JP2004283161A - 核酸増幅の有無を検出する方法および装置 - Google Patents
核酸増幅の有無を検出する方法および装置 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】
核酸増幅反応の有無を、複雑な操作や特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に検出する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
核酸の増幅反応において、反応生成物と結合する金属イオンと、核酸とは結合しない化合物との結合能を指標とする核酸増幅の有無の検出方法であって、核酸増幅に伴い生成されるピロリン酸と結合する金属イオンと、金属指示薬との呈色および／または蛍光を観察することにより、核酸増幅の有無を高感度に検出する。
【選択図】 なし
核酸増幅反応の有無を、複雑な操作や特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に検出する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
核酸の増幅反応において、反応生成物と結合する金属イオンと、核酸とは結合しない化合物との結合能を指標とする核酸増幅の有無の検出方法であって、核酸増幅に伴い生成されるピロリン酸と結合する金属イオンと、金属指示薬との呈色および／または蛍光を観察することにより、核酸増幅の有無を高感度に検出する。
【選択図】 なし
Description
本発明は、核酸の増幅反応の有無を検出する方法と装置に関する。
核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、当該分析方法は遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段である。また、遺伝子そのものを検出対象とするために、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略できる場合もある。しかしながら、試料中に存在する目的の核酸量が少ない場合の検出は一般に容易ではなく、標的核酸そのものを、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。
核酸の増幅産物を検出する最も一般的な方法は、増幅反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動にアプライし、エチジウムブロマイド等の蛍光インターカレーターを結合させて特異的な蛍光を観察するというものである。ここで、他のＤＮＡが混在するおそれがなく、増幅産物の有無のみを知りたい場合には、電気泳動を省略して増幅反応後の溶液に蛍光インターカレーターを加えて蛍光を観察することも可能である。ただし、これらの方法は簡便であるものの、蛍光を観察するためのＵＶランプと暗室が必要である。
固相等の支持体上で核酸を発色させる方法には、酵素を利用し金属−硫黄錯体を固着する方法(例えば、特許文献１参照）、金属染色法で染色した核酸に色素前駆体と補力剤を作用させる方法(例えば、特許文献２参照）があるが、いずれも煩雑な工程を必要とする。
蛍光色素をはじめとする各種標識物質で標識したプライマーやヌクレオチドを用いて増幅反応を行い、増幅産物に取り込まれた標識を観察する方法もあるが(例えば、特許文献３参照）、増幅産物に取り込まれなかったフリーの標識プライマー（あるいはヌクレオチド）を分離する操作が必要であり、反応液量が微量である核酸増幅反応には適さない。また、標識プライマーやヌクレオチドは高価である。
電気泳動ゲルや膜等の支持体および標識物質を使用しない検出法には、核酸増幅反応液に偏光を通過させその偏光の旋光度または円偏光二色性を測定する方法(例えば、特許文献４参照）、伸長した増幅産物の偏光成分の変化を検知する方法(例えば、特許文献５、６および７参照）がある。また、増幅反応に伴い生成するピロリン酸とマグネシウムによる不溶性物質の沈殿を観察する方法(例えば、特許文献８参照）も開発されているが、沈殿による検出は極めて簡便で実用的であるものの、シグナルとしての認識性および訴求力にやや乏しい面もある。さらに、ピロリン酸を対象とする分析方法として、ピロリン酸に対して、酸化酵素を含む酵素反応試薬で処理し、酸化酵素が作用する際に起こる電子移動を、電気化学的活性インターカレータの存在下で増幅し、電気化学的に電流として検出する方法もあるが操作の煩雑さは否めない(例えば、特許文献９参照）。いずれにせよ、上述した方法には、増幅反応液の色調変化を簡単に観察できる極めて簡便で明確な核酸増幅の有無の検出方法についての記載はない。
本発明は、核酸の増幅反応の有無または増幅過程を、複雑な操作や特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、核酸の増幅反応において、
反応生成物と結合する金属イオンと、核酸とは結合しない金属指示薬との結合能を指標とした高感度な核酸増幅の有無の検出法と、核酸の増幅過程をモニタリングする方法ならびに試薬キット、さらには核酸増幅の有無を検出する簡易装置を見出し、本発明を完成させた。
反応生成物と結合する金属イオンと、核酸とは結合しない金属指示薬との結合能を指標とした高感度な核酸増幅の有無の検出法と、核酸の増幅過程をモニタリングする方法ならびに試薬キット、さらには核酸増幅の有無を検出する簡易装置を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、核酸の合成または増幅反応における、ｄＮＴＰｓとピロリン酸の結合能の差に基づく反応液中の金属イオン量の変化を、金属指示薬によって検知する核酸合成または増幅の有無の検出方法である。さらに、本発明は、ポリヌクレオチド鎖上の標的領域を増幅し、増幅反応に伴い変化する反応液中の金属イオンを指示薬により呈色させ、核酸の合成または増幅の有無すなわち標的核酸の存在を簡便に検出する方法と、核酸の増幅過程をモニターする方法ならびに試薬キット、さらには核酸増幅の有無を検出する簡易装置に関するものであり、以下の構成からなる。
（１）核酸の増幅反応において、反応生成物に結合する金属イオンと、核酸とは結合しない化合物との結合による呈色および／または蛍光を指標とすることを特徴とする、核酸増幅の有無を検出する方法。
（２）さらに、反応生成物と金属イオンとの結合によって生じる不溶性物質による濁度または沈殿を指標とすることを特徴とする、（１）記載の方法。
（３）核酸の増幅反応において、反応生成物に結合する金属イオンと金属指示薬との呈色および／または蛍光反応を指標とすることを特徴とする、核酸増幅の有無を検出する方法。
（４）金属イオンが、Ｍｇ（II）、Ｍｎ（II）、Ｎｉ（II）、Ｆｅ（II）およびＺｎ（II）から選択される少なくとも１種である（１）〜（３）記載の方法。
（５）金属指示薬が、エリオクロムブラックＴ、ヒドロキシナフトールブルー、チモールフタレインコンプレクソン、メチルチモールブルー、キシリジルブルー−１、クロロホスフォナゾ−３およびカルセインから選択される少なくとも１種である（３）記載の方法。
（６）反応液中の金属指示薬の濃度が、０．０５〜１０００μＭの範囲である（５）記載の方法。
（７）核酸の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（１）〜（６）記載の核酸増幅の有無を検出する方法。
（８）反応液の入った容器を反応温度が一定に保てるサンプルホルダーに設置し、反応液に光を照射して、濁度、呈色または蛍光を検出することを特徴とする（７）記載の方法。
（９）（７）記載の核酸増幅の有無を濁度、呈色または蛍光によって検出する装置であって、
（ａ）反応温度を一定に保てる保温機能を有するサンプルホルダー、
（ｂ）前記（ａ）に挿入した反応容器の中の反応液に、光が照射できるように配置された光源、ならびに
（ｃ）反応液の濁度、呈色または蛍光を検知できるように配置された検出器、含む装置。
（１０）光源を切り換えることにより濁度、呈色または蛍光による検出を行えるようにしたことを特徴とする（９）記載の装置。
（１１）核酸を増幅するために必要な試薬に加え、金属指示薬を含む試薬キット。
（１２）金属指示薬が、エリオクロムブラックＴ、ヒドロキシナフトールブルー、チモールフタレインコンプレクソン、メチルチモールブルー、キシリジルブルー−１、クロロホスフォナゾ−３およびカルセインから選択される少なくとも１種である（１１）記載のキット。
（１）核酸の増幅反応において、反応生成物に結合する金属イオンと、核酸とは結合しない化合物との結合による呈色および／または蛍光を指標とすることを特徴とする、核酸増幅の有無を検出する方法。
（２）さらに、反応生成物と金属イオンとの結合によって生じる不溶性物質による濁度または沈殿を指標とすることを特徴とする、（１）記載の方法。
（３）核酸の増幅反応において、反応生成物に結合する金属イオンと金属指示薬との呈色および／または蛍光反応を指標とすることを特徴とする、核酸増幅の有無を検出する方法。
（４）金属イオンが、Ｍｇ（II）、Ｍｎ（II）、Ｎｉ（II）、Ｆｅ（II）およびＺｎ（II）から選択される少なくとも１種である（１）〜（３）記載の方法。
（５）金属指示薬が、エリオクロムブラックＴ、ヒドロキシナフトールブルー、チモールフタレインコンプレクソン、メチルチモールブルー、キシリジルブルー−１、クロロホスフォナゾ−３およびカルセインから選択される少なくとも１種である（３）記載の方法。
（６）反応液中の金属指示薬の濃度が、０．０５〜１０００μＭの範囲である（５）記載の方法。
（７）核酸の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（１）〜（６）記載の核酸増幅の有無を検出する方法。
（８）反応液の入った容器を反応温度が一定に保てるサンプルホルダーに設置し、反応液に光を照射して、濁度、呈色または蛍光を検出することを特徴とする（７）記載の方法。
（９）（７）記載の核酸増幅の有無を濁度、呈色または蛍光によって検出する装置であって、
（ａ）反応温度を一定に保てる保温機能を有するサンプルホルダー、
（ｂ）前記（ａ）に挿入した反応容器の中の反応液に、光が照射できるように配置された光源、ならびに
（ｃ）反応液の濁度、呈色または蛍光を検知できるように配置された検出器、含む装置。
（１０）光源を切り換えることにより濁度、呈色または蛍光による検出を行えるようにしたことを特徴とする（９）記載の装置。
（１１）核酸を増幅するために必要な試薬に加え、金属指示薬を含む試薬キット。
（１２）金属指示薬が、エリオクロムブラックＴ、ヒドロキシナフトールブルー、チモールフタレインコンプレクソン、メチルチモールブルー、キシリジルブルー−１、クロロホスフォナゾ−３およびカルセインから選択される少なくとも１種である（１１）記載のキット。
本発明の方法により、試料中に存在する目的の標的核酸の増幅の有無を簡単に検出することができる。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、核酸またはポリヌクレオチド鎖上の標的領域を合成または増幅した後もしくは合成または増幅中に、合成反応または増幅反応に伴い変化する反応液中の金属イオンと金属指示薬との呈色または蛍光反応により、核酸の合成または増幅反応を検出するものである。反応によって生じる色調の変化は、肉眼でも観察可能であるため、増幅反応の有無を、複雑な操作や特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に検出することを特徴としている。
１．検出対象
本発明において、検出対象となる金属イオンは、核酸増幅反応の結果生じるピロリン酸と結合可能な金属イオンである。一般にタリウム（I）以外のアルカリ金属およびアルカリ土金属の多くはピロリン酸と結合して水に不溶、あるいは難溶性の塩を形成するため、好適に使用できる。増幅反応液中には、通常、ポリメラーゼの活性化剤であるマグネシウムイオンが十分量存在しているため、これをそのまま指標としてもよい。また、別途マグネシウムイオンと異なる金属イオンを加えることにより、マグネシウムイオンとピロリン酸の結合が抑制され、ポリメラーゼ活性を低下させない効果が期待できる。この方法では、マグネシウムのように過剰量添加する必要がないため、金属指示薬の選択範囲が広がる。しかしながら、マグネシウムと同じアルカリ土類金属であるカルシウムは、ポリメラーゼ活性を阻害するため使用に適さない。マグネシウム以外に好適な金属イオンとして、Ｍｎ（II）、Ｎｉ（II）、Ｆｅ（II）、Ｚｎ（II）等が挙げられる。
本発明において、検出対象となる金属イオンは、核酸増幅反応の結果生じるピロリン酸と結合可能な金属イオンである。一般にタリウム（I）以外のアルカリ金属およびアルカリ土金属の多くはピロリン酸と結合して水に不溶、あるいは難溶性の塩を形成するため、好適に使用できる。増幅反応液中には、通常、ポリメラーゼの活性化剤であるマグネシウムイオンが十分量存在しているため、これをそのまま指標としてもよい。また、別途マグネシウムイオンと異なる金属イオンを加えることにより、マグネシウムイオンとピロリン酸の結合が抑制され、ポリメラーゼ活性を低下させない効果が期待できる。この方法では、マグネシウムのように過剰量添加する必要がないため、金属指示薬の選択範囲が広がる。しかしながら、マグネシウムと同じアルカリ土類金属であるカルシウムは、ポリメラーゼ活性を阻害するため使用に適さない。マグネシウム以外に好適な金属イオンとして、Ｍｎ（II）、Ｎｉ（II）、Ｆｅ（II）、Ｚｎ（II）等が挙げられる。
ここで、マグネシウム以外に、別途金属イオンを添加する場合のその濃度は、０．０１〜１００ｍＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは、０．０５〜２０ｍＭの範囲である。濃度が０．０１ｍＭより低いときは、金属指示薬によっては呈色が十分でなく、１００ｍＭより高い濃度では、ポリメラーゼ活性の低下により、増幅反応に影響を及ぼすときがある。
前記金属イオンの検出は、水溶性金属指示薬によるのが好ましい。本発明では、増幅に伴い減少する反応液中の金属イオンを検出するため、金属イオン濃度に比例して発色を呈する指示薬ではなく、金属イオンと金属指示薬とのキレート化によって吸光スペクトルが変化し、その変化を観察できるものの方が好ましい。例えば、エリオクロムブラックＴ（ＢＴ）はｐＨ１０において種々の金属の共存により赤色を呈し、非存在下では青色を呈するので好適である。一方、この色調の変化を利用して増幅反応をモニタリングするためには、反応液のｐＨ、反応温度（６０℃以上）、ポリメラーゼに対する阻害等を考慮しなければならない。また、マグネシウム以外の金属イオンを指標とする場合は、共存するマグネシウムの影響も考慮する必要がある。このような条件を満たす金属指示薬として、ＢＴの他、ヒドロキシナフトールブルー（ＨＮＢ）、チモールフタレインコンプレクソン（ＴＰＣ）、メチルチモールブルー（ＭＴＢ）、キシリジルブルー1（ＸＢ−１ ）、クロロホスフォナゾ−３（Ｃｈ−３）およびカルセインが挙げられる。これらの指示薬は、単独または組み合わせて使用できる。
金属指示薬の濃度は、０．０５〜１０００μＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５００μＭの範囲である。濃度が０．０５μＭより低いときは、金属イオンによっては呈色が十分でなく、１０００μＭより高い濃度では、反応液のバックグランドが上昇し、呈色による増幅の有無が確認しにくくなる。
ここで、本発明においてポリヌクレオチドとは、増幅の対象となる核酸を意味し、一般的にはＤＮＡとＲＮＡの双方を含む。核酸は、一般に生物学的試料に含まれる。生物学的試料とは、動物、植物または微生物の組織、細胞、培養物若しくは排泄物、またはそれらの抽出物を意味する。また、生物学的試料には、ウイルスやマイコプラズマのような細胞内寄生体のゲノムＤＮＡ、あるいはＲＮＡが含まれる。また核酸は、前記生物学的試料に含まれる核酸から誘導されたものであってもよい。たとえば、ｍＲＮＡをもとに合成されたｃＤＮＡや、生物学的試料に由来する核酸をもとに増幅された核酸等が挙げられる。
２．核酸の合成反応
核酸の合成反応では、使用する酵素により核酸の末端にヌクレオチドを付加する過程でピロリン酸が生成する場合がある。本発明は、このような酵素による核酸の合成反応で生成されたピロリン酸と金属イオンの結合能を指標として核酸の存在を検出することができる。前記酵素としては、特に限定されるものではなく、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ、逆転写酵素（ Reverse Transcriptase ）、ＳＰ６ ＲＮＡ ポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、各酵素の反応は、公知の任意の条件で行うことができる（ T. Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 )。
核酸の合成反応では、使用する酵素により核酸の末端にヌクレオチドを付加する過程でピロリン酸が生成する場合がある。本発明は、このような酵素による核酸の合成反応で生成されたピロリン酸と金属イオンの結合能を指標として核酸の存在を検出することができる。前記酵素としては、特に限定されるものではなく、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ、逆転写酵素（ Reverse Transcriptase ）、ＳＰ６ ＲＮＡ ポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、各酵素の反応は、公知の任意の条件で行うことができる（ T. Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 )。
３．増幅反応
本発明の検出対象は、ピロリン酸と結合する金属イオンであることから、本発明において適用される増幅反応は、ヌクレオチドが核酸鎖に取り込まれる際にピロリン酸が生成する反応であれば、特に限定されるものではない。例えば、in vitroにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法であるＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction ）法の他、ＬＡＭＰ（ Loop-Mediated Isothermal Amplification ）法と呼ばれる増幅法（特許第３３１３３５８号等）、ＳＤＡ（ Strand Displacement Amplification ）法（特公平７−１１４７１８号公報等)、ＮＡＳＢＡ( Nucleic Acid Sequence Based Amplification ）法（特許第２６５０１５９号）等に適用することができる。
本発明の検出対象は、ピロリン酸と結合する金属イオンであることから、本発明において適用される増幅反応は、ヌクレオチドが核酸鎖に取り込まれる際にピロリン酸が生成する反応であれば、特に限定されるものではない。例えば、in vitroにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法であるＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction ）法の他、ＬＡＭＰ（ Loop-Mediated Isothermal Amplification ）法と呼ばれる増幅法（特許第３３１３３５８号等）、ＳＤＡ（ Strand Displacement Amplification ）法（特公平７−１１４７１８号公報等)、ＮＡＳＢＡ( Nucleic Acid Sequence Based Amplification ）法（特許第２６５０１５９号）等に適用することができる。
前期増幅反応のうちＬＡＭＰ法は、増幅対象となる塩基配列の末端にループ構造を形成し、そこを起点としてポリメラーゼによる伸長反応が起きると同時に、ループ内の領域にハイブリダイズしたプライマーが、鎖置換反応により核酸鎖を伸長しながら先の伸長反応の産物を１本鎖に解離させていくというものである。生成した１本鎖核酸はその末端に自己相補性領域を持つため、末端にループを形成し新たな伸長反応が始まる。実際のＬＡＭＰ法では等温で進行するため、上に述べた反応は同時に並行して起こる。ＬＡＭＰ法の特徴としては、等温で進行する鎖置換型の反応であることの他に、増幅産物の量が非常に多いことが挙げられる。これは、ポリメラーゼが失活する原因である熱変性の操作が含まれていないことも一因である。増幅産物の量が多いということは、生成するピロリン酸の量すなわちピロリン酸と反応する金属イオンの量も多いため、本発明を適用する核酸増幅法としてＬＡＭＰ法は好適である。
ここで、ＬＡＭＰ法において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸の塩基配列の計６領域から設計・作製された、ループ構造の形成に関与する２種類の内部プライマー（ＦＡプライマー、ＲＡプライマー）と、２種類の外部プライマー（Ｆ３プライマー、Ｒ３プライマー）の、少なくとも計４種類のオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。
４．検出
本発明においては、反応液中の金属イオンを金属指示薬によって検出する。検出操作の違いにより、以下の通り、定性的または定量的に検出することが可能である。検出対象である金属イオンは、増幅反応に用いられたヌクレオチドから生成したピロリン酸と結合して不溶性物質を形成し、反応液中の金属イオンは増幅反応の進行に伴い減少する。
本発明においては、反応液中の金属イオンを金属指示薬によって検出する。検出操作の違いにより、以下の通り、定性的または定量的に検出することが可能である。検出対象である金属イオンは、増幅反応に用いられたヌクレオチドから生成したピロリン酸と結合して不溶性物質を形成し、反応液中の金属イオンは増幅反応の進行に伴い減少する。
（１）目視による検出
増幅反応により減少する反応液中の金属イオンを検出する最も簡便な方法は、透明な容器の横からあるいは不透明容器の上部から、金属指示薬による呈色または蛍光を目視により観察することである。
（２）吸光度による測定
反応液の吸光度を測定することにより、増幅産物を検出することもできる。吸光度の測定には、汎用の分光光度計等を用いることができる。測定波長は、金属イオンおよび金属指示薬の種類によって適宜設定すればよい。また、吸光度測定により、特定のサイクル数または一定時間で反応を停止した反応液を用いて、試料中の核酸を定量することも可能である。さらに本発明においては、特に吸光度を経時的に測定することで、反応時間の経過と共に反応産物がどのように推移したか、そのモニタリングが可能となる。
（３）蛍光による測定
金属指示薬カルセインは、呈色と同時に蛍光も発するため蛍光の観察により増幅反応の有無を検出することもできる。また増幅反応がネガティブで青色、ポジティブで無色となるＴＰＣにさらに一般的な蛍光色素（フルオレセイン等）を添加すれば、ポジティブにおいても蛍光が観察されるようになる。このように、適当な蛍光色素を選択して添加することで、より広範な波長域で増幅反応の有無の検出またはモニタリングが可能となる。
増幅反応により減少する反応液中の金属イオンを検出する最も簡便な方法は、透明な容器の横からあるいは不透明容器の上部から、金属指示薬による呈色または蛍光を目視により観察することである。
（２）吸光度による測定
反応液の吸光度を測定することにより、増幅産物を検出することもできる。吸光度の測定には、汎用の分光光度計等を用いることができる。測定波長は、金属イオンおよび金属指示薬の種類によって適宜設定すればよい。また、吸光度測定により、特定のサイクル数または一定時間で反応を停止した反応液を用いて、試料中の核酸を定量することも可能である。さらに本発明においては、特に吸光度を経時的に測定することで、反応時間の経過と共に反応産物がどのように推移したか、そのモニタリングが可能となる。
（３）蛍光による測定
金属指示薬カルセインは、呈色と同時に蛍光も発するため蛍光の観察により増幅反応の有無を検出することもできる。また増幅反応がネガティブで青色、ポジティブで無色となるＴＰＣにさらに一般的な蛍光色素（フルオレセイン等）を添加すれば、ポジティブにおいても蛍光が観察されるようになる。このように、適当な蛍光色素を選択して添加することで、より広範な波長域で増幅反応の有無の検出またはモニタリングが可能となる。
例えば、前記蛍光を利用したモニタリングに関しては、以下の構成を備えた簡易装置を用いて実施できる。すなわち、核酸増幅の反応温度を一定に保てる保温機能を備えたサンプルホルダーと、前記サンプルホルダーの、例えば下部に設けた開放口からサンプルホルダーに導入された反応容器の中の反応液に励起光が照射できるように配置された光源と、反応液から放射された蛍光を、光軸に対して９０°の方向での検知できるように配置された検出器とを備えた装置である。さらに、前記検出器に、所要の波長のみを通過させるためのフィルターを兼ね備えていてもよい。
ここで、本発明で用いるサンプルホルダーは、反応容器の導入口、光の通過する開放口を有しており、核酸増幅中の反応液の温度が一定に保たれれば特に限定されない。そして、前記光源は、紫外線（ＵＶ）ランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ケミカルライト、レーザー光等から選択され、吸光度または蛍光等の検出手段により、切り換えができるように配置されていてもよい。前記検出器は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、フォトダイード等から選択される。そして、所要の波長のみを通過させるためのフィルターとは、反応液から放射される固有の波長の帯域光のみを透過させ、それ以外の波長域を遮断する目的のものである。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例において、その技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１：ＬＡＭＰ反応による核酸増幅の金属指示薬による検出
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
８ｍＭ ＭgＳＯ4
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
８Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
１．６μＭ ＦＡプライマー
１．６μＭ ＲＡプライマー
０．４μＭ Ｆ３プライマー
０．４μＭ Ｒ３プライマー
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
８ｍＭ ＭgＳＯ4
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
８Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
１．６μＭ ＦＡプライマー
１．６μＭ ＲＡプライマー
０．４μＭ Ｆ３プライマー
０．４μＭ Ｒ３プライマー
前記ＬＡＭＰ用反応液に、ＬＡＭＰ反応の鋳型としてＰＳＡ(前立腺特異抗原)ＤＮＡを６×１０-20Ｍ、金属指示薬としてエリオクロムブラックＴ（ＢＴ）、ヒドロキシナフトールブルー（ＨＮＢ）、チモールフタレインコンプレクソン（ＴＰＣ）およびメチルチモールブルー（ＭＴＢ）をそれぞれ５０μＭ、キシリジルブルー−１（ＸＢ−１）は１００μＭの濃度となるように添加し、増幅反応を６５℃で６０分を行った。ＴＰＣ、ＸＢ−１は水に難溶のため、予め０．０２ＭのＮａＯＨに溶解した１０ｍＭ溶液を添加した。なお、鋳型ＤＮＡを添加した反応液をポジティブ（＋）、鋳型ＤＮＡを添加しなかった反応液をネガティブ（−）（以下それぞれ「ポジティブ」「ネガティブ」）とした。本増幅反応においては、鋳型中に含まれる以下の配列(配列番号１)を目的のポリヌクレオチドとした。
5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCACACACCC-3'(配列番号１)
5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCACACACCC-3'(配列番号１)
また、反応液組成中のＦＡプライマー、ＲＡプライマーならびにＦ３、Ｒ３プライマーは、配列番号１に示す塩基配列に基づいて以下のように設計した。
・ＦＡプライマー
5'-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3'(配列番号２)
・ＲＡプライマー
5'-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3'(配列番号３)
・Ｆ３プライマー
5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3'(配列番号４)
・Ｒ３プライマー
5'-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3'(配列番号５)
・ＦＡプライマー
5'-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3'(配列番号２)
・ＲＡプライマー
5'-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3'(配列番号３)
・Ｆ３プライマー
5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3'(配列番号４)
・Ｒ３プライマー
5'-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3'(配列番号５)
増幅後の反応液の色調を目視により観察した。また、反応液のスペクトルおよび吸光度の測定に関しては、遠心操作によって反応液中のピロリン酸マグネシウムの沈殿物を除去した後、上清８０μＬを、 分光光度計Ｕｌｔｏｒｏｓｐｅｃ２０００（ Pharmacia社製 ）を用いて、波長３００〜８００ｎｍの吸光スペクトルと、可視領域内での変化の大きい極大吸収波長における吸光度を測定した。
その結果を図１〜図５および以下に示す。すべての指示薬について概ね５５０〜７００ｎｍの１つの領域にスペクトル変化が認められた。また、遠心後の反応液の色調差も顕著であり、肉眼で容易に増幅の有無を確認することができた。
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指示薬 鋳型添加 色調 吸光度（極大吸収波長）
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ＢＴ − 赤紫 ０．２４７（６５０ｎｍ）
＋ 青 ０．６２９（ 同 上 ）
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ＨＮＢ − 青紫 ０．５７９（６５０ｎｍ）
＋ 青 １．１１９（ 同 上 ）
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ＴＰＣ − 青 ０．５７３（６００ｎｍ）
＋ 無色 ０．１８５（ 同 上 ）
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ＭＴＢ − 淡青 １．１５３（６１０ｎｍ）
＋ 濃青 ０．７００（ 同 上 ）
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ＸＢ−１ − 橙 ０．１７８（６００ｎｍ）
＋ 桃 ０．４４４（ 同 上 ）
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指示薬 鋳型添加 色調 吸光度（極大吸収波長）
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ＢＴ − 赤紫 ０．２４７（６５０ｎｍ）
＋ 青 ０．６２９（ 同 上 ）
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ＨＮＢ − 青紫 ０．５７９（６５０ｎｍ）
＋ 青 １．１１９（ 同 上 ）
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ＴＰＣ − 青 ０．５７３（６００ｎｍ）
＋ 無色 ０．１８５（ 同 上 ）
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ＭＴＢ − 淡青 １．１５３（６１０ｎｍ）
＋ 濃青 ０．７００（ 同 上 ）
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ＸＢ−１ − 橙 ０．１７８（６００ｎｍ）
＋ 桃 ０．４４４（ 同 上 ）
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実施例２：ＮｉイオンとＣｈ−３添加による核酸増幅の検出
実施例１で用いたＬＡＭＰ用反応液（以下「ＬＡＭＰ用反応液」）に、ＮｉＣｌ2を０．１ｍＭおよびクロロホスフォナゾ−３（Ｃｈ−３）を４０μＭとなるようにそれぞれ添加し、実施例１に準じてＰＳＡのＤＮＡ増幅を行い、目視による増幅後の反応液の色調の観察とスペクトル測定を行った。
実施例１で用いたＬＡＭＰ用反応液（以下「ＬＡＭＰ用反応液」）に、ＮｉＣｌ2を０．１ｍＭおよびクロロホスフォナゾ−３（Ｃｈ−３）を４０μＭとなるようにそれぞれ添加し、実施例１に準じてＰＳＡのＤＮＡ増幅を行い、目視による増幅後の反応液の色調の観察とスペクトル測定を行った。
その結果を図６に示す。ＮｉＣｌ2およびＣｈ−３が無添加のものは、ポジティブ、ネガティブにスペクトルの差はほとんど見られなかったが、ＮｉＣｌ2およびＣｈ−３を添加したものは、３００〜７００ｎｍ全域でスペクトルに大きな差が現れ、極大吸収波長５８０ｎｍでの吸光度は、ネガティブが１．３９０に対し、ポジティブが１．６７８、また、目視による増幅後の反応液の色調は、ネガティブが青紫色に対し、ポジティブが青色であり、増幅の有無を確認することができた。。
実施例３：ＭｎＣｌ 2 とカルセイン添加による核酸増幅の検出
ＬＡＭＰ用反応液に、ＭｎＣｌ2を１ｍＭおよびカルセインを２５μＭとなるようにそれぞれ添加し、実施例１に準じてＰＳＡのＤＮＡ増幅を行い、目視による増幅後の反応液の色調の観察とスペクトル測定を行った。
ＬＡＭＰ用反応液に、ＭｎＣｌ2を１ｍＭおよびカルセインを２５μＭとなるようにそれぞれ添加し、実施例１に準じてＰＳＡのＤＮＡ増幅を行い、目視による増幅後の反応液の色調の観察とスペクトル測定を行った。
その結果を図７に示す。ＭｎＣｌ2およびカルセインが無添加のものは、ポジティブ、ネガティブにスペクトルの差はほとんど見られなかったが、ＭｎＣｌ2およびカルセインを添加したものは、極大吸収波長が、ネガティブが４９４ｎｍ（吸光度１．７１４）に対し、ポジティブでは４８９ｎｍ（吸光度１．６５９）とわずかに変化した。また、目視による増幅後の反応液の色調は、ネガティブがオレンジ色に対し、ポジティブが黄色となり、増幅の有無を確認することができた。ここで、増幅後の反応液について、ＵＶイルミネーターで波長３６５ｎｍの紫外線を照射すると、ポジティブのみで強い蛍光色が観察された。さらに、この反応液を蛍光光度計で測定すると、Ｅｘ．３６０ｎｍ（励起波長）−Ｅｍ．５１４ｎｍ（蛍光波長）で、蛍光強度がポジティブで２６３．８７、ネガティブで２４．２５となり、蛍光測定においても増幅の有無を確認することができた。図８（ネガティブ）および図９（ポジティブ）に蛍光スペクトル図を示す。
実施例４：核酸増幅反応の呈色を指標としたモニタリング
ＬＡＭＰ用反応液に、ＨＮＢまたはＢＴを１００μＭの濃度となるように添加し、測定波長（６５０ｎｍ）が固定式のリアルタイム濁度計ＬＡ−２００（ テラメックス社製 ) を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で５０分間行った。金属指示薬無添加のものをベースラインとし、増幅反応によって生じるＨＮＢまたはＢＴの色調変化に伴う吸光度変化をモニタリングした。
ＬＡＭＰ用反応液に、ＨＮＢまたはＢＴを１００μＭの濃度となるように添加し、測定波長（６５０ｎｍ）が固定式のリアルタイム濁度計ＬＡ−２００（ テラメックス社製 ) を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で５０分間行った。金属指示薬無添加のものをベースラインとし、増幅反応によって生じるＨＮＢまたはＢＴの色調変化に伴う吸光度変化をモニタリングした。
その結果を図１０に示す。ＨＮＢまたはＢＴのどちらを添加しても、１０分過ぎにポジティブのみ急激な吸光度の上昇がみられた。このことは、呈色反応のみによる増幅反応のモニタリングすなわちリアルタイム測定が可能であることを示唆する。
実施例５：核酸増幅反応の呈色と濁度を指標としたモニタリング
ＬＡＭＰ用反応液に、ＨＮＢまたはＢＴを１００μＭの濃度となるように添加し、実施例４で使用した濁度計を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で６０分間行い、増幅反応によって生じる色調と濁度の変化に伴う吸光度変化をモニタリングした。
ＬＡＭＰ用反応液に、ＨＮＢまたはＢＴを１００μＭの濃度となるように添加し、実施例４で使用した濁度計を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で６０分間行い、増幅反応によって生じる色調と濁度の変化に伴う吸光度変化をモニタリングした。
その結果を図１１に示す。金属イオンとピロリン酸による濁度（図中「ポジティブ」）に、金属イオンと金属指示薬による呈色が加わり、より大きい吸光度の上昇（図中「ＢＴ−またはＨＮＢ−ポジティブ」）が見られた。このことは、より高感度なモニタリングが可能であると同時に、呈色または濁度のどちらの手段を用いても、核酸増幅の有無を検出することが可能であることを示唆している。
実施例６：核酸増幅反応の蛍光によるモニタリング（１）
ＬＡＭＰ用反応液に、ＭｎＣｌ2を０．２５ｍＭおよびカルセインを５μＭ濃度となるように添加し、リアルタイム高温蛍光マイクロプレートリーダーＦｌｕｏＤｉａ Ｔ７０（ 大塚電子株式会社製 ）を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で６０分間行い、増幅反応によって生じる蛍光強度の変化をモニタリングした。
ＬＡＭＰ用反応液に、ＭｎＣｌ2を０．２５ｍＭおよびカルセインを５μＭ濃度となるように添加し、リアルタイム高温蛍光マイクロプレートリーダーＦｌｕｏＤｉａ Ｔ７０（ 大塚電子株式会社製 ）を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で６０分間行い、増幅反応によって生じる蛍光強度の変化をモニタリングした。
その結果を図１２に示す。Ｅｘ．４８５ｎｍ−Ｅｍ．５３０ｎｍにおいて、１３分過ぎにポジティブのみで急激な蛍光強度の上昇がみられた。このことより、金属イオンと金属指示薬の添加による蛍光測定によって、増幅反応のモニタリングが可能であることが示唆された。
実施例７：核酸増幅反応の蛍光によるモニタリング（２）
ＬＡＭＰ用反応液に、ＴＰＣを２００μＭおよびフルオレセインを６０ｎＭの濃度となるように添加し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳＹＳＴＥＭ（ Perkin Elmer Applied Biosystems社製 ）を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で６０分間行い、増幅反応によって生じる蛍光強度の変化をモニタリングした。
ＬＡＭＰ用反応液に、ＴＰＣを２００μＭおよびフルオレセインを６０ｎＭの濃度となるように添加し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳＹＳＴＥＭ（ Perkin Elmer Applied Biosystems社製 ）を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で６０分間行い、増幅反応によって生じる蛍光強度の変化をモニタリングした。
その結果を図１３に示す。励起波長４８８ｎｍ、Ｄｙｅ Ｌａｙｅｒ ＦＡＭ (蛍光波長５２０〜５３０ｎｍ)において、１５分過ぎにポジティブのみで急激な蛍光強度の上昇がみられた。これは、核酸増幅の進行と共に、ＴＰＣによる反応液の色調が弱くなることで、反応前にＴＰＣに吸収されていたフルオレセインの蛍光色が次第に観察されるようになってくるためである。このことより、金属指示薬と蛍光物質の共存による蛍光測定によって、増幅反応のモニタリングが可能であることが示唆された。
実施例８：核酸増幅反応の蛍光によるモニタリング（３）
ＬＡＭＰ用反応液に、ＭｎＣｌ2を０．５ｍＭおよびカルセインを２５μＭの濃度となるように添加し、サーマルサイクラー Ｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ( Biometra社製 )を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で３０分間行った。反応時間２分毎にデジタルカメラＱＶ−２９００ＵＸ ( CASIO社製 ）、ＵＶランプＵＶＧＬ−５８型ミネラライト・ランプ( UVP )を用い、図１５に示す装置構成で、反応液の蛍光をデジタルカメラ（ Shutter Speed 1/20sec. F 3.2 ）を固定したまま撮影を行った。
ＬＡＭＰ用反応液に、ＭｎＣｌ2を０．５ｍＭおよびカルセインを２５μＭの濃度となるように添加し、サーマルサイクラー Ｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ( Biometra社製 )を用いて、ＰＳＡのＤＮＡ増幅反応を６５℃で３０分間行った。反応時間２分毎にデジタルカメラＱＶ−２９００ＵＸ ( CASIO社製 ）、ＵＶランプＵＶＧＬ−５８型ミネラライト・ランプ( UVP )を用い、図１５に示す装置構成で、反応液の蛍光をデジタルカメラ（ Shutter Speed 1/20sec. F 3.2 ）を固定したまま撮影を行った。
その結果を図１４に示す。図１４は、反応終了後、撮影した画像を画像編集ソフト（ Adobe Photo Shop 5.5 )で変換し、反応液部分のヒストグラムの平均値（チャンネル；ブラック）を算出し、得られた平均値を撮影時間に対してプロットしたグラフである。ポジティブのみ蛍光の上昇に伴うヒストグラム平均値の上昇が見られた。このことより、簡易装置を用いた増幅反応のリアルタイム測定が可能であることが示唆される。
Claims (12)
- 核酸の増幅反応において、反応生成物に結合する金属イオンと、核酸とは結合しない化合物との結合による呈色および／または蛍光を指標とすることを特徴とする、核酸増幅の有無を検出する方法。
- さらに、反応生成物と金属イオンとの結合によって生じる不溶性物質による濁度または沈殿を指標とすることを特徴とする、請求項１記載の方法。
- 核酸の増幅反応において、反応生成物に結合する金属イオンと金属指示薬との呈色および／または蛍光反応を指標とすることを特徴とする、核酸増幅の有無を検出する方法。
- 金属イオンが、Ｍｇ（II）、Ｍｎ（II）、Ｎｉ（II）、Ｆｅ（II）およびＺｎ（II）から選択される少なくとも１種である請求項１〜３記載の方法。
- 金属指示薬が、エリオクロムブラックＴ、ヒドロキシナフトールブルー、チモールフタレインコンプレクソン、メチルチモールブルー、キシリジルブルー−１、クロロホスフォナゾ−３およびカルセインから選択される少なくとも１種である請求項３記載の方法。
- 反応液中の金属指示薬の濃度が、０．０５〜１０００μＭの範囲である請求項５記載の方法。
- 核酸の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする請求項１〜６記載の核酸増幅の有無を検出する方法。
- 反応液の入った容器を反応温度が一定に保てるサンプルホルダーに設置し、反応液に光を照射して、濁度、呈色または蛍光を検出することを特徴とする請求項７記載の方法。
- 請求項７記載の核酸増幅の有無を濁度、呈色または蛍光によって検出する装置であって、
（ａ）反応温度を一定に保てる保温機能を有するサンプルホルダー、
（ｂ）前記（ａ）に挿入した反応容器の中の反応液に、光が照射できるように配置された光源、ならびに
（ｃ）反応液の濁度、呈色または蛍光を検知できるように配置された検出器、含む装置。 - 光源を切り換えることにより濁度、呈色または蛍光による検出を行えるようにしたことを特徴とする請求項９記載の装置。
- 核酸を増幅するために必要な試薬に加え、金属指示薬を含む試薬キット。
- 金属指示薬が、エリオクロムブラックＴ、ヒドロキシナフトールブルー、チモールフタレインコンプレクソン、メチルチモールブルー、キシリジルブルー−１、クロロホスフォナゾ−３およびカルセインから選択される少なくとも１種である請求項１１記載のキット。
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