JP2003102499A

JP2003102499A - 核酸の測定方法

Info

Publication number: JP2003102499A
Application number: JP2001305815A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Yukimasa; 哲男行政; Eishin Yaku; 英信夜久; Hirokazu Sugihara; 宏和杉原
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-10-01
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2003-04-08

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中の目的核酸を標識することなく、簡便
かつ迅速に目的の核酸の有無を検出する。【解決手段】試料中の目的核酸を検出する方法であっ
て、目的核酸と、目的核酸に相補的な配列を持つ核酸プ
ローブとをハイブリダイスさせる工程であって、この核
酸プローブが標識化合物で標識されている工程、一本鎖
の核酸を切断する工程、およびハイブリダイズした核酸
プローブを、該標識化合物を検出することによって検出
する工程、を包含する。上記核酸プローブは、支持体に
固定化され得る。上記標識化合物は、蛍光物質、化学発
光物質、電気化学発光物質、および酸化還元物質からな
る群から選択され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の目的核酸
を簡易かつ高感度で検出する方法、およびそれに用いる
核酸センサに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに
開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析
することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能とな
ってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごと
に対応したテーラーメード医療も可能となってきた。製
薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホル
モンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用して
いる。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情
報を利用した製品が作り出されている。

【０００３】これら遺伝子情報を得るため、サザンハイ
ブリダイゼーション法などの従来法に代わり、ＤＮＡチ
ップ、またはＤＮＡマイクロアレイが多く使われるよう
になってきている。これらの集積型ＤＮＡセンサでは、
数千から数十万といった大量のＤＮＡ断片を一度に処理
し、そこから得られた大量のデータをいかにして短時間
に解析処理を行うかが大きな目標となっている。

【０００４】その一方、特に、医療分野における遺伝子
診断などにおいては、上記のような核酸分子間のハイブ
リダイゼーションを検出する装置は、汎用の検出装置と
して用いることが可能なように、小型かつ操作性の高い
装置が強く望まれている。また、ＰＣＲなどによる核酸
増幅ステップを省略するために、微量の核酸でも検出可
能なように高感度の検出が望まれている。さらに、多く
の医療機関で手軽に使用できるためには、価格を低く抑
える必要がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来、このようなＤＮ
ＡチップまたはＤＮＡアレイを用いる測定で、対象とな
る目的核酸は、その検出方法の原理から目的核酸自身を
標識する必要がある。しかし、現在のＤＮＡチップまた
はＤＮＡマイクロアレイでは測定感度が低いことから、
ＰＣＲなどによる核酸増幅ステップが不可欠となってお
り、目的核酸自身への標識は、この核酸増幅ステップを
利用して行なわれている。しかしながら、今後はより短
時間での検出が望まれており、核酸増幅ステップととも
に、目的核酸の標識ステップをどのように効率的に行う
かが問題となっている。

【０００６】そこで、目的核酸の標識ステップを必要と
せず、核酸分子間のハイブリダイゼーションをより簡便
に検出する方法として、特許第１７１７７３０号は、二
本鎖核酸を特異的に分解する酵素を用いた方法を開示し
ている。この方法では、一本鎖の目的核酸を、支持体に
固定化された一本鎖標識核酸プローブとを溶液中で接触
させて二本鎖核酸を形成し、この二本鎖核酸を、二本鎖
核酸特異的ヌクレアーゼの作用により分解し、溶液また
は固相（支持体）にある標識を測定することにより目的
核酸を検出する。この方法では、目的核酸を標識する必
要がなく、あらかじめ標識された一本鎖の核酸プローブ
を固定化した基板を作製しておくことによって、迅速か
つ簡便に試料中の目的核酸を検出することが可能であ
る。さらに改良された方法として、特許第１８０７２３
６号および特許第１８６１７６５号は、酵素および発光
物質のエネルギートランスファーを用い、固液分離操作
を必要としない方法を開示している。

【０００７】しかし、これらの方法は共通して以下のよ
うな課題がある。すなわち、上記従来の方法はいずれ
も、二本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ（いわゆる制限
酵素）を用いて一本鎖の核酸と二本鎖核酸の分離を試み
る方法であって、ハイブリダイゼーションにより形成さ
れた二本鎖核酸を分解するため、図７に示すように、一
本鎖の核酸プローブと目的核酸から形成される二本鎖に
制限酵素の認識部位が形成されるように特定の配列をそ
れぞれ組み込む必要がある。制限酵素の認識部位は、制
限酵素の種類によって異なる上に、制限酵素によってそ
の分解効率も異なるため、結果として、核酸プローブの
設計が極めて煩雑になる。図７は、二本鎖核酸に特異的
な制限酵素を用いた従来法による目的核酸の測定の概略
を示している。図７中、１は核酸プローブ、２は標識化
合物、３は支持体、４は核酸プローブと二本鎖を形成し
た目的核酸、９は制限酵素認識部位または制限酵素認識
部位を構成する核酸配列、そして１０は制限酵素により
切断された二本鎖核酸をそれぞれ模式的に示す。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記の従来の
核酸検出法の課題を解決するものである。

【０００９】本発明は、試料中の目的核酸の検出方法に
関し、この方法は、目的核酸と、目的核酸に相補的な配
列を持つ核酸プローブとをハイブリダイスさせる工程で
あって、該核酸プローブが標識化合物で標識されている
工程、一本鎖の核酸を切断する工程、およびハイブリダ
イズした核酸プローブを、該標識化合物を検出すること
によって検出する工程を包含する。

【００１０】好ましくは、上記核酸プローブは支持体に
固定化されている。

【００１１】好ましくは、上記標識化合物は、蛍光物
質、化学発光物質、電気化学発光物質、および酸化還元
物質からなる群から選択される。

【００１２】好ましくは、上記核酸プローブは一対の標
識化合物により標識され、この一対の標識化合物の各々
は上記核酸プローブ上で相互作用し、上記検出する工程
は、この相互作用を検出することによって行なわれる。

【００１３】好ましくは、上記一対の標識化合物の各々
は蛍光物質であって、１つの蛍光物質の蛍光波長域が、
他方の蛍光物質の励起波長域である。

【００１４】好ましくは、上記一対の標識化合物の各々
は酵素であって、１つの酵素による生成物質が、他方の
酵素の基質となる。

【００１５】好ましくは、上記一本鎖の核酸を切断する
工程は、一本鎖特異的ポリヌクレオチド分解酵素を用い
て行なわれる。

【００１６】本発明はまた、１つの局面で、試料中の目
的核酸を検出する核酸センサに関し、この核酸センサ
は、目的核酸に相補的な配列を持つ核酸プローブが固定
化される支持体を備え、ここで、この核酸プローブは、
標識化合物で標識され、そしてこの核酸プローブが上記
目的核酸とハイブリダイズするとき上記標識化合物が上
記支持体に連結され、そしてこの核酸プローブが上記目
的核酸とハイブリダイズしないとき上記標識化合物が上
記支持体から離脱するように固定化されている。

【００１７】好ましくは、上記支持体は基板であり、こ
の基板にヒーターが組み込まれている。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明の実施の形態を詳細に説明
する。

【００１９】本発明による試料中の目的核酸の検出方法
は、目的核酸と目的核酸に相補的な配列を持つ核酸プロ
ーブとをハイブリダイズさせる工程を包含し、ここで、
この核酸プローブは標識化合物で標識されている。ハイ
ブリダイゼーションのための核酸プローブは、通常、一
本鎖の核酸であって、目的核酸の配列を基に通常の化学
的合成法または組換え法を用いて生成され得る。市販の
配列を用いてもよい。目的核酸は、公知の方法、通常、
高温もしくは高アルカリによってあらかじめ一本鎖に変
性されて用いられる。核酸プローブと目的核酸のハイブ
リダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙなどの実験書に記載される方法によって行なわれ、
当業者に公知である。代表的には、ハイブリダイゼーシ
ョンは、いわゆる「ストリンジェント」なハイブリダイ
ゼーション条件下で行なわれ、これは、代表的には、ｐ
Ｈ７．０〜８．３の約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン
塩濃度（通常、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオ
ンの塩濃度）、そして短いプローブ（例えば、１０〜５
０ヌクレオチドの核酸）については少なくとも約３０℃
の温度、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオ
チド）については少なくとも約６０℃の温度である。ス
トリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不
安定化剤の添加によっても達成でき、この場合、より低
い温度が採用され得る。

【００２０】上記標識化合物は、通常、蛍光物質、化学
発光物質、電気化学発光物質、および酸化還元物質から
なる群から選択され得る。

【００２１】上記標識化合物として蛍光物質を用いる場
合、アントラセン、フルオロセイン、ローダミン、ダン
シルクロライドなどの既知の化合物を用いることができ
る。これら蛍光物質のコハク酸イミドエステルなどを用
い、上記の核酸プローブに導入したアミノ基と既知の方
法で反応させることによって、これらの蛍光物質を核酸
プローブに導入することが可能である。

【００２２】上記標識化合物として化学発光物質を用い
る場合、ルミノール、メチルスクシンイミジルオキシカ
ルボニルアクリジニウムフルオロサルフェイト；Ａｃｒ
ｉｄｉｎｉｕｍ−Ｉ（１０−Ｍｅｔｈｙｌ−１１−｛４
−［２−（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏ
ｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｏｘｙｃａｒｂｏｎｙ
ｌ｝−ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍｆｌｕｏｒｏｓｕｌｆｏ
ｎａｔｅ）、ジメトキシベンゾチアゾリルフタリルハイ
ドラジド；ＤＢＰＨ（４−（５，６−Ｄｉｍｅｔｈｏｘ
ｙ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｐｈｔｈａｌ
ｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、メチルフェノキニカルボニ
ルアクリジニウムフルオロサルフェイト；ＰＭＡＣ（１
０−Ｍｅｔｈｙｌ−１１−（ｐｈｅｎｏｘｙｃａｒｂｏ
ｎｙｌ）−ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍｆｌｕｏｒｏｓｕｌ
ｆｏｎａｔｅ）などの既知の化合物を用いることができ
る。

【００２３】上記標識化合物として、電気化学発光物質
を用いる場合、ジフェニルアントラセン、テトラフェニ
ルアントラセン、トリス（ビピリヂル）ルテニウム錯体
などの既知の化合物を用いることができる。

【００２４】上記標識化合物として、酸化還元物質を用
いる場合、フェロセン、チオニンなどの既知の物質を用
いることができる。フェロセンを使用する場合は、例え
ば、フェロセニルカルボン酸を用い、核酸プローブにア
ミノ基を導入し、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３ジメチルアミプロピ
ル）カルボジイミドなどのカップリング剤を用いること
により、一本鎖の核酸プローブに導入したアミノ基また
はカルボキシル基と反応させることができる。

【００２５】本発明による核酸の測定方法の一形態にお
いて、上記核酸プローブは支持体に固定化されている。
上記の方法で、あらかじめ標識された核酸プローブは、
イオン結合、共有結合など、当該分野で公知の手順に従
って支持体上に固定化される。支持体として用いる固相
物質として、ガラス、シリコン、セラミック、金属、樹
脂などの基板もしくは粒体、寒天、アクリルアミドなど
のゲル、セルロースなどの膜などを用い得る。イオン結
合による核酸プローブの固定化は、ポリリジン、ポリオ
ルニチン、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンを、
固相物質にコーティングし、核酸プローブと接触させる
ことにより達成され得る。共有結合による核酸プローブ
の固定化は、ヒドロキシシラン、アミノアルキルトリア
ルコキシシランなどのシラン、ポリカルボジイミドなど
の化合物を固相物質表面にそれぞれコーティングするこ
とによって、固相物質表面に水酸基、アミノ基、カルボ
キシル基などの官能基を導入し、そして、これらを、上
記のカップリング剤の存在下、核酸プローブに導入した
アミノ基またはカルボキシル基と反応させることにより
達成され得る。核酸プローブへの官能基の導入は、公知
の方法によって行なわれ得る。また、固相物質が金属の
場合、核酸プローブにチオール基を導入することによっ
て、硫黄と金属との結合力を利用して、核酸プローブを
金属固相表面に固定することができる。金属としては、
白金、銀、銅などが利用できるが、結合力の点などから
金を用いることが最も望ましい。なお、核酸プローブへ
のチオール基の導入は、公知の方法によって可能であ
る。

【００２６】このようにして、支持体上に固定した一本
鎖の標識核酸プローブの概念図を図１に示す。この状態
で、標識２由来の信号を測定することによって、支持体
３上に固定された核酸プローブ１の定量を行うことも可
能である。標識２由来の信号を測定する方法は、後に詳
細に述べる。

【００２７】この核酸プローブ１は、試料中の目的核酸
のいずれかと相補的な配列を持つように設計されている
が、試料中に目的核酸が存在しない場合もあり得る。目
的核酸は、通常、高温もしくは高アルカリによって、あ
らかじめ一本鎖に変性される。試料中に、相補的な配列
を持つ一本鎖の目的核酸が存在する場合、ｐＨ、温度、
時間などの条件を適切にすることにより、核酸プローブ
と目的の一本鎖の核酸は、速やかに二本鎖をを形成す
る。この場合の概念図を、図２（ａ）に示す。一方、試
料中に相補的な配列を持つ目的核酸が存在しない場合、
核酸プローブは一本鎖の状態で存在する。この場合の概
念図を図２（ｂ）に示す。なお、図２（ｂ）において参
照番号５で示されるのは、試料中の変性された目的核酸
ではない一本鎖の核酸である。

【００２８】本発明では、目的核酸とハイブリダイゼー
ションしなかった核酸プローブは、通常、一本鎖に特異
的なポリヌクレオチド分解酵素（ヌクレアーゼ）を用い
て切断される。一本鎖特異的ヌクレアーゼとして、Ｓ１
ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼなどが公知で
あり本発明に好適に用いられ得る。

【００２９】図２（ａ）にされるような、標識核酸プロ
ーブに目的核酸がハイブリダイズし二本鎖４を形成した
状態に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させたとして
も、図３（ａ）に示すように、二本鎖４は分解されず、
標識化合物も支持体に連結された状態のままである。そ
の一方、図２（ｂ）に示されるように、目的核酸と二本
鎖を形成せずに、一本鎖の核酸プローブのままで存在す
る場合は、一本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させた場
合、図３（ｂ）に示すように、核酸プローブは分解さ
れ、標識化合物は洗浄により除去される。

【００３０】このようにして調製した目的核酸の測定系
において、標識化合物として蛍光物質を用いた場合、そ
の蛍光物質の持つ励起波長の光を照射することにより、
二本鎖核酸を形成していた場合、つまり試料中に目的の
核酸が存在していた場合には、蛍光物質の出す蛍光を測
定することによって、試料中の二本鎖核酸の有無を検出
することができる。また、標識化合物として化学発光物
質を用いた場合には、所定の試薬などを加え、条件を整
えることによって生ずる基質の発光を測定することによ
って、試料中の二本鎖の有無を検出することができる。

【００３１】また、あらかじめ金などの金属電極に標識
核酸プローブを固定していた場合には、検出に際し電気
化学的な手法を用いることが可能である。標識化合物と
して、電気化学発光物質を用いた場合には、電解液中の
参照電極と支持体上に配置された核酸センサ電極間に電
位を発生させることによって、電気化学発光物質の持つ
酸化電位もしくは還元電位において生ずる発光を測定す
ることにより、試料中の二本鎖の有無を検出することが
できる。

【００３２】また、標識化合物として酸化還元物質を用
いた場合には、同様に電解液中の参照電極と支持体上に
配置された核酸センサ電極間に電位を発生させることに
よって、酸化還元物質の持つ酸化電位もしくは還元電位
において発生する電流を測定することにより、試料中の
二本鎖の有無を検出することができる。電極間に電位を
発生させる方法としては、リニアスイープボルタンメト
リ、サイクリックボルタンメトリ、ディファレンシャル
パルスボルタンメトリなどを用いることができる。

【００３３】また、本発明による核酸の測定方法は、必
ずしも核酸プローブが固相上に固定されている必要はな
い。この場合、上記核酸プローブは、互いに近接して存
在するときに相互作用する複数の、代表的には一対の標
識化合物を用いる。

【００３４】このような互いに近接して存在するときに
相互作用する一対の標識化合物を結合した核酸プローブ
の概念図を図４に示す。この一対の標識化合物７、８
は、核酸プローブ上で相互作用するに十分近接して存在
する。この核酸プローブは、試料中の目的核酸の一部分
と相補的な配列を持つように設計されている。目的核酸
は、高温もしくは高アルカリ条件によって、あらかじめ
一本鎖に変性されている。試料中に目的の核酸が存在す
る場合、ｐＨ、温度、時間などを適切な条件にすること
により、核酸プローブと一本鎖の目的核酸は、速やかに
二本鎖４を形成する。この場合の概念図を図５の（ａ）
に示した。その一方、試料中に目的核酸が存在しない場
合、核酸プローブは一本鎖のままの状態で存在する。こ
の場合の概念図を図５の（ｂ）に示す。図中の参照番号
５は、変性された目的核酸以外の核酸を表す。

【００３５】ここで、上記のように、一本鎖特異的ヌク
レアーゼを作用させると、核酸プローブに目的核酸がハ
イブリダイズし二本鎖を形成した状態である場合は、図
６の（ａ）に示したように、この二本鎖は分解されず、
一対の標識化合物７、８は核酸プローブ上で相互作用す
るに十分近接して存在している。これに対し、図６の
（ｂ）に示したように、一本鎖のままの状態の核酸プロ
ーブに一本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させた場合、一
本鎖の核酸は分解され、一対の標識化合物は拡散して相
互作用しなくなる。

【００３６】このような一対の標識化合物の例として、
例えば、一対の蛍光物質を用いることができ、ここで、
１つの蛍光物質の蛍光波長域は、他方の蛍光物質の励起
波長域であるような組み合わせが選択され得る。１つの
蛍光物質の持つ励起波長域の光を照射することにより、
この蛍光物質は蛍光を発し、その蛍光波長は他方の蛍光
物質の励起波長であるので、核酸プローブと目的核酸が
二本鎖を形成していた場合、つまり試料中に目的核酸が
存在していた場合には、一対の蛍光物質が核酸プローブ
上で近接し、上記他方の蛍光物質の出す蛍光を測定する
ことができる。

【００３７】一方、試料中に目的核酸が存在していなか
った場合、つまり二本鎖が形成されない場合は、一対の
蛍光物質は、ヌクレアーゼ処理による核酸プローブの分
解により、相互作用するに十分近い距離にある可能性は
極めて低く、１つの蛍光物質の励起波長の光を照射して
も、他方の蛍光物質の蛍光波長の光は発せられない。

【００３８】このような１対の蛍光物質として、例え
ば、ＦＡＭとＲ６Ｇとの組み合わせ、ＴＡＭＲＡとＲＯ
Ｘとの組み合わせが挙げられる。

【００３９】さらに、一対の標識化合物の例として、例
えば、一対の酵素を用いることができ、ここで、１つの
酵素による生成物質が、他方の酵素の基質となると組み
合わせが選択され得る。このような例として、グルコー
スオキシダーゼとペルオキシダーゼの組み合わせが挙げ
られる。

【００４０】本発明はまた、試料中の目的核酸を検出す
る核酸センサに関し、上記のように、この核酸センサ
は、目的核酸に相補的な配列を持つ核酸プローブが固定
化される支持体を備え、ここで、該核酸プローブが、標
識化合物で標識され、そして該核酸プローブが該目的核
酸とハイブリダイズするとき該標識化合物が該支持体に
連結され、そして該核酸プローブが該目的核酸とハイブ
リダイズしないとき該標識化合物が該支持体から離脱す
るように固定化されている。上記支持体としては、先に
記載のように、ガラス、シリコン、セラミック、金属、
樹脂などの基板が好適に用いられる。基板には、既知の
技術、例えば、スパッタリングでＩＴＯなどの金属酸化
膜を形成することによって、基板自体にヒーター機能を
持たせることができ、それによって支持体に温度制御機
能を付与し、上記のハイブリダイゼーション温度および
ヌクレアーゼ反応を、より簡便で効率良く行う核酸セン
サを提供することが出来る。

【００４１】上記に記載の本発明の方法は、従来法のよ
うに制限酵素を用いないので核酸プローブ内に制限酵素
部位を設ける必要がなく、そして従来法が目的核酸とハ
イブリダイズした後切断された二本鎖上にある標識化合
物からの信号を、通常、信号の減少として検出する、い
わばネガティブ検出であるのに対し、本発明の方法で
は、目的核酸とハイブリダイズした核酸プローブ上にあ
る標識化合物をポジティブに検出する点で操作性および
感度に優れている。

【００４２】また、一般に、支持体に固定化される核酸
プローブ量を制御することは難しく、従って、核酸プロ
ーブに結合した標識化合物の初期量は支持体上の各スポ
ット間で大きく異なる可能性がある。従来法の場合、核
酸プローブと目的核酸とのハイブリダイゼーションを、
ハイブリダイズした二本鎖上にある標識化合物からの信
号の減少量として検出するので、標識化合物の初期量が
各スポットで異なっている場合、信号の規格化などの煩
雑な作業が必要となる。これに対し、本発明の方法で
は、核酸プローブと目的核酸とのハイブリダイゼーショ
ンを、同標識化合物からの信号を零を基準とした残量で
評価するため、このような煩雑な作業は不要である。

【００４３】

【実施例】（実施例１）核酸センサの支持体としてスラ
イドガラスを用いた。核酸プローブの付着性を良くする
ために、スライドガラス表面をポリリジンで処理した。
次いで、スライドガラス上に、０．１ｍｇ／ｍｌのポリ
リジン水溶液を１０μｌ滴下し、室温で５分間放置した
後、純水で洗浄した。

【００４４】核酸プローブとして、５’末端をダンシル
で修飾した１２塩基よりなる一本鎖蛍光標識オリゴヌク
レオチドプローブ（５’−ダンシル−Ｃ₆Ｈ₁₂−ＧＣＣ
−ＡＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＣ−３’）を用いた。この一本
鎖オリゴヌクレオチドプローブの５０ｐｍｏｌ／μｌ水
溶液の１０μｌをスライドガラス上に滴下し、室温で２
時間放置した後、純水で洗浄して、スライドガラス表面
に一本鎖蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを固定
し、核酸センサ１とした。

【００４５】さらに、核酸リガンドとして、１２塩基よ
りなる一本鎖オリゴヌクレオチドリガンド（５’−ＧＧ
Ａ−ＧＣＴ−ＧＧＴ−ＧＧＣ−３’）をＴＥバッファー
（１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、1ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
７．２）を用いて、１００ｐｍｏｌ／μｌとした。この
溶液１０μｌを核酸センサ１のスライドガラス上に滴下
し、室温で４時間放置した後、純水で洗浄して、スライ
ドガラス表面に、核酸の二本鎖を形成し、核酸センサ２
とした。

【００４６】次に、核酸センサ１および核酸センサ２に
対し、一本鎖の核酸に特異的なヌクレアーゼを用いて酵
素処理を行った。Ｓ１ヌクレアーゼ１００Ｕ／μｌ液
を、核酸センサ１および核酸センサ２上にそれぞれ１０
μｌづつ滴下し、３７℃で１０分間放置した後、純水で
洗浄して一本鎖オリゴヌクレオチドを切断した。

【００４７】このようにして作成した試料１および試料
２について、蛍光強度を測定したところ、核酸センサ２
については、ダンシルに由来する蛍光がはっきりと認め
られたのに対し、核酸センサ１については、蛍光が認め
られなかった。

【００４８】（実施例２）直径１．６ｍｍの円盤上の金
電極（ＢＡＳ社製）を支持体として用いた。金電極の表
面を、６μｍおよび１μｍ径のダイヤモンド研磨液、次
いで０．０５μｍ径のアルミナ研磨液によって研磨する
ことにより表面仕上した。その後、ピラニア溶液（硫
酸：過酸化水素水＝３：１）に数秒浸漬することによっ
て、表面に付着している有機物を取り除いた。

【００４９】核酸プローブとして、５’末端をチオール
基で修飾し、そして３’末端をフェロセンで修飾した１
２塩基よりなる、一本鎖の電気化学標識オリゴヌクレオ
チドプローブ（５’−ＳＨ−Ｃ₆Ｈ₁₂−ＧＣＣ−ＡＣＣ
−ＡＧＣ−ＴＣＣ−フェロセン−３’）を用いた。一本
鎖オリゴヌクレオチドプローブの５０ｐｍｏｌ／μｌ水
溶液の１０μｌを金電極上に滴下し、室温で２時間放置
した後、純水で洗浄して、金電極表面に一本鎖蛍光標識
オリゴヌクレオチドプローブを固定し、核酸センサ３と
した。

【００５０】さらに、実施例１と同様の方法を用いて、
金電極表面に、核酸の二本鎖を形成した。ここまでの操
作を行った電極を核酸センサ４とした。

【００５１】次に、核酸センサ３および核酸センサ４に
対し、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いて酵素処理を行
った。すなわち、マングビーンヌクレアーゼの５０Ｕ／
μｌ液を、核酸センサ３および核酸センサ４の電極上に
それぞれ１０μｌづつ滴下し、３７℃で１０分間放置す
ることにより一本鎖オリゴヌクレオチドを切断した後、
金電極表面を純水で洗浄した。

【００５２】このようにして作成した核酸センサ３およ
び核酸センサ４について、リニアスイープボルタンメト
リを用いて測定したところ、核酸センサ４については、
フェロセンに由来する酸化電流がはっきりと認められた
のに対し、核酸センサ３については、電流が認められな
かった。

【００５３】（実施例３）実施例１と同様に、金電極を
調整した。核酸プローブとして、５’末端をチオール基
で修飾し、そして３’末端をルテニウムトリス（ビピリ
ヂル）錯体で修飾した１２塩基よりなる一本鎖電気化学
発光標識オリゴヌクレオチドプローブ（５’−ＳＨ−Ｃ
₆Ｈ₁₂−ＧＣＣ−ＡＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＣ−ルテニウム
トリス（ビピリヂル）錯体−３’）を用いた。一本鎖オ
リゴヌクレオチドプローブの５０ｐｍｏｌ／μｌ水溶液
の１０μｌを金電極上に滴下し、室温で２時間放置する
ことによって金電極表面に一本鎖蛍光標識オリゴヌクレ
オチドプローブを固定し、その後金電極を純水で洗浄し
た。ここまでの操作を行った電極を核酸センサ５とし
た。

【００５４】さらに、実施例１と同様の方法を用いて、
金電極表面に、核酸の二本鎖を形成した。ここまでの操
作を行った電極を核酸センサ６とした。

【００５５】次に、核酸センサ５および核酸センサ６に
対し、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いて酵素処理を行
った。すなわち、マングビーンヌクレアーゼの５０Ｕ／
μｌ液を、核酸センサ５および核酸センサ６の電極上に
それぞれ１０μｌづつ滴下し、３７℃で１０分間放置す
ることによって一本鎖オリゴヌクレオチドを切断した
後、電極を純水で洗浄した。

【００５６】このようにして作成した核酸センサ５およ
び核酸センサ６について、リニアスイープボルタンメト
リを用いて測定したところ、核酸センサ６については、
ルテニウムトリス（ビピリヂル）錯体に由来する電気化
学発光がはっきりと認められたのに対し、核酸センサ５
については、発光が認められなかった。

【００５７】（実施例４）核酸プローブとして、５’末
端ヌクレオチドをＴＡＭＲＡで修飾し、そして３’末端
ヌクレヘチドをＲＯＸで修飾した２８塩基よりなる一本
鎖蛍光標識オリゴヌクレオチド（５’−（ＴＡＭＲＡ
−）ＧＴＣＧＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣ
ＴＧＣＣＧ（−ＲＯＸ）−３’）を用いた。この核酸プ
ローブを、ハイブリダイゼーションバッファー（５×Ｓ
ＳＣ（８３ｍＭクエン酸ナトリウム、８３ｍＭ塩化ナト
リウム水溶液）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム）に
１００ｐｍｏｌ／μｌとなるように溶解した。この溶液
１００μｌを、底面にＩＴＯヒーターを形成したガラス
容器に入れた。これを核酸センサ７とした。

【００５８】さらに、核酸リガンドとして、２８塩基よ
りなる一本鎖オリゴヌクレオチドリガンド（５’−ＣＧ
ＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＣＧＴＣＣＧＡ
Ｃ−３’）をハイブリダイゼーションバッファーに１０
０ｐｍｏｌ／μｌとなるように溶解した。この溶液１０
０μｌを一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ溶液の入っ
たガラス容器に滴下し、室温で４時間放置した。ここを
核酸センサ８とした。

【００５９】次に、核酸センサ７および核酸センサ８
に、Ｓ１ヌクレアーゼ１００Ｕ／μｌ液をそれぞれ１０
０μｌづつ滴下し、ガラス容器底面に形成したＩＴＯヒ
ーターに電流を流すことによって容器内を３７℃とし、
１０分間放置した後、純水で洗浄して一本鎖オリゴヌク
レオチドを切断した。

【００６０】このようにして作成した核酸センサ７およ
び核酸センサ８について、蛍光分光光度計を用いてＴＡ
ＭＲＡの励起波長である５５２ｎｍの励起光について測
定を行ったところ、核酸センサ８については、ＲＯＸに
由来する波長６０５ｎｍ付近の蛍光がはっきりと認めら
れたのに対し、核酸センサ７については波長６０５ｎｍ
付近の蛍光は認められなかった。

【００６１】

【発明の効果】簡便かつ迅速に目的核酸の有無を検出す
る方法、およびそれに用いる核酸センサが提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一形態を表す、支持体に固定された、
標識を持つ一本鎖の核酸プローブの概念図。

【図２】本発明の原理を概略的に示す図。（ａ）は、核
酸プローブと目的核酸が二本鎖を形成した場合を、
（ｂ）は、目的核酸が存在せず、核酸プローブが一本鎖
のままの場合をそれぞれ示す。

【図３】本発明の原理を概略的に示す図。（ａ）は、図
２の（ａ）に示す核酸プローブと目的核酸により形成さ
れた二本鎖に一本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させた後
の二本鎖核酸の状態を、（ｂ）は、図２の（ｂ）に示す
一本鎖のままの核酸ブローブに一本鎖特異的ヌクレアー
ゼを作用させた後の状態をそれぞれ示す。

【図４】本発明の一形態を表す標識化合物を持つ核酸プ
ローブの概念図。

【図５】本発明の原理を概略的に示す図。（ａ）は、図
４に示す核酸プローブと目的核酸により形成された二本
鎖を示し、（ｂ）は、核酸ブローブと目的核酸が一本鎖
のままの状態を示す。

【図６】本発明の原理を概略的に示す図。（ａ）は、図
５の（ａ）に示す核酸プローブと目的核酸により形成さ
れた二本鎖に一本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させた後
の二本鎖核酸の状態を、（ｂ）は、図５の（ｂ）に示す
一本鎖のままの核酸ブローブに一本鎖特異的ヌクレアー
ゼを作用させた後の状態をそれぞれ示す。

【図７】従来の、制限酵素を用いた二本鎖核酸の分解に
よる核酸測定方法の概略を示す図。

【符号の説明】

１標識２一本鎖の核酸プローブ３支持体４核酸プローブと目的核酸から形成される二本鎖５目的核酸以外の一本鎖核酸６ヌクレアーゼにより切断され、支持体に連結されて
残る一本鎖の核酸プローブの部分７標識化合物８標識化合物９制限酵素認識部位１０制限酵素により切断された二本鎖核酸

フロントページの続き (72)発明者杉原宏和大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内Ｆターム(参考） 4B029 AA07 FA12 4B063 QA13 QQ34 QQ42 QQ52 QR14 QR32 QR35 QR84 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の目的核酸の検出方法であって、目的核酸と、目的核酸に相補的な配列を持つ核酸プロー
ブとをハイブリダイスさせる工程であって、該核酸プロ
ーブが標識化合物で標識されている、工程、一本鎖の核酸を切断する工程、およびハイブリダイズし
た核酸プローブを、該標識化合物を検出することによっ
て検出する工程、を包含する方法。
【請求項２】前記核酸プローブが支持体に固定化され
ている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記標識化合物が、蛍光物質、化学発光
物質、電気化学発光物質、および酸化還元物質からなる
群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記核酸プローブが一対の標識化合物に
より標識され、該一対の標識化合物の各々が該核酸プロ
ーブ上で相互作用する、請求項１に記載の方法であっ
て、前記検出する工程が、該相互作用を検出することによっ
て行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記一対の標識化合物の各々が蛍光物質
であって、１つの蛍光物質の蛍光波長域が、他方の蛍光
物質の励起波長域である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記一対の標識化合物の各々が酵素であ
って、１つの酵素による生成物質が、他方の酵素の基質
となる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】前記一本鎖の核酸を切断する工程が、一
本鎖特異的ポリヌクレオチド分解酵素を用いて行なわれ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】試料中の目的核酸を検出する核酸センサ
であって、目的核酸に相補的な配列を持つ核酸プローブが固定化さ
れる支持体を備え、ここで、該核酸プローブが、標識化合物で標識され、そ
して該核酸プローブが該目的核酸とハイブリダイズする
とき該標識化合物が該支持体に連結され、そして該核酸
プローブが該目的核酸とハイブリダイズしないとき該標
識化合物が該支持体から離脱するように固定化される、
核酸センサ。
【請求項９】前記支持体が基板であり、該基板にヒー
ターが組み込まれた、請求項８に記載の核酸センサ。