CN111801426B - 用于检测微生物的基于环介导等温扩增(lamp)的测定 - Google Patents

用于检测微生物的基于环介导等温扩增(lamp)的测定 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于检测疑似含有病原体的样品中的微生物病原体的方法和系统。该方法包括将环介导等温扩增(LAMP)试剂和聚合物凝胶(诸如水凝胶)与样品合并以形成混合物。使凝胶在短时间内聚合，将病毒颗粒固定在混合物内。如果样品中存在靶DNA/RNA，则产生扩增子。通过视觉检测扩增子的存在或不存在来检测靶微生物。靶微生物浓度可以基于反应后荧光扩增子点的数目使用智能手机或荧光显微镜确定。该方法可以用于快速且低廉地以高灵敏度对环境水样品中的微生物病原体定量。

Description

用于检测微生物的基于环介导等温扩增(LAMP)的测定
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年1月2日提交的美国临时申请系列第62/612,978号的权益，该美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开内容大体上涉及用于检测环境样品中感兴趣的微生物的技术，并且更特别地，涉及基于环介导等温扩增(LAMP)的检测技术。
背景
水传播(waterborne)疾病是由病原微生物(例如，病毒、细菌和原生动物)引起的疾患。根据世界卫生组织(WHO)，单独的水传播腹泻疾病每年造成180万人死亡，这使其成为全世界疾病和死亡的主要原因。由于其尺寸小且多样性大，检测环境水中微生物病原体具有挑战性。
当前，有多种方法可用于水传播微生物病原体检测。这些方法可以分为两类。第一类是传统的基于培养的方法，其基于提供将支持感兴趣的微生物的生长的营养和物理化学条件的组合。然而，提供如同病原体的温血宿主的相似环境可能是困难的，或者在某些情况下是不可能的。另外地，基于培养的方法通常耗时(几天到几周)且耗力，并且因此仅能由训练有素的技术人员在设备齐全的实验室中进行。另一类是基于分子的方法，诸如聚合酶链式反应(PCR)、免疫测定和多种生物传感器。PCR，特别是定量PCR(qPCR)方法，是最广泛使用的病原体检测方法，并且被认为是新的金标准测试。qPCR提供短得多的样品到结果(sample-to-result)的时间(3到5小时)。然而，尽管qPCR被广泛接受，但它因依赖标准参考物质(标准曲线)进行定量而受到限制。不可靠和不一致的商业标准参考物质也可能影响qPCR定量的准确度。此外，qPCR易于受到由环境样品中自然存在的物质(例如，重金属和有机质)引起的抑制，从而导致靶定量不准确或假阴性结果。
与qPCR相比，最近的数字PCR技术已被证明是用于环境样品中的微生物病原体检测的更稳健的解决方案。数字PCR基于分区(partitioning)和泊松统计，因此，不需要比较外部定量标准来对未知浓度的样品定量。然而，将数字PCR方法实施于使用点应用(point-of-use application)可能是挑战性的。这是因为数字PCR需要昂贵的仪器(即Bio-rad液滴数字PCR)、设备齐全的实验室环境和训练有素的技术人员来进行测定。这些因素严重限制数字PCR在资源有限背景下的可及性和应用。
因此，期望用于检测微生物的快速、简化、低成本的测定，以在集中式实验室之外，例如，在需要对资源有限的地方的环境水进行现场使用点测试的情况下提供分子测定的益处。
发明内容
本文提供了以下项目：
1.一种检测疑似含有靶微生物的样品中的所述靶微生物的方法，所述方法包括：
将环介导等温扩增(LAMP)试剂、聚合物凝胶和所述样品合并以形成混合物，所述聚合物凝胶用于将所述微生物固定在所述混合物内；和
检测所述混合物中是否存在所述靶微生物，检测由对所述靶微生物的DNA/RNA进行扩增的LAMP反应产生的一个或更多个扩增子的存在或不存在，其中所述扩增子的存在指示所述样品中存在所述靶微生物，而所述扩增子的不存在指示所述样品中不存在所述靶微生物。
2.如项目1所述的方法，其中所述聚合物凝胶是选自由以下组成的组的水凝胶：聚乙二醇(PEG)凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
3.如项目1所述的方法，所述方法还包括：
基于所述LAMP反应后检测到的存在的扩增子的数目对所述样品中的靶微生物浓度定量。
4.如项目1所述的方法，其中所述靶微生物中的每一个对应一个扩增子。
5.如项目1所述的方法，其中所述微生物是病毒、细菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、原生动物或细菌。
6.如项目1所述的方法，所述方法还包括：
允许所述聚合物凝胶在预定温度在所述混合物中聚合预定时间段；和
在所述聚合物凝胶聚合步骤后孵育所述混合物。
7.如项目1所述的方法，所述方法还包括：
向所述混合物添加引物-染料和引物-猝灭剂双链体。
8.如项目1所述的方法，所述方法还包括：
用染料对所述混合物染色。
9.如项目1所述的方法，所述方法还包括：
将所述混合物放置在载玻片上；和
使用智能手机摄像头或荧光显微镜来视觉检测所述载玻片上存在或不存在扩增子。
10.如项目1所述的方法，其中对所述聚合物凝胶的交联进行调节以在所述聚合物凝胶中的交联剂之间形成预定的网孔尺寸和预定的分子量。
11.如项目1所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：环境水、土壤、粪便、尿液、血液以及前述物质的任何组合。
12.一种检测疑似含有细菌噬菌体的样品中的所述细菌噬菌体的方法，所述方法包括：
将环介导等温扩增(LAMP)试剂、聚合物凝胶和所述样品合并以形成混合物，所述聚合物凝胶用于将所述细菌噬菌体固定在所述混合物内；
孵育所述混合物；和
检测所述混合物中是否存在所述细菌噬菌体，检测由对所述细菌噬菌体的DNA/RNA进行扩增的LAMP反应产生的一个或更多个扩增子的存在或不存在，其中所述扩增子的存在指示所述样品中存在所述细菌噬菌体，而所述扩增子的不存在指示所述样品中不存在所述细菌噬菌体。
13.如项目12所述的方法，其中所述细菌噬菌体是感染大肠杆菌(Escherichiacoli)的大肠杆菌噬菌体MS2。
14.如项目12所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：环境水、土壤、粪便、尿液、血液以及前述物质的任何组合。
15.如项目12所述的方法，其中所述聚合物凝胶选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
16.如项目12所述的方法，所述方法还包括：
允许所述聚合物凝胶在预定温度在所述混合物中聚合预定时间段；和
在所述聚合物凝胶聚合步骤后孵育所述混合物。
17.如项目12所述的方法，所述方法还包括：
向所述混合物添加引物-染料和引物-猝灭剂双链体。
18.如项目12所述的方法，所述方法还包括：
将所述混合物放置在载玻片上；和
使用手机摄像头或荧光显微镜来视觉检测所述载玻片上存在或不存在扩增子。
19.一种用于检测疑似含有靶微生物的样品中的所述靶微生物的系统，所述系统包括：
反应剂，所述反应剂包括环介导等温扩增(LAMP)试剂和聚合物凝胶；
室，所述室用于将所述反应剂和所述样品合并以形成混合物；和
载玻片，所述载玻片被配置为接收所述混合物，以允许视觉检测所述混合物中是否存在所述靶微生物，视觉检测由对所述靶微生物的DNA/RNA进行扩增的LAMP反应产生的一个或更多个扩增子的存在或不存在，其中所述扩增子的存在指示所述样品中存在所述靶微生物，而所述扩增子的不存在指示所述样品中不存在所述靶微生物。
20.如项目19所述的系统，所述系统还包括荧光标志物和照相机，所述荧光标志物被应用于所述混合物以形成所述扩增子；所述照相机被配置为视觉检测所述载玻片上接收的所述混合物中的扩增子的存在或不存在。
概述
除了基于PCR的核酸扩增和检测技术之外，等温扩增方法，诸如环介导等温扩增(LAMP)、依赖螺旋酶的扩增(HDA)、多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)，提供在集中式实验室(centralized laboratory)之外提供分子测定的益处的机会。由于不需要热循环，等温反应更适合与小型化、便携式和电池供电的“芯片实验室”平台相结合。LAMP最初于2000年被描述，现已成为最流行的等温扩增技术，几乎覆盖所有环境卫生(sanitation)上重要的微生物病原体。LAMP能够在约65℃的温度，在少于30min内将靶DNA模板扩增109倍。另外，LAMP产物可以使用嵌入性染料(例如，EvaGreen、Sybr Green和SYTO9)通过荧光检测，或者通过作为扩增副产物的焦磷酸镁沉淀引起的浊度变化用肉眼检测。
已经开发了促进LAMP在即时检验(point-of-care)疾病诊断中的应用的便携式设备。然而，这些测定中的大多数是定性的，并且因此不适于定量环境水质监测。尽管已经报道了几种实时或数字形式的定量LAMP测定，但是这些测定都需要复杂的仪器(即手持式实时荧光检测设备)或定制的微制造消耗品(例如，Slipchip和DropChip)。
本文公开了基于LAMP的技术和系统，其可以提供定量的、低成本的且快速的细菌噬菌体检测和/或监测工具，其可以容易地在资源有限的背景下采用。受关于原位PCR、水凝胶中微生物的固定、聚丙烯酰胺凝胶中的PCR扩增和聚乙二醇(PEG)水凝胶中的MDA扩增方面的早期工作的启发，本文描述了一种新的凝胶内LAMP(gLAMP)技术，该技术能够在30min内对环境水样品中的微生物病原体定量。gLAMP系统不需要微流体芯片且人员培训有限。虽然所公开的示例性实施方案可集中于大肠杆菌噬菌体(病毒感染细菌)检测，但是gLAMP技术也可以适于检测和/或监测其他背景的水或食物样品中的其他微生物病原体(例如，大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella))。该系统也可以用于通过简单的样品预处理(DNA/RNA提取和纯化)对其他基质(例如，粪便、尿液和血液)中的微生物进行检测和定量。
根据gLAMP技术的示例性实施方案，公开了用于检测疑似含有靶微生物的样品中的靶微生物(包括病毒颗粒、细菌细胞或靶DNA/RNA)的一种或更多种方法和系统。该方法包括将环介导等温扩增(LAMP)试剂和水凝胶与样品合并在一起以形成混合物。水凝胶在短时间内聚合，以将靶固定在混合物内。如果样品中存在靶，则在加热孵育期间通过LAMP扩增产生扩增子。通过视觉检测扩增子的存在或不存在来检测靶。靶的浓度可以使用智能手机或荧光显微镜基于反应后荧光扩增子点的数目来确定。
前面的概述没有定义对所附权利要求的限制。对于本领域技术人员而言，在查看以下附图和详细描述后，其他方面、实施方案、特征和优势将是或将变得明显。意图所有这样的另外的特征、实施方案、方面和优势都被包括在本说明书内并且受所附权利要求保护。
附图简述
应理解的是，附图仅为了说明的目的并且不定义对所附权利要求的限制。此外，附图中的组件不一定按比例绘制。在附图中，相似的附图标记贯穿不同的视图表示对应的部分。
图1是示例性凝胶内LAMP测定系统的示意图。
图2是说明检测样品中的病毒颗粒和/或微生物病原体的示例性凝胶内LAMP方法的流程图。
图3A-3F是显示由对环境水的某些实验性凝胶内LAMP测试产生的示例性扩增子点谱的摄影图像。
图4A-4B是示例性实验结果的图，显示了反应时间和模板浓度对凝胶内LAMP方法的实例的结果的影响。
图5A-5B是示例性实验结果的图，显示了某些样品预处理对凝胶内LAMP方法的实例的影响(图5A)和凝胶内LAMP方法的实例与常规空斑测定之间的计数比较(图5B)。
图6A-6C是在处理某些环境水样品时示例性的直接gLAMP测定的示例性实验结果的图。
图7是显示本文公开的凝胶内LAMP技术的实例的引物和探针序列的表(SEQ IDNO:1-11)。
详细描述
参考并结合附图的以下详细描述描述并说明了基于凝胶内环介导等温扩增(gLAMP)测试样品的测定系统、试剂盒和方法的一个或更多个实例。对这些实例的展示和描述足够详细到使得本领域技术人员能够实践所要求保护的内容，提供这些实例不是为了限制而是仅用于例证和教导本发明的测定和系统的实施方案。因此，在适当的情况下为了避免本发明模糊不清，本描述可能省略了本领域技术人员已知的某些信息。本文中的公开内容是不应当被理解为是过度限制可能基于本申请最终被授权的任何专利权利要求的范围的实例。
在整个本申请中使用词语“示例性”意指“用作实例、例子(instance)或说明”。本文被描述为“示例性”的任何系统、方法、装置、技术、特征或类似物不一定被解释为相对于其他特征是优选的或有利的。
除非上下文清楚地另外指示，否则如在本说明书和所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
虽然与本文描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但本文描述了适当的材料和方法的具体实例。
此外，除非另外指明，否则“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”是可互换的并且意图是非限制性的。
还应理解，在各个实施方案的描述使用术语“包含(comprising)”的情况下，本领域技术人员将理解，在某些特定情况下，实施方案可以使用语言“主要由......组成(consisting essentially of)”或“由......组成(consisting of)”来替换性地描述。
如上讨论的，水传播疾病是由病原微生物(例如，病毒、细菌和原生动物)引起的疾患。例如，通过环境水传播的人类病原肠道病毒是许多水传播疾病(包括肝炎、肠胃炎、脑膜炎、发热和结膜炎)的主要原因。由于其尺寸小且多样性大，检测环境水中微生物病原体具有挑战性。例如，由于方法学限制，对特定病毒病原体的直接监测对于公共卫生保护通常是不切实际的。与细菌指示物相似，大肠杆菌噬菌体(感染大肠杆菌的病毒)可以用作预测水的病毒污染的指示生物体。虽然所公开的示例性实施方案可以集中于大肠杆菌噬菌体(感染细菌的病毒)检测，但是gLAMP技术也可以适用于检测和/或监测水、临床或食物样品中的其他微生物病原体(例如，革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌物种、病毒和原生动物)。除了环境水之外，本文公开的系统和方法还可以用于通过样品预处理(DNA/RNA提取和纯化)对其他基质(例如，粪便、尿液和血液)中的微生物进行检测和定量。
环介导等温扩增(LAMP或Loopamp)是一种等温DNA扩增程序，使用特异性识别靶DNA序列的一组4至6个引物：2至3个“正向”和2至3个“反向”(参见Nagamine等人，NucleicAcids Res.(2000)28:e63；Nagamine等人，Clin.Chem.(2001)47:1742-43；美国专利第6,410,278号；美国专利申请第2006/0141452号；第2004/0038253号；第2003/0207292号；和第2003/0129632号；和欧洲专利申请第1,231,281号)。简而言之，设计一组引物，使得约1/2的引物是正链，另1/2的引物序列是负链。通过聚合酶进行链置换扩增后，产生每侧上都有发夹环的核酸结构。从该结构，进行重复的多轮扩增，产生不同尺寸的产物。这种扩增的副产物是形成焦磷酸镁，其形成白色沉淀，导致反应溶液混浊。这种浑浊的存在意味着阳性反应，而没有浑浊则是阴性反应。另外的添加剂，诸如钙黄绿素，允许发生其他可视化现象；至于钙黄绿素，其能够实现荧光检测。扩增反应在等温条件下(在约65℃)发生，并在少于一小时内持续积累109个拷贝的靶。
用于LAMP的试剂是已知的(例如，Bst聚合酶、dNTP、缓冲液等)。此外，本领域技术人员使用已知的序列信息容易设计和鉴定引物对。例如，用于核酸的环介导等温扩增的预备试剂(reagent preparation)包含至少一种聚合酶(其中酶能够进行链置换)、靶特异性引物组和脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。在一些实施方案中，能够进行链置换的聚合酶是Bst酶。如果靶是RNA，则预备试剂还包括逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶是AMV逆转录酶。
如本文使用的术语“微生物(microbial或microbe)”包括细菌、真菌、原生动物和病毒生物体。本公开内容的方法和系统可以用于检测和识别这样的微生物生命体的存在。
可以使用本公开内容的方法和系统检测的细菌微生物包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌二者。例如，可能受影响的细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群)、链球菌属的种(Streptococcussp.)(草绿色链球菌的群(viridans group))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群)、牛链球菌(S.bovis)、链球菌属(Streptococcus)(厌氧物种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和肠球菌属的种(Enterococcus sp.)；革兰氏阴性球菌，诸如，例如，淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)和卡他布兰汉菌(Branhamella catarrhalis)；革兰氏阳性杆菌，诸如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、痤疮丙酸杆菌(P.acne)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和类白喉菌属(diptheroids)的棒状杆菌属(Corynebacterium)的种(需氧和厌氧的)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌属(Enterobacter)的种、奇异变形杆菌(Proteus mirablis)和其他的种、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、沙门氏菌、志贺氏菌(Shigella)、沙雷氏菌(Serratia)和空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)。特别地，本公开内容的方法和系统可用于检测任何病原体。被这些细菌中的一种或更多种感染可以导致的疾病诸如菌血症、肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、鼻窦炎、关节炎、尿路感染、破伤风、坏疽、结肠炎、急性胃肠炎、脓疱病、痤疮、acne posacue、伤口感染、出生感染(born infection)、筋膜炎、支气管炎和多种脓肿、医院内感染和机会性感染。
真菌生物体也可以通过本公开内容的方法和系统来检测，例如，犬小孢子菌(Microsporum canis)和其他小孢子菌属的种(Microsporum sp.)；和毛癣菌属的种(Trichophyton sp.)，诸如红色毛癣菌(T.rubrum)和须毛癣菌(T.mentagrophytes)，酵母菌(yeasts)(例如，白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(C.Tropicalis)或其他念珠菌属(Candida)的种)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)(圆形糠秕孢子菌(Pityrosporum orbiculare)或卵状糠秕孢子菌(P.ovale))、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和其他曲霉属的种(Aspergillus sp.)，接合菌(Zygomycetes)(例如，根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor))，巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitides)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)。
可以通过本公开内容的方法和系统检测的病毒生物体包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、胡宁病毒(Junin Virus)、BK病毒、马丘波病毒、水痘带状疱疹病毒(Varicella zoster virus)、甲病毒属(alphavirus)、科罗拉多蜱热病毒(Colorado tickfever virus)、鼻病毒和冠状病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、登革病毒(Dengueviruses)、埃博拉病毒(Ebolavirus)、肠道病毒属(Enterovirus)的种、单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒-2、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒(Mumps virus)、诺如病毒(Norovirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、轮状病毒(Rotavirus)、风疹病毒(Rubella virus)，SARS冠状病毒、西尼罗病毒(West Nile Virus)和寨卡病毒(Zika Virus)。
图1是示例性凝胶内LAMP(gLAMP)测定系统10的示意图，该示例性凝胶内LAMP(gLAMP)测定系统10能够使用标准实验室设备在约30分钟内进行微生物病原体定量，例如大肠杆菌噬菌体定量。系统10可以是包括LAMP试剂和聚合物凝胶11的试剂盒；一个或更多个室12，所述室包括至少一个载玻片，用于观察LAMP试剂、凝胶和样品的混合物；培养箱14，用于加热放置在载玻片上的混合物；以及成像器16，用于观察由室12中的LAMP反应产生的扩增产物，例如，扩增子点。
在一些实施方案中，系统10中包括的硬件可以包括标准实验室设备。LAMP试剂可以包括以下、由以下组成或主要由以下组成：用于引发和完成LAMP反应的任何合适的LAMP试剂，例如，下文描述的那些。载玻片室12可以包括用于保持和观察混合物的任何合适的室，例如，PCR框架密封室(frame seal chamber)。培养箱14可以是用于在期望的温度将混合物加热期望的时间段的任何合适的装置。例如，培养箱可以包括PCR仪(MJ ResearchPTC-100)或小型干浴器(Benchmark,Edison,NJ)。可选地，简单的水浴可以用作培养箱14的热源。扩增子成像器16可以包括用于视觉检查经处理的混合物的任何合适的装置；例如，成像器16可以包括照明光源、用于对混合物中的扩增产物进行染色或标记的工具，以及用于捕获呈现经处理的混合物的经照射的载玻片的图像的相机或显微镜。例如，照明光源可以是用于照射载玻片的廉价蓝色(460-470nm)LED笔或凝胶成像器。
通常，在测定系统10的操作期间，将靶微生物(例如，MS2、大肠杆菌、沙门氏菌和肠球菌)与LAMP试剂固定在聚合物凝胶(例如，水凝胶，诸如一种或更多种聚乙二醇(PEG)水凝胶)内，并且然后通过原位LAMP反应扩增病毒RNA。由于聚合物凝胶的限制作用，一个靶微生物仅能产生一个扩增子点。因此，样品微生物浓度可以使用扩增子成像器16(例如，智能手机或荧光显微镜)基于反应后的荧光扩增子点的数目来确定。
与2-4小时的qPCR及传统的多于24小时的基于培养的方法相比，gLAMP测定显著快于其他可用的方法，耗时少于30分钟。扩增的凝胶载玻片可以在室温储存多于一个月，而不会影响荧光点可视化。这表明凝胶基质为扩增子提供了良好的保护，这将允许在需要进一步分析的情况下运送样品。考虑到本文公开的gLAMP技术突出的简易性、灵敏度和快速性，本文公开的gLAMP技术对于微生物水质分析，特别是在资源有限的背景下的微生物水质分析具有巨大的潜力。
此外，示例实验结果表明，gLAMP测定结果显示与传统的空斑测定计数良好地相关(R2＝0.984,p<0.05)，并且达到与实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)相似的灵敏度(1PFU/反应)。此外，实验结果显示，gLAMP技术显示出对厕所废水中存在的抑制剂的高耐受性，在厕所废水中RT-qPCR被完全抑制。考虑到gLAMP的简易性、灵敏度和快速性，gLAMP为微生物水质分析，特别是在资源有限的背景下的微生物水质分析提供了极大改进的技术。
gLAMP测定系统10也可以用于其他水测试/监测应用或食品样品应用。
图2是说明检测/监测样品中的病毒颗粒和/或微生物病原体的示例性凝胶内LAMP(gLAMP)方法50的流程图。在步骤52中，将LAMP试剂、凝胶和样品合并为混合物。样品可以是环境样品或临床样品。例如，样品包括环境水、土壤、粪便、尿液、血液或前述物质的任何组合。
凝胶可以包括以下、由以下组成或主要由以下组成：任何合适的聚合物凝胶或不同凝胶的组合。例如，在一些示例性实施方案中，用作gLAMP的基质的聚合物凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶。例如，聚丙烯酰胺凝胶可以通过使用过硫酸铵(Bio-Rad,Hercules,CA)作为引发剂经四甲基乙二胺(TEMED)(Bio-Rad,Hercules,CA)催化丙烯酰胺与双丙烯酰胺(40％(w/v)溶液丙烯酰胺/双丙烯酰胺19:1)(Bio-Rad,Hercules,CA)之间的交联而形成。在其他示例性实施方案中，用作gLAMP的基质的聚合物凝胶可以是聚乙二醇(PEG)水凝胶。例如，PEG凝胶可以通过摩尔比为1:2的四臂PEG丙烯酸酯[分子量(MW)10K]与硫醇-PEG-硫醇(MW3.4K)(Laysan Bio,Arab,AL)之间的迈克尔加成而形成。
在gLAMP测定的示例性实施方案中，25μL的水凝胶反应混合物可以包括以下、由以下组成或主要由以下组成：12.5μL 2x LAMP主混合物(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA)、1.25μL 20x病毒引物混合物(图7中示出的表)、0.8μL猝灭引物(qFIP-3’IBFQ)(当有荧光团标记引物(5'FAM-FIP)时)。对于实验样品，可以使用2μL MS2RNA模板或2μL的原始水样品。水凝胶可以以10％(w/v)的最终浓度添加到反应混合物中。上述25μL水凝胶反应混合物可以装载到玻璃载玻片上的原位PCR框架密封室(9×9mm)(Bio-Rad,Hercules,CA)中，并且然后用透明的qPCR膜(Sorenson,Salt Lake City,UT)覆盖。然后，可以使水凝胶在室温(21℃)聚合5-15分钟(步骤54)，并且然后在PCR仪(MJ ResearchPTC-100)或小型干浴器(Benchmark,Edison,NJ)上在约65℃孵育25-60分钟之间，例如25分钟(步骤55)。
扩增后，然后可以任选地用0.5×LAMP染料(包括在LAMP试剂盒中)在黑暗中对凝胶混合物染色15分钟，并且然后用2×TE缓冲液(pH＝7.8)洗涤两次。对于使用互补荧光探针和猝灭引物的反应(如下所述)，反应后染色不是必要的。
在步骤56中，视觉确定聚合的混合物中存在或不存在扩增产物(例如扩增子)。为此，可以用E-GelTM安全成像仪(Invitrogen,Carlsbad,CA)对载玻片进行照射，并且用智能手机(例如，iPhone 6s plus或类似的智能手机)记录扩增子点。可选地，可以使用荧光显微镜(例如，Leica DMi8,Leica Co.,Germany)对载玻片进行可视化。
为了证明测定系统10和方法50的功效，制备模型大肠杆菌噬菌体。选择大肠杆菌噬菌体MS2(ATCC 15597-B1)作为方法开发的模型病毒。对于噬菌体繁殖，将0.1mL(107PFU/mL)的MS2接种到20mL的在LB(Luria-Bertani)培养基中的活跃生长的大肠杆菌-3000(ATCC15597)宿主悬浮液中。将感染的细菌在37℃连续通气36小时。然后将结合过宿主的MS2悬浮液以3,000×g离心10分钟以使细菌细胞和碎片沉淀。使含有MS2病毒体的上清液通过0.2μm注射器过滤器(GE Whatman,Pittsburgh,PA)进一步纯化。将滤液在1×PBS(pH＝7.5)中稀释1,000×，并用作接种研究(seeding study)的MS2储备液。MS2储备液的浓度通过琼脂双层法滴定。按照制造商的方案，使用AllPrep PowerViral DNA/RNA试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)进行MS2 RNA提取。
在使用聚丙烯酰胺凝胶的gLAMP测定的实施方案中，澄清的聚丙烯酰胺凝胶可以在10-15分钟内相对快速地形成。在使用PEG凝胶的gLAMP测定的实施方案中，PEG凝胶的形成通常可以更快，在碱性pH(LAMP反应混合物的pH可以为约8.8)仅需要3-5分钟。这两种类型的凝胶通常都不显示荧光背景，并且在任一情况下均可以成功进行gLAMP测定(参见图3)。
图3是示出了由环境水的某些实验性gLAMP测试产生的示例性扩增子点谱的摄影图像。图3的照片A和B示出了在使用聚丙烯酰胺水凝胶的测定实验期间的扩增子点。图3的照片C-F示出了在使用PEG水凝胶的测定实验期间的扩增子点。在照片A-D中，扩增子在孵育后用0.5×LAMP染料染色，并且在照片E-F中使用QUASR引物而不进行反应后染色。照片A、C、E由荧光显微镜拍摄，并且照片B、D、F由iPhone 6S Plus拍摄。图像的测定反应时间为25分钟。
当扩增子点的尺寸小于20μm(直径)时，其检测可能需要荧光显微镜。为了便于用智能手机摄像头读取结果，同时仍然维持实际的测定动态范围，可以使用50-200μm的点尺寸。扩增子点的尺寸可能主要由凝胶基质的限制作用决定。
在测定的一些实施方案中，可以形成允许小分子(MW<100kDa)，诸如水、离子、引物(<50bp,MW<15kD)和酶(Bst＝67kDa)的自由扩散，但限制DNA/RNA模板/扩增子(>150bp,MW>100kDa)的扩散的凝胶基质。这可以通过操纵凝胶交联度来调节关键参数，诸如交联剂之间的网孔尺寸和分子量，以便改变宏观特性(即扩散)来实现。先前的研究已经发现，在聚丙烯酰胺水凝胶中，514bp、234bp和120bp模板分别产生100μm、400μm和800μm的均匀PCR扩增子点。应该注意的是，与单一长度PCR扩增子不同，LAMP的产物是具有不同尺寸的靶区多联体的混合物。基于琼脂糖凝胶电泳图谱，最短的MS2 LAMP扩增子可以为约90bp，而最长的扩增子可以多达几千个bp。在gLAMP测定期间，较长的扩增子可能被水凝胶滞留，但较短的扩增子可以从初始模板(点的中心)扩散开，并用作进一步扩增的模板，直到它们达到扩散极限或其附近的LAMP试剂(例如，酶、引物、dNTP)被耗尽。由于LAMP的随机性质，在水凝胶中可以产生不同尺寸的点。
聚丙烯酰胺和PEG水凝胶的网孔尺寸可以相似，并且在20-25nm的范围内。然而，PEG凝胶中的扩增子点(例如，参见图3，照片C)可能比聚丙烯酰胺凝胶中形成的扩增子点(图3，照片A)更小且更均匀。因此，PEG凝胶可能对较小的扩增子具有更好的限制。因此，除了尺寸排阻，聚合物与DNA模板之间的其他相互作用(即电荷相互作用)也可以影响扩散系数。
清晰的扩增子点谱可以通过用例如嵌入性LAMP染料的反应后凝胶染色来获得(图3照片A、B)。这突出显示了通过gLAMP技术将针对其他微生物(例如，大肠杆菌、肠球菌和沙门氏菌)的传统的定性LAMP测定调整成定量测定的可行性。
在一些实施方案中，正常的LAMP引物可以用于对gLAMP混合物进行反应后染色。参考图7，F3/B3、FIP/BIP和LF/LB的最终浓度可以分别为0.2μM、1.6μM和0.4μM。
在gLAMP测定的另一个实施方案中，引物-染料/引物-猝灭剂双链体，也称为QUASR(将未掺入的扩增信号报告物猝灭)，可以用于标记扩增产物，而不需要进行反应后染色。在QUASR中，正向内部引物(FIP)在5’引物端处被荧光团标记(5’FAM-FIP)。探针被在3’引物端处具有猝灭剂(Iowa FQ)的互补引物(qFIP-3’IBFQ)猝灭。由于复合体的解链温度(Tm)比反应温度(65℃)低5-10℃，因此在LAMP反应期间，5’FAM-FIP被释放，并且其表现得类似于常规FIP。当样品中存在靶模板时，5’FAM-FIP被掺入到LAMP扩增子中。反应后，自由流动的5’FAM-FIP被互补的猝灭引物qFIP-3’IBFQ再次猝灭。相比之下，掺入到LAMP扩增子中的5’FAM-FIP将不会被猝灭，因为它们已经在LAMP反应期间形成稳定的双链DNA结构。
对于QUASR探针，荧光团(FAM)可以在5’端处附接到FIP；猝灭剂IBFQ可以在3’端处附接到猝灭探针qFIP。IBFQ可以是lowa FQ(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)，其具有范围从420nm到620nm的宽吸收光谱，峰值吸收在531nm处。该猝灭剂可以与荧光素和在绿色到粉色光谱范围发射的其他荧光染料一起使用。在QUASR gLAMP中，FIP(图7)可以被5'FAM-FIP替换，并且2×qFIP-3'IBFQ(3.2μM)可以被添加到反应混合物中。
与非特异性DNA嵌入染料(即LAMP染料)相比，QUASR显著降低与LAMP测定相关的假阳性的问题。然而，QUASR不能转化为实时LAMP方案的定量测定，因为反应混合物的荧光强度不是在热孵育期间逐渐增加，而是始终处于最高水平(所有的5'FAM-FIP被释放)。因此，QUASR仅能用作终点确定的定性测定。
在gLAMP测定的一些实施方案中，可以使用更高浓度的猝灭引物(2×的互补探针引物)以在gLAMP反应结束时维持干净的凝胶背景。PEG凝胶可以允许染料标记的短寡核苷酸自由移动，即使凝胶中的扩散系数可能比溶液中的扩散系数小。由于5’FAM-FIP被掺入到扩增子中，并积累在初始模板周围，因此在蓝光暴露后，明亮且轮廓分明的扩增子点可以直接用智能手机摄像头可视化。
图4A-4B是示例性实验结果的图，示出了反应时间和模板浓度对示例性gLAMP方法的QUASR扩增子点结果的影响。gLAMP测定实验使用提取的MS2病毒RNA进行。这些图示出了左侧扩增子点直径的箱式图。根据单因素ANOVA接着Tukey事后检验，不同的字母(a、b、c)指示在p，0.05水平处的显著差异。对于图4A的图，模板浓度如下地定义：低＝1-20个拷贝/凝胶，中等＝20-200个拷贝/凝胶，且高＝200-2000个拷贝/凝胶。图4A的图使用中等模板浓度，且图4B的图的反应时间为25分钟。提取的MS2 RNA用作样品中的模板。
实验结果显示，早在20分钟就能在荧光显微镜下看到扩增子点(图4A)。25min后，点发展到约156±33μm(直径)，并且荧光强度强至足以用智能手机摄像头检测到(图3)。尽管扩增子点的尺寸保持增长，并在30分钟后达到212±50μm，但点计数保持与25分钟时的点计数相似。因此，对于示例性MS2 gLAMP测定，25分钟可能是期望的反应时间。扩增子点尺寸在低模板浓度(1-20个拷贝/凝胶)和中等模板浓度(20-200个拷贝/凝胶)未显示显著差异(图4B)。在这些条件下，扩增子点彼此相对远离，并且具有有限的相互作用。点尺寸代表扩增子在给定反应时间内可以发展的最大尺寸，而单个凝胶中的尺寸可变性可以由可变的初始模板构象、模板变性的程度或水凝胶结构的局部不均一性(由于大分子单体(macromer)的自由悬垂末端、自身成环(self-looping)或缠结)造成。相比之下，在高浓度(200-2000个拷贝/凝胶)的扩增子点的尺寸明显小于在低浓度和中等浓度形成的扩增子点的尺寸(图4B)。较高模板浓度下的较小的扩增子尺寸可能是由于整体自抑制造成的，特别是由于pH的下降造成的。酶、引物和dNTP的局部竞争也可能有所贡献，因为在彼此接近的扩增子之间显现了清晰的分离。在较高模板浓度显现的较小的扩增子尺寸加分界(watershed)因提高了荧光点的可识别性而对测定的动态范围有利。对于智能手机摄像头读取，测定的动态范围可以为1-1000个点/凝胶。当使用荧光显微镜读取结果时，每个凝胶可以容纳多达5000个点，而不损害精确度。
在gLAMP测定的一些实施方案中，可以使用手动扩增子计数。在gLAMP测定的其他实施方案中，显微镜和智能手机图像的自动扩增子分析可以由自动扩增子计数器，诸如CellProfiler 2.2.0进行。通过适当的阈值设置，自动计数与手动计数之间的差异可以小于5％。
在gLAMP测定的一些实施方案中，可以在LAMP反应前对样品进行核酸提取和纯化。在qPCR测定中，通常需要提取和纯化核酸以改进检测。许多商业提取试剂盒已经优化了程序，为下游qPCR分析提供了高质量的DNA/RNA，并且这些试剂盒可以与gLAMP技术一起使用。然而，这个过程占用30-90分钟，并且这些试剂盒相对昂贵。
在gLAMP测定的其他实施方案中，可以在LAMP反应前对样品进行加热预处理。在gLAMP测定的一些实施方案中，在未处理的样品中实现了病毒颗粒的直接检测，而无需在先的核酸提取或预热处理。
图5A-5B是示例性实验结果的图，示出了某些样品预处理对gLAMP方法的实例的影响(图5A)和gLAMP方法的实例与常规空斑测定之间的计数比较(图5B)。
参考图5A，该图示出了采用多种样品预处理时gLAMP方法的实验结果。在图5A的图中，病毒体是指不经样品预处理直接检测病毒颗粒；加热表示样品被预热到95℃持续5分钟进行变性；并且提取的RNA表示使用商业可得的AllPrep Power Viral DNA/RNA试剂盒对提取的RNA预处理。这些实验在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行；因此，提取试剂盒的作用仅仅是释放病毒RNA。纯化作用是有限的，因为预期缓冲系统中抑制剂的浓度非常低。图5A显示，直接gLAMP测定(未经样品预处理)获得了与加热预处理gLAMP测定和使用用商业病毒RNA提取试剂盒预处理的样品的gLAMP测定相比相似的扩增子计数。在扩增子点尺寸和荧光强度方面，在这些处理之间未发现显著差异。先前报道了简单的加热预处理提高LAMP测定中的细菌检测，因为受损的细胞膜对LAMP试剂是更易穿透的，而变性的DNA可以促进Bst酶的链置换活性。然而，呈现的结果表明，LAMP引物和酶(RTx逆转录酶和Bst 2.0DNA聚合酶)在反应温度(65℃)能够穿透病毒衣壳，并且变性加热步骤可能不必要，因为与细菌基因组相比，病毒基因组小得多。
为了评估直接gLAMP的灵敏度，可以将其与传统的空斑测定和RT-qPCR进行比较(如由图5B的图示出的)。直接gLAMP测定扩增子计数显示与空斑测定计数的良好相关性(R2＝0.984,p<0.05)。回归线(斜率＝1.036，截距＝-0.290)表示1个凝胶扩增子点接近等于(closely equal to)1个空斑形成单位(PFU)。直接gLAMP测定达到与RT-qPCR的检测下限(0.4PFU/反应)相比相似的检测下限(0.7PFU/反应)，而RT-qPCR仍然显示出更大的检测上限的优势。将测定灵敏度和动态范围与使用Eppendorf RealPlex2(Hamburg,Germany)的RT-qPCR进行比较。
gLAMP测定的动态范围可以通过降低扩增子点尺寸来增加。在单个凝胶中容纳更多扩增子点对于诸如突变检测和凝胶内测序的应用可能是期望的。然而，区分扩增子点与其他污染性荧光信号(污染性DNA/RNA片段或颗粒)的能力在点尺寸小时可能会受到影响。因此，在低浓度(<20个拷贝/反应)的精确度会受损。出于环境监测目的，水样品中MS2的浓度很少超过所公开的gLAMP测定的检测上限(106PFU/mL)。此外，高浓度样品可以被容易地稀释。事实上，从大体积水样品(例如，地下水)浓缩少量MS2更富挑战性。因此，在低浓度维持精确度对于所公开的gLAMP测定而言可能是有价值的。
图6A-6C是用于处理某些环境水样品的示例性直接gLAMP测定的示例性实验结果的图。酶驱动的核酸扩增过程易受环境样品中常见的多种抑制性物质(例如，有机质和重金属)的影响。直接gLAMP测定的实例使用以下进行测试：黄棕色的并且具有的化学需氧量(COD)水平为821mg/L的厕所废水，代表高度污染的水；澄清且污染较少(COD＝75mg/L)的池水；和PBS对照。在两种掺入MS2的环境水样品(厕所水和池水)中成功进行了直接gLAMP测定。在扩增子点计数(p>0.05)(图6A)以及点形态方面，与在PBS缓冲液中的对照实验相比，未观察到显著差异。相比之下，在池水的gLAMP测定中观察到轻微抑制，因为检测时间从PBS中的23min延迟到池水中的27min。通常，对于处理复杂的样品，LAMP测定具有比PCR更稳健的化学，因为：(1)与PCR中的两个引物相比，LAMP测定采用六个引物来启动扩增，(2)LAMP中使用的较小的67kDa Bst聚合酶可能比PCR中使用的94kDa Taq DNA聚合酶更容易进入靶细胞/病毒颗粒，以及(3)LAMP的产量(10-20μg/反应)是PCR的产量(0.2μg/反应)的约50-100倍高。然而，一些已知的LAMP测定是定性的或半定量的。使用粗样品可能不损害检测下限(仍可检测)，但其通常会导致检测时间增加或反应结束时的信噪比降低。
厕所废水中类腐殖质的(humic-like)溶解性有机质(DOM)的浓度可能是池水中的浓度的10-15倍高。厕所废水也可能还含有低水平的蛋白质物质，并且厕所废水中的抑制剂可能是有机来源的，与尿液和粪便样品中存在的那些相似。已知尿液样品中存在的尿素阻止聚合酶的非共价结合并干扰引物退火。LAMP对尿素的耐受性被报道为高达1.8M。取决于营养、肠道菌群和生活方式，来源于粪便的抑制剂是高度可变的。尤其是粪便样品中存在的复杂多糖、胆盐、脂质和尿酸盐造成了对PCR的抑制。抑制机制复杂，包括与聚合酶的结合(复杂多糖、胆盐)、与模板的竞争(胆红素)和对扩增辅因子Mg2+的螯合(植酸)。
当与PCR方法相比时，gLAMP测定在厕所废水中的表现更好，可能归因于凝胶基质可能在对厕所废水中的抑制剂的增强的耐受性方面具有更重要的作用。首先，与数字PCR相似，gLAMP测定是一种通过对最终扩增产物进行计数的终点扩增检测测定，因此，其定量较少受扩增效率影响。其次，由于在gLAMP测定中，DNA/RNA模板在空间上是分离的，所以在扩增期间，DNA/RNA分子与底物竞争之间的干扰可以被最小化。此外，取决于它们的分子量，大分子量有机抑制剂的移动可能受凝胶基质的限制，并且因此，接近模板的局部抑制剂的浓度可能降低。
本文公开的任何测定系统(例如系统10)或方法(例如方法50)可以用于有效检测和/或监测任何合适的样品(例如水或食物样品或生物样品)中的微生物，诸如病毒颗粒、病毒、细菌噬菌体、原生动物、细菌或前述物质的任何组合等。
实施例
模型大肠杆菌噬菌体MS2制备。选择大肠杆菌噬菌体MS2(ATCC15597-B1)作为方法开发的模型病毒。对于噬菌体繁殖，将0.1mL[107个空斑形成单位(PFU)/mL]的MS2接种到20mL的在LB培养基中的活跃生长的大肠杆菌-3000(ATCC 15597)宿主悬浮液中。将感染的细菌在37℃连续通气36h。然后将结合过宿主的MS2悬浮液以3000g离心10min以使细菌细胞和碎片沉淀。使含有MS2病毒体的上清液通过0.2μm注射器过滤器(GE Whatman,Pittsburgh,PA)进一步纯化。将滤液在1×PBS(pH 7.5)(Corning,New York,NY)中稀释1000×，并用作接种研究的MS2储备液。MS2储备液的浓度通过琼脂双层法(double-agarlayer method)滴定。按照制造商的方案，使用AllPrep PowerViral DNA/RNA试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)进行MS2 RNA提取。
gLAMP测定设计。将最初测试两种类型的水凝胶作为gLAMP的基质。聚丙烯酰胺(PA)凝胶通过使用0.05％(w/v)过硫酸铵(Bio-Rad，Hercules，CA)作为引发剂(initiator)并经由0.05％(w/v)四甲基乙二胺(TEMED)(Bio-Rad)催化丙烯酰胺与双丙烯酰胺(丙烯酰胺/双丙烯酰胺19:1)(BioRad,Hercules,CA)之间的交联而形成。PEG凝胶通过摩尔比为1:2的四臂PEG丙烯酸酯[分子量(MW)10000]与硫醇-PEG-硫醇(MW 3400；Laysan Bio,Arab,AL)之间的迈克尔加成而形成。在本研究中，使用并优化了最初由Ball等人开发的MS2 LAMP引物和探针。对于每个gLAMP测定(25μL)，优化的水凝胶反应混合物具有以下组成：10％(w/v)水凝胶、12.5μL 2×WarmStart LAMP主混合物(Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶和WarmStartRTx逆转录酶的共混物；New England Biolabs,Ipswich,MA)、1.25μL的20×病毒引物混合物(F3/B3、FIP/BIP和LF/LB的最终浓度分别为0.2μM、1.6μM和0.4μM)以及2μL的MS2 RNA模板或2μL水样品。对于使用互补荧光探针和猝灭引物的反应，当使用荧光团标记的引物(5’FAM-FIP)替代常规FIP引物时，添加猝灭引物(qFIP-3’IBFQ)(最终浓度3.2μM)。将上述25μL水凝胶反应混合物装载到玻璃载玻片上的原位PCR框架密封室(9×9mm；Bio-Rad)中，并且然后用透明的qPCR膜(Sorenson,Salt Lake City,UT)覆盖。使水凝胶在室温(21℃)聚合5-15min，并且然后在PCR仪(MJ Research PTC-100,Watertown,MA)上或小型干浴器(Benchmark,Edison,NJ)上在65℃孵育25min。扩增后，将凝胶用0.5×LAMP染料(包括在WarmStart LAMP试剂盒中)在黑暗中染色15min，并且然后用2×TE缓冲液(pH 7.8；Corning,New York,NY)洗涤两次。对于使用互补荧光探针和猝灭引物的反应，不需要反应后染色。用E-Gel安全成像仪(Invitrogen,Carlsbad,CA)对载玻片进行照射，并且用iPhone6s Plus记录扩增子点。为了验证智能手机检测系统的灵敏度，还使用荧光显微镜(LeicaDMi8；Leica Co.,Germany)对载玻片进行成像。
gLAMP测定优化。最初的gLAMP开发使用提取的MS2病毒RNA进行。进行测定以找到最佳染色策略(用LAMP染料或使用荧光探针进行反应后染色)、孵育时间(20min、25min和30min)和测定动态范围(低，1-20个拷贝/反应；中等，20-200个拷贝/反应；以及高，200-2000个拷贝/反应)。随后，为了简化RNA提取步骤，我们还探索了简单加热(95℃，5min)作为预处理程序或在不进行RNA提取的情况下直接检测MS2病毒颗粒。将测定灵敏度和动态范围与使用Eppendorf RealPlex2(Hamburg,Germany)的RT-qPCR进行比较。
gLAMP对环境水样品中存在的抑制剂的耐受性。总计测试三个环境水样品，以评估gLAMP对环境水中天然存在的抑制剂的耐受性。湖水(LW)收集自Echo Park Lake(LosAngeles,CA)，该湖主要用作城市雨水排放系统的滞洪区，同时提供游憩价值(recreational benefit)和野生动物栖息地。池水(PW)收集自加州理工学院(theCalifornia Institute of Technology)(Caltech)的Turtle Pond。废水(WW)收集自中试规模的太阳能供能的移动厕所系统的沉淀和储存槽，该系统也位于Caltech校园内。WW由尿液、粪便、和洗手水及冲厕水构成。关于厕所系统的设计和操作条件的更多细节已报道在先前的研究中(Huang等人，Wate Res.，92：164-172，2016；Cho等人Environ.Sci.Technol.，48(4)：2377-2384，2014)。表1总结了这些样品的基本水质参数。
表1：环境样品的水质参数：
湖水 池水 厕所废水 一级出水
pH 8.45 7.75 9.16 8.02
EC(mS/cm) 0.794 0.926 14.59 1.377
COD(mg/L) 60 74.7 821.3 1110
DOC(mg/L) 30 101 430 352
环境样品中的溶解性有机质(DOM)使用荧光光谱法(Shimadzu RF-6000，Kyoto，Japan)通过激发-发射矩阵(EEM)表征。校正的EEM由原始扫描(激发波长：250-550nm，5nm间隔；发射波长：300-600nm，2nm间隔)产生，并用于估计多种DOM组分。所有这些样品中的固有MS2(没有预浓缩)的浓度均低于空斑测定(1PFU/mL)和RT-qPCR(1个空斑形成单位/反应)的检测限值。因此，将纯的培养的MS2以2×103至2×104PFU/mL(相当于10-100个空斑形成单位/反应)的最终浓度掺入这些样品和PBS缓冲液溶液中。允许掺入的水样品平衡1h，然后在没有RNA提取的情况下用gLAMP、管内(in-tube)实时LAMP和RT-qPCR直接分析。掺入MS2的PBS用作对照，因为预期在这种缓冲液溶液中不存在抑制。通过将来自环境样品的结果与从PBS获得的结果进行比较来评估抑制作用：在gLAMP中，抑制被反映为环境样品中的荧光点计数少于PBS中的荧光点计数，而对于管内LAMP和qPCR，其分别显示为增加的检测时间(time-todetection)和更大的定量周期(Cq)值。
一级出水样品中MS2的检测。为了证明在未掺入的天然水中检测到MS2，从服务15万人的当地的污水处理厂收集了一级出水废水样品。用0.22μm注射器过滤器(GE Whatman，Pittsburgh，PA)过滤20mL水样品，以去除细菌和碎片，然后进一步分析。对于双层空斑测定，使用大肠杆菌Famp(ATCC 700891)作为细菌宿主来对F-特异性大肠杆菌噬菌体进行计数，而使用大肠杆菌C3000(ATCC 15597)进行总(体细胞和F-特异性)大肠杆菌噬菌体计数。使用Amicon Ultra-15离心过滤器(30KDa标称分子量限值)(Millipore,Burlington,MA)，将总计15mL的滤液进一步浓缩至150μL。使用AllPrep PowerViral DNA/RNA试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)从100μL浓缩物中提取病毒RNA，并且然后通过gLAMP和RT-qPCR进行分析。
凝胶选择。澄清的聚丙烯酰胺凝胶在10-15min内形成，而PEG凝胶的形成更快，在碱性pH(LAMP反应混合物的pH为8.8)需要3-5min。两种凝胶均不显示荧光背景，并且在任一情况下均成功进行gLAMP。实验表明，当扩增子点尺寸小于20μm(直径)时，检测将需要荧光显微镜。为了便于用智能手机摄像头读取结果，同时仍然维持实际的(practical)测定动态范围，在本研究中使用50μm至200μm之间的点尺寸。扩增子点的尺寸主要由凝胶基质的限制作用决定。理想地，凝胶基质应允许小分子(分子量(MW)<100kDa)，诸如水、离子、引物(<50bp，MW<15kDa)和酶(Bst:67kDa)的自由扩散，但限制DNA模板和RNA模板以及扩增子(>150bp，MW>100kDa)的移动。这可以通过调节凝胶交联度和交联剂的长度来控制凝胶网孔尺寸，并从而控制宏观凝胶特性(即扩散)来实现。应该注意的是，与单一长度PCR扩增子不同，LAMP的产物是具有不同尺寸的靶区多联体的混合物。基于琼脂糖凝胶电泳图谱，最短的MS2LAMP扩增子为约90bp，而最长的扩增子多达几千个碱基对。在gLAMP期间，较长的扩增子被水凝胶基质滞留，但较短的扩增子从初始模板(点的中心)扩散，并用作进一步扩增的模板，直到它们达到扩散极限或附近的LAMP试剂(例如，酶、引物和dNTP)被耗尽。由于LAMP的随机性质，在水凝胶中产生不同尺寸的点。根据先前研究，这2种水凝胶的网孔尺寸相似，并且在20-25nm的范围内。然而，PEG凝胶中的扩增子点比聚丙烯酰胺凝胶中形成的那些扩增子点明显更小且更均匀。结果显示，PEG凝胶对较小的扩增子具有更好的限制作用。因此，除了尺寸排阻，聚合物与DNA模板之间的其他相互作用(即电荷相互作用)也可以影响扩散系数。鉴于更好的模板限制作用，选择PEG水凝胶用于进一步的方法开发。
gLAMP扩增子染色策略。通过用嵌入性LAMP染料进行反应后凝胶染色，获得清晰的MS2扩增子点谱。在针对大肠杆菌和沙门氏菌的gLAMP测定中获得了相似的图谱。结果突出显示了通过gLAMP系统将已建立的定性LAMP测定转化为定量测定的可行性。然而，扩增后打开框架密封室并对凝胶染色会增加测定的额外的复杂性，并且可能导致扩增子对周围工作环境的污染。
为了开发不需要反应后染色的更简单的gLAMP，本研究采用并优化了引物-染料和引物-猝灭剂双链体(QUASR)。在QUASR中，正向内部引物(FIP)在5’引物端处被荧光团标记(5’FAM-FIP)。探针在3’引物端处具有猝灭剂(Iowa Black FQ)的互补引物(qFIP-3’IBFQ)猝灭。由于复合体的解链温度(Tm)比反应温度(65℃)低5-10℃，因此在LAMP反应期间，5’FAM-FIP被释放，并且表现得类似于常规FIP。当样品中存在靶模板时，5’FAM-FIP被掺入到LAMP扩增子中。反应后，额外的未掺入的5’FAMFIP被互补的猝灭引物qFIP-3’IBFQ再次猝灭。相比之下，掺入到LAMP扩增子中的5’FAM-FIP将不会被猝灭，因为它们在LAMP反应期间已经形成稳定的双链DNA结构。与非特异性DNA嵌入性染料(即LAMP染料)相比，QUASR显著降低了与LAMP测定相关的假阳性结果的问题。然而，QUASR不能转化为实时LAMP方案的定量测定，因为反应混合物的荧光强度始终处于最高水平(所有的5'FAM-FIP被释放)，而不是在热孵育期间逐渐增加。因此，QUASR仅能用作终点确定的定性测定。在初步实验中，该研究表明，QUASR引物不会降低gLAMP扩增效率，但是需要更高浓度的猝灭引物(2x的互补探针引物)以在gLAMP反应结束时维持澄清的凝胶背景。这些结果表明PEG凝胶允许染料标记的短寡核苷酸自由移动，即使凝胶基质中的扩散系数会比溶液中的扩散系数小。由于5’FAMFIP被掺入到扩增子中，并积累在初始模板周围，因此在蓝光暴露后，明亮且轮廓分明的扩增子点可以用智能手机摄像头直接可视化。因此，使用QUASR引物用于进一步的gLAMP优化。
gLAMP优化。早在20min就能在荧光显微镜下看到扩增子点。25min后，点发展到约156±33μm(直径)，并且荧光强度强至足以用智能手机摄像头检测到。尽管扩增子点的尺寸保持增长，并在30min后达到212±50μm，但点的数目保持与25min时的数目相似。因此，对于MS2 gLAMP，选择25min作为最佳反应时间。扩增子点尺寸在低模板浓度(1-20个拷贝/反应)和中等模板浓度(20-200个拷贝/反应)未显示显著差异。在这些条件下，扩增子点彼此远离，并且具有非常有限的相互作用。点尺寸代表扩增子在给定反应时间内可以发展的最大尺寸，而单个凝胶中的尺寸可变性可以由可变的初始模板构象、模板变性的程度或水凝胶结构中的局部不均一性(由于大分子单体的自由悬垂末端、自身成环或缠结)造成。相比之下，在高浓度(200-2000个拷贝/反应)的扩增子点的尺寸明显小于在低浓度和中等浓度形成的扩增子点的尺寸。在gLAMP中，存在对酶、引物和dNTP的局部竞争，因为在彼此接近的扩增子之间显现了清晰的分离。在较高模板浓度显现的较小的扩增子尺寸加上清晰的边界通过提高荧光点的可识别性而有利于测定的动态范围。对于智能手机摄像头读取，最佳测定动态范围为1-1000个点/反应。当使用荧光显微镜读取结果时，每个凝胶可以容纳多达5000个点，而不损害精确度。显微镜和智能手机图像的自动扩增子分析由CellProfiler 2.2.0实现。通过适当的阈值设置，自动计数与手动计数之间的差异小于5％。
对于基于核酸的检测方法，在使用点应用中优选简单的DNA和RNA提取程序。在对掺入MS2的PBS溶液的gLAMP分析中，粗制样品、简单加热(95℃，5min)预处理后的样品和用商业RNA提取试剂盒提取的样品在扩增子点计数、点尺寸和扩增子荧光强度方面未显示出显著差异。当前的结果指示LAMP引物和酶(RTx逆转录酶和Bst 2.0DNA聚合酶)能够在反应温度(65℃)穿透病毒衣壳，并且变性可能不是必需的，因为与细菌基因组相比，病毒基因组小得多。
为了评估直接gLAMP的灵敏度，将该方法与传统的空斑测定和RT-qPCR进行比较。gLAMP扩增子计数显示与空斑测定计数的良好相关性(R2＝0.984，p<0.05)。回归线(斜率为1.036，且截距为-0.290)表示1个凝胶扩增子点几乎等于1个PFU。gLAMP达到与RT-qPCR的检测下限(0.4个空斑形成单位/反应)相比相似的检测下限(0.7个空斑形成单位/反应)，而RT-qPCR仍然显示出更大检测上限的优势。如之前讨论的，通过降低扩增子点尺寸可以增加gLAMP的动态范围(1-1000个空斑形成单位/反应)。在单个凝胶中容纳更多扩增子点将是诸如突变检测和凝胶内测序的应用期望的。
对抑制剂的耐受性。酶驱动的核酸扩增过程易受环境样品中常见的多种抑制性物质(例如，有机质和重金属)的影响。WW是黄棕色的，并且具有821mg/L的化学需氧量(COD)水平，代表高度污染的水。LW和PW是澄清的，并且含有较少的有机污染物，COD水平分别为63mg/L和75mg/L。在所有掺入MS2的环境水样品(掺入水平为2×103至2×104PFU/mL，相当于10-100个空斑形成单位/反应)中在没有RNA提取的情况下成功进行了gLAMP测定。没有观察到抑制，因为在扩增子点计数(p>0.05)以及点形态方面，环境样品与PBS对照之间不存在显著差异。对于管内实时LAMP测定，在LW和PW中未见显著抑制(p>0.05)。然而，在WW中，6次管内实时LAMP测定中的4次被完全抑制，因为在反应结束时(60min)未观察到扩增。对于RT-qPCR，由于Cq超出检测下限(Cqmax＝40)，所以在WW中测定被完全抑制。通常，在处理复杂的粗样品方面，LAMP测定具有比PCR更稳健的化学，因为：(1)与PCR中的两个引物相比，LAMP测定采用六个引物来启动扩增，(2)较小的67kDa Bst聚合酶可以比PCR中使用的94kDa TaqDNA聚合酶更容易地进入靶细胞和病毒颗粒，以及(3)LAMP的产量(10-20微克/反应)是PCR的产量(0.2微克/反应)的约50-100倍高。
PW和WW的主要荧光DOM峰是与类腐殖质组分相关的C峰和M峰。WW中类腐殖质DOM的浓度是LW和PW中类腐殖质DOM的浓度的10-15倍高，这与COD和DOC数据是一致的。WW还含有低水平的蛋白质物质，如由B峰和T峰所代表的。考虑到WW的来源，抑制剂可能是有机来源的，与尿液和粪便样品中发现的那些相似。已知尿液样品中存在的尿素阻止聚合酶的非共价结合并干扰引物退火。在PCR中，尿素的抑制浓度低至50mM，而据报道LAMP对尿素的耐受性高达1.8M。尽管如此，gLAMP在WW中的更好的性能不能简单地归因于更稳健的LAMP化学。可能的是，凝胶基质在增强对WW中的抑制剂的耐受性方面发挥了更重要的作用。首先，与数字PCR相似，gLAMP是一种对最终扩增产物进行计数的终点扩增检测测定。因此，其定量不太受扩增效率影响。第二，因为DNA模板和RNA模板是空间分离的，扩增期间的底物竞争应该最小化。此外，取决于它们的分子量，大分子量有机抑制剂的移动将受到凝胶基质的限制，并且因此，靠近模板的局部抑制剂浓度被降低。
一级出水中的MS2。通过gLAMP成功地在从一级出水样品中提取的RNA中检测到MS2(7.8±7.7PFU/mL)。在RTqPCR中获得了相似的结果(1.13±0.98PFU/mL)，这确认了gLAMP测定的灵敏度和特异性。使用大肠杆菌C3000[(6.9±0.4)×103PFU/mL]和大肠杆菌Famp[(2.6±0.7)×103PFU/mL]作为宿主细胞的基于培养的空斑测定产生高得多的计数。该差异是因为基于培养的空斑测定中使用的细菌宿主对样品中含有的各种各样的大肠杆菌噬菌体敏感，而gLAMP和RT-qPCR测定对MS2是特异性的。
前述描述是说明性的并且不是限制性的。尽管已经描述了某些示例性实施方案，但鉴于前述教导，本领域普通技术人员将容易地想到涉及本发明的其他实施方案、组合和修改。因此，本发明将仅由所附权利要求来限制，所附权利要求覆盖当结合以上说明书和附图阅读时的公开的实施方案中的至少一些，以及所有其他这样的实施方案和修改。

Claims (28)

1.一种检测疑似含有靶微生物的样品中的所述靶微生物的非诊断方法，所述方法包括：
将环介导等温扩增(LAMP)试剂、聚乙二醇(PEG)水凝胶和所述样品合并以形成混合物，所述环介导等温扩增(LAMP)试剂包含多个引物，所述引物包括荧光团标记的引物，所述聚乙二醇(PEG)水凝胶以基于LAMP试剂和水凝胶的总量的10％(w/v)的浓度存在，所述水凝胶用于将所述靶微生物固定在所述混合物内；其中所述聚乙二醇(PEG)水凝胶通过摩尔比为1:2的具有10K的分子量(MW)的四臂PEG丙烯酸酯与具有3.4K的分子量(MW)硫醇-PEG-硫醇之间的迈克尔加成形成；并且其中对所述PEG水凝胶的交联进行调节以在所述PEG水凝胶中的交联剂之间形成预定的网孔尺寸和预定的分子量，所述PEG水凝胶限制所述靶微生物的DNA/RNA模板在所述PEG水凝胶内的扩散同时允许具有MW<100kDa的分子在所述PEG水凝胶内的自由扩散；
允许所述PEG水凝胶在预定温度在所述混合物中聚合预定时间段；
在所述PEG水凝胶聚合步骤后孵育所述混合物；和
检测所述混合物中是否存在所述靶微生物，检测由对所述靶微生物的DNA/RNA进行扩增的LAMP反应产生的一个或更多个扩增子的存在或不存在，其中所述扩增子的存在指示所述样品中存在所述靶微生物，而所述扩增子的不存在指示所述样品中不存在所述靶微生物。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
基于所述LAMP反应后检测到的存在的扩增子的数目对所述样品中的靶微生物浓度定量。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶微生物中的每一个对应一个扩增子。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述靶微生物是病毒、细菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、原生动物或细菌。
5.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
向所述混合物添加引物-染料和引物-猝灭剂双链体。
6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
用染料对所述混合物染色。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述检测包括：
将所述混合物放置在载玻片上；和
使用智能手机摄像头或荧光显微镜来视觉检测所述载玻片上存在或不存在扩增子。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：环境水、土壤、粪便、尿液、血液以及前述物质的任何组合。
9.一种检测疑似含有细菌噬菌体的样品中的所述细菌噬菌体的非诊断方法，所述方法包括：
将环介导等温扩增(LAMP)试剂、聚乙二醇(PEG)水凝胶和所述样品合并以形成混合物，所述环介导等温扩增(LAMP)试剂包含多个引物，所述引物包括荧光团标记的引物，所述聚乙二醇(PEG)水凝胶以基于LAMP试剂和水凝胶的总量的10％(w/v)的浓度存在，所述水凝胶用于将所述细菌噬菌体固定在所述混合物内；其中所述聚乙二醇(PEG)水凝胶通过摩尔比为1:2的具有10K的分子量(MW)的四臂PEG丙烯酸酯与具有3.4K的分子量(MW)硫醇-PEG-硫醇之间的迈克尔加成形成；并且其中对所述PEG水凝胶的交联进行调节以在所述PEG水凝胶中的交联剂之间形成预定的网孔尺寸和预定的分子量，所述PEG水凝胶限制所述细菌噬菌体的DNA/RNA模板在所述PEG水凝胶内的扩散同时允许具有MW<100kDa的分子在所述PEG水凝胶内的自由扩散；
允许所述PEG水凝胶在预定温度在所述混合物中聚合预定时间段；
在所述PEG水凝胶聚合步骤后孵育所述混合物；和
检测所述混合物中是否存在所述细菌噬菌体，检测由对所述细菌噬菌体的DNA/RNA进行扩增的LAMP反应产生的一个或更多个扩增子的存在或不存在，其中所述扩增子的存在指示所述样品中存在所述细菌噬菌体，而所述扩增子的不存在指示所述样品中不存在所述细菌噬菌体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述细菌噬菌体是感染大肠杆菌(Escherichiacoli)的大肠杆菌噬菌体MS2。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：环境水、土壤、粪便、尿液、血液以及前述物质的任何组合。
12.如权利要求9所述的方法，所述方法还包括：
向所述混合物添加引物-染料和引物-猝灭剂双链体。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述检测包括：
将所述混合物放置在载玻片上；和
使用手机摄像头或荧光显微镜来视觉检测所述载玻片上存在或不存在扩增子。
14.一种用于检测疑似含有靶微生物的样品中的所述靶微生物的系统，所述系统包括：
反应剂，所述反应剂包括环介导等温扩增(LAMP)试剂和所述反应剂的10％(w/v)的浓度的聚乙二醇(PEG)水凝胶，所述环介导等温扩增(LAMP)试剂包含多个引物，所述引物包括荧光团标记的引物，所述聚乙二醇水凝胶通过摩尔比为1:2的具有10K的分子量(MW)的四臂PEG丙烯酸酯与具有3.4K的分子量(MW)硫醇-PEG-硫醇之间的迈克尔加成形成；
其中对所述PEG水凝胶的交联进行调节以在所述PEG水凝胶中的交联剂之间形成PEG水凝胶的预定的网孔尺寸和预定的分子量，所述PEG水凝胶限制所述靶微生物的DNA/RNA模板在所述PEG水凝胶内的扩散同时允许具有MW<100kDa的分子在所述PEG水凝胶内的自由扩散；
室，所述室用于将所述反应剂和所述样品合并以形成混合物；
培养箱，所述培养箱被配置为加热所述混合物；
载玻片，所述载玻片被配置为接收所述混合物，以允许视觉检测所述混合物中是否存在所述靶微生物，视觉检测由对所述靶微生物的DNA/RNA进行扩增的LAMP反应产生的一个或更多个扩增子的存在或不存在，其中所述扩增子的存在指示所述样品中存在所述靶微生物，而所述扩增子的不存在指示所述样品中不存在所述靶微生物；和
照相机，所述照相机被配置为视觉检测所述载玻片上接收的所述混合物中的扩增子的存在或不存在。
15.如权利要求14所述的系统，其中所述引物包括引物-染料和引物-猝灭剂双链体。
16.环介导等温扩增(LAMP)试剂在制备用于检测疑似含有靶微生物的样品中的所述靶微生物的产品中的用途，其中当所述产品被使用时，
所述LAMP试剂、聚乙二醇(PEG)水凝胶和所述样品被合并以形成混合物，所述环介导等温扩增(LAMP)试剂包含多个引物，所述引物包括荧光团标记的引物，所述聚乙二醇(PEG)水凝胶以基于LAMP试剂和水凝胶的总量的10％(w/v)的浓度存在，所述水凝胶用于将所述靶微生物固定在所述混合物内；其中所述聚乙二醇(PEG)水凝胶通过摩尔比为1:2的具有10K的分子量(MW)的四臂PEG丙烯酸酯与具有3.4K的分子量(MW)硫醇-PEG-硫醇之间的迈克尔加成形成；并且其中对所述PEG水凝胶的交联进行调节以在所述PEG水凝胶中的交联剂之间形成预定的网孔尺寸和预定的分子量，所述PEG水凝胶限制所述靶微生物的DNA/RNA模板在所述PEG水凝胶内的扩散同时允许具有MW<100kDa的分子在所述PEG水凝胶内的自由扩散；
所述PEG水凝胶被允许在预定温度在所述混合物中聚合预定时间段；
所述混合物在所述PEG水凝胶聚合步骤后被孵育；和
所述混合物被检测其中是否存在所述靶微生物，由对所述靶微生物的DNA/RNA进行扩增的LAMP反应产生的一个或更多个扩增子的存在或不存在被检测，其中所述扩增子的存在指示所述样品中存在所述靶微生物，而所述扩增子的不存在指示所述样品中不存在所述靶微生物。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述样品中的靶微生物浓度基于所述LAMP反应后检测到的存在的扩增子的数目被定量。
18.如权利要求16所述的用途，其中所述靶微生物中的每一个对应一个扩增子。
19.如权利要求16所述的用途，其中所述靶微生物是病毒、细菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、原生动物或细菌。
20.如权利要求16所述的用途，其中引物-染料和引物-猝灭剂双链体被添加至所述混合物。
21.如权利要求16所述的用途，其中所述混合物被用染料染色。
22.如权利要求16所述的用途，其中所述检测包括：
将所述混合物放置在载玻片上；和
使用智能手机摄像头或荧光显微镜来视觉检测所述载玻片上存在或不存在扩增子。
23.如权利要求16所述的用途，其中所述样品选自由以下组成的组：环境水、土壤、粪便、尿液、血液以及前述物质的任何组合。
24.环介导等温扩增(LAMP)试剂在制备用于检测疑似含有细菌噬菌体的样品中的所述细菌噬菌体的产品中的用途，其中当所述产品被使用时，
所述LAMP试剂、聚乙二醇(PEG)水凝胶和所述样品被合并以形成混合物，所述环介导等温扩增(LAMP)试剂包含多个引物，所述引物包括荧光团标记的引物，所述聚乙二醇(PEG)水凝胶以基于LAMP试剂和水凝胶的总量的10％(w/v)的浓度存在，所述水凝胶用于将所述细菌噬菌体固定在所述混合物内；其中所述聚乙二醇(PEG)水凝胶通过摩尔比为1:2的具有10K的分子量(MW)的四臂PEG丙烯酸酯与具有3.4K的分子量(MW)硫醇-PEG-硫醇之间的迈克尔加成形成；并且其中对所述PEG水凝胶的交联进行调节以在所述PEG水凝胶中的交联剂之间形成预定的网孔尺寸和预定的分子量，所述PEG水凝胶限制所述细菌噬菌体的DNA/RNA模板在所述PEG水凝胶内的扩散同时允许具有MW<100kDa的分子在所述PEG水凝胶内的自由扩散；
所述PEG水凝胶被允许在预定温度在所述混合物中聚合预定时间段；
所述混合物在所述PEG水凝胶聚合步骤后被孵育；和
所述混合物被检测其中是否存在所述细菌噬菌体，由对所述细菌噬菌体的DNA/RNA进行扩增的LAMP反应产生的一个或更多个扩增子的存在或不存在被检测，其中所述扩增子的存在指示所述样品中存在所述细菌噬菌体，而所述扩增子的不存在指示所述样品中不存在所述细菌噬菌体。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述细菌噬菌体是感染大肠杆菌(Escherichiacoli)的大肠杆菌噬菌体MS2。
26.如权利要求24所述的用途，其中所述样品选自由以下组成的组：环境水、土壤、粪便、尿液、血液以及前述物质的任何组合。
27.如权利要求24所述的用途，其中引物-染料和引物-猝灭剂双链体被添加至所述混合物。
28.如权利要求24所述的用途，其中所述检测包括：
将所述混合物放置在载玻片上；和
使用手机摄像头或荧光显微镜来视觉检测所述载玻片上存在或不存在扩增子。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210012553A (ko) * 2019-07-25 2021-02-03 사회복지법인 삼성생명공익재단 표적 물질의 검출용 키트 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법
CN111172314B (zh) * 2020-02-21 2022-10-14 福建省农业科学院植物保护研究所 一种利用lamp检测三七黑斑病菌的方法
US11761031B2 (en) 2020-05-28 2023-09-19 The Hong Kong University Of Science And Technology Method for real time monitoring of nucleic acid amplicons mediated by loop oligonucleotide probes
WO2022029219A1 (en) * 2020-08-05 2022-02-10 C4Diagnostics Methods for rapid and sensitive detection of nucleic acids
CN112410405B (zh) * 2020-11-24 2022-03-25 浙江大学 一种复杂样品中细菌的快速检测方法
CN112695076A (zh) * 2021-02-05 2021-04-23 青岛农业大学 一种核酸恒温扩增定量检测方法
CN117143868B (zh) * 2023-10-30 2024-01-19 江苏美克医学技术有限公司 一种新生隐球菌检测引物组、试剂盒及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101724714A (zh) * 2009-12-30 2010-06-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010096202A2 (en) * 2009-02-23 2010-08-26 Georgetown University Sequence-specific detection of nucleotide sequences
RU2394915C2 (ru) * 2006-03-24 2010-07-20 Александр Борисович Четверин Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления
US20140220667A1 (en) * 2012-08-02 2014-08-07 Mohammadali Safavieh Device for pathogen detection
CN106103728A (zh) 2013-12-30 2016-11-09 米罗库鲁斯公司 检测和分析来自生物样品的微rna谱的系统、组合物和方法
US10179932B2 (en) * 2014-07-11 2019-01-15 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
US20190085417A1 (en) * 2015-12-18 2019-03-21 Lucence Diagnostics Pte Ltd Detection and Quantification of Target Nucleic Acid Sequence of a Microorganism
MA38729B1 (fr) * 2015-12-29 2018-04-30 Mascir Morrocan Foundation For Advanced Science Innovation & Res Kit de diagnostic de la tuberculose
US10889854B2 (en) * 2016-08-08 2021-01-12 Universiti Brunei Darussalam System and method for immobilization free electrochemiluminescence DNA detection using a luminophore dye for multi-species detection

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101724714A (zh) * 2009-12-30 2010-06-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Evaluation and comparison of loop-mediated isothermal amplification(LAMP),PCR and nested PCR for detection of Ehrlichia canis in naturally infected dogs;Vitor Pinhanelli et al.;《BMC Proc》;20141001;第1页 *
Loop-mediated isothermal amplification of a single DNA molecule in polyacrylamide gel-based microchamber;Liza Lam et al;《Biomed Microdevices》;20090326;摘要，第540页第2栏第1、3-4段，第541页第1栏第2段，图2、4、6，第542页第2栏第2-3段 *
多重荧光LAMP法在食源性致病菌风险监测中的应用;田浩等;《食品工程》;20170930;第23-27页 *

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