JP2007037483A - 酵素反応の有無の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
核酸増幅反応などの酵素反応の有無を、複雑な操作や特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に検出する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
トリリン酸化合物からジリン酸化合物を生成する反応、またはその逆反応を触媒する酵素反応において、基質または反応生成物と金属イオンとによって形成される化合物の電気化学的特性を測定することを特徴とする酵素反応の有無の検出方法。
【選択図】 無し

Description

本発明は核酸の増幅反応などの酵素反応の有無の検出方法に関するものである。

核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、この分析方法は遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段である。また、遺伝子そのものを検出対象とするために、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略できる場合もある。
しかしながら、試料中に存在する目的の核酸量が少ない場合の検出は一般に容易ではなく、標的核酸そのものを、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。

核酸の増幅産物を検出する最も一般的な方法は、増幅反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動にアプライし、エチジウムブロマイド等の蛍光インターカレーターを結合させて特異的な蛍光を観察するというものである。増幅産物の有無のみを知りたい場合には、電気泳動を省略して増幅反応後の溶液に蛍光インターカレーターを加えて蛍光を観察することも可能である。
しかしながら、これらの方法は簡便であるものの、蛍光を観察するためのＵＶランプと暗室が必要である。

固相等の支持体上で核酸を発色させる方法には、酵素を利用し金属−硫黄錯体を固着させる方法(例えば、特許文献１参照）、金属染色法で染色した核酸に色素前駆体と補力剤とを作用させる方法(例えば、特許文献２参照）があるが、いずれも煩雑な工程を必要とする。

蛍光色素をはじめとする各種標識物質で標識したプライマーやヌクレオチドを用いて増幅反応を行い、増幅産物に取り込まれた標識を観察する方法(例えば、特許文献３参照）もあるが、増幅産物に取り込まれなかったフリーの標識プライマー（あるいはヌクレオチド）を分離する操作が必要であり、反応液量が微量である核酸増幅反応には適さない。また、標識プライマーやヌクレオチドは高価である。

電気泳動ゲルや膜等の支持体および標識物質を使用しない検出法には、核酸増幅反応液に偏光を通過させその偏光の旋光度または円偏光二色性を測定する方法(例えば、特許文献４参照）、伸長した増幅産物の偏光成分の変化を検知する方法(例えば、特許文献５、６および７参照）がある。また、増幅反応に伴い生成するピロリン酸とマグネシウムによる不溶性物質の沈殿を観察する方法(例えば、特許文献８参照）も開発されているが、沈殿による検出は極めて簡便で実用的であるものの、シグナルとしての認識性および訴求力にやや乏しい面もある。さらに、ピロリン酸を対象とする分析方法として、ピロリン酸に対して、酸化酵素を含む酵素反応試薬で処理し、酸化酵素が作用する際に起こる電子移動を、電気化学的活性インターカレータの存在下で増幅し、電気化学的に電流として検出する方法もあるが操作の煩雑さは否めない(例えば、特許文献９および１０参照）。
この問題を解決するため、本発明者は、核酸増幅反応におけるｄＮＴＰとピロリン酸の結合能の差に基づく反応液中の金属イオン量の変化を、金属指示薬によって検知する核酸増幅の有無を検出する方法を既に提案している（例えば、特許文献１１参照）。

特開平２−９４００号公報 特開昭６１−６６９６４号公報 特開平９−１８７２７５号公報 特開２００２−１８６４８１号公報 特開２００２−１７１９９７号公報 特開２００２−１７１９９８号公報 特開２００２−１７１９９９号公報 ＷＯ０１／８３８１７号 特開２００３−２９９号公報 特開２００３−４７５００号公報 特開２００４−２８３１６１号公報

しかしながら、上記方法では、通常、光学測定を行うため、光源および光検出器が必要となり、装置の小型化や簡易化を進める上では不利となる場合が多いという問題があった。
従って本発明は、このような従来の課題に着目してなされたものであって、酵素反応の有無、特に核酸の増幅反応の有無または増幅過程を、複雑な操作や特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、電気化学的に活性な金属イオンに対するトリリン酸基とジリン酸基との配位力の違いに着目し、電気化学的に活性な金属イオンを用い、電極表面での酸化反応に基づく電流を測定することによって酵素反応を高感度に検出できることを見出し、本発明を完成させた。

本発明は、下記のような構成からなるものである。
（１）トリリン酸化合物からジリン酸化合物を生成する反応、またはその逆反応を触媒する酵素反応において、基質または反応生成物と金属イオンとによって形成される錯化合物の電気化学的特性を測定することを特徴とする酵素反応の有無の検出方法。
（２）金属イオンに電位を印加して発生する電流を測定する（１）記載の方法。
（３）印加する電位が-１．２〜１．２Ｖの範囲である（１）または（２）記載の方法。
（４）金属イオンの濃度が１μＭ〜１００ｍＭの範囲である（１）〜（３）記載の方法。
（５）反応生成物がピロリン酸イオンまたはヌクレオシド二リン酸である（１）〜（４）記載の方法。
（６）錯化合物がピロリン酸-金属錯体またはヌクレオシド二リン酸-金属錯体である（１）〜（５）記載の方法。
（７）金属イオンおよび／または金属錯体が酸素発生電位と水素発生電位との間に酸化還元電位を有する金属イオンおよび/または金属錯体である（１）〜（６）記載の方法。
（８）金属イオンが遷移金属である（１）〜（７）記載の方法。
（９）金属イオンがＭｎ（ＩＩ）および/またはＣｕ（ＩＩ）である（１）〜（８）記載の方法。
（１０）電気化学的特性の測定法が電位規制法である（１）〜（９）記載の方法。
（１１）電位規制法がサイクリックボルタンメトリー、リニアースイープボルタンメトリーまたはリニアースイープストリッピングボルタンメトリーである（１０）記載の方法。
（１２）酵素反応が核酸の増幅反応である（１）〜（１１）記載の方法。
（１３）核酸の増幅反応がＬＡＭＰ法である（１２）記載の方法。
（１４）酵素がＤＮＡポリメラーゼである（１）〜（１３）記載の方法。

本発明の方法によれば、酵素反応の有無、特に核酸の増幅反応の有無または増幅過程を、複雑な操作や特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に検出することができる。
以下、本発明について更に詳細に説明する。

本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅反応などの酵素反応を電気化学的に検出する方法であり、具体的には、金属イオンの電極表面での酸化・還元反応を利用した酸化電流測定法である。特に、ある種の金属イオンは、所定の範囲の電位を印加した電極表面で酸化反応を行い、酸化電流を発生させる。
この酸化電流の大きさは、金属イオンの濃度や配位状態に依存する。核酸の増幅反応に伴って金属イオンの溶存状態が変化すれば、その酸化電流を測定することで核酸の増幅反応を検出することができる。
ｄＮＴＰは弱い配位子であるが、核酸増幅反応の結果生じるピロリン酸イオンは強い配位子である。従って、フリーの金属イオンまたは溶液中の他の成分と弱く相互作用している金属イオンは、核酸の増幅反応の進行に伴ってピロリン酸-金属錯体へと変化する。
本発明においては、金属イオンの配位状態の変化に伴う酸化電流の変化を測定することで、光学的測定による濁度検出と略同等の感度で核酸の増幅反応を検出することができる。

本発明においては、酵素反応の際に生ずるジリン酸（例えば、ピロリン酸やヌクレオシド二リン酸など）と結合する金属イオンにより形成される錯体の電気化学的特性を測定することにより、酵素反応の有無を検出することができる。具体的には、金属イオンに電位を印加または走査して発生する電流を測定する。この際、印加または走査する電位は、−１．２〜１．２Ｖの範囲であることが好ましく、より好ましくは、−１．０〜１．０Ｖの範囲である。
特に金属イオンがＭｎ（ＩＩ）イオンの場合は、０．６Ｖであることが好ましい。
本発明における電気化学的特性の測定法としては、電位規制法が好ましいものとして用いられ、特にサイクリックボルタンメトリー、リニアースイープボルタンメトリーまたはリニアースイープストリッピングボルタンメトリーが最も好ましい。

本発明で使用できる金属イオンは、酵素反応の結果生じるジリン酸（例えば、ピロリン酸やヌクレオシド二リン酸など）と結合可能な金属イオンである限り、公知の金属イオンの中から適宜選択すれば良い。
本発明において金属イオンおよび／または金属錯体としては、酵素発生電位と水素発生電位との間に酸化還元電位を有する金属イオンおよび/または金属錯体が挙げられる。金属イオンとしては、遷移金属が好ましく、より好ましくはＭｎ（ＩＩ）および/またはＣｕ（ＩＩ）である。

金属イオンを添加する場合のその濃度は、１μＭ〜１００ｍＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは、０．０１〜１．０ｍＭの範囲である。濃度が１μＭより低いと、核酸の増幅反応を十分に電気化学的に検出することができず、１００ｍＭより高い濃度では、ポリメラーゼ活性の低下により、増幅反応に影響を及ぼすときがある。

核酸の合成反応では、使用する酵素により核酸の末端にヌクレオチドを付加する過程でピロリン酸が生成する場合がある。本発明は、このような酵素による核酸の合成反応で生成されたピロリン酸と金属イオンの結合能を指標として核酸の存在を検出することができる。前記酵素としては、特に限定されるものではなく、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ、逆転写酵素（ Reverse Transcriptase ）、ＳＰ６ ＲＮＡ ポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。各酵素の反応は、公知の任意の条件で行うことができる（ T. Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 )。

本発明の検出対象は、ピロリン酸と結合する金属イオンに電位を印加して発生する電流であることから、本発明において適用される増幅反応は、ヌクレオチドが核酸鎖に取り込まれる際にピロリン酸が生成する反応である限り、特に限定されるものではない。例えば、in vitroにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法であるＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction ）法の他、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification ）法と呼ばれる増幅法（特許第３３１３３５８号等）、ＳＤＡ（ Strand Displacement Amplification ）法（特公平７−１１４７１８号公報等)、ＮＡＳＢＡ( Nucleic Acid Sequence Based Amplification ）法（特許第２６５０１５９号）等に適用することができる。

増幅反応のうちＬＡＭＰ法は、増幅対象となる塩基配列の末端にループ構造を形成し、そこを起点としてポリメラーゼによる伸長反応が起きると同時に、ループ内の領域にハイブリダイズしたプライマーが、鎖置換反応により核酸鎖を伸長しながら先の伸長反応の産物を１本鎖に解離させていくというものである。生成した１本鎖核酸はその末端に自己相補性領域を持つため、末端にループを形成し新たな伸長反応が始まる。実際のＬＡＭＰ法では等温で進行するため、上に述べた反応は同時に並行して起こる。ＬＡＭＰ法の特徴としては、等温で進行する鎖置換型の反応であることの他に、増幅産物の量が非常に多いことが挙げられる。これは、ポリメラーゼが失活する原因である熱変性の操作が含まれていないことも一因である。増幅産物の量が多いということは、生成するピロリン酸の量すなわちピロリン酸と反応する金属イオンの量も多いため、本発明を適用する核酸増幅法としてＬＡＭＰ法は好適である。

ＬＡＭＰ法において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸の塩基配列の計６領域から設計・作製された、ループ構造の形成に関与する２種類の内部プライマー（ＦＡプライマー、ＲＡプライマー）と、２種類の外部プライマー（Ｆ３プライマー、Ｒ３プライマー）の、少なくとも計４種類のオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。

以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。

実験例．
（１）電気化学測定用機器
ポテンシオスタット（北斗電工（株）製：ＨＺ−３０００、ＨＺ−５０００）
作用電極：金ディスク電極（ビーエーエス株式会社製）
対極：白金電極（ビーエーエス株式会社製）
参照電極：飽和ＮａＣｌ銀・塩化銀電極（ビーエーエス株式会社製）
微量サンプルフォルダー：バイコールガラス式２００ul用

（２）電気化学測定（リニアースイーボルタンメトリー（ＬＳＶ）の測定）
バイコールガラス式微量サンプルフォルダーに１５０〜２００ulのサンプルを投入し、次いで作用電極を挿入した。
電解槽にバッファー（20mM Tris-HCl(pH8.8),10mM KCl,10mM (NH₄)₂SO₄)１０ｍＬを加え、上記サンプルフォルダーを浸漬した。参照電極、対極を所定の位置に挿入し、各電極をポテンシオスタットと結線した。ＬＳＶ法を用いてＭｎ（II)イオンの電気化学応答を測定した。

ＬＳＶ測定条件
初期電位：自然電位
最終電位：１．２Ｖ
スキャン速度：１００ｍＶ／ｓｅｃ
電流測定レンジ：±１００
ノイズフィルター：２０Ｈｚ

(３）ＬＡＭＰ反応
〔反応液組成〕
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８） ２０ｍＭ
ＫＣｌ １０ｍＭ
(NH₄)₂SO₄ １０ｍＭ
ＭgＳＯ₄ ８ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％
ｄＮＴＰｓ １．４ｍＭ
ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ ８Ｕ
ＦＡプライマー １．６μＭ
ＲＡプライマー １．６μＭ
Ｆ３プライマー ０．４μＭ
Ｒ３プライマー ０．４μＭ

・ＬＡＭＰ反応の鋳型としてＰＳＡ(前立腺特異抗原)ＤＮＡ
5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCACACACCC-3'(配列番号１)
反応液組成中のＦＡプライマー、ＲＡプライマーおよびＦ３、Ｒ３プライマーは、配列番号１に示す塩基配列に基づいて以下のように設計した。
・ＦＡプライマー
5'-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3'(配列番号２)
・ＲＡプライマー
5'-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3'(配列番号３)
・Ｆ３プライマー
5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3'(配列番号４)
・Ｒ３プライマー
5'-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3'(配列番号５)

実施例１．Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中でのＭｎ（ＩＩ)イオンの電気化学的検出
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー(Tris-HCl(pH8.8)=20mM,KCl=10mM, (NH₄)₂SO₄=10mM)中のＭｎ(ＩＩ)イオンの電気化学応答（酸化反応）を調べた。すなわち、Ｍｎ(ＩＩ)イオンを含む溶液のＬＳＶを測定したところ、Ｍｎ(ＩＩ)イオンを含まない溶液の測定値と著しく異なるＬＳＶ曲線が得られた(図１参照）。図１に示すように、３ｍＭのＭｎ(ＩＩ)イオン溶液について測定した場合は、０．６Ｖ付近に約８μＡの電流が流れることが判る。この電流値は、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの濃度を下げると低下したことから、この電流がＭｎ(ＩＩ)イオン由来であることが判った。
尚、過剰量の硫酸アンモニウム存在下であるから、Ｍｎ(ＩＩ)イオンのカウンターイオンはこの電流には無関係である。
電位の絶対値および文献（Ｄ．Junwei and Z.Feng,Talanta 60 (2003) 31-36)から、この電流がＭｎ(ＩＩ)イオンの二酸化マンガンへの酸化反応に伴い生じる電流(以下、単に酸化電流という）と判断した。
この測定条件でＭｎ(ＩＩ)イオンを検出できることが判ったので、次に、この測定に及ぼす共存物質の影響について検討した。

実施例２．Ｍｎ(ＩＩ)イオンの電気化学的検出に及ぼすＭｇ^２＋イオンおよびｄＮＴＰの添加効果
ＬＡＭＰ反応液の組成の中で、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの電気化学応答に影響を及ぼす可能性のあるものとして、同じ２価のカチオンであるＭｇ^２＋イオン、およびトリリン酸基を有するｄＮＴＰが考えられる。
そこで、それらの成分がＭｎ(ＩＩ)イオンの電気化学応答に及ぼす影響を調べた。ＬＡＭＰ反応で通常使用する濃度範囲のＭｇ^２＋イオンは、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの電気化学応答にほとんど影響を及ぼさなかったが（図２参照）、ｄＮＴＰは、僅かにＭｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流を減少させたことが判る(図３参照）。
ｄＮＴＰは、ピロリン酸イオンより弱い配位子であるものの、いくつかの金属イオンと錯形成することも知られている。したがって、通常ＬＡＭＰ反応で用いる濃度範囲のｄＮＴＰは、Ｍｎ(ＩＩ)イオンと弱いながらも何等かの相互作用を行っていることが予想される。
本検出法の原理は、ｄＮＴＰとピロリン酸イオンの間の配位力の差が重要であるから、Ｍｎ(ＩＩ)イオンとｄＮＴＰが僅かに相互作用したとしても、その影響は小さいと考えられる。実際に、実用的な濃度のｄＮＴＰ存在下においてＭｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流が測定できたという事実から、本測定法はｄＮＴＰ共存下でも有効であると判断した。

実施例３．Ｍｎ(ＩＩ)イオンの電気化学的検出におけるＭｎ(ＩＩ)イオンの濃度依存性
Ｍｎ(ＩＩ)イオンはＬＡＭＰ反応に対して阻害的に働くことが判っているので、できるだけＭｎ(ＩＩ)イオン濃度は低い方が実用上好ましい。
そこで、実際のＬＡＭＰ反応条件（[ｄＮＴＰ]=２．６ｍＭ，[ＭｇＳＯ_４]=４ｍＭ）におけるＭｎ(ＩＩ)イオンの検出感度を調べた(図４参照）。図４に示すように、測定したＭｎ(ＩＩ)イオン０．２ｍＭ〜０．８ｍＭまでの範囲で、Ｍｎ(ＩＩ)イオン濃度と酸化電流の値が直線関係を示した。この結果から、現在の測定条件（電極の大きさ、種類、反応液組成)でのＭｎ(ＩＩ)イオンの検出感度がおよそ０．２ｍＭ程度であることが判った。

実施例４．Ｍｎ(ＩＩ)イオンの電気化学的検出に及ぼすピロリン酸イオンの添加効果
ＬＡＭＰ反応検出のモデル実験として、ピロリン酸イオン添加によるＭｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流の変化を調べた。その結果を図５に示す。
[ｄＮＴＰ]＋[Ｐ_２Ｏ_７ ^４-]＝６ｍＭ [Ｍｇ^２＋イオン]＝８ｍＭのＬＡＭＰ反応条件）となるようにピロリン酸イオン（ＰＰ)(ピロリン酸カリウム溶液）およびｄＮＴＰを加えた溶液中でのＭｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流は、ピロリン酸イオンの添加量が増加するにしたがって減少したことが判る。
したがって、ポリメラーゼによってｄＮＴＰが消費され、それと同時にピロリン酸イオンが遊離すると、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流は減少することが予想される。そこで、次に実際のＬＡＭＰ反応を用いてＭｎ(ＩＩ)イオンの電気化学応答を測定した。

実施例５．ＬＡＭＰ反応の検出
（１）Ｍｎ(ＩＩ)イオンを用いたＬＡＭＰ反応の電気化学的検出
０．４ｍＭのＭｎ(ＩＩ)イオンを含むＬＡＭＰ反応（ＰＳＡ増幅系)を所定時間行い、それら溶液のＭｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流を測定した（図６参照）。
図３の結果から、本検出法にとってはｄＮＴＰが少ない方が有利であるから、Ｍｇ^２＋イオンおよびｄＮＴＰ濃度ができるだけ低いＬＡＭＰ反応条件（[ｄＮＴＰ]=２．６ｍＭ，[Ｍｇ^２＋イオン]=４ｍＭ）を採用した。
ＬＡＭＰ反応ポジティブの場合は、ＬＡＭＰ反応の進行に伴ってＭｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流が減少したが、ＬＡＭＰ反応ネガティブの場合は、僅かに減少するだけで略一定であった。この結果から、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流を測定することによってＬＡＭＰ反応を検出できることが明らかとなった。
リアルタイム濁度計ＬＡ−２００（テラメックス社製）を用いた濁度を指標とした方法では、反応開始後１５分の時点でも、まだ濁度が上昇しなかった。一方、電気化学的検出では僅かに信号（酸化電流の低下)が観察された(図７参照）。
したがって、本反応条件下では（[Ｍｎ(ＩＩ)イオン]=４ｍＭ）では、ＬＡ−２００を用いた濁度検出より、電気化学検出の方が僅かに検出感度が高いと言える。
このことは、測定条件を至適化したり、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの必要濃度を低下させることができれば、より高感度にＬＡＭＰ反応を検出できることを示唆している。
尚、ＬＡＭＰ反応ネガティブの場合の僅かな電流値の減少は、電極表面以外でのＭｎ(ＩＩ)イオンの酸化、例えば、溶存酸素による酸化が起き、有効Ｍｎ(ＩＩ)イオン濃度が減少したためと思われる。

（２）Ｍｎ(ＩＩ)イオンを用いたＬＡＭＰ反応の電気化学検出におけるピロフォスファターゼの添加効果
図７で得られた結果がＭｎ(ＩＩ)イオンのｄＮＴＰとピロリン酸イオンに対する配位性の違いに基づいていることを確認するため、耐熱性ピロフォスファターゼ（Ppase:２０ｍＵ/２５ｕｌ）共存下で行ったＬＡＭＰ反応液の電気化学測定を試みた。その結果を図８に示す。図８の結果から、Ppaseを加えなかった場合は、上記結果と同様、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流が減少したが、Ppaseを加えた場合、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流減少は起こらず、ＬＡＭＰ反応ネガティブの場合と略同じ電流値を示した。このことは、ＬＡＭＰ反応が起きてもピロリン酸イオンが生成しない場合は、Ｍｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流の減少が起こらないことを示している。この結果は、図２に示したＭｎ(ＩＩ)イオンによるＬＡＭＰ反応検出が可能なことを示唆している。

実施例６．ルシフェラーゼ反応
（１）ルシフェラーゼ反応液の基本組成（２００μＬスケール）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ２５ｍＭ
ＭｇＳＯ_４ ４ｍＭ
ＡＴＰ ２．０ｍＭ
ルシフェリン ４７０μＭ
ＨＰ−β−ＣＤ ２．３５ｍＭ
ルシフェラーゼ ０．６１Ｕｇ（＋）ＯＲ ９．１５Ｕｇ（＋＋＋）
反応温度 室温
発光測定 ＥＧ＆Ｇ ＢＥＲＴＨＯＬＤ社製 ＭｉｃｒｏＬＵＭＡＴＬＢ９６Ｂ

（２）ルシフェラーゼ反応
ルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として発光反応を行う際、ＡＴＰからピロリン酸イオン（ｐｐｉ）を遊離する。そのため、ルシフェラーゼ反応が起きた場合も、ポリメラーゼ反応（ｄＮＴＰからｐｐｉが遊離する反応）が起きた場合と同様に、Ｍｎ（ＩＩ）イオンの配位状態が変化し、その酸化電流値が変わることが予測される。
そこで、ルシフェラーゼを添加した反応溶液にＭｎ（ＩＩ）イオンを添加し、その酸化電流を同様な方法で測定したところ、ルシフェラーゼを添加しなかった場合やルシフェラーゼを少量添加した場合に比べて顕著な酸化電流の減少が観察された（図９参照）。
この結果から、本発明がポリメラーゼだけに適用可能なのではなく、トリリン酸基からピロリン酸イオンが生成する様々な酵素反応を検出できることが判る。

実施例７．ＡＤＰの検出
生成するジリン酸がピロリン酸イオンではなく、ＡＤＰである場合について同様の方法で検出できるかを検討した。すなわち、キナーゼ反応を検出するための実験として、Ｍｎ（ＩＩ）イオンの酸化電流値に及ぼすＡＴＰおよびＡＤＰの添加量依存性をＬＳＶで測定した。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＡＴＰの存在下に比べて、ＡＤＰの存在下では、共存させたＭｎ（ＩＩ）イオンの酸化電流値が顕著に減少した。
この酸化電流の減少は、ピロリン酸イオンで観察された現象と同様に、ＡＤＰがＭｎ（ＩＩ）イオンに強く配位したためと考えられる。
従って、本発明の検出方法によれば、ピロリン酸イオンが生成する反応だけでなく、例えば、ＡＤＰを生成するキナーゼ反応にも適用できることが判る。
反応生成物がピロリン酸イオンの場合でも、ＡＤＰの場合でも検出できたということは、本発明の検出方法がトリリン酸基とジリン酸基のＭｎ（ＩＩ）イオンへの配位力の違いによることを裏付けている。

実施例８．Ｃｕ(ＩＩ）イオンを用いた検出
Ｃｕ（ＩＩ）イオンの場合、−１．０Ｖからスタートさせたアノード曲線において、ｄＮＴＰとピロリン酸イオンの量比に応じた酸化電流曲線の形状変化が見られた（図１１参照）。図１１に示すように、ピロリン酸イオンの添加量が増加すると、−０．１Ｖ付近の酸化電流におけるピーク電位がマイナス電位側にシフトしていく現象が観察された。
このことは、Ｃｕ（ＩＩ）イオンの酸化電流測定でも、Ｍｎ（ＩＩ）イオンと同様に、ｄＮＴＰとピロリン酸イオンの識別が可能であることを意味している。

実施例９．電極表面の電気化学的洗浄法
酵素反応をリアルタイムに検出するためには、Ｍｎ（ＩＩ）イオンの酸化電流測定を繰り返しその場で検出する必要がある。
しかし、Ｍｎ（ＩＩ）イオンは、ＬＳＶ測定によって酸化されると二酸化マンガンとして電極表面に析出するため、一度測定した電極をそのまま次の測定に用いることができない。そこで、電極表面の電気化学的洗浄法を検討した。すなわち、ＬＳＶ測定によって一旦析出した二酸化マンガンを電気化学的に還元してイオン化すれば電極表面が再生し、繰り返し測定できることになる。
電気化学的な還元処理方法を確認するため、まず二酸化マンガンが析出した電極表面のカソード分析を行った。二酸化マンガンが析出した電極のカソードＬＳＶ曲線と、析出していないＬＳＶ曲線との差曲線は、−０．４Ｖ付近にピーク電流を持つことがわかった。
２曲線の差は、二酸化マンガンの析出の有無だけであるから、この−０．４Ｖでの電流は、二酸化マンガンが還元された際に流れる電流であると考えられる。
そこで、ＬＳＶ測定を行う際、予め−０．４Ｖでカソード処理を行うことによって、その後のアノードＬＳＶにおけるＭｎ（ＩＩ）イオンの酸化電流値がどのように変化するか調べた（図１２参照）。
図１２に示す結果から、還元処理を行わない場合は、測定を繰り返すと徐々に電流値が増加してしまうが、還元処理を行えば一定の電流値を示すことが判った。
従って、ＬＳＶ測定の前に必ずカソード処理を行えば、Ｍｎ（ＩＩ）イオンの酸化電流測定を繰り返し行うことができることが判った。
アノードＬＳＶ測定におけるＭｎ（ＩＩ）イオンの酸化電流がピロリン酸イオン等のジリン酸の存在によって低下することは既に明らかになっていることから、Ｍｎ（ＩＩ）イオンの酸化電流が繰り返し測定できたということは、酵素反応をリアルタイムに検出可能であることを意味している。

Ｍｎ(ＩＩ)イオンの電極応答を示す図である。 Ｍｎ(ＩＩ)イオンの電気化学検出に及ぼすＭｇ^２＋イオンの添加効果を示す図である。 Ｍｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流に及ぼすｄＮＴＰの添加効果を示す図である。 ＬＡＭＰ反応液組成中でのＭｎ(II)イオンの検出感度を示す図である。 Ｍｎ(ＩＩ)イオンの電気化学検出に及ぼすピロリン酸イオンの添加効果を示す図である。 Ｍｎ(ＩＩ)イオンを用いたＬＡＭＰ反応（ＰＳＡ）の電気化学検出を示す図である。 Ｍｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流のＬＡＭＰ反応時間依存性を示す図である。 Ｍｎ(ＩＩ)イオンを用いたＬＡＭＰ反応の電気化学的検出におけるピロフォスファターゼの添加効果を示す図である。 Ｍｎ(ＩＩ)イオンを用いたルシフェラーゼ反応の電気化学的検出を示す図である。 Ｍｎ(ＩＩ)イオンの酸化電流測定によるＡＴＰとＡＤＰの添加量依存性を示す図である。 Ｃｕ（ＩＩ）イオンの酸化電流に及ぼすピロリン酸イオンの添加効果を示す図である。 カソード処理による電極表面洗浄効果を示す図である。

Claims (14)

1. トリリン酸化合物からジリン酸化合物を生成する反応、またはその逆反応を触媒する酵素反応において、基質または反応生成物と金属イオンとによって形成される錯化合物の電気化学的特性を測定することを特徴とする酵素反応の有無の検出方法。
2. 金属イオンに電位を印加して発生する電流を測定する請求項１記載の方法。
3. 印加する電位が-１．２〜１．２Ｖの範囲である請求項１または２記載の方法。
4. 金属イオンの濃度が１μＭ〜１００ｍＭの範囲である請求項１〜３記載の方法。
5. 反応生成物がピロリン酸イオンまたはヌクレオシド二リン酸である請求項１〜４記載の方法。
6. 錯化合物がピロリン酸-金属錯体またはヌクレオシド二リン酸-金属錯体である請求項１〜５記載の方法。
7. 金属イオンおよび/または金属錯体が酸素発生電位と水素発生電位との間に酸化還元電位を有する金属イオンおよび/または金属錯体である請求項１〜６記載の方法。
8. 金属イオンが遷移金属である請求項１〜７記載の方法。
9. 金属イオンがＭｎ（ＩＩ）および/またはＣｕ（ＩＩ）である請求項１〜８記載の方法。
10. 電気化学的特性の測定法が電位規制法である請求項１〜９記載の方法。
11. 電位規制法がサイクリックボルタンメトリー、リニアースイープボルタンメトリーまたはリニアースイープストリッピングボルタンメトリーである請求項１０記載の方法。
12. 酵素反応が核酸の増幅反応である請求項１〜１１記載の方法。
13. 核酸の増幅反応がＬＡＭＰ法である請求項１２記載の方法。
14. 酵素がＤＮＡポリメラーゼである請求項１〜１３記載の方法。

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