５や７と同一形状の電極の別の配置例を示している。対極４から所定の間隔をおいて、かつ対極４の長手方向とほぼ平行に長手方向を有する参照極５１，５２が配置されている。その一方の参照極５１と対極４との間には検出極２が、他方の参照極５２と対極４の間には対照極３が配置されている。検出極２に対する参照極５１及び対極４に対する位置関係と、対照極３に対する参照極５２及び対極４に対する位置関係は等しい。検出極２と、この検出極２に対応して設けられた参照極５１の組を検出極側電極群５１０、対照極３と、この対照極３に対応して設けられた参照極５２の組を対照極側電極群５２０と呼ぶ。１つの検出極側電極群５１０と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット４０が接続される。１つの対照極側電極群５２０と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット５０が接続される。
図１０は図９の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１０に示すように、図９に示したのと同様の電極構造を有しており、検出極側電極群５１０が列方向に複数等間隔で配置され、対照極側電極群５２０が列方向に複数等間隔で配置され、これら電極群同士が互いに行方向に交互に配置されているマトリクス構造である。この電極群５１０，５２０の各々と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。なお、列方向には同一の電極群が配置される例を示しているが、列方向にも検出極側電極群５１０と対照極側電極群５２０が交互に配置される構成としてもよい。また、行方向と列方向は互いにほぼ垂直な場合を示しているが、これに限定されるものではなく、列方向は行方向に対して垂直ではない角度を有していてもよい。
図１１は図３，５，７や９と同一形状の検出極２及び対照極３と、円形の対極４及び円環形状の参照極５による電極構造の一例を示す図である。図１１に示すように円形の対極４の中心を同じくする円環形状の参照極５が対極４を囲むように配置されている。さらに、対極４に対して対称の位置であって参照極５の外周から所定の間隔をおいて検出極２及び対照極３が配置されている。
図１２は図１１の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１２に示すように、図１１に示すのと同様の電極構造を有しており、かつ検出極２及び対照極３が対極４に対して対称の位置に複数配置されている。また、複数の検出極２及び複数の対照極３の各々は対極４から同じ位置に配置されているため、対極４を中心とする円周４００上に検出極２及び対極３が交互に複数配置される構成をなす。対極４に対して対称の位置にある検出極２及び対照極３同士を減算の対象としてもよいし、隣り合う検出極２及び対照極３同士を減算の対象としてもよい。
図１３は図３，５，７や９と同一形状の検出極２及び対照極３と、正方形の対極４及び十字形状の参照極５による電極構造の一例を示す図である。図１３に示すように、長手方向が互いにほぼ垂直に交差する２つの長方形の電極が重なるように構成された十字形状の参照極５が配置されている。この参照極５の十字により仕切られる４つの領域の各々に、参照極５から所定の間隔をおいて対極４が１つずつ配置されている。また、これら４つの領域の各々のうち、２つの領域には、検出極２が１つずつ配置され、他の２つの領域には対照極３が１つずつ配置されている。これら検出極２及び対照極３は、対極４よりも参照極５から離れた位置に配置される。参照極５からの各対極４への距離は等しく、また参照極５からの各検出極２及び各対照極３への距離は等しい。
図１４は図１３の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１４に示すように、対極４と参照極５の構成は図１３と共通する。この図１４の場合、参照極５で仕切られる４つの領域４０１〜４０４の各々に、検出極２が複数配置され、あるいは対照極３が複数配置される。より具体的には、互いに隣接する領域４０１と４０４には検出極２が複数配置され、互いに隣接する領域４０２と４０３には対照極３が複数配置される。参照極５との間隔が等しい検出極２及び対照極３同士が減算の対象となる。なお、４つの領域４０１〜４０４のうちの少なくとも１つの領域に検出極２が配置され、また少なくとも１つの領域に対照極３が配置されていればよい。従って、３つの領域に検出極２が配置されていても、１つの領域のみに検出極２が配置されていてもよい。また、対極４は各領域に１つずつ、計４つ配置する場合を示したが、各領域に２つ以上の対極４を配置してもよい。また、１つの領域に検出極２と対照極３を混在して配置してもよい。
以上に示した図３〜図１４の電極配置は一例にすぎず、各電極の形状、大きさ、位置関係などを種々変更することができる。図３〜図１４に示す電極構造は、１つの半導体やガラス等の基板に配置することができる。従って、検出極２と対照極３は同一基板内に配置される。検出極２は１つでも複数でもよい。対照極３は１つでも複数でもよい。また、検出極２に対して減算の対象となる対照極３は１つでも複数でもよい。また、対照極３に対して減算の対象となる検出極２は１つでも複数でもよい。もちろん、各電極を別の基板上に配置してもよい。
次に、前述した塩基配列検出装置の動作を図１５のフローチャートに沿って説明する。
まず、電気化学セル１内に検出極２及び対照極３を配置し、セル１内に検査の対象となる核酸を含む試料（検体溶液）で充填する。そして、セル１を所定の温度に保持し、試料と検出極２に固定化された標的相補核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を促進させる。ハイブリダイゼーション反応が終了した後、セル１内から試料を送出し、バッファ剤で充填した後、セル１内を挿入剤で充填する。この挿入剤が充填されたセル１内の検出極２及び対照極３と対極４との間に参照極５による電圧のフィードバックの下で所定の電圧を印加することにより、検出極２及び対照極３でそれぞれ並行してポテンシオ・スタット４０及び５０により電気化学測定が行われる（ｓ１）。
次に、電気化学測定により得られた検出極２及び対照極３からの電流値のピーク電流値を検出する（ｓ２）。このピーク電流値の検出は、検出極２及び対照極３の双方で並行して行われる。ピーク電流値の検出は、信号処理装置６０及び７０で実行される。信号処理装置６０及び７０は、ポテンシオ・スタット４０及び５０から得られる電流波形あるいは電流波形を電流電圧変換した電圧波形のピーク値を抽出する。なお、得られるピーク電流値は、Ａ／Ｄ変換されていてもよいし、また複数の検出極２や複数の対照極３の平均値算出等の統計処理を行った後に得てもよい。得られたピーク電流値は減算器８０に出力される。
減算器８０は、検出極２についてのピーク電流値から対照極３についてのピーク電流値を減算する（ｓ３）。検出極２についてのピーク電流値は、標的相補核酸プローブに挿入剤分子が相互作用することに起因するプローブ電流と、意図しないノイズとして検出されるバックグラウンド電流を加算した電流に基づいて得られる。バックグラウンド電流としては、検出極２表面と挿入剤分子が相互作用することに起因する電流値と、核酸プローブ部分と基板表面とをつなぐスペーサ部材２２に挿入剤分子が相互作用することに起因する電流値が含まれる。
対照極３についてのピーク電流値は、意図しないノイズとして検出されるバックグラウンド電流に基づいて得られる。従って、減算により、バックグランド電流による電流値を差し引くことができ、プローブによる電流を検出することができる。
減算器８０は、減算結果をコンピュータ９０に出力する。コンピュータ９０は、減算結果を表示装置９３に表示する。オペレータは、この表示された減算結果により、試料に含まれる塩基配列を特定することができる。もちろん、減算結果に基づき試料に含まれる塩基配列の有無の判定などを行う判定回路を設け、その判定結果を表示装置９３に表示してもよい。
このように本実施形態によれば、本発明においては、検出極２としての従来の遺伝子検出電極のほかに、対照極３としてバックグラウンド電流のみを検出できる電極を具備する。両電極２、３における電流値を検出した後、基板上の集積回路上で演算を行うことによって検出極２の電流値から対照極３の電流値を差し引き、バックグラウンド電流を除去した標的遺伝子由来の電流値のみを検出することが可能である。ブロッキング分子が検出極２及び対照極３の表面を被覆するように形成されているため、電極表面と挿入剤の相互作用によるバックグラウンド電流の影響を低減できる。また、スペーサ部材として直鎖状有機分子を用いることにより、スペーサ起因のバックグラウンド電流を大幅に低減できる。従って、対照極３はプローブを設けなくてもスペーサの有無によるバックグラウンド電流の差がほとんど生じない。従って、スペーサ及びプローブを固定化させる手間が省ける。
従来の電流検出型の遺伝子検出法においては、標的遺伝子由来の電流値のみを抽出し、解析することが困難であった。特に一塩基多型を判別する際には、非特異的にハイブリダイズした遺伝子によって電流値が増加し、バックグラウンド電流との判別が困難であったが、本実施形態によれば、このような課題を解決することができる。
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
検出極２に固定化させるプローブは、標的塩基配列と相補的な塩基配列である標的相補塩基配列を有するプローブが用いられたが、これに限定されるものではない。例えば、標的相補塩基配列とは一塩基、あるいは数塩基異なる塩基配列を有し、標的相補塩基配列よりも標的塩基配列との相補性が低いプローブ（以下、標的準相補核酸プローブと呼ぶ）を用いてもよい。また、標的相補核酸プローブと標的準相補核酸プローブの双方を検出極に固定化して用いてもよい。
また、上記実施形態では対照極３表面にブロッキング分子３１を被覆し、スペーサ及びプローブを設けない例を示したが、これに限定されない。図１６は図２Ｂに示す対照極３の変形例を示す図である。この変形例に係る対照極３００は、ブロッキング分子３１を介して直鎖状有機分子からなるスペーサ部材３０１の末端が固定化されている。このスペーサ部材３０１は検出極２に設けられたスペーサ部材２２と同一の材料により構成される。
スペーサ部材３０１の他の末端には、ダミープローブ３０２が固定化されている。ダミープローブ３０２は、標的核酸配列と相補的な塩基配列を有さず、非相補的な塩基配列を有する核酸からなるプローブである。
このように、対照極３側にもスペーサを介してプローブを固定化することができる。これにより、検出極２側のスペーサ部材２２に起因するバックグラウンド電流を対照極３側の電流で差し引くことが出来る。
また、検出極２側では、スペーサ部材２２を介して検出極２に標的核酸プローブ２３を固定化する例を示したが、これに限定されない。例えば図２２Ａ及び図２２Ｂに示すように、標的核酸プローブ２３をスペーサ部材２２を介さずに検出極２に固定化させるものでもよい。
また、図１では特に示さなかったが、コンピュータ９０が半導体基板１０１に形成された各回路を自動制御するものでもよい。この場合、コンピュータ９０は、通信インタフェース９１を介してポテンシオ・スタット４０，５０、信号処理装置６０，７０、減算器８０の動作を制御するための制御指令を出力する。これら各回路は、受信した制御指令に基づき動作し、動作結果や演算結果をさらにコンピュータ９０に送信する。これにより、塩基配列の検出を自動化することができる。また、図１では、半導体基板１０１に信号処理装置６０、７０及び減算器８０を設ける場合を示したが、これらと同様の機能をコンピュータ９０側で実現してもよい。この場合、ポテンシオ・スタット４０及び５０の出力信号がコンピュータ９０に送信され、コンピュータ９０側で信号処理及び減算処理が実行される。
以上説明したように本発明は、標的塩基配列との相互作用に基づく電流の検出を高精度に行うことができる。
（実施例）
以下に、本発明による塩基配列検出装置のより具体的な実施例を説明する。
この実施例では、上述した本実施形態の実施例と、その実施例との比較のための従来例を説明する。
（従来例）
この従来例では、対照極３を用いずに核酸の検出を行った。検出極２として、検出極２０１、２０２及び２０３の３つのＡｕ電極が用いられた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸の配列番号１と相補的な配列２を持つプローブとして、一本鎖の核酸プローブを１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬する。これにより、検出極２０１への標的相補核酸プローブ２１１の固定化を行った。同様に標的核酸と相補的な塩基配列と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖核酸プローブ（以下、標的準相補核酸プローブ２１２，２１３と呼ぶ）を検出極２０２及び２０３にそれぞれ固定化した。これら一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、塩基（シトシン）２０個からなるスペーサを介して検出極２０１〜２０３にそれぞれ固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３を浸漬することにより、標的相補核酸プローブ２１１や標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３が固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を図１７に示す。検出極２０１と比較すると検出極２０２及び２０３の電流値は低いが、バックグラウンド電流との区別が付かない。
（実施例１）
この実施例１では、対照極３を用いて従来例と同様な核酸の検出を行った。検出極２として、検出極２０１、２０２及び２０３の３つのＡｕ電極が用いられた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖核酸プローブを１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって標的相補核酸プローブ２１１の固定化を行った。同様に配列２と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖標的準相補核酸プローブを検出極２０２及び２０３に固定化した。さらに配列２とは非相補的な配列５を持つ一本鎖核酸プローブ（以下、標的非相補核酸プローブと呼ぶ）を対照極３に固定化した。一本鎖核酸プローブは、塩基（シトシン）２０個からなるスペーサ部材を介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図１８に示す。検出極２０２は検出目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的とする遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。この実施例１により、対照極３を用いた遺伝子検出を行うことによって目的遺伝子由来の電流のみを抽出できていることが明らかになった。
（実施例２）
従来例１及び実施例１においては、核酸プローブのスペーサ部材に、挿入剤分子と相互作用しやすい塩基列を用いた。そのため、対照極３にも核酸プローブを固定化した。この実施例２においては、核酸プローブのスペーサ部材に、挿入剤分子と相互作用しないエチレングリコール分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブの固定化を行った。同様に標的核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、エチレングリコール分子３０個からなるスペーサを介して各電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１及び２０２および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１及び２０２および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図１９に示す。検出極２０２は検出の目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。この実施例２により、検出極２に固定化させる核酸プローブのスペーサとしてエチレングリコールを用いることによって、対照極３には核酸プローブを固定化せずにブロッキング分子のみで構成することが可能であることが明らかになった。
（実施例３）
この実施例３においては、従来例、実施例１及び２とは別なブロッキング分子を用いた。核酸プローブのスペーサ部材には、エチレングリコール分子が５個結合した分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この試料核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブの固定化を行った。同様に試料核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、エチレングリコール分子３０個からなるスペーサを介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトオクタノール水溶液中に各検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図２０に示す。検出極２０２は検出の目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。
（実施例４）
この実施例４においては、核酸プローブのスペーサ部材に、直鎖アルカン分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この試料核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブ２１１の検出極２０１への固定化を行った。同様に試料核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１及び標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３は、炭素数９６個の直鎖アルカン分子からなるスペーサを介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図２１に示す。検出極２０２は検出目的遺伝子由来の電流値があまりなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。この実施例４により、核酸プローブのスペーサとして直鎖アルカン分子を用いることによっても、対照極３には核酸プローブを固定化せずにブロッキング分子のみで構成することが可能であることが明らかになった。
付加的な長所及び改変は当該技術に長けた者にとって容易に思い浮かぶであろう。従って、そのより広範な観点における本発明は、ここで示され説明される具体的な詳細及び代表的な実施形態に限定されない。従って、添付されるクレーム及びその均等物により定義される一般的な発明概念の精神あるいは視野から離れることなく様々な改変がなされ得る。
産業上の利用可能性
以上説明したようにこの発明は、塩基配列を検出するための検出電極の技術分野、塩基配列を検出するための検出装置の技術分野及び塩基配列を検出するための検出方法の分野に有効である。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の一実施形態に係る塩基配列検出装置の全体構成の概念を示すブロック図。
図２Ａ及び図２Ｂは同実施形態に係る検出極及び対照極の詳細な構成を示す図。
図３は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図４は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図５は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図６は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図７は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図８は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図９は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１０は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１１は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１２は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１３は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１４は同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
図１５は同実施形態に係る塩基配列検出装置の動作のフローチャートを示す図。
図１６は同実施形態に係る塩基配列検出装置の対照極の変形例を示す図。
図１７は従来の塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図１８は対照極を含む塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図１９はスペーサ部材にエチレングリコール分子を用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図２０はメルカプトオクタノールをブロッキング分子として用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図２１はスペーサ部材に直鎖アルカン分子を用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
図２２Ａ及び図２２Ｂはスペーサ部材を用いずに標的核酸プローブを固定化する変形例を示す図。
【配列表】
【書類名】明細書
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性の検出極と、
この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、
前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、
導電性の対照極と、
この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、
直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブと
を具備する事を特徴とする塩基配列検出電極。
【請求項２】
前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項１に記載の塩基配列検出電極。
【請求項３】
導電性の検出極と、
この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、
前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、
導電性の対照極と、
この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、
前記検出極から検出された電気化学信号から前記対照極から検出された電気化学信号を減算する減算器と、
直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブと
を具備してなる事を特徴とする塩基配列検出装置。
【請求項４】
前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項５】
前記検出極と対向して配置された第１の対極との間に所定の電圧を印加して、前記検出極からの電気化学信号を検出するための第１のポテンシオ・スタットと、
第１のポテンシオ・スタットの出力を信号処理し、前記減算器に出力する第１の信号処理装置と、
前記対照極と対向して配置された第２の対極との間に所定の電圧を印加して、前記対照極からの電気化学信号を検出する第２のポテンシオ・スタットと、
第２のポテンシオ・スタットの出力を信号処理し、前記減算器に出力する第２の信号処理装置と
を具備することを特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項６】
前記減算器の減算結果を表示する表示装置をさらに備える事をと特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項７】
前記検出極、対照極及び減算器は同一基板に形成され、
前記減算器と前記表示装置はコンピュータを介して信号線により接続されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項８】
前記検出極と、
前記検出極から第１の距離離間して配置され、前記検出極との間に所定の電圧を印加するための第１の対極と、
前記検出極から第２の距離離間して配置され、検出される電圧を第１の対極に負帰還させるための第１の参照極と
からなる検出極側３電極系と、
前記対照極と、
前記対照極から第１の距離離間して配置され、前記対照極との間に所定の電圧を印加するための第２の対極と、
前記検出極から第２の距離離間して配置され、検出される電圧を第２の対極に負帰還させるための第２の参照極と
からなる対照極側３電極系とをさらに備え、
前記検出極側３電極系と前記対照極側３電極系の組はマトリクス状に複数配置される事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項９】
前記検出極が第１の方向に複数等間隔に配置された検出極群と、
前記検出極群から所定の距離離間して配置され、第１の方向に長手方向を有する参照極と、
前記参照極から所定の距離離間して配置され、前記対照極が第１の方向に複数等間隔に配置された対照極群と、
前記対照極群から所定の距離離間して配置され、第１の方向に長手方向を有し、前記検出極の各々及び前記対照極の各々との間に所定の電圧を印加するための対極と
をさらに備える事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１０】
前記検出極が第１の方向に複数等間隔に配置された検出極群と、
前記対照極が第１の方向に複数等間隔に配置された対照極群と、
前記検出極群及び前記対照極群から所定の距離離間して配置され、第１の方向に長手方向を有し、前記検出極の各々に所定の電圧を印加するための対極と、
前記検出極群、対照極群及び対極から所定の距離離間して配置され、第１の方向とはほぼ垂直な第２の方向に長手方向を有し、検出される電圧を前記対極に負帰還させるための参照極と
をさらに備える事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１１】
前記検出極と、前記検出極から第１の距離離間して配置された第１の参照極からなる検出極側電極群と、
前記対照極と、前記対照極から第１の距離離間して配置された第２の参照極からなる対照極側電極群と、
第１の方向に長手方向を有し前記検出極の各々及び前記対照極の各々との間に所定の電圧を印加するための対極とをさらに備え、
前記検出極側電極群と前記対照極側電極群は、第１の方向と、第１の方向とは異なる第２の方向にマトリクス状に配置されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１２】
前記検出極及び前記対照極に所定の電圧を印加するための円形の対極と、
前記対極を取り囲むように前記対極から所定の距離離間して配置された円環状の参照極とを備え、
前記検出極及び対照極は、前記対極を中心とした円周上に、交互に複数配置されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１３】
第１の方向に長手方向を有する第１の部材と、第１の方向とはほぼ垂直な方向に長手方向を有し、第１の部材と第１の交点で交差する第２の部材からなる参照極と、
前記参照極により仕切られる４つの領域の各々に、第１の交点から第１の距離離間して配置される４つの対極とをさらに備え、
前記検出極は、前記４つの領域のうちの少なくとも１つの領域に配置され、第１の交点から第１の距離よりも長い距離離間して複数配置され、
前記対照極は、前記４つの領域のうちの少なくとも１つの領域に配置され、第１の交点から第１の距離よりも長い距離離間して複数配置されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１４】
前記対照極は、前記４つの領域のうち、前記検出極が配置されていない領域に配置され、前記検出極は、前記４つの領域のうち、前記対照極が配置されていない領域に配置されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１５】
導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを備えた塩基配列検出装置の前記検出極及び対照極における電気化学信号を検出し、
前記検出極で検出された電気化学信号から前記対照極で検出された電気化学信号を減算し、
直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブを備える事を特徴とする塩基配列検出方法。
【請求項１６】
前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項１５に記載の塩基配列検出方法。
【請求項１７】
前記減算結果を、コンピュータに備えられた表示装置に表示させる事を特徴とする請求項１５に記載の塩基配列検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は試料中に存在する特定の遺伝子を特異的に検出するための塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
近年の遺伝子工学の発展により、医療分野では遺伝子による病気の診断や予防が可能となってきている。遺伝子工学を用いた診断は遺伝子診断とよばれている。この遺伝子診断では、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥や変化を検出することにより、病気の発症前やその初期段階で診断や予測を行うことができる。また、感染したウィルスや病原菌の遺伝子を検出することにより、正確な診断が可能になる。
【０００３】
従来用いられている一般的な遺伝子検出法は次の通りである。
【０００４】
まず、試料から遺伝子を抽出する。必要があれば、適当な制限酵素で切断した後、電気泳動及びサザンプロットを行う。次に、検出の目的とする標的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを、プロットされた遺伝子とハイブリダイズさせる。なお、この核酸プローブは、通常蛍光色素でラベルされている。次いで、レーザ光で蛍光色素を励起する。これにより、ハイブリダイズされた核酸プローブを検出し、標的遺伝子の存在を確認する。
【０００５】
しかしながら、この蛍光色素を用いた検出方法では、遺伝子の検出までに少なくとも２〜３日間を要する。また、核酸プローブを高価な蛍光色素でラベルしなければならない。さらには、蛍光色素を励起させるためのレーザ発生装置が必要となり、装置が大型化してしまう。
【０００６】
前述した蛍光色素を用いた検出方法の問題を解決するため、電気化学的手法を用いた遺伝子検出方法が考案されている。この電気化学的手法を用いた検出方法は、本発明者らにより考案された文献に開示されており、その内容は参考のためにここに組み込まれる（例えば、特許文献１参照）。この電気化学的手法によれば、プローブが固定化された電極からの電気化学的信号を検出することにより、標的遺伝子の存在を確認することができる。
【０００７】
しかしながら、電気化学的手法を用いた遺伝子検出では、電流検出時にバックグラウンド電流が発生する。従って、電極から検出される電流値には、プローブとの由来による電流とバックグラウンド電流が含まれる。そのため、検出結果からプローブ由来の電流のみを抽出することが困難であった。
【０００８】
【特許文献１】
特許第２５７３４４３号明細書
【０００９】
【発明の開示】
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、標的塩基配列との相互作用に基づく電流の検出を高精度に行う塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この発明の一の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブとを具備してなる塩基配列検出電極が提供される。
【００１２】
この発明の別の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、前記検出極から検出された電気化学信号から前記対照極から検出された電気化学信号を減算する減算器と、直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブとを具備してなる塩基配列検出装置が提供される。
【００１３】
また、この発明のさらに別の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを備えた塩基配列検出装置の前記検出極及び対照極における電気化学信号を検出し、前記検出極で検出された電気化学信号から前記対照極で検出された電気化学信号を減算し、直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブを備える塩基配列検出方法が提供される。
【００１４】
【発明を実施するための最良の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の一実施形態を説明する。
【００１５】
図１は本発明の一実施形態に係る塩基配列検出装置の全体構成の概念を示すブロック図である。図１に示すように、電気化学セル１内に、検出極２及び対照極３が配置されている。これら検出極２及び対照極３における電流は、ポテンシオ・スタット４０及び５０でそれぞれ検出される。得られた電気化学信号は、それぞれ信号処理装置６０及び７０に出力される。信号処理装置６０及び７０は、ピーク電流値の算出等の信号処理を行い、その信号処理されたデータを減算器８０に出力する。
【００１６】
減算器８０は、信号処理装置６０から得られたデータから、信号処理装置７０から得られたデータを減算し、減算結果をコンピュータ９０に出力する。
【００１７】
電気化学セル１、検出極２、対照極３、ポテンシオ・スタット４０及び５０は塩基配列を検出するための半導体基板１０１（チップ）に形成される。また、検出極２、対照極３、ポテンシオ・スタット４０及び５０は、その半導体チップの集積回路により構成される。減算器８０はその半導体基板１０１に形成された集積回路として実現されてもよいし、半導体基板１０１とは別個に設けられたコンピュータや減算器により実現されてもよい。減算器８０は、コンピュータとそのコンピュータを制御するソフトウェアにより実現されてもよいし、ＲＯＭなどに減算処理内容が記録されるファームウェアとして実現されてもよいし、ハードウェアのみで実現されてもよい。
【００１８】
コンピュータ９０は、例えばパーソナルコンピュータなど、一般的な演算処理が可能なコンピュータであれば何でもよい。コンピュータ９０は、通信インタフェース９１、ＣＰＵ９２及び表示装置９３を備える。通信インタフェース９１は、減算器８０からの減算結果を受信し、ＣＰＵ９２に出力する。ＣＰＵ９２は、減算結果を表示装置９３に表示させる。
【００１９】
図２Ａ及び図２Ｂは検出極２及び対照極３の詳細な構成を示す図である。図２Ａは検出極２の詳細を、図２Ｂは対照極３の詳細を示している。
【００２０】
図２Ａに示すように、ブロッキング分子２１が検出極２の表面を被覆するように形成されている。ブロッキング分子２１は、検出極２表面よりも単位面積当たりの挿入剤の吸着が少ない分子により構成される。具体的には、例えばメルカプトヘキサノールやメルカプトオクタノールなどから構成されている。検出極２は完全に被覆されていなくてもよく、少なくとも検出極２表面の一部が被覆されていればよい。このように、検出極２表面をブロッキング分子２１が被覆する構成とすることにより、挿入剤分子の検出極２表面への吸着を低減することができる。
【００２１】
ブロッキング分子２１は特に上述の物質に限定されるものではないが、例えば直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、エステル、ケトン類が好ましく、さらにこれらの分子が酸素、窒素、イオウ等の原子を介して複数個鎖状に結合した分子でも構わない。また、これらに官能基として例えばアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、フェニル基、アミノ基、チオール基、ハロゲン等の中で、挿入剤分子と相互作用しにくいものが導入されている分子がより好ましい。また、これらのブロッキング分子２１は、チオール基、アミノ基等を介して検出極２表面に吸着させ、自己組織単分子膜を作製するのが好ましい。この他にも、無機酸化物層、高分子層などを形成させてもよい。
【００２２】
また、このブロッキング分子２１が形成されていない検出極２表面にはスペーサ部材２２の末端が固定化されている。このスペーサ部材２２は検出極２表面よりも単位面積当たりの挿入剤の吸着が少ない材料からなる。具体的には、スペーサ部材２２は直鎖状有機分子からなり、例えばエチレングリコールが該当する。スペーサ部材２２の材料は特に限定されるものではないが、例えば直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、エステル、ケトン類が好ましく、さらにこれらの分子が酸素、窒素、イオウ等の原子を介して複数個鎖状に結合した分子でも構わない。
【００２３】
さらに、このスペーサ部材２２の他の末端には、標的相補核酸プローブ２３が固定化されている。標的相補核酸プローブ２３は、検出の目的とする標的核酸配列と相補的な塩基配列を有する核酸からなるプローブである。このように、スペーサ部材２２を介して検出極２に標的相補核酸プローブ２３が固定化される構成をとることにより、試料と標的相補核酸プローブ２３との結合の効率を向上させることができる。
【００２４】
従来、スペーサ部材には挿入剤分子が相互作用し、バックグラウンド電流を増加させる原因となっていたが、本実施形態のようにスペーサ部材２２の構成として、挿入剤分子が相互作用しにくい分子を選択することにより、バックグラウンド電流を減少させることができる。バックグラウンド電流とは、検出極２に配置した標的相補核酸プローブ２３と挿入剤との相互作用に起因する電流以外のノイズ等の原因となる電流を指す。このバックグラウンド電流は、例えば検出極２表面と挿入剤との相互作用や、ブロッキング分子２１と挿入剤との相互作用、スペーサ部材２２と挿入剤との相互作用に起因する電流を含む。標的相補核酸プローブ２３と挿入剤との相互作用に起因する電流をプローブ電流と呼ぶ。
【００２５】
上述したような直鎖状有機分子から構成される標的相補核酸プローブ２３を使用する場合には、バックグラウンド電流は、ほぼ検出極２表面に挿入剤が相互作用することに起因する電流のみとなる。このため、後述する対照極３の構成は、ブロッキング分子層のみでよくなり、非常に好ましい。このような効果のあるスペーサ分子としては、例えばエチレングリコールが１つあるいは多数連結された直鎖状分子がある。この他にも、挿入剤分子と相互作用しない分子であれば、その材料は限定されない。
【００２６】
図２Ｂに示すように、対照極３では、ブロッキング分子３１が対照極３の表面を被覆するように形成されている。このブロッキング分子３１は、検出極２表面を被覆するブロッキング分子２１と同じ材料により構成されるのが好ましいが、類似の性質を示す分子であれば特に限定されない。対照極３を完全に被覆してなくてもよく、少なくとも対照極３表面の一部が被覆されていればよい。このように、対照極３表面を、ブロッキング分子２１と同じ材料のブロッキング分子３１が被覆する構成とすることにより、挿入剤分子の検出極２表面への吸着を低減することができるとともに、検出極２と対照極３の双方におけるバックグラウンド電流に対する影響の低減効果を同じにすることができる。
【００２７】
図３〜図１４は、この検出極２及び対照極３を含む電極構造の上面模式図である。図３〜図１４に示すように、電極の種類には、検出極２及び対照極３の他に、対極４及び参照極５がある。これら検出極２、対照極３、対極４及び参照極５は導電性の材料により構成され、いずれも電気化学セル１内に配置される。これら検出極２、対照極３、対極４及び参照極５が配置された電気化学セル１には、検出極２や対照極３に固定化されたプローブとの間のハイブリダイゼーションを行わせるための検体塩基配列を有する試料や、挿入剤、バッファなどが充填され、電気化学反応が実行される。
【００２８】
検出極２及び対照極３は、セル１内の反応電流を検出するための電極である。
【００２９】
検出極２には、標的塩基配列とは相補的な標的相補塩基配列を有するＤＮＡプローブが固定化され、標的相補核酸プローブと挿入剤との相互作用に起因するプローブ電流が検出される。
【００３０】
対照極３は、ノイズなどのバックグラウンド電流を検出し、後にそのバックグラウンド電流で検出極２で検出される電流から差し引くことによりノイズ等の影響を低減するための電極である。対照極３は、プローブが固定されずに用いられるか、あるいは後述の図１６に示すようにダミープローブが固定化されて用いられる。
【００３１】
対極４は、検出極２あるいは対照極３との間に所定の電圧を印加してセル１内に電流を供給する電極である。
【００３２】
参照極５は、参照極５と検出極２あるいは参照極５と対照極３の間の電圧を所定の電圧特性に制御すべく、その電極電圧を対極４に負帰還させる電極である。この参照極５により、対極４による電圧が制御され、セル１内の各種検出条件に左右されない精度の高い酸化電流検出が行える。
【００３３】
図３は、検出極２、対極４及び参照極５からなる検出極側３電極系３１と、対照極３、対極４及び参照極５からなる対照極側３電極系３２からなる。
【００３４】
検出極側３電極系３１は、円形の検出極２に対して所定の間隔をおいて、所定の方向に長手方向を有する長方形の対極４が配置されている。また、検出極２に対して所定の間隔をおいて、対極４の長手方向とはほぼ垂直な方向に長手方向を有する長方形の参照極５が配置されている。検出極２と対極４との距離と、検出極２と参照極５との距離はほぼ等しく配置される例を示しているが、これに限定されず、異なる距離で配置してもよい。
【００３５】
対照極側３電極系３２は、検出極側３電極系３１の検出極２を対照極３に置換した構成となっている。これら３電極系３１や３２を１組の電極系として、ポテンシオ・スタット４０や５０が接続される。
【００３６】
図４は図３の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図４に示すように、図３に示したのと同様の３電極系３１及び３２が交互にマトリクス配置されている。図４では列方向に同じ３電極系が並び、行方向に異なる３電極系が交互に配置される例を示しているが、行方向に同じ３電極系を配置し、列方向に異なる３電極系を交互に配置してもよい。また、行方向及び列方向共に異なる３電極系が交互に配置されるように配置してもよい。この場合、マトリクスの斜め方向に共通する３電極系が並んで配置される。
【００３７】
図５は図３と同一形状の電極の別の配置例を示している。長方形の対極４に対して長手方向が同一の参照極５が対極４を挟んで等しい間隔をおいて配置されている。対極４及び一方の参照極５の間には対照極３が配置され、さらにその参照極５の対照極３が設けられた側とは反対側には検出極２が配置されている。また、対極３及び他方の参照極５の間には検出極２が配置され、さらにその参照極５の対照極３が設けられた側とは反対側には対照極３が配置されている。対極４あるいは参照極５と検出極２あるいは対照極３の距離は等間隔である。また、検出極２と対照極３は、参照極５を挟んで対称の位置に配置されている。さらに、検出極２と対照極３は対極４を挟んで対称の位置に配置されている。
【００３８】
図６は図５の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図６に示すように、図５に示したのと同様の電極構造を有しているが、検出極２及び対照極３は、対極４や参照極５の長手方向に沿って等間隔に複数配置され、それぞれ検出極群２０及び対照極群３をなす。また、検出極２や対照極３は、参照極５や対極４を挟んで対称の位置に配置されている。対称の位置に配置される検出極２と対照極３同士が減算の対象となる電極である。すなわち、参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２あるいは対照極３と、その参照極５と、さらにはその検出極２あるいは対照極３に近接して設けられた対極４により３電極系をなす。各検出極２から対極４及び参照極５までの距離は等しく、各対照極３から対極４及び参照極５までの距離は等しい。その３電極系にポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。１つの検出極群２０、１つの対照極群３０、１つの対極４及び１つの参照極５からなる電極セットが、それら電極あるいは電極群の長手方向と異なる方向（望ましくはほぼ垂直な方向）に複数配置される。
【００３９】
図７は図３や図５と同一形状の電極の別の配置例を示している。対極４の中心近傍から所定の間隔をおいて、かつ対極４に対して長手方向がほぼ垂直となるように参照極５が配置されている。参照極５から所定の間隔をおいて検出極２が配置され、またこの検出極２と参照極５に対して対称の位置に対照極３が配置されている。
【００４０】
図８は図７の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図８に示すように、図７に示したのと同様の電極構造を有しており、かつ検出極２及び対照極３は、参照極５を挟んで対称の位置に、参照極５の長手方向に沿って等間隔に複数配置され、それぞれ検出極群２０及び対照極群３をなす。参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２と対照極３が減算の対称となる電極である。すなわち、参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２あるいは対照極３と、その参照極５と、さらには参照極５に垂直に設けられた対極４により３電極系をなす。その３電極系にポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。各検出極２から参照極５までの距離は等しく、各対照極３から参照極５までの距離は等しい。
【００４１】
図９は図３，５や７と同一形状の電極の別の配置例を示している。対極４から所定の間隔をおいて、かつ対極４の長手方向とほぼ平行に長手方向を有する参照極５１，５２が配置されている。その一方の参照極５１と対極４との間には検出極２が、他方の参照極５２と対極４の間には対照極３が配置されている。検出極２に対する参照極５１及び対極４に対する位置関係と、対照極３に対する参照極５２及び対極４に対する位置関係は等しい。検出極２と、この検出極２に対応して設けられた参照極５１の組を検出極側電極群５１０、対照極３と、この対照極３に対応して設けられた参照極５２の組を対照極側電極群５２０と呼ぶ。１つの検出極側電極群５１０と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット４０が接続される。１つの対照極側電極群５２０と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット５０が接続される。
【００４２】
図１０は図９の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１０に示すように、図９に示したのと同様の電極構造を有しており、検出極側電極群５１０が列方向に複数等間隔で配置され、対照極側電極群５２０が列方向に複数等間隔で配置され、これら電極群同士が互いに行方向に交互に配置されているマトリクス構造である。この電極群５１０，５２０の各々と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。なお、列方向には同一の電極群が配置される例を示しているが、列方向にも検出極側電極群５１０と対照極側電極群５２０が交互に配置される構成としてもよい。また、行方向と列方向は互いにほぼ垂直な場合を示しているが、これに限定されるものではなく、列方向は行方向に対して垂直ではない角度を有していてもよい。
【００４３】
図１１は図３，５，７や９と同一形状の検出極２及び対照極３と、円形の対極４及び円環形状の参照極５による電極構造の一例を示す図である。図１１に示すように円形の対極４の中心を同じくする円環形状の参照極５が対極４を囲むように配置されている。さらに、対極４に対して対称の位置であって参照極５の外周から所定の間隔をおいて検出極２及び対照極３が配置されている。
【００４４】
図１２は図１１の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１２に示すように、図１１に示すのと同様の電極構造を有しており、かつ検出極２及び対照極３が対極４に対して対称の位置に複数配置されている。また、複数の検出極２及び複数の対照極３の各々は対極４から同じ位置に配置されているため、対極４を中心とする円周４００上に検出極２及び対極３が交互に複数配置される構成をなす。対極４に対して対称の位置にある検出極２及び対照極３同士を減算の対象としてもよいし、隣り合う検出極２及び対照極３同士を減算の対象としてもよい。
【００４５】
図１３は図３，５，７や９と同一形状の検出極２及び対照極３と、正方形の対極４及び十字形状の参照極５による電極構造の一例を示す図である。図１３に示すように、長手方向が互いにほぼ垂直に交差する２つの長方形の電極が重なるように構成された十字形状の参照極５が配置されている。この参照極５の十字により仕切られる４つの領域の各々に、参照極５から所定の間隔をおいて対極４が１つずつ配置されている。また、これら４つの領域の各々のうち、２つの領域には、検出極２が１つずつ配置され、他の２つの領域には対照極３が１つずつ配置されている。これら検出極２及び対照極３は、対極４よりも参照極５から離れた位置に配置される。参照極５からの各対極４への距離は等しく、また参照極５からの各検出極２及び各対照極３への距離は等しい。
【００４６】
図１４は図１３の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１４に示すように、対極４と参照極５の構成は図１３と共通する。この図１４の場合、参照極５で仕切られる４つの領域４０１〜４０４の各々に、検出極２が複数配置され、あるいは対照極３が複数配置される。より具体的には、互いに隣接する領域４０１と４０４には検出極２が複数配置され、互いに隣接する領域４０２と４０３には対照極３が複数配置される。参照極５との間隔が等しい検出極２及び対照極３同士が減算の対象となる。なお、４つの領域４０１〜４０４のうちの少なくとも１つの領域に検出極２が配置され、また少なくとも１つの領域に対照極３が配置されていればよい。従って、３つの領域に検出極２が配置されていても、１つの領域のみに検出極２が配置されていてもよい。また、対極４は各領域に１つずつ、計４つ配置する場合を示したが、各領域に２つ以上の対極４を配置してもよい。また、１つの領域に検出極２と対照極３を混在して配置してもよい。
【００４７】
以上に示した図３〜図１４の電極配置は一例にすぎず、各電極の形状、大きさ、位置関係などを種々変更することができる。図３〜図１４に示す電極構造は、１つの半導体やガラス等の基板に配置することができる。従って、検出極２と対照極３は同一基板内に配置される。検出極２は１つでも複数でもよい。対照極３は１つでも複数でもよい。また、検出極２に対して減算の対象となる対照極３は１つでも複数でもよい。また、対照極３に対して減算の対象となる検出極２は１つでも複数でもよい。もちろん、各電極を別の基板上に配置してもよい。
【００４８】
次に、前述した塩基配列検出装置の動作を図１５のフローチャートに沿って説明する。
【００４９】
まず、電気化学セル１内に検出極２及び対照極３を配置し、セル１内に検査の対象となる核酸を含む試料（検体溶液）で充填する。そして、セル１を所定の温度に保持し、試料と検出極２に固定化された標的相補核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を促進させる。ハイブリダイゼーション反応が終了した後、セル１内から試料を送出し、バッファ剤で充填した後、セル１内を挿入剤で充填する。この挿入剤が充填されたセル１内の検出極２及び対照極３と対極４との間に参照極５による電圧のフィードバックの下で所定の電圧を印加することにより、検出極２及び対照極３でそれぞれ並行してポテンシオ・スタット４０及び５０により電気化学測定が行われる（ｓ１）。
【００５０】
次に、電気化学測定により得られた検出極２及び対照極３からの電流値のピーク電流値を検出する（ｓ２）。このピーク電流値の検出は、検出極２及び対照極３の双方で並行して行われる。ピーク電流値の検出は、信号処理装置６０及び７０で実行される。信号処理装置６０及び７０は、ポテンシオ・スタット４０及び５０から得られる電流波形あるいは電流波形を電流電圧変換した電圧波形のピーク値を抽出する。なお、得られるピーク電流値は、Ａ／Ｄ変換されていてもよいし、また複数の検出極２や複数の対照極３の平均値算出等の統計処理を行った後に得てもよい。得られたピーク電流値は減算器８０に出力される。
【００５１】
減算器８０は、検出極２についてのピーク電流値から対照極３についてのピーク電流値を減算する（ｓ３）。検出極２についてのピーク電流値は、標的相補核酸プローブに挿入剤分子が相互作用することに起因するプローブ電流と、意図しないノイズとして検出されるバックグラウンド電流を加算した電流に基づいて得られる。バックグラウンド電流としては、検出極２表面と挿入剤分子が相互作用することに起因する電流値と、核酸プローブ部分と基板表面とをつなぐスペーサ部材２２に挿入剤分子が相互作用することに起因する電流値が含まれる。
【００５２】
対照極３についてのピーク電流値は、意図しないノイズとして検出されるバックグラウンド電流に基づいて得られる。従って、減算により、バックグランド電流による電流値を差し引くことができ、プローブによる電流を検出することができる。
【００５３】
減算器８０は、減算結果をコンピュータ９０に出力する。コンピュータ９０は、減算結果を表示装置９３に表示する。オペレータは、この表示された減算結果により、試料に含まれる塩基配列を特定することができる。もちろん、減算結果に基づき試料に含まれる塩基配列の有無の判定などを行う判定回路を設け、その判定結果を表示装置９３に表示してもよい。
【００５４】
このように本実施形態によれば、本発明においては、検出極２としての従来の遺伝子検出電極のほかに、対照極３としてバックグラウンド電流のみを検出できる電極を具備する。両電極２，３における電流値を検出した後、基板上の集積回路上で演算を行うことによって検出極２の電流値から対照極３の電流値を差し引き、バックグラウンド電流を除去した標的遺伝子由来の電流値のみを検出することが可能である。ブロッキング分子が検出極２及び対照極３の表面を被覆するように形成されているため、電極表面と挿入剤の相互作用によるバックグラウンド電流の影響を低減できる。また、スペーサ部材として直鎖状有機分子を用いることにより、スペーサ起因のバックグラウンド電流を大幅に低減できる。従って、対照極３はプローブを設けなくてもスペーサの有無によるバックグラウンド電流の差がほとんど生じない。従って、スペーサ及びプローブを固定化させる手間が省ける。
【００５５】
従来の電流検出型の遺伝子検出法においては、標的遺伝子由来の電流値のみを抽出し、解析することが困難であった。特に一塩基多型を判別する際には、非特異的にハイブリダイズした遺伝子によって電流値が増加し、バックグラウンド電流との判別が困難であったが、本実施形態によれば、このような課題を解決することができる。
【００５６】
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００５７】
検出極２に固定化させるプローブは、標的塩基配列と相補的な塩基配列である標的相補塩基配列を有するプローブが用いられたが、これに限定されるものではない。例えば、標的相補塩基配列とは一塩基、あるいは数塩基異なる塩基配列を有し、標的相補塩基配列よりも標的塩基配列との相補性が低いプローブ（以下、標的準相補核酸プローブと呼ぶ）を用いてもよい。また、標的相補核酸プローブと標的準相補核酸プローブの双方を検出極に固定化して用いてもよい。
【００５８】
また、上記実施形態では対照極３表面にブロッキング分子３１を被覆し、スペーサ及びプローブを設けない例を示したが、これに限定されない。図１６は図２Ｂに示す対照極３の変形例を示す図である。この変形例に係る対照極３００は、ブロッキング分子３１を介して直鎖状有機分子からなるスペーサ部材３０１の末端が固定化されている。このスペーサ部材３０１は検出極２に設けられたスペーサ部材２２と同一の材料により構成される。
【００５９】
スペーサ部材３０１の他の末端には、ダミープローブ３０２が固定化されている。ダミープローブ３０２は、標的核酸配列と相補的な塩基配列を有さず、非相補的な塩基配列を有する核酸からなるプローブである。
【００６０】
このように、対照極３側にもスペーサを介してプローブを固定化することができる。これにより、検出極２側のスペーサ部材２２に起因するバックグラウンド電流を対照極３側の電流で差し引くことが出来る。
【００６１】
また、検出極２側では、スペーサ部材２２を介して検出極２に標的核酸プローブ２３を固定化する例を示したが、これに限定されない。例えば図２２Ａ及び図２２Ｂに示すように、標的核酸プローブ２３をスペーサ部材２２を介さずに検出極２に固定化させるものでもよい。
【００６２】
また、図１では特に示さなかったが、コンピュータ９０が半導体基板１０１に形成された各回路を自動制御するものでもよい。この場合、コンピュータ９０は、通信インタフェース９１を介してポテンシオ・スタット４０，５０、信号処理装置６０，７０、減算器８０の動作を制御するための制御指令を出力する。これら各回路は、受信した制御指令に基づき動作し、動作結果や演算結果をさらにコンピュータ９０に送信する。これにより、塩基配列の検出を自動化することができる。また、図１では、半導体基板１０１に信号処理装置６０、７０及び減算器８０を設ける場合を示したが、これらと同様の機能をコンピュータ９０側で実現してもよい。この場合、ポテンシオ・スタット４０及び５０の出力信号がコンピュータ９０に送信され、コンピュータ９０側で信号処理及び減算処理が実行される。
【００６３】
以上説明したように本発明は、標的塩基配列との相互作用に基づく電流の検出を高精度に行うことができる。
【００６４】
（実施例）
以下に、本発明による塩基配列検出装置のより具体的な実施例を説明する。
【００６５】
この実施例では、上述した本実施形態の実施例と、その実施例との比較のための従来例を説明する。
【００６６】
（従来例）
この従来例では、対照極３を用いずに核酸の検出を行った。検出極２として、検出極２０１、２０２及び２０３の３つのＡｕ電極が用いられた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００６７】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸の配列番号１と相補的な配列２を持つプローブとして、一本鎖の核酸プローブを１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬する。これにより、検出極２０１への標的相補核酸プローブ２１１の固定化を行った。同様に標的核酸と相補的な塩基配列と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖核酸プローブ（以下、標的準相補核酸プローブ２１２，２１３と呼ぶ）を検出極２０２及び２０３にそれぞれ固定化した。これら一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、塩基(シトシン)２０個からなるスペーサを介して検出極２０１〜２０３にそれぞれ固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３を浸漬することにより、標的相補核酸プローブ２１１や標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３が固定化されていない部分をブロッキングした。
【００６８】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を図１７に示す。検出極２０１と比較すると検出極２０２及び２０３の電流値は低いが、バックグラウンド電流との区別が付かない。
【００６９】
（実施例１）
この実施例１では、対照極３を用いて従来例と同様な核酸の検出を行った。検出極２として、検出極２０１、２０２及び２０３の３つのＡｕ電極が用いられた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００７０】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖核酸プローブを１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって標的相補核酸プローブ２１１の固定化を行った。同様に配列２と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖標的準相補核酸プローブを検出極２０２及び２０３に固定化した。さらに配列２とは非相補的な配列５を持つ一本鎖核酸プローブ（以下、標的非相補核酸プローブと呼ぶ）を対照極３に固定化した。一本鎖核酸プローブは、塩基(シトシン)２０個からなるスペーサ部材を介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
【００７１】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図１８に示す。検出極２０２は検出目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的とする遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。この実施例１により、対照極３を用いた遺伝子検出を行うことによって目的遺伝子由来の電流のみを抽出できていることが明らかになった。
【００７２】
（実施例２）
従来例１及び実施例１においては、核酸プローブのスペーサ部材に、挿入剤分子と相互作用しやすい塩基列を用いた。そのため、対照極３にも核酸プローブを固定化した。この実施例２においては、核酸プローブのスペーサ部材に、挿入剤分子と相互作用しないエチレングリコール分子を用いた。試料核酸には配列番号1を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００７３】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブの固定化を行った。同様に標的核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、エチレングリコール分子３０個からなるスペーサを介して各電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
【００７４】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１及び２０２および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１及び２０２および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図１９に示す。検出極２０２は検出の目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。この実施例２により、検出極２に固定化させる核酸プローブのスペーサとしてエチレングリコールを用いることによって、対照極３には核酸プローブを固定化せずにブロッキング分子のみで構成することが可能であることが明らかになった。
【００７５】
（実施例３）
この実施例３においては、従来例、実施例１及び２とは別なブロッキング分子を用いた。核酸プローブのスペーサ部材には、エチレングリコール分子が５個結合した分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００７６】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この試料核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブの固定化を行った。同様に試料核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、エチレングリコール分子３０個からなるスペーサを介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトオクタノール水溶液中に各検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
【００７７】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図２０に示す。検出極２０２は検出の目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。
【００７８】
（実施例４）
この実施例４においては、核酸プローブのスペーサ部材に、直鎖アルカン分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００７９】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この試料核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブ２１１の検出極２０１への固定化を行った。同様に試料核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１及び標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３は、炭素数９６個の直鎖アルカン分子からなるスペーサを介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
【００８０】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図２１に示す。検出極２０２は検出目的遺伝子由来の電流値があまりなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。この実施例４により、核酸プローブのスペーサとして直鎖アルカン分子を用いることによっても、対照極３には核酸プローブを固定化せずにブロッキング分子のみで構成することが可能であることが明らかになった。
【００８１】
付加的な長所及び改変は当該技術に長けた者にとって容易に思い浮かぶであろう。従って、そのより広範な観点における本発明は、ここで示され説明される具体的な詳細及び代表的な実施形態に限定されない。従って、添付されるクレーム及びその均等物により定義される一般的な発明概念の精神あるいは視野から離れることなく様々な改変がなされ得る。
【００８２】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【００８３】
【産業上の利用可能性】
以上説明したようにこの発明は、塩基配列を検出するための検出電極の技術分野、塩基配列を検出するための検出装置の技術分野及び塩基配列を検出するための検出方法の分野に有効である。
【００８４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA
OKADA, Jun
HASHIMOTO, Koji
TAKAHASHI, Masayoshi
<120> Base sequence detecting electrode, base sequence detecting device and base sequence detecting method
<130> 02S1026P
<150> JP 2002-244018
<151> 2002-8-23
<160> 5
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggcctccgct ctcgcttcgc ctctttcacc ccgcgcccag ccccgccccg cgccgcgaag 60
aaatgaaact cacagaccct gtgctgaggg cggctccggg cgcagaaacg aaacctagct 120
c 121
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gtttctgcgc ccgga 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gtttctgcac ccgga 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gtttctgctc ccgga 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
gacctgcttc tgact 15
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の一実施形態に係る塩基配列検出装置の全体構成の概念を示すブロック図。
【図２】
Ａ及びＢは同実施形態に係る検出極及び対照極の詳細な構成を示す図。
【図３】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図４】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図５】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図６】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図７】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図８】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図９】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１０】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１１】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１２】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１３】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１４】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１５】
同実施形態に係る塩基配列検出装置の動作のフローチャートを示す図。
【図１６】
同実施形態に係る塩基配列検出装置の対照極の変形例を示す図。
【図１７】
従来の塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図１８】
対照極を含む塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図１９】
スペーサ部材にエチレングリコール分子を用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図２０】
メルカプトオクタノールをブロッキング分子として用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図２１】
スペーサ部材に直鎖アルカン分子を用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図２２】
Ａ及びＢはスペーサ部材を用いずに標的核酸プローブを固定化する変形例を示す図。
【符号の説明】
１…電気化学セル、２…検出極、３…対照極、４０、５０…ポテンシオ・スタット、６０、７０…信号処理装置、８０…減算器、９０…コンピュータ、９１…通信インタフェース、９２…ＣＰＵ、９３…表示装置、１０１…半導体基板（チップ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性の検出極と、
この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、
前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、
導電性の対照極と、
この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、
直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブと
を具備する事を特徴とする塩基配列検出電極。
【請求項２】
前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項１に記載の塩基配列検出電極。
【請求項３】
導電性の検出極と、
この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、
前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、
導電性の対照極と、
この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、
前記検出極から検出された電気化学信号から前記対照極から検出された電気化学信号を減算する減算器と、
直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブと
を具備してなる事を特徴とする塩基配列検出装置。
【請求項４】
前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項５】
前記検出極と対向して配置された第１の対極との間に所定の電圧を印加して、前記検出極からの電気化学信号を検出するための第１のポテンシオ・スタットと、
第１のポテンシオ・スタットの出力を信号処理し、前記減算器に出力する第１の信号処理装置と、
前記対照極と対向して配置された第２の対極との間に所定の電圧を印加して、前記対照極からの電気化学信号を検出する第２のポテンシオ・スタットと、
第２のポテンシオ・スタットの出力を信号処理し、前記減算器に出力する第２の信号処理装置と
を具備することを特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項６】
前記減算器の減算結果を表示する表示装置をさらに備える事をと特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項７】
前記検出極、対照極及び減算器は同一基板に形成され、
前記減算器と前記表示装置はコンピュータを介して信号線により接続されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項８】
前記検出極と、
前記検出極から第１の距離離間して配置され、前記検出極との間に所定の電圧を印加するための第１の対極と、
前記検出極から第２の距離離間して配置され、検出される電圧を第１の対極に負帰還させるための第１の参照極と
からなる検出極側３電極系と、
前記対照極と、
前記対照極から第１の距離離間して配置され、前記対照極との間に所定の電圧を印加するための第２の対極と、
前記検出極から第２の距離離間して配置され、検出される電圧を第２の対極に負帰還させるための第２の参照極と
からなる対照極側３電極系とをさらに備え、
前記検出極側３電極系と前記対照極側３電極系の組はマトリクス状に複数配置される事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項９】
前記検出極が第１の方向に複数等間隔に配置された検出極群と、
前記検出極群から所定の距離離間して配置され、第１の方向に長手方向を有する参照極と、
前記参照極から所定の距離離間して配置され、前記対照極が第１の方向に複数等間隔に配置された対照極群と、
前記対照極群から所定の距離離間して配置され、第１の方向に長手方向を有し、前記検出極の各々及び前記対照極の各々との間に所定の電圧を印加するための対極と
をさらに備える事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１０】
前記検出極が第１の方向に複数等間隔に配置された検出極群と、
前記対照極が第１の方向に複数等間隔に配置された対照極群と、
前記検出極群及び前記対照極群から所定の距離離間して配置され、第１の方向に長手方向を有し、前記検出極の各々に所定の電圧を印加するための対極と、
前記検出極群、対照極群及び対極から所定の距離離間して配置され、第１の方向とはほぼ垂直な第２の方向に長手方向を有し、検出される電圧を前記対極に負帰還させるための参照極と
をさらに備える事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１１】
前記検出極と、前記検出極から第１の距離離間して配置された第１の参照極からなる検出極側電極群と、
前記対照極と、前記対照極から第１の距離離間して配置された第２の参照極からなる対照極側電極群と、
第１の方向に長手方向を有し前記検出極の各々及び前記対照極の各々との間に所定の電圧を印加するための対極とをさらに備え、
前記検出極側電極群と前記対照極側電極群は、第１の方向と、第１の方向とは異なる第２の方向にマトリクス状に配置されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１２】
前記検出極及び前記対照極に所定の電圧を印加するための円形の対極と、
前記対極を取り囲むように前記対極から所定の距離離間して配置された円環状の参照極とを備え、
前記検出極及び対照極は、前記対極を中心とした円周上に、交互に複数配置されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１３】
第１の方向に長手方向を有する第１の部材と、第１の方向とはほぼ垂直な方向に長手方向を有し、第１の部材と第１の交点で交差する第２の部材からなる参照極と、
前記参照極により仕切られる４つの領域の各々に、第１の交点から第１の距離離間して配置される４つの対極とをさらに備え、
前記検出極は、前記４つの領域のうちの少なくとも１つの領域に配置され、第１の交点から第１の距離よりも長い距離離間して複数配置され、
前記対照極は、前記４つの領域のうちの少なくとも１つの領域に配置され、第１の交点から第１の距離よりも長い距離離間して複数配置されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１４】
前記対照極は、前記４つの領域のうち、前記検出極が配置されていない領域に配置され、前記検出極は、前記４つの領域のうち、前記対照極が配置されていない領域に配置されてなる事を特徴とする請求項３に記載の塩基配列検出装置。
【請求項１５】
導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを備えた塩基配列検出装置の前記検出極及び対照極における電気化学信号を検出し、
前記検出極で検出された電気化学信号から前記対照極で検出された電気化学信号を減算し、
直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブを備える事を特徴とする塩基配列検出方法。
【請求項１６】
前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項１５に記載の塩基配列検出方法。
【請求項１７】
前記減算結果を、コンピュータに備えられた表示装置に表示させる事を特徴とする請求項１５に記載の塩基配列検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は試料中に存在する特定の遺伝子を特異的に検出するための塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
近年の遺伝子工学の発展により、医療分野では遺伝子による病気の診断や予防が可能となってきている。遺伝子工学を用いた診断は遺伝子診断とよばれている。この遺伝子診断では、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥や変化を検出することにより、病気の発症前やその初期段階で診断や予測を行うことができる。また、感染したウィルスや病原菌の遺伝子を検出することにより、正確な診断が可能になる。
【０００３】
従来用いられている一般的な遺伝子検出法は次の通りである。
【０００４】
まず、試料から遺伝子を抽出する。必要があれば、適当な制限酵素で切断した後、電気泳動及びサザンプロットを行う。次に、検出の目的とする標的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを、プロットされた遺伝子とハイブリダイズさせる。なお、この核酸プローブは、通常蛍光色素でラベルされている。次いで、レーザ光で蛍光色素を励起する。これにより、ハイブリダイズされた核酸プローブを検出し、標的遺伝子の存在を確認する。
【０００５】
しかしながら、この蛍光色素を用いた検出方法では、遺伝子の検出までに少なくとも２〜３日間を要する。また、核酸プローブを高価な蛍光色素でラベルしなければならない。さらには、蛍光色素を励起させるためのレーザ発生装置が必要となり、装置が大型化してしまう。
【０００６】
前述した蛍光色素を用いた検出方法の問題を解決するため、電気化学的手法を用いた遺伝子検出方法が考案されている。この電気化学的手法を用いた検出方法は、本発明者らにより考案された文献に開示されており、その内容は参考のためにここに組み込まれる（例えば、特許文献１参照）。この電気化学的手法によれば、プローブが固定化された電極からの電気化学的信号を検出することにより、標的遺伝子の存在を確認することができる。
【０００７】
しかしながら、電気化学的手法を用いた遺伝子検出では、電流検出時にバックグラウンド電流が発生する。従って、電極から検出される電流値には、プローブとの由来による電流とバックグラウンド電流が含まれる。そのため、検出結果からプローブ由来の電流のみを抽出することが困難であった。
【０００８】
【特許文献１】
特許第２５７３４４３号明細書
【０００９】
【発明の開示】
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、標的塩基配列との相互作用に基づく電流の検出を高精度に行う塩基配列検出電極、塩基配列検出装置及び塩基配列検出方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この発明の一の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブとを具備してなる塩基配列検出電極が提供される。
【００１２】
この発明の別の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、前記検出極から検出された電気化学信号から前記対照極から検出された電気化学信号を減算する減算器と、直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブとを具備してなる塩基配列検出装置が提供される。
【００１３】
また、この発明のさらに別の観点によれば、導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを備えた塩基配列検出装置の前記検出極及び対照極における電気化学信号を検出し、前記検出極で検出された電気化学信号から前記対照極で検出された電気化学信号を減算し、直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブを備える塩基配列検出方法が提供される。
【００１４】
【発明を実施するための最良の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の一実施形態を説明する。
【００１５】
図１は本発明の一実施形態に係る塩基配列検出装置の全体構成の概念を示すブロック図である。図１に示すように、電気化学セル１内に、検出極２及び対照極３が配置されている。これら検出極２及び対照極３における電流は、ポテンシオ・スタット４０及び５０でそれぞれ検出される。得られた電気化学信号は、それぞれ信号処理装置６０及び７０に出力される。信号処理装置６０及び７０は、ピーク電流値の算出等の信号処理を行い、その信号処理されたデータを減算器８０に出力する。
【００１６】
減算器８０は、信号処理装置６０から得られたデータから、信号処理装置７０から得られたデータを減算し、減算結果をコンピュータ９０に出力する。
【００１７】
電気化学セル１、検出極２、対照極３、ポテンシオ・スタット４０及び５０は塩基配列を検出するための半導体基板１０１（チップ）に形成される。また、検出極２、対照極３、ポテンシオ・スタット４０及び５０は、その半導体チップの集積回路により構成される。減算器８０はその半導体基板１０１に形成された集積回路として実現されてもよいし、半導体基板１０１とは別個に設けられたコンピュータや減算器により実現されてもよい。減算器８０は、コンピュータとそのコンピュータを制御するソフトウェアにより実現されてもよいし、ＲＯＭなどに減算処理内容が記録されるファームウェアとして実現されてもよいし、ハードウェアのみで実現されてもよい。
【００１８】
コンピュータ９０は、例えばパーソナルコンピュータなど、一般的な演算処理が可能なコンピュータであれば何でもよい。コンピュータ９０は、通信インタフェース９１、ＣＰＵ９２及び表示装置９３を備える。通信インタフェース９１は、減算器８０からの減算結果を受信し、ＣＰＵ９２に出力する。ＣＰＵ９２は、減算結果を表示装置９３に表示させる。
【００１９】
図２Ａ及び図２Ｂは検出極２及び対照極３の詳細な構成を示す図である。図２Ａは検出極２の詳細を、図２Ｂは対照極３の詳細を示している。
【００２０】
図２Ａに示すように、ブロッキング分子２１が検出極２の表面を被覆するように形成されている。ブロッキング分子２１は、検出極２表面よりも単位面積当たりの挿入剤の吸着が少ない分子により構成される。具体的には、例えばメルカプトヘキサノールやメルカプトオクタノールなどから構成されている。検出極２は完全に被覆されていなくてもよく、少なくとも検出極２表面の一部が被覆されていればよい。このように、検出極２表面をブロッキング分子２１が被覆する構成とすることにより、挿入剤分子の検出極２表面への吸着を低減することができる。
【００２１】
ブロッキング分子２１は特に上述の物質に限定されるものではないが、例えば直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、エステル、ケトン類が好ましく、さらにこれらの分子が酸素、窒素、イオウ等の原子を介して複数個鎖状に結合した分子でも構わない。また、これらに官能基として例えばアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、フェニル基、アミノ基、チオール基、ハロゲン等の中で、挿入剤分子と相互作用しにくいものが導入されている分子がより好ましい。また、これらのブロッキング分子２１は、チオール基、アミノ基等を介して検出極２表面に吸着させ、自己組織単分子膜を作製するのが好ましい。この他にも、無機酸化物層、高分子層などを形成させてもよい。
【００２２】
また、このブロッキング分子２１が形成されていない検出極２表面にはスペーサ部材２２の末端が固定化されている。このスペーサ部材２２は検出極２表面よりも単位面積当たりの挿入剤の吸着が少ない材料からなる。具体的には、スペーサ部材２２は直鎖状有機分子からなり、例えばエチレングリコールが該当する。スペーサ部材２２の材料は特に限定されるものではないが、例えば直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、エステル、ケトン類が好ましく、さらにこれらの分子が酸素、窒素、イオウ等の原子を介して複数個鎖状に結合した分子でも構わない。
【００２３】
さらに、このスペーサ部材２２の他の末端には、標的相補核酸プローブ２３が固定化されている。標的相補核酸プローブ２３は、検出の目的とする標的核酸配列と相補的な塩基配列を有する核酸からなるプローブである。このように、スペーサ部材２２を介して検出極２に標的相補核酸プローブ２３が固定化される構成をとることにより、試料と標的相補核酸プローブ２３との結合の効率を向上させることができる。
【００２４】
従来、スペーサ部材には挿入剤分子が相互作用し、バックグラウンド電流を増加させる原因となっていたが、本実施形態のようにスペーサ部材２２の構成として、挿入剤分子が相互作用しにくい分子を選択することにより、バックグラウンド電流を減少させることができる。バックグラウンド電流とは、検出極２に配置した標的相補核酸プローブ２３と挿入剤との相互作用に起因する電流以外のノイズ等の原因となる電流を指す。このバックグラウンド電流は、例えば検出極２表面と挿入剤との相互作用や、ブロッキング分子２１と挿入剤との相互作用、スペーサ部材２２と挿入剤との相互作用に起因する電流を含む。標的相補核酸プローブ２３と挿入剤との相互作用に起因する電流をプローブ電流と呼ぶ。
【００２５】
上述したような直鎖状有機分子から構成される標的相補核酸プローブ２３を使用する場合には、バックグラウンド電流は、ほぼ検出極２表面に挿入剤が相互作用することに起因する電流のみとなる。このため、後述する対照極３の構成は、ブロッキング分子層のみでよくなり、非常に好ましい。このような効果のあるスペーサ分子としては、例えばエチレングリコールが１つあるいは多数連結された直鎖状分子がある。この他にも、挿入剤分子と相互作用しない分子であれば、その材料は限定されない。
【００２６】
図２Ｂに示すように、対照極３では、ブロッキング分子３１が対照極３の表面を被覆するように形成されている。このブロッキング分子３１は、検出極２表面を被覆するブロッキング分子２１と同じ材料により構成されるのが好ましいが、類似の性質を示す分子であれば特に限定されない。対照極３を完全に被覆してなくてもよく、少なくとも対照極３表面の一部が被覆されていればよい。このように、対照極３表面を、ブロッキング分子２１と同じ材料のブロッキング分子３１が被覆する構成とすることにより、挿入剤分子の検出極２表面への吸着を低減することができるとともに、検出極２と対照極３の双方におけるバックグラウンド電流に対する影響の低減効果を同じにすることができる。
【００２７】
図３〜図１４は、この検出極２及び対照極３を含む電極構造の上面模式図である。図３〜図１４に示すように、電極の種類には、検出極２及び対照極３の他に、対極４及び参照極５がある。これら検出極２、対照極３、対極４及び参照極５は導電性の材料により構成され、いずれも電気化学セル１内に配置される。これら検出極２、対照極３、対極４及び参照極５が配置された電気化学セル１には、検出極２や対照極３に固定化されたプローブとの間のハイブリダイゼーションを行わせるための検体塩基配列を有する試料や、挿入剤、バッファなどが充填され、電気化学反応が実行される。
【００２８】
検出極２及び対照極３は、セル１内の反応電流を検出するための電極である。
【００２９】
検出極２には、標的塩基配列とは相補的な標的相補塩基配列を有するＤＮＡプローブが固定化され、標的相補核酸プローブと挿入剤との相互作用に起因するプローブ電流が検出される。
【００３０】
対照極３は、ノイズなどのバックグラウンド電流を検出し、後にそのバックグラウンド電流で検出極２で検出される電流から差し引くことによりノイズ等の影響を低減するための電極である。対照極３は、プローブが固定されずに用いられるか、あるいは後述の図１６に示すようにダミープローブが固定化されて用いられる。
【００３１】
対極４は、検出極２あるいは対照極３との間に所定の電圧を印加してセル１内に電流を供給する電極である。
【００３２】
参照極５は、参照極５と検出極２あるいは参照極５と対照極３の間の電圧を所定の電圧特性に制御すべく、その電極電圧を対極４に負帰還させる電極である。この参照極５により、対極４による電圧が制御され、セル１内の各種検出条件に左右されない精度の高い酸化電流検出が行える。
【００３３】
図３は、検出極２、対極４及び参照極５からなる検出極側３電極系３１と、対照極３、対極４及び参照極５からなる対照極側３電極系３２からなる。
【００３４】
検出極側３電極系３１は、円形の検出極２に対して所定の間隔をおいて、所定の方向に長手方向を有する長方形の対極４が配置されている。また、検出極２に対して所定の間隔をおいて、対極４の長手方向とはほぼ垂直な方向に長手方向を有する長方形の参照極５が配置されている。検出極２と対極４との距離と、検出極２と参照極５との距離はほぼ等しく配置される例を示しているが、これに限定されず、異なる距離で配置してもよい。
【００３５】
対照極側３電極系３２は、検出極側３電極系３１の検出極２を対照極３に置換した構成となっている。これら３電極系３１や３２を１組の電極系として、ポテンシオ・スタット４０や５０が接続される。
【００３６】
図４は図３の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図４に示すように、図３に示したのと同様の３電極系３１及び３２が交互にマトリクス配置されている。図４では列方向に同じ３電極系が並び、行方向に異なる３電極系が交互に配置される例を示しているが、行方向に同じ３電極系を配置し、列方向に異なる３電極系を交互に配置してもよい。また、行方向及び列方向共に異なる３電極系が交互に配置されるように配置してもよい。この場合、マトリクスの斜め方向に共通する３電極系が並んで配置される。
【００３７】
図５は図３と同一形状の電極の別の配置例を示している。長方形の対極４に対して長手方向が同一の参照極５が対極４を挟んで等しい間隔をおいて配置されている。対極４及び一方の参照極５の間には対照極３が配置され、さらにその参照極５の対照極３が設けられた側とは反対側には検出極２が配置されている。また、対極３及び他方の参照極５の間には検出極２が配置され、さらにその参照極５の対照極３が設けられた側とは反対側には対照極３が配置されている。対極４あるいは参照極５と検出極２あるいは対照極３の距離は等間隔である。また、検出極２と対照極３は、参照極５を挟んで対称の位置に配置されている。さらに、検出極２と対照極３は対極４を挟んで対称の位置に配置されている。
【００３８】
図６は図５の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図６に示すように、図５に示したのと同様の電極構造を有しているが、検出極２及び対照極３は、対極４や参照極５の長手方向に沿って等間隔に複数配置され、それぞれ検出極群２０及び対照極群３をなす。また、検出極２や対照極３は、参照極５や対極４を挟んで対称の位置に配置されている。対称の位置に配置される検出極２と対照極３同士が減算の対象となる電極である。すなわち、参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２あるいは対照極３と、その参照極５と、さらにはその検出極２あるいは対照極３に近接して設けられた対極４により３電極系をなす。各検出極２から対極４及び参照極５までの距離は等しく、各対照極３から対極４及び参照極５までの距離は等しい。その３電極系にポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。１つの検出極群２０、１つの対照極群３０、１つの対極４及び１つの参照極５からなる電極セットが、それら電極あるいは電極群の長手方向と異なる方向（望ましくはほぼ垂直な方向）に複数配置される。
【００３９】
図７は図３や図５と同一形状の電極の別の配置例を示している。対極４の中心近傍から所定の間隔をおいて、かつ対極４に対して長手方向がほぼ垂直となるように参照極５が配置されている。参照極５から所定の間隔をおいて検出極２が配置され、またこの検出極２と参照極５に対して対称の位置に対照極３が配置されている。
【００４０】
図８は図７の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図８に示すように、図７に示したのと同様の電極構造を有しており、かつ検出極２及び対照極３は、参照極５を挟んで対称の位置に、参照極５の長手方向に沿って等間隔に複数配置され、それぞれ検出極群２０及び対照極群３をなす。参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２と対照極３が減算の対称となる電極である。すなわち、参照極５に対して対称の位置に配置される検出極２あるいは対照極３と、その参照極５と、さらには参照極５に垂直に設けられた対極４により３電極系をなす。その３電極系にポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。各検出極２から参照極５までの距離は等しく、各対照極３から参照極５までの距離は等しい。
【００４１】
図９は図３，５や７と同一形状の電極の別の配置例を示している。対極４から所定の間隔をおいて、かつ対極４の長手方向とほぼ平行に長手方向を有する参照極５１，５２が配置されている。その一方の参照極５１と対極４との間には検出極２が、他方の参照極５２と対極４の間には対照極３が配置されている。検出極２に対する参照極５１及び対極４に対する位置関係と、対照極３に対する参照極５２及び対極４に対する位置関係は等しい。検出極２と、この検出極２に対応して設けられた参照極５１の組を検出極側電極群５１０、対照極３と、この対照極３に対応して設けられた参照極５２の組を対照極側電極群５２０と呼ぶ。１つの検出極側電極群５１０と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット４０が接続される。１つの対照極側電極群５２０と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット５０が接続される。
【００４２】
図１０は図９の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１０に示すように、図９に示したのと同様の電極構造を有しており、検出極側電極群５１０が列方向に複数等間隔で配置され、対照極側電極群５２０が列方向に複数等間隔で配置され、これら電極群同士が互いに行方向に交互に配置されているマトリクス構造である。この電極群５１０，５２０の各々と対極４により３電極系をなし、これにポテンシオ・スタット４０あるいは５０が接続される。なお、列方向には同一の電極群が配置される例を示しているが、列方向にも検出極側電極群５１０と対照極側電極群５２０が交互に配置される構成としてもよい。また、行方向と列方向は互いにほぼ垂直な場合を示しているが、これに限定されるものではなく、列方向は行方向に対して垂直ではない角度を有していてもよい。
【００４３】
図１１は図３，５，７や９と同一形状の検出極２及び対照極３と、円形の対極４及び円環形状の参照極５による電極構造の一例を示す図である。図１１に示すように円形の対極４の中心を同じくする円環形状の参照極５が対極４を囲むように配置されている。さらに、対極４に対して対称の位置であって参照極５の外周から所定の間隔をおいて検出極２及び対照極３が配置されている。
【００４４】
図１２は図１１の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１２に示すように、図１１に示すのと同様の電極構造を有しており、かつ検出極２及び対照極３が対極４に対して対称の位置に複数配置されている。また、複数の検出極２及び複数の対照極３の各々は対極４から同じ位置に配置されているため、対極４を中心とする円周４００上に検出極２及び対極３が交互に複数配置される構成をなす。対極４に対して対称の位置にある検出極２及び対照極３同士を減算の対象としてもよいし、隣り合う検出極２及び対照極３同士を減算の対象としてもよい。
【００４５】
図１３は図３，５，７や９と同一形状の検出極２及び対照極３と、正方形の対極４及び十字形状の参照極５による電極構造の一例を示す図である。図１３に示すように、長手方向が互いにほぼ垂直に交差する２つの長方形の電極が重なるように構成された十字形状の参照極５が配置されている。この参照極５の十字により仕切られる４つの領域の各々に、参照極５から所定の間隔をおいて対極４が１つずつ配置されている。また、これら４つの領域の各々のうち、２つの領域には、検出極２が１つずつ配置され、他の２つの領域には対照極３が１つずつ配置されている。これら検出極２及び対照極３は、対極４よりも参照極５から離れた位置に配置される。参照極５からの各対極４への距離は等しく、また参照極５からの各検出極２及び各対照極３への距離は等しい。
【００４６】
図１４は図１３の電極構造に基づいて構成されるより具体的な電極構造例である。図１４に示すように、対極４と参照極５の構成は図１３と共通する。この図１４の場合、参照極５で仕切られる４つの領域４０１〜４０４の各々に、検出極２が複数配置され、あるいは対照極３が複数配置される。より具体的には、互いに隣接する領域４０１と４０４には検出極２が複数配置され、互いに隣接する領域４０２と４０３には対照極３が複数配置される。参照極５との間隔が等しい検出極２及び対照極３同士が減算の対象となる。なお、４つの領域４０１〜４０４のうちの少なくとも１つの領域に検出極２が配置され、また少なくとも１つの領域に対照極３が配置されていればよい。従って、３つの領域に検出極２が配置されていても、１つの領域のみに検出極２が配置されていてもよい。また、対極４は各領域に１つずつ、計４つ配置する場合を示したが、各領域に２つ以上の対極４を配置してもよい。また、１つの領域に検出極２と対照極３を混在して配置してもよい。
【００４７】
以上に示した図３〜図１４の電極配置は一例にすぎず、各電極の形状、大きさ、位置関係などを種々変更することができる。図３〜図１４に示す電極構造は、１つの半導体やガラス等の基板に配置することができる。従って、検出極２と対照極３は同一基板内に配置される。検出極２は１つでも複数でもよい。対照極３は１つでも複数でもよい。また、検出極２に対して減算の対象となる対照極３は１つでも複数でもよい。また、対照極３に対して減算の対象となる検出極２は１つでも複数でもよい。もちろん、各電極を別の基板上に配置してもよい。
【００４８】
次に、前述した塩基配列検出装置の動作を図１５のフローチャートに沿って説明する。
【００４９】
まず、電気化学セル１内に検出極２及び対照極３を配置し、セル１内に検査の対象となる核酸を含む試料（検体溶液）で充填する。そして、セル１を所定の温度に保持し、試料と検出極２に固定化された標的相補核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を促進させる。ハイブリダイゼーション反応が終了した後、セル１内から試料を送出し、バッファ剤で充填した後、セル１内を挿入剤で充填する。この挿入剤が充填されたセル１内の検出極２及び対照極３と対極４との間に参照極５による電圧のフィードバックの下で所定の電圧を印加することにより、検出極２及び対照極３でそれぞれ並行してポテンシオ・スタット４０及び５０により電気化学測定が行われる（ｓ１）。
【００５０】
次に、電気化学測定により得られた検出極２及び対照極３からの電流値のピーク電流値を検出する（ｓ２）。このピーク電流値の検出は、検出極２及び対照極３の双方で並行して行われる。ピーク電流値の検出は、信号処理装置６０及び７０で実行される。信号処理装置６０及び７０は、ポテンシオ・スタット４０及び５０から得られる電流波形あるいは電流波形を電流電圧変換した電圧波形のピーク値を抽出する。なお、得られるピーク電流値は、Ａ／Ｄ変換されていてもよいし、また複数の検出極２や複数の対照極３の平均値算出等の統計処理を行った後に得てもよい。得られたピーク電流値は減算器８０に出力される。
【００５１】
減算器８０は、検出極２についてのピーク電流値から対照極３についてのピーク電流値を減算する（ｓ３）。検出極２についてのピーク電流値は、標的相補核酸プローブに挿入剤分子が相互作用することに起因するプローブ電流と、意図しないノイズとして検出されるバックグラウンド電流を加算した電流に基づいて得られる。バックグラウンド電流としては、検出極２表面と挿入剤分子が相互作用することに起因する電流値と、核酸プローブ部分と基板表面とをつなぐスペーサ部材２２に挿入剤分子が相互作用することに起因する電流値が含まれる。
【００５２】
対照極３についてのピーク電流値は、意図しないノイズとして検出されるバックグラウンド電流に基づいて得られる。従って、減算により、バックグランド電流による電流値を差し引くことができ、プローブによる電流を検出することができる。
【００５３】
減算器８０は、減算結果をコンピュータ９０に出力する。コンピュータ９０は、減算結果を表示装置９３に表示する。オペレータは、この表示された減算結果により、試料に含まれる塩基配列を特定することができる。もちろん、減算結果に基づき試料に含まれる塩基配列の有無の判定などを行う判定回路を設け、その判定結果を表示装置９３に表示してもよい。
【００５４】
このように本実施形態によれば、本発明においては、検出極２としての従来の遺伝子検出電極のほかに、対照極３としてバックグラウンド電流のみを検出できる電極を具備する。両電極２，３における電流値を検出した後、基板上の集積回路上で演算を行うことによって検出極２の電流値から対照極３の電流値を差し引き、バックグラウンド電流を除去した標的遺伝子由来の電流値のみを検出することが可能である。ブロッキング分子が検出極２及び対照極３の表面を被覆するように形成されているため、電極表面と挿入剤の相互作用によるバックグラウンド電流の影響を低減できる。また、スペーサ部材として直鎖状有機分子を用いることにより、スペーサ起因のバックグラウンド電流を大幅に低減できる。従って、対照極３はプローブを設けなくてもスペーサの有無によるバックグラウンド電流の差がほとんど生じない。従って、スペーサ及びプローブを固定化させる手間が省ける。
【００５５】
従来の電流検出型の遺伝子検出法においては、標的遺伝子由来の電流値のみを抽出し、解析することが困難であった。特に一塩基多型を判別する際には、非特異的にハイブリダイズした遺伝子によって電流値が増加し、バックグラウンド電流との判別が困難であったが、本実施形態によれば、このような課題を解決することができる。
【００５６】
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００５７】
検出極２に固定化させるプローブは、標的塩基配列と相補的な塩基配列である標的相補塩基配列を有するプローブが用いられたが、これに限定されるものではない。例えば、標的相補塩基配列とは一塩基、あるいは数塩基異なる塩基配列を有し、標的相補塩基配列よりも標的塩基配列との相補性が低いプローブ（以下、標的準相補核酸プローブと呼ぶ）を用いてもよい。また、標的相補核酸プローブと標的準相補核酸プローブの双方を検出極に固定化して用いてもよい。
【００５８】
また、上記実施形態では対照極３表面にブロッキング分子３１を被覆し、スペーサ及びプローブを設けない例を示したが、これに限定されない。図１６は図２Ｂに示す対照極３の変形例を示す図である。この変形例に係る対照極３００は、ブロッキング分子３１を介して直鎖状有機分子からなるスペーサ部材３０１の末端が固定化されている。このスペーサ部材３０１は検出極２に設けられたスペーサ部材２２と同一の材料により構成される。
【００５９】
スペーサ部材３０１の他の末端には、ダミープローブ３０２が固定化されている。ダミープローブ３０２は、標的核酸配列と相補的な塩基配列を有さず、非相補的な塩基配列を有する核酸からなるプローブである。
【００６０】
このように、対照極３側にもスペーサを介してプローブを固定化することができる。これにより、検出極２側のスペーサ部材２２に起因するバックグラウンド電流を対照極３側の電流で差し引くことが出来る。
【００６１】
また、検出極２側では、スペーサ部材２２を介して検出極２に標的核酸プローブ２３を固定化する例を示したが、これに限定されない。例えば図２２Ａ及び図２２Ｂに示すように、標的核酸プローブ２３をスペーサ部材２２を介さずに検出極２に固定化させるものでもよい。
【００６２】
また、図１では特に示さなかったが、コンピュータ９０が半導体基板１０１に形成された各回路を自動制御するものでもよい。この場合、コンピュータ９０は、通信インタフェース９１を介してポテンシオ・スタット４０，５０、信号処理装置６０，７０、減算器８０の動作を制御するための制御指令を出力する。これら各回路は、受信した制御指令に基づき動作し、動作結果や演算結果をさらにコンピュータ９０に送信する。これにより、塩基配列の検出を自動化することができる。また、図１では、半導体基板１０１に信号処理装置６０、７０及び減算器８０を設ける場合を示したが、これらと同様の機能をコンピュータ９０側で実現してもよい。この場合、ポテンシオ・スタット４０及び５０の出力信号がコンピュータ９０に送信され、コンピュータ９０側で信号処理及び減算処理が実行される。
【００６３】
以上説明したように本発明は、標的塩基配列との相互作用に基づく電流の検出を高精度に行うことができる。
【００６４】
（実施例）
以下に、本発明による塩基配列検出装置のより具体的な実施例を説明する。
【００６５】
この実施例では、上述した本実施形態の実施例と、その実施例との比較のための従来例を説明する。
【００６６】
（従来例）
この従来例では、対照極３を用いずに核酸の検出を行った。検出極２として、検出極２０１、２０２及び２０３の３つのＡｕ電極が用いられた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００６７】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸の配列番号１と相補的な配列２を持つプローブとして、一本鎖の核酸プローブを１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬する。これにより、検出極２０１への標的相補核酸プローブ２１１の固定化を行った。同様に標的核酸と相補的な塩基配列と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖核酸プローブ（以下、標的準相補核酸プローブ２１２，２１３と呼ぶ）を検出極２０２及び２０３にそれぞれ固定化した。これら一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、塩基(シトシン)２０個からなるスペーサを介して検出極２０１〜２０３にそれぞれ固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３を浸漬することにより、標的相補核酸プローブ２１１や標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３が固定化されていない部分をブロッキングした。
【００６８】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を図１７に示す。検出極２０１と比較すると検出極２０２及び２０３の電流値は低いが、バックグラウンド電流との区別が付かない。
【００６９】
（実施例１）
この実施例１では、対照極３を用いて従来例と同様な核酸の検出を行った。検出極２として、検出極２０１、２０２及び２０３の３つのＡｕ電極が用いられた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００７０】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖核酸プローブを１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって標的相補核酸プローブ２１１の固定化を行った。同様に配列２と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖標的準相補核酸プローブを検出極２０２及び２０３に固定化した。さらに配列２とは非相補的な配列５を持つ一本鎖核酸プローブ（以下、標的非相補核酸プローブと呼ぶ）を対照極３に固定化した。一本鎖核酸プローブは、塩基(シトシン)２０個からなるスペーサ部材を介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
【００７１】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図１８に示す。検出極２０２は検出目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的とする遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。この実施例１により、対照極３を用いた遺伝子検出を行うことによって目的遺伝子由来の電流のみを抽出できていることが明らかになった。
【００７２】
（実施例２）
従来例１及び実施例１においては、核酸プローブのスペーサ部材に、挿入剤分子と相互作用しやすい塩基列を用いた。そのため、対照極３にも核酸プローブを固定化した。この実施例２においては、核酸プローブのスペーサ部材に、挿入剤分子と相互作用しないエチレングリコール分子を用いた。試料核酸には配列番号1を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００７３】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この標的核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブの固定化を行った。同様に標的核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、エチレングリコール分子３０個からなるスペーサを介して各電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
【００７４】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１及び２０２および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１及び２０２および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図１９に示す。検出極２０２は検出の目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。この実施例２により、検出極２に固定化させる核酸プローブのスペーサとしてエチレングリコールを用いることによって、対照極３には核酸プローブを固定化せずにブロッキング分子のみで構成することが可能であることが明らかになった。
【００７５】
（実施例３）
この実施例３においては、従来例、実施例１及び２とは別なブロッキング分子を用いた。核酸プローブのスペーサ部材には、エチレングリコール分子が５個結合した分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００７６】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この試料核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブの固定化を行った。同様に試料核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖核酸プローブ２１１〜２１３は、エチレングリコール分子３０個からなるスペーサを介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトオクタノール水溶液中に各検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
【００７７】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。この試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図２０に示す。検出極２０２は検出の目的とする遺伝子由来の電流値がほとんどなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。一方、検出極２０３は非特異的に目的遺伝子がハイブリダイゼーションしていることがわかる。
【００７８】
（実施例４）
この実施例４においては、核酸プローブのスペーサ部材に、直鎖アルカン分子を用いた。試料核酸には配列番号１を持つＭｘＡタンパク質のプロモーター領域を用いた。
【００７９】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
前述の試料核酸を標的核酸とする。この試料核酸と相補的な配列２を持つ一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１を１０μＭ含む溶液に検出極２０１を１時間浸漬することによって核酸プローブ２１１の検出極２０１への固定化を行った。同様に試料核酸と一塩基異なる配列３，４を持つ一本鎖の標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３を検出極２０２及び２０３に固定化した。対照極３には一本鎖核酸プローブの固定は行わない。一本鎖の標的相補核酸プローブ２１１及び標的準相補核酸プローブ２１２及び２１３は、炭素数９６個の直鎖アルカン分子からなるスペーサを介して電極に固定されている。次に、１ｍＭメルカプトヘキサノール水溶液中に検出極２０１〜２０３及び対照極３を浸漬することにより、核酸プローブが固定化されていない部分をブロッキングした。
【００８０】
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、抽出後、ＰＣＲにより増幅した。試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液中に、（１）で作製した検出極２０１〜２０３および対照極３を浸漬し３５℃で６０分間インキュベートすることによってアニーリング反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。さらに検出極２０１〜２０３および対照極３を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定後、減算器によりバックグラウンド電流を除去した。除去後の結果を図２１に示す。検出極２０２は検出目的遺伝子由来の電流値があまりなく、１塩基の差が明確に判別できていることを示している。この実施例４により、核酸プローブのスペーサとして直鎖アルカン分子を用いることによっても、対照極３には核酸プローブを固定化せずにブロッキング分子のみで構成することが可能であることが明らかになった。
【００８１】
付加的な長所及び改変は当該技術に長けた者にとって容易に思い浮かぶであろう。従って、そのより広範な観点における本発明は、ここで示され説明される具体的な詳細及び代表的な実施形態に限定されない。従って、添付されるクレーム及びその均等物により定義される一般的な発明概念の精神あるいは視野から離れることなく様々な改変がなされ得る。
【００８２】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【００８３】
【産業上の利用可能性】
以上説明したようにこの発明は、塩基配列を検出するための検出電極の技術分野、塩基配列を検出するための検出装置の技術分野及び塩基配列を検出するための検出方法の分野に有効である。
【００８４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA
OKADA, Jun
HASHIMOTO, Koji
TAKAHASHI, Masayoshi
<120> Base sequence detecting electrode, base sequence detecting device and base sequence detecting method
<130> 02S1026P
<150> JP 2002-244018
<151> 2002-8-23
<160> 5
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggcctccgct ctcgcttcgc ctctttcacc ccgcgcccag ccccgccccg cgccgcgaag 60
aaatgaaact cacagaccct gtgctgaggg cggctccggg cgcagaaacg aaacctagct 120
c 121
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gtttctgcgc ccgga 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gtttctgcac ccgga 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gtttctgctc ccgga 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
gacctgcttc tgact 15
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の一実施形態に係る塩基配列検出装置の全体構成の概念を示すブロック図。
【図２】
Ａ及びＢは同実施形態に係る検出極及び対照極の詳細な構成を示す図。
【図３】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図４】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図５】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図６】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図７】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図８】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図９】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１０】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１１】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１２】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１３】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１４】
同実施形態に係る検出極及び対照極を含む電極構造の上面図。
【図１５】
同実施形態に係る塩基配列検出装置の動作のフローチャートを示す図。
【図１６】
同実施形態に係る塩基配列検出装置の対照極の変形例を示す図。
【図１７】
従来の塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図１８】
対照極を含む塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図１９】
スペーサ部材にエチレングリコール分子を用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図２０】
メルカプトオクタノールをブロッキング分子として用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図２１】
スペーサ部材に直鎖アルカン分子を用いた塩基配列検出装置の電流測定結果を示す図。
【図２２】
Ａ及びＢはスペーサ部材を用いずに標的核酸プローブを固定化する変形例を示す図。
【符号の説明】
１…電気化学セル、２…検出極、３…対照極、４０、５０…ポテンシオ・スタット、６０、７０…信号処理装置、８０…減算器、９０…コンピュータ、９１…通信インタフェース、９２…ＣＰＵ、９３…表示装置、１０１…半導体基板（チップ）。
Claims (20)
- 導電性の検出極と、
この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、
前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、
導電性の対照極と、
この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と
を具備する事を特徴とする塩基配列検出電極。 - 前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項１に記載の塩基配列検出電極。
- 直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブをさらに備える事を特徴とする請求項１に記載の塩基配列検出電極。
- 導電性の検出極と、
この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、
前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、
導電性の対照極と、
この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子と、
前記検出極から検出された電気化学信号から前記対照極から検出された電気化学信号を減算する減算器と
を具備してなる事を特徴とする塩基配列検出装置。 - 前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。
- 前記検出極と対向して配置された第１の対極との間に所定の電圧を印加して、前記検出極からの電気化学信号を検出するための第１のポテンシオ・スタットと、
第１のポテンシオ・スタットの出力を信号処理し、前記減算器に出力する第１の信号処理装置と、
前記対照極と対向して配置された第２の対極との間に所定の電圧を印加して、前記対照極からの電気化学信号を検出する第２のポテンシオ・スタットと、
第２のポテンシオ・スタットの出力を信号処理し、前記減算器に出力する第２の信号処理装置と
を具備することを特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。 - 前記減算器の減算結果を表示する表示装置をさらに備える事をと特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。
- 前記検出極、対照極及び減算器は同一基板に形成され、
前記減算器と前記表示装置はコンピュータを介して信号線により接続されてなる事を特徴とする請求項７に記載の塩基配列検出装置。 - 直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブをさらに備える事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。
- 前記検出極と、
前記検出極から第１の距離離間して配置され、前記検出極との間に所定の電圧を印加するための第１の対極と、
前記検出極から第２の距離離間して配置され、検出される電圧を第１の対極に負帰還させるための第１の参照極と
からなる検出極側３電極系と、
前記対照極と、
前記対照極から第１の距離離間して配置され、前記対照極との間に所定の電圧を印加するための第２の対極と、
前記検出極から第２の距離離間して配置され、検出される電圧を第２の対極に負帰還させるための第２の参照極と
からなる対照極側３電極系とをさらに備え、
前記検出極側３電極系と前記対照極側３電極系の組はマトリクス状に複数配置される事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。 - 前記検出極が第１の方向に複数等間隔に配置された検出極群と、
前記検出極群から所定の距離離間して配置され、第１の方向に長手方向を有する参照極と、
前記参照極から所定の距離離間して配置され、前記対照極が第１の方向に複数等間隔に配置された対照極群と、
前記対照極群から所定の距離隙間して配置され、第１の方向に長手方向を有し、前記検出極の各々及び前記対照極の各々との間に所定の電圧を印加するための対極と
をさらに備える事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。 - 前記検出極が第１の方向に複数等間隔に配置された検出極群と、
前記対照極が第１の方向に複数等間隔に配置された対照極群と、
前記検出極群及び前記対照極群から所定の距離離間して配置され、第１の方向に長手方向を有し、前記検出極の各々に所定の電圧を印加するための対極と、
前記検出極群、対照極群及び対極から所定の距離離間して配置され、第１の方向とはほぼ垂直な第２の方向に長手方向を有し、検出される電圧を前記対極に負帰還させるための参照極と
をさらに備える事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。 - 前記検出極と、前記検出極から第１の距離離間して配置された第１の参照極からなる検出極側電極群と、
前記対照極と、前記対照極から第１の距離離間して配置された第２の参照極からなる対照極側電極群と、
第１の方向に長手方向を有し前記検出極の各々及び前記対照極の各々との開に所定の電圧を印加するための対極とをさらに備え、
前記検出極側電極群と前記対照極側電極群は、第１の方向と、第１の方向とは異なる第２の方向にマトリクス状に配置されてなる事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。 - 前記検出極及び前記対照極に所定の電圧を印加するための円形の対極と、
前記対極を取り囲むように前記対極から所定の距離離間して配置された円環状の参照極とを備え、
前記検出極及び対照極は、前記対極を中心とした円周上に、交互に複数配置されてなる事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。 - 第１の方向に長手方向を有する第１の部材と、第１の方向とはほぼ垂直な方向に長手方向を有し、第１の部材と第１の交点で交差する第２の部材からなる参照極と、
前記参照極により仕切られる４つの領域の各々に、第１の交点から第１の距離離間して配置される４つの対極とをさらに備え、
前記検出極は、前記４つの領域のうちの少なくとも１つの領域に配置され、第１の交点から第１の距離よりも長い距離離間して複数配置され、
前記対照極は、前記４つの領域のうちの少なくとも１つの領域に配置され、第１の交点から第１の距離よりも長い距離離間して複数配置されてなる事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。 - 前記対照極は、前記４つの領域のうち、前記検出極が配置されていない領域に配置され、前記検出極は、前記４つの領域のうち、前記対照極が配置されていない領域に配置されてなる事を特徴とする請求項４に記載の塩基配列検出装置。
- 導電性の検出極と、この検出極の表面を被覆するように形成され、該検出極表面への挿入剤の吸着を低減する第１ブロッキング分子と、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的相補プローブと、導電性の対照極と、この対照極の表面を被覆するように形成され、該対照極表面への挿入剤の吸着を低減する第２ブロッキング分子とを備えた塩基配列検出装置の前記検出極及び対照極における電気化学信号を検出し、
前記検出極で検出された電気化学信号から前記対照極で検出された電気化学信号を減算する事を特徴とする塩基配列検出方法。 - 前記標的相補プローブは、直鎖状有機分子からなる第１のスペーサ部材を介して前記検出極に固定される事を特徴とする請求項１７に記載の塩基配列検出方法。
- 直鎖状有機分子からなる第２のスペーサ部材を介して前記対照極に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と非相補的な塩基配列を有するダミープローブをさらに備える事を特徴とする請求項１７に記載の塩基配列検出方法。
- 前記減算結果を、コンピュータに備えられた表示装置に表示させる事を特徴とする請求項１７に記載の塩基配列検出方法。
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