JPWO2002094880A1 - 抗ｔｒａｉｌ−ｒ抗体 - Google Patents

Abstract

以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２抗体又はその機能的断片：（ａ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現している癌細胞にアポトーシスを誘導する活性を有する、（ｂ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現しているヒト正常細胞には影響を及ぼさない、並びに（ｃ）ヒト肝臓細胞傷害を誘発しない。

Description

技術分野
本発明はアポトーシスに関与する細胞膜分子であるＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）又はＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）を認識する抗ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）抗体に関する。
さらに本発明は、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体を有効成分とする、ＴＲＡＩＬ−Ｒを発現している細胞に起因する疾患に対する予防又は治療剤、特に悪性腫瘍治療剤に関する。
背景技術
生体内において、正常な細胞交代のために生じる生理的な細胞死はアポトーシスと呼ばれ、病理的な細胞死である壊死（ネクローシス）とは区別される［Ｋｅｒｒ，ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２６，２３９参照］。アポトーシスは、胚発生やリンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞）の選択などの過程において一般に見られる現象である［Ｉｔｏｈ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ ６６，２３３−２４３参照］。アポトーシスにより本来排除されるべき細胞が排除されないと、それが癌、ループス、ヘルペスウイルス感染などの原因になることがあると考えられている。また、本来生存すべき細胞がアポトーシスにより排除されてしまうと、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、網膜色素変性症、再生不良性貧血、心筋梗塞、脳卒中、毒性物質による肝障害などの疾患や病態の原因となる場合がある［Ｋａｔａｏｋａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １，３９９−４０１参照］。
アポトーシスにおいては細胞表面の湾曲、核クロマチンの凝縮、染色体ＤＮＡの断片化、ミトコンドリアの機能梢滅等の現象が特徴的に観察される。内因性、外因性の様々なシグナルがこの様な細胞の変化を引き起こしていると考えられており、内因性のものとして、ｍｙｃ、ｂｃｌ−２などの癌遺伝子や、ｐ５３などの癌抑制遺伝子がアポトーシスの誘導に関わっていることが報告されている［片岡之郎ら（１９９３）実験医学１１，１７，２３２４−２３２８参照］。外因性シグナルとしては、化学療法剤や放射線などが、アポトーシスを誘導することが知られている［片岡之郎ら（１９９４）最新医学４９，６，１１５２−１１５７参照］。
このようなアポトーシスに関与する分子としては、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、Ｆａｓリガンドなどの腫瘍壊死因子ファミリー（ＴＮＦファミリー）に属する分子が同定されている。ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βは癌細胞にアポトーシスを誘導するとの報告がある［Ｓｃｈｍｉｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３，１８８１参照；Ｄｅａｌｔｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，６８９参照］。マウスのＦａｓ又はＦａｓリガンドの変異個体は自己免疫疾患の状態を呈することから、Ｆａｓリガンドが末梢における自己抗原反応性のリンパ球をアポトーシスにより排除する機能を担っていることが強く示唆されている［Ｋｒａｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒ，Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，２７９−２８９参照；Ｎａｇａｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７，１４４９−１４５６参照］。Ｆａｓに特異的に結合するアゴニスティックなマウスモノクローナル抗体は、癌細胞に対してＴＮＦ−αと同程度のアポトーシス誘導活性を示すことが報告されている［Ｙｏｎｅｈａｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９，１７４７−１７５６］。
これらのＴＮＦファミリー分子は、細胞表面の特異的受容体に結合することで細胞内にシグナルを伝達している。ＴＮＦファミリー分子の受容体は複数知られており、ＴＮＦレセプターファミリー分子と呼称される。
ＴＮＦレセプターファミリーの分子は、細胞外ドメインのシステインリッチ反復の存在により定義されるが、その中でもＦａｓリガンド及びＴＮＦ−αの受容体であるＦａｓ及びＴＮＦＲ１は、ショウジョウバエ自殺遺伝子ｒｅａｐｅｒ［Ｇｏｌｓｔｅｉｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ．８１，１８５−１８６参照；Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，６７７−６８３参照］と相同性を示す領域である「デスドメイン」と呼ばれるアポトーシスのシグナル伝達に必須の領域を細胞内に持つ。Ｆａｓの活性化は、デスドメインを含むアダプター分子ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１の会合を促し、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１に結合しているカスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）−８の活性化を引き起こす。活性化したカスパーゼ−８により下流のカスパーゼ分子群を順次活性化し、最終的に細胞をアポトーシスへと導く［Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８，３５５−３６５参照］。
最近、新規のアポトーシスを誘導するＴＮＦファミリー分子が発見された。Ｗｉｌｅｙら［Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９５）３，６７３−６８２参照］は、この分子を「ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド」又は簡潔に「ＴＲＡＩＬ」と命名した。この分子はまた、「Ａｐｏ−２リガンド」又は「Ａｐｏ−２Ｌ」とも呼ばれている［Ｐｉｔｔ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２６８７−１２６９０参照］。便宜上、この分子はＴＲＡＩＬとして本明細書中では呼ぶことにする。
Ｆａｓリガンドとは異なり、有意なレベルのＴＲＡＩＬは多くのヒトの組織中で検出される（例えば、脾臓、肺、前立腺、胸腺、卵巣、小腸、大腸、末梢血リンパ球、胎盤、腎臓）。そしていくつかの細胞株において恒常的に転写される。ＴＲＡＩＬは、Ｆａｓによる死のシグナル伝達に類似する時間枠内で、ＴＮＦ誘導性アポトーシスよりも非常に早くアポトーシスを急速に活性化させることも示されている。［Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，７５０−７５２参照］。
ＴＲＡＩＬの受容体として、現在すでに五つのタンパク質が同定されている。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４ともいう）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５ともいう）の二つの受容体は、ともにデスドメインを細胞内領域にもつことが報告されている。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１の転写産物は脾臓、末梢血白血球、小腸、胸腺を含むヒトの多くの組織中で認められる。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の転写産物は脾臓、末梢血リンパ球、卵巣をはじめとした、多くの組織中で確認されている［Ｐａｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６，１１１−１１３参照；Ｐａｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７，８１５−８１８参照；Ｗａｌｃｚａｋ，Ｈ．，ｅｔａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ １６（１７）５３８６−５３９７参照］。
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２には選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）による２つの形態があり、癌細胞においては４４０アミノ酸から成るＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現量が多いことが報告されている［Ｓｃｒｅａｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ７（９），６９３−６９６参照；Ａｒａｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １３３，１９７−２０４参照］。
組換え型ヒトＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬの細胞外領域からなる組換えタンパク質であり、これまでに多種類の癌細胞にアポトーシスを誘導することが報告されている［Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，５５９−５６３参照］。
さらに、組換え型ヒトＴＲＡＩＬは、ヒトの大腸癌細胞及び乳癌細胞を用いた担癌マウスモデルで効果を示している［Ｗａｌｃｚａｋ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，２，１５７−１６３参照］。同じくＴＮＦレセプターファミリーに属し、アポトーシス誘導活性を持つＴＮＦ−αやＦａｓリガンドとは異なり、ＴＲＡＩＬはマウス及びカニクイザルの正常組織に対して傷害を与えることはなかった［Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４，１５５−１６２参照］。
これらの報告により、ＴＲＡＩＬは腫瘍選択的に細胞死を誘導すると考えられたが、ＴＲＡＩＬの受容体は正常細胞にも発現しており選択性の理論的裏付けは未だなされていない。さらに、最近組換えヒトＴＲＡＩＬがヒト正常肝実質細胞にアポトーシスを誘導することが報告され［Ｊｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６，Ｎｏ．５，５６４−５６７参照］、また、ヒト脳細胞にもアポトーシスを誘導することが報告された［Ｎｉｔｓｃｈ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５６，８２７−８２８参照］。肝臓細胞にアポトーシスを誘導するアゴニスティックな抗Ｆａｓ抗体は、非常に短時間で劇症肝炎を誘発しマウスやチンパンジーを死に至らしめる事から、ＴＲＡＩＬの肝細胞に対する細胞死誘導は特に大きな問題として注目を浴び、ＴＲＡＩＬをヒトに対し医薬品として使用する場合の安全性に疑問が投げかけられた［Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６，５，５０２−５０３参照］。
ＴＲＡＩＬの肝細胞に対する細胞死誘導活性の有無は、組換えＴＲＡＩＬタンパク質の種類に依存しているとの報告も出されている［Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７，４，３８３−３８５参照］が、組換えＴＲＡＩＬタンパク質の安全性は未だ研究の途上である。
最近、マウスに投与した際に肝臓傷害を誘発しない抗Ｆａｓ抗体が初めて報告された［Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２，Ｎｏ．４，５５５−５６２参照］。肝臓傷害を誘発しないことが確認された組換え型Ｆａｓリガンドは知られていない。この事は、リガンドでは期待できない活性を持つ抗体を得ることが可能なことを示唆している。しかし、この抗体がＴ細胞にはアポトーシスを誘導するにもかかわらず、何故肝毒性を示さないのか理論的な背景は明らかになっておらず、例えばＴＲＡＩＬなど抗原が異なる場合に毒性のないアゴニスティック抗体を取得できるかどうかは定かではない。
ＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１若しくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２又はこれらの両方に作用してアポトーシスを誘導するが、ＴＲＡＩＬが肝細胞にアポトーシスを誘導する時どのレセプターを介してシグナルを入れるのかは明らかになっていない。また、アゴニスティック抗体にＴＲＡＩＬ−Ｒ１／Ｒ２選択性を付加することで肝毒性が回避できるかどうかという着想に立った研究は今だなされていない。
悪性腫瘍に対しては、癌細胞を除去し、正常組織又は細胞を保護することが有効な治療手段となる。組換え型ヒトＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘導を作用機序とする薬物では、癌細胞を除去できても正常組織、特に肝臓、脳に傷害を起こす可能性がある。
現在、細胞膜上に存在するレセプターであるＣＤ２０を標的としたキメラ抗体、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的としたヒト化抗体などのモノクローナル抗体が、悪性腫瘍を対象疾患として使用されており、その治療効果が認められている。抗体は、血中半減期が長く、抗原への特異性が高いという特徴を持ち、抗腫瘍剤として特に有用である。例えば、腫瘍特異的な抗原を標的とした抗体であれば、投与した抗体は腫瘍に集積することが推定されるので、補体依存的細胞傷害や抗体依存的細胞傷害による、免疫システムの癌細胞に対する攻撃が期待できる。また、その抗体に放射性核種や細胞毒性物質などの薬剤を結合しておくことにより、結合した薬剤を効率よく腫瘍部位に送達することが可能となり、同時に、非特異的な他組織への該薬剤到達量が減少することで、副作用の軽減も見込むことができる。腫瘍特異的抗原に細胞死を誘導するような活性がある場合はアゴニスティックな活性を持つ抗体を投与することで、また、腫瘍特異的抗原が細胞の増殖及び生存に関与する場合は中和活性を持つ抗体を投与することで、腫瘍特異的な抗体の集積と、抗体の活性による腫瘍の増殖抑制又は退縮が期待される。
抗体は、上記のようにその特徴から抗腫瘍剤として適用するのに適切であると考えられる。しかもＴＲＡＩＬの受容体に対する抗体であれば、組換え型ヒトＴＲＡＩＬ自体では回避できない肝臓への傷害を回避し、かつ、癌細胞に対しては同等のアポトーシス誘導活性をもつものが得られる可能性がある。
発明の開示
本発明の第１の目的は、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合でき、癌細胞に対して特異的にアポトーシスを誘導し、かつ、組換えヒトＴＲＡＩＬタンパク質では傷害を引き起こす可能性のあるヒト正常肝実質細胞に対して、傷害を誘発しない新規な抗体、又はそれに類似した分子を提供することにある。第２の目的は、上記抗体、又はそれに類似した分子を有効成分として含有する、現在治療困難な固形腫瘍をはじめとした各種悪性腫瘍の予防又は治療剤を提供することにある。
本発明者らは、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２に対する抗体の作製に関して鋭意研究した結果、遺伝子工学技術を用いてヒト由来の抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウスをヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１又はＲ２で免疫し、モノクローナル抗体の製造において慣用されているケーラー及びミルシュタインらの方法［（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５参照］を用いることにより、新規ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作出し、その培養上清より該モノクローナル抗体を取得する事に成功した。そして、この新規モノクローナル抗体は、癌細胞の表面にあるＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＲ２に結合して癌細胞特異的にアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する抗体又はその機能的断片。
上記抗体又はその機能的断片は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有するものである。
（ａ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現している癌細胞にアポトーシスを誘導する活性を有する
（ｂ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現しているヒト正常細胞には影響を及ぼさない
（ｃ）ヒト肝臓細胞傷害を誘発しない
本発明においては、上記の（ａ）〜（ｃ）の全ての性質を有する抗体又はその機能的断片が好ましい。また、上記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの性質を有する抗体又はその機能的断片であって、▲１▼ＴＲＡＩＬ−Ｒ２には結合するがＴＲＡＩＬ−Ｒ１には結合しないもの、あるいは▲２▼ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＴＲＡＩＬ−Ｒ１の両者に結合するものも、本発明の抗体又はその機能的断片に含まれる。
（２）上記抗体は、マウス−マウスハイブリドーマ、例えばＥ−１１−１３、Ｈ−４８−２、Ｌ−３０−１０、Ｎ−１８−１２、Ｗ−４０−５、Ｘ−１４−４、Ｘ−５１−１２、Ｆ−４−８、Ｇ−３−１０、０３０４又はＫＭＴＲ１により産生されるモノクローナル抗体であり、ヒト抗体であることが好ましい。Ｅ−１１−１３、Ｈ−４８−２、Ｌ−３０−１０、Ｎ−１８−１２、Ｗ−４０−５、Ｘ−１４−４、Ｘ−５１−１２、Ｆ−４−８、０３０４又はＫＭＴＲ１により産生されるモノクローナル抗体のタイプはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）型であり、Ｇ−３−１０により産生されるモノクローナル抗体のタイプはイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）型である。ここで、上記ハイブリドーマのうちＨ−４８−２、Ｅ−１１−１３、Ｆ−４−８、Ｌ−３０−１０、０３０４及びＫＭＴＲ１はそれぞれ国際寄託されており、その寄託情報は以下の通りである。

癌細胞としては、大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５、神経膠腫由来Ｕ２５１細胞又はＴ細胞リンパ腫由来Ｊｕｒｋａｔ細胞が挙げられ、これらの細胞の中から適宜選ばれる。
（３）本発明の抗体又はその機能的断片は、細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間の条件において、ヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が０．０１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２−１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０−１００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上（例えば１００μｇ／ｍｌ以上）である。一方、本発明の抗体又はその機能的断片は、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間の条件において、癌細胞（例えばＣｏｌｏ２０５細胞、Ｕ２５１細胞又はＪｕｒｋａｔ細胞）に対するＬＤ５０値が１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．７μｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは０．０２−０．１１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０２μｇ／ｍｌ以下である。そして、細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が２−１００μｇ／ｍｌであり、かつ、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値が０．０２−０．１１μｇ／ｍｌである組合せの抗体又はその機能的断片が本発明において特に好ましい。
ここで、本発明の抗体の上記肝細胞又は癌細胞に対するＬＤ５０は、１反応系あたり（１ウェルあたり）１１０〜１２０μｌの反応容量で行われたときの測定値である。
（４）また、本発明の抗体又はその機能的断片は、細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２，５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の２倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくば５０倍以上（例えば５０倍−１００倍）、さらに好ましくは１００倍以上（例えば１００倍−２５０倍）、さらに好ましくは２５０倍−１０００倍、最も好ましくは１０００倍以上である。
（５）さらに、本発明の抗体又はその機能的断片は、腫瘍（例えばヌードマウスに移植されたＣｏｌｏ２０５細胞に由来するもの）の増殖を抑制し、又は腫瘍を退縮させることができる。この場合、本発明の抗体又はその機能的断片を投与したときに腫瘍細胞の増殖を抑制することができる期間、又は腫瘍を退縮させることができる期間は少なくとも９日、好ましくは少なくとも１１日、さらに好ましくは少なくとも１３日であり、以下少なくとも３０日、少なくとも６０日の順で好ましく、最も好ましくは少なくとも１２０日である。また、腫瘍を担持する被検動物（例えば担癌実験動物、体重２０ｇとする）に本発明の抗体又はその機能的断片を投与する量は、０．１μｇ／ｂｏｄｙ（５μｇ／ｋｇ）〜１００μｇ／ｂｏｄｙ（５ｍｇ／ｋｇ）である。例えば、投与量として１００μｇ／ｂｏｄｙ又は５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０μｇ／ｂｏｄｙ又は１ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは４μｇ／ｂｏｄｙ又は２００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１μｇ／ｂｏｄｙ又は５０μｇ／ｋｇである。また、０．５μｇ／ｂｏｄｙ（２５μｇ／ｋｇ）を投与してもよい。投与頻度としては、１週あたり１回−３回の頻度又は隔日投与などが挙げられる。
さらに、担癌マウスにおける本発明の抗体（例えば０３０４抗体又はＥ−１１−１３抗体）又はその機能的断片の抗腫瘍効果は以下の通りである。
（ａ）１００ｍｍ^３の腫瘍を有する４〜６週齢の担癌マウスに２０μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与４日後に平均１４％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる。この場合、平均１４％以上の腫瘍の縮小を少なくとも７日維持することができる。
（ｂ）１００ｍｍ^３の腫瘍を有する４〜６週齢の担癌マウスに２０μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与４日後に平均６５％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる。
（ｃ）１００ｍｍ^３の腫瘍を有する４〜６週齢の担癌マウスに２０μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与７日後に平均８０％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる。この場合、平均８０％以上の腫瘍の縮小を少なくとも４日維持することができる。
（ｄ）１００ｍｍ^３の腫瘍を有する１２週齢の担癌マウスに２５μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与３日後に平均４５％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる。
（ｅ）１００ｍｍ^３の腫瘍を有する１２週齢の担癌マウスに２５μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与５日後に平均６５％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる。この場合、平均６５％以上の腫瘍の縮小を少なくとも２７日維持することができる。
（ｆ）３００ｍｍ^３の腫瘍を有する４〜６週齢の担癌マウスに２０μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与４日後に平均３９％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる。この場合、平均３９％以上の腫瘍の縮小を少なくとも１４日維持することができる。
腫瘍としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫及びウィルムス腫瘍等からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
（６）配列番号１７及び１９にそれぞれ示される、ハイブリドーマＥ−１１−１３の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２１及び２３にそれぞれ示される、ハイブリドーマＬ−３０−１０の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２５及び２７にそれぞれ示される、ハイブリドーマＨ−４８−２の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２９及び３１にそれぞれ示される、ハイブリドーマ０３０４の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は配列番号３３及び３５にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭＴＲ１の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
上記抗体又はその機能的断片は、例えば、配列番号１６及び１８にそれぞれ示される、ハイブリドーマＥ−１１−１３から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２０及び２２にそれぞれ示される、ハイブリドーマＬ−３０−１０から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２４及び２６にそれぞれ示される、ハイブリドーマＨ−４８−２から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２８及び３０にそれぞれ示される、ハイブリドーマ０３０４から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は配列番号３２及び３４にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭＴＲ１から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有するものである。
（７）Ｅ−１１−１３、Ｈ−４８−２、Ｌ−３０−１０、Ｎ−１８−１２、Ｗ−４０−５、Ｘ−１４−４、Ｘ−５１−１２、Ｆ−４−８ Ｇ−３−１０、０３０４及びＫＭＴＲ１からなる群から選ばれる、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（８）前記ハイブリドーマを培養し、得られる培養物からＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する抗体を採取することを特徴とする、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の製造方法。
（９）前記ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清又は宿主の分泌物から抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を採取することを特徴とする、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の製造方法。
宿主としては、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞並びに哺乳動物からなる群から選ばれるいずれかのものが挙げられる。
（１０）前記抗体又はその機能的断片を有効成分として含有する、腫瘍の予防又は治療剤。
ここで、腫瘍としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、丸癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫及びウィルムス腫瘍等からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００１−１５０２１３号（２００１年５月１８日出願）、日本国特許出願２００１−２４３０４０号（２００１年８月９日出願）及び日本国特許出願２００１−３１４４８９号（２００１年１０月１１日出願）の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体に、癌細胞に対してアポトーシスを誘導する活性があることは報告がなされている［Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，２５９７−２６０５参照；Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，４８９１−４８９８参照］。しかしながら、これらの抗体はマウス由来のものである。
また、組換えヒトＴＲＡＩＬタンパク質において問題となっている、ヒト正常肝実質細胞に対する傷害性について危惧される。
驚くべきことに、本発明の新規ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体は、ヒト正常組織由来の細胞に対してのみならず、組換えヒトＴＲＡＩＬタンパク質による細胞傷害性が危惧される正常肝実質細胞に対しても、傷害を誘発する副作用が無いことが判明した。本発明者らは、新規抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を取得することにより、安全性及び治療効果の向上の可能性という利点を備えた抗体を作製することに世界に先んじて初めて成功し、本発明を完成させた。該モノクローナル抗体は好ましくはヒト抗体であり、マウス由来の抗体では常に問題となる抗原性については、すでに回避されている。
該抗体としてはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、同Ａ（ＩｇＡ）、同Ｅ（ＩｇＥ）及び同Ｍ（ＩｇＭ）のいずれの型も好適に用いられうるが、通常はＩｇＧがより好適である。
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
１．ＴＲＡＩＬ及びその抗体
本発明の抗体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）の受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）に対する抗体であり、▲１▼ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に反応する抗体、▲２▼ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に反応する抗体、及び▲３▼ＴＲＡＩＬ−Ｒ１とＴＲＡＩＬ−Ｒ２の両者に反応する抗体が存在する。本発明では、▲１▼の抗体を「抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体」、▲２▼及び▲３▼の抗体を「抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体」ということもある。また、本明細書においてＴＲＡＩＬ−Ｒ１とＴＲＡＩＬ−Ｒ２の両方のＴＲＡＩＬ受容体を便宜的に合わせて説明する場合は、「ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２」ということもある。従って、例えば「ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２発現ベクター」のように記載した場合は（後述の実施例１参照）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１の発現ベクターと、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現ベクターの２つを説明することを意味する。
本発明における「抗体」とは、前記に定義したようなヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２又はその一部に反応性を有する抗体又は抗体の一部であり、これらの抗体の機能的断片も含む。「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を１つ以上保持するものを意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びこれらの重合体等が挙げられる（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８ Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）。
本発明で「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。
本発明の抗体としては、例えば、後述の実施例７に記載される、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の発現する癌細胞にアポトーシスを誘導する特性を有する各種の抗体、を挙げることができる。
本発明の抗体には、抗体を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなるモノクローナル抗体も包含される。本発明の抗体のアミノ酸配列中に、前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）を施すには、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することが方法として挙げられる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて定法により導入することができる（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，１９８４ Ｖｏｌ８１：５６６２）。ここで、抗体とは、イムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及び重鎖定常領域、並びに軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域を含む全ての領域が、イムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。
本発明の抗体には、いずれのイムノグロブリンクラス及びアイソタイプを有する抗体をも包含する。
本発明の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２抗体は、下記のような製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、前記で定義したようなヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２又はその一部と、抗原の抗原性を高めるための適当な物質（例えば、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ等）との結合物を、必要に応じて免疫賦活剤（フロインドの完全又は不完全アジュバント等）とともに、ヒト抗体産生トランスジェニックマウス等を含む非ヒト哺乳動物に免疫する。あるいは、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１をコードする遺伝子、又はヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２をコードする遺伝子を導入し、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を細胞表面に過剰に発現している動物細胞を投与することにより、免疫感作を行うことができる。モノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。
本発明の抗体は、当業者に周知である遺伝子工学的改変により異なるサブクラスのものに変換されたものも包含する。例えば、本発明の抗体のサブクラスをＩｇＧ２又はＩｇＧ４に変換することにより、Ｆｃレセプターに対する結合度の低い抗体を取得することができる。逆に、本件発明の抗体のサブクラスをＩｇＧ１又はＩｇＧ３に変換することにより、Ｆｃレセプターに対する結合度の高い抗体を取得することができる。さらに、本発明の抗体の定常領域のアミノ酸配列を人為的に改変すること、あるいはそのような配列を有する定常領域配列と結合することにより、Ｆｃレセプターに対する結合度を変化させることも可能である。また、本発明の抗体に、ヨード、イットリウム、インジウム、テクネチウム等の放射性核種（Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｍｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３ ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、緑膿菌毒素、ジフテリアトキシン、リシン等の細菌毒素、メトトレキセート、マイトマイシン、カリキアマイシン等の化学療法剤（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８ Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．；Ｍ．Ｌ．Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＢａｓｅｄＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．，１９９８ Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ）、さらに、Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ等のプロドラッグ（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９２ Ｖｏｌ．５２：１２７；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６ Ｖｏｌ．９３：８６８１）などを結合させることにより癌などの疾患の治療効果をさらに増強することも可能である。
また、発明者らは、本発明の抗体において、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合し、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１には結合しない性質を有するものに、ヒト肝臓細胞に傷害を誘発しないものが含まれることを発見した。従って、本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する抗体の集団から、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１には結合しないものを選抜する工程を含むことを特徴とする、肝細胞傷害性を有しない抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体の製造方法をも提供する。しかしながら、肝細胞傷害性を有しない本発明の抗体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合し、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１には結合しない性質を有するものに限定されるものではない。
本発明において、モノクローナル抗体の製造にあたっては、下記の作業工程を包含する。すなわち、（１）生体高分子の精製及び／又は抗原タンパク質を細胞表面に過剰に発現している細胞の作製（これらの生体高分子及び／又は細胞は免疫原として使用される）、（２）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓等の摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、（３）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、（４）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、（５）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（６）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、（７）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、（８）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性及びその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
以下、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
（１）抗原の精製
抗原としては、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の細胞外領域とヒトＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質（以下ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃという）を用いることができる。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１又はＲ２とヒトＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに組み込み、該発現ベクターを動物細胞に導入し、取得した形質転換株の培養上清から精製することにより取得できる。あるいは、ＡＬＥＸＩＳ社等から市販されているＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃを用いる事もできる。また、ヒト細胞株の細胞膜上に存在するＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２そのものを精製したものも、抗原として使用することができる。さらに、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の一次構造は公知である［Ｐａｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６，１１１−１１３及びＳｃｉｅｎｃｅ ２７７，８１５−８１８参照；Ｗａｌｃｚａｋ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ １６（１７）５３８６−５３９７参照］ので、当業者に周知の方法により、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２のアミノ酸配列からペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。
また、免疫原としては、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の全長から細胞内領域のデスドメイン及びデスドメインよりＣ末端側のアミノ酸を除いたヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２（以下「ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ」という）を有する発現ベクターｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ及びｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａをＬ９２９細胞に導入し、細胞表面にＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａを過剰に発現している細胞も有効である。ｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ及びｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａは、それぞれ、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａタンパク質をコードするＤＮＡ及びヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａタンパク質をコードするＤＮＡを、動物細胞用発現ベクターｐＥＦｎｅｏ［Ｏｈａｓｈｉ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１，１５８−１６２参照］に組み込むことにより作製できる。ただし、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２をコードするＤＮＡ、ベクター、宿主等はこれらに限定されない。
具体的には、ｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａでＬ９２９細胞を形質転換して得られた形質転換株を培養し、ｐＥＦｎｅｏベクターが挿入された細胞に獲得されるネオマイシン耐性の形質、及びヤギ抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）を用いたＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ発現の確認を指標に、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａをその細胞表面に過剰に発現しているＬ９２９細胞を作製することができる。
（２）抗体産生細胞の調製工程
（１）で得られた抗原と、フロインドの完全若しくは不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、ヒト由来の抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウスが最も好適に用いられるが、そのようなマウスは富塚らの文献［Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，２０００ Ｖｏｌ ９７：７２２］に記載されている。
マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射、足蹠注射などいずれでもよいが、皮下注射、腹腔内注射、足踏注射又は静脈内注射が好ましい。
免疫は、一回、又は、適当な間隔で（好ましくは３日間から１週間あるいは２週間間隔で）複数回繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を、後の細胞融合に用いることが好ましい。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下「ＲＩＡ法」という）、固相酵素免疫定量法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、及び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法がより好適である。
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製又は部分精製した組換えヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、一次抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２抗体を結合させる。さらに二次抗体として酵素標識されたヒト抗体に対する抗体を加えてヒト抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
（３）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることが出来るが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９（１９７６）］、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）［Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｈｏｒｉｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン及びウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地（例えば、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合当日に２×１０^７以上の細胞数を確保しておく。
（４）細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（３）で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単な、ポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順よりなる。
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＤＭＥＭ）、又はリン酸緩衝生理食塩液（以下「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液及びヒトインターロイキン−６（以下「ＩＬ−６」という）を含む正常培地（以下「ＨＡＴ培地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
（５）ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、及びミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法により抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２抗体価を測定する。ただし、ＥＬＩＳＡ用の抗原として上記融合タンパク質を用いる場合は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合する抗体を産生するクローンを選択しないように、該クローンを除外する操作が必要である。そのようなクローンの有無は、例えばヒトＩｇＧのＦｃ領域を抗原としたＥＬＩＳＡ等により確認することができる。
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。
（６）クローニング工程
（２）の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便であり、よく用いられる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
なお、本発明のヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の産生細胞であるマウス−マウスハイブリドーマＨ−４８−２は、平成１３年（２００１年）５月１８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託されている。国際寄託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７５９９である。また、ハイブリドーマＥ−１１−１３は受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７６９８として、ハイブリドーマＦ−４−８は受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７６９９として、ハイブリドーマＬ−３０−１０は受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７７００として、平成１３年（２００１年）８月８日付けで国際寄託されている。また、ハイブリドーマ０３０４は受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−８０３７として、ハイブリドーマＫＭＴＲ１は受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−８０３８として、平成１４年（２００２年）５月１０日付けで国際寄託されている。したがって、例えばマウス−マウスハイブリドーマを用いて抗体を調製する場合は、工程（６）までを省略して、以下に記載する工程（７）から抗体の調製を行うことができる。また、マウスの腹水中等でのインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
（７）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の予防又は治療剤を有効成分として含有する抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えばＢＡＬＢ／ｃ）若しくはＮｕ／Ｎｕマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明の予防又は治療剤を有効成分として含有する抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩキット；アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２に対して高い抗原特異性を有する。
（８）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。
一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
モノクローナル抗体の認識エピトープの同定は以下のようにして行なうことができる。まず、モノクローナル抗体の認識する分子の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いてその分子の様々な部分ペプチドを作成する方法、遺伝子組換え技術を用いて目的の部分ペプチドをコードするＤＮＡ配列を好適な発現プラスミドに組み込み、大腸菌等の宿主内外で生産する方法等があるが、上記目的のためには両者を組み合わせて用いるのが一般的である。例えば、抗原タンパク質のＣ末端又はＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製した後、それらに対するモノクローナル抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定する。
その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、又は該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、本発明の予防又は治療剤が有効成分として含有するモノクローナル抗体のそれらペプチドに対する結合性を調べるか、又は該モノクローナル抗体と抗原との結合に対するペプチドの競合阻害活性を調べることによりエピトープを限定する。多種のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット（例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等）を利用することもできる。
また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えば哺乳類細胞細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を調製することもできる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＭＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。
ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子を調製するには、モノクローナル抗体の軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域及び重鎖定常領域をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲ法等により調製する方法が採用される。プライマーは、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体遺伝子又はアミノ酸配列から設計したオリゴＤＮＡを、鋳型としてはハイブリドーマから調製したＤＮＡを使用することができる。これらのＤＮＡを１つの適当なベクターに組み込み、これを宿主に導入して発現させるか、あるいはこれらのＤＮＡをそれぞれ適当なベクターに組み込み、共発現させる。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、マイクロインジェクション法、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションやリポフェクション法を使用して遺伝子を導入する方法、核移植法などが挙げられる。
本発明において、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体は、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物、（ｃ）形質転換体の分泌物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養するには、使用する宿主に適した培地を用い、静置培養法、ローラーボトルによる培養法などが採用される。
培養後、目的タンパク質が菌体内又、は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより抗体を採取する。また、目的抗体が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる各種クロマトグラフィーを用いた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の抗体を単離精製することができる。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて、目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれた動物宿主、例えばトランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックヒツジ又はトランスジェニックブタを作製し、そのトランスジェニック動物から分泌されるミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，８３０−８３４）。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地、あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
（９）抗体の性質
本発明の抗体は下記のａ）乃至ｃ）の機能的特性を有し、それぞれの特性は例えば各項目に記載の方法により確認することができる：
ａ）ヒト癌細胞を培養し、本発明の抗体を培地に含有せしめた時の該細胞の生存率を調べた結果、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＲ２を発現している癌細胞にアポトーシスを誘導する活性を有する。
ｂ）ヒト正常組織由来細胞を培養し、本発明の抗体を培地に含有せしめた時の該細胞の生存率を調べた結果、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＲ２を発現している正常細胞には影響を及ぼさない。
ｃ）ヒト肝実質細胞を培養し、本発明の抗体を培地に含有せしめた時の該細胞の生存率を調べた結果、肝臓細胞傷害を誘発しない。
本発明の抗体のアポトーシス誘導活性は、ＬＤ５０値（所定の実験条件において、細胞の半分に死をもたらす抗体の濃度）を指標として表すことができる。ＬＤ５０値は、後述する実験条件において１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．７μｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは０．０２−０．１１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０２μｇ／ｍｌ以下である。
また、「正常細胞に影響を及ぼさない」又は「肝臓細胞傷害を誘発しない」とは、本発明の抗体の正常細胞（ヒト肝細胞）に対するアポトーシス誘導活性が顕著に高くないことを意味する。ＬＤ５０値を指標とした場合、後述する実験条件において０．０１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２−１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０−２４μｇ／ｍｌ、最も好ましくは２４μｇ／ｍｌ以上である。
本発明の抗体は、上記ａ）〜ｃ）のいずれかの活性を有するものであるが、好ましくは上記ａ）記載の活性、すなわち癌細胞に対してアポトーシスを誘導する活性と、上記ｂ）及びｃ）記載の活性、すなわち正常細胞、特に正常肝実質細胞には傷害を誘発しない活性とを併せ持つ、新規な特性を有する物質である。従って、本発明の抗体は悪性腫瘍に対する予防又は治療剤に含有させるための成分として有用である。
正常細胞又は癌細胞に対するアポトーシス誘導活性はＬＤ５０値を指標として表すことができる。本発明におけるＬＤ５０値は以下のように算出できる。正常細胞（例えばヒト肝細胞）又は癌細胞（例えばヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）を培養し、本発明の抗体を培地に添加し、一定時間経過後の該細胞の生存率をＭＴＴアッセイ（Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７０：２５７−２６８（１９８４））又はＬＤＨアッセイなどにより測定する。
生存率と添加された抗体の濃度をプロットしたグラフから、生存率５０％に相当する抗体濃度をＬＤ５０値とする。
ＬＤ５０値はグラフから読み取ることも、回帰計算によりグラフ曲線の式を求めることにより算出することもできる。
癌細胞Ｃｏｌｏ２０５に対する試験では、９６穴平底プレートの１穴あたり１００μｌの培地に２．５ｘ１０^３の細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養し、抗体を翌日添加し、前記環境下に４８時間置いた後に細胞の生存率を測定した（反応液の全量：１１０〜１２０μｌ）。本発明においては、前記条件を「細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間」と記載する。
正常細胞（肝細胞）に対する試験では、９６穴平底プレートの１穴あたり１００μｌの培地に７．５ｘ１０^４の細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養し、抗体を翌日添加し、前記環境下に２４時間置いた後に細胞の生存率を測定した（反応液の全量：１１０〜１２０μｌ）。本発明においては、前記条件を「細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間」と記載する。
本発明の抗体には、上記の条件でＬＤ５０を測定したときに、正常細胞（ヒト肝細胞）に対してＬＤ５０値が例えば０．０１μｇ／ｍｌ（１０ｎｇ／ｍｌ）以上、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上の性質を有するものが含まれる。正常細胞に対するＬＤ５０は高いほど安全性が高いといえるため、２−１００μｇ／ｍｌのＬＤ５０値を有する抗体がさらに好ましい。また、本発明の抗体には、上記の条件でＬＤ５０を測定したときに、癌細胞に対してＬＤ５０値が例えば１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．７μｇ／ｍｌ以下の性質を有するものが含まれる。癌細胞に対するＬＤ５０は低いほど殺腫瘍細胞活性が強いといえるため、０．０２−０．１１μｇ／ｍｌのＬＤ５０を有するものがさらに好ましい。特に、本発明のＥ−１１−１３抗体、Ｌ−３０−１０抗体及びＫＭＴＲ１抗体は、そのヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が２−１００μｇ／ｍｌ以上（例えば２−２４μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌ）、かつ、癌細胞に対するＬＤ５０値が０．０２−０．１１μｇ／ｍｌの性質を有しており、正常細胞に対する安全性と腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導効果を併せ持っている。さらに驚くべきことに、本件発明の抗体は、マウス担癌モデルにおける腫瘍細胞の増殖を顕著に抑制した。
ここで、「細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間」の条件で測定したときの正常細胞に対するＬＤ５０値と、「細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間」の条件で測定したときの癌細胞に対するＬＤ５０値との比について検討してみる。前記の通り、正常細胞に対するＬＤ５０は高いほど安全性が高く、癌細胞に対するＬＤ５０は低いほど殺腫瘍細胞活性が強いため、正常細胞に対するＬＤ５０値は、癌細胞に対するＬＤ５０と比較して、その比は大きいほど有用であるといえる（安全性が高く、癌細胞に対するアポトーシス誘導活性が強い）。癌細胞に対する正常細胞のＬＤ５０の比（正常細胞に対するＬＤ５０が癌細胞に対するＬＤ５０の何倍あるか）をＮ／Ｃ比とすると、本発明の抗体は、Ｎ／Ｃ＝２以上、すなわち正常細胞に対するＬＤ５０が癌細胞に対するＬＤ５０の２倍以上の性質を有するものである。好ましくは、正常細胞に対するＬＤ５０が癌細胞に対するＬＤ５０の１０倍以上（Ｎ／Ｃ＝１０以上）、より好ましくはＮ／Ｃ＝１０−２５であり、以下、順に好ましい範囲がＮ／Ｃ＝５０、Ｎ／Ｃ＝５０以上、Ｎ／Ｃ＝５０から１００、Ｎ／Ｃ＝１００以上、Ｎ／Ｃ＝１００から１０００となり、さらに好ましくはＮ／Ｃ＝２５０から１０００であり、そして最も好ましくはＮ／Ｃ＝１０００以上である。
医薬組成物
本発明のヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２抗体の精製された製剤を含有する製剤もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。かかる予防又は治療剤は、種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ乃至１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ乃至１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
本発明の抗体又は医薬組成物は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２を発現している細胞に起因する可能性を有する種々の疾患又は症状の治療又は予防への適用が可能である。その疾患又は症状としては、各種悪性腫瘍が挙げられる。
腫瘍の種類は、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫又はウィルムス腫瘍等であり、本発明の抗体を適用する際の腫瘍は１種類に限られず、複数種類の腫瘍が併発したものでもよい。
製剤例
本発明の分子は、水又はそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液又は懸濁液のアンプルとして使用に供される。また、無菌粉末製剤（本発明の分子を凍結乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される態様のみに限定されるものではない。
実施例１ 抗原の調製
ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２が細胞膜上に過剰発現している細胞を得るため、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の全長アミノ酸から細胞内領域のデスドメイン及びデスドメインよりＣ末端側のアミノ酸を除いたヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２（以下「ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ」という）発現プラスミドベクターを作製した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａをコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法により作製した。
ａ）全長ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２発現ベクターの調製
鋳型ＰＣＲを行うにあたり、鋳型として用いたのは、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２である。ｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は以下の方法で作製された。完全長ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１ ＤＮＡ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２ ＤＮＡを、その５’末端にＥｃｏＲＩ配列を、その３’末端にＮｏｔＩ配列と終止コドンを付加する為のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い修飾した。ヒト胎盤由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１についてはプライマーとして：５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２）を、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２についてはプライマーとして：５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＡＴＴＡＣＣＴ−３’（配列番号４）を合成し、プラチナＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（ギブコ・ビーアールエル社製）を使用して、（９４℃、２０秒；６０℃、３０秒；６８℃、９０秒間）×３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。修飾されたＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２配列を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片として単離し、同一酵素で解裂されていたｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターに連結した。得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と命名した。ｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に組み込まれたＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、選択的スプライシングにより形成された２つの断片の中で、１３２０ｂｐのｃＤＮＡにコードされる４４０アミノ酸から成るものである。以下、実施例中のすべてのＰＣＲの反応温度調節は、ジーンアンプＰＣＲシステム９７００；（株）パーキンエルマー・ジャパン社製を使用した。
ｂ）ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ発現ベクターの調製
ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ発現ベクターを以下の方法にて調製した。１−３５１のアミノ酸配列を持つＴＲＡＩＬ−Ｒ１部分ペプチド、及び、１−３４８のアミノ酸配列を持つＴＲＡＩＬ−Ｒ２部分ペプチドからなる発現プラスミドを作製するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２部分ペプチドの５’末端にＥｃｏＲＩ配列、３’末端にＮｏｔＩ配列と終止コドンを付加する為のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１についてはオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＴＣＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＡ−３’（配列番号５）を、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２についてはオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＴＣＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＣＡＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号６）を、プラチナＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（ギブコビーアールエル社製）、及びｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を使用して、（９４℃、２０秒；６５℃、３０秒；及び６８℃、７５秒間）×２５サイクルの条件で行った。修飾されたＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の部分ペプチドを、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片として単離した。そしてこのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ酵素で解裂したｐＥＦｎｅｏベクターに連結した。得られたプラスミドをｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ及びｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａと命名した。
ｃ）ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ発現細胞の作製
ｂ）で作製したｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ及びｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ（ギブコビーアールエル社製）を用いて、Ｌ９２９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｏ．ＣＣＬ−１）に導入した。遺伝子導入はマニュアルの方法にて行った。細胞培養用フラスコ（培養面積７５ｃｍ^２）中で３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコビーアールエル社製）を１ｍｇ／ｍｌになるように加え、１週間培養した。次いで、ヤギ抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１ポリクローナル抗体及びヤギ抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）を用いたＦＡＣＳ解析を行い、遺伝子導入された細胞でＧ４１８耐性の形質を獲得したものは、３５１アミノ酸からなるＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ及び３４８アミノ酸からなるＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａを細胞膜表面上に発現していることを確認した。
ＰＣＲ用プライマー等のオリゴヌクレオチドの合成は、全てＤＮＡ自動合成機（モデル３９４８；（株）パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を用いて、そのマニュアルに従って行った［Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，３１８５−３１９１参照］。各オリゴヌクレオチドは合成終了後、支持体から開裂させ脱保護を行い、得られた溶液を乾固した後蒸留水に溶解し、使用するまで−２０℃で凍結保存した。
実施例２ ヒト抗体産生マウスの作製
免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製した。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告（Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，２０００ Ｖｏｌ９７：７２２）に記載されている。また、系統Ｂは内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（トランスジェニックマウス）であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６ Ｖｏｌ１４：８４５）に記載されている。
系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、あるいは系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られる子マウスを富塚らの報告（Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，２０００ Ｖｏｌ９７：７２２）に記載された方法で解析し、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される個体（ヒト抗体産生マウス）を選抜し（Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＩＢＣ’ｓ １１ｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０００；Ｉｓｈｉｄａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ＆Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ４，８５−９６（２００２））、以下の免疫実験に用いた。免疫実験には、上記マウスの遺伝的背景を改変したマウスなど（石田功（２００２）実験医学２０，６，８４６−８５１）も用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウスは、契約を結ぶことによって、麒麟麦酒株式会社より入手可能である。
実施例３ ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２に対するヒトモノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行１９９１）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２は、実施例１で調製したＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞、又はヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の細胞外領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とが融合したタンパク質を用いた。被免疫動物は、実施例２で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。
ヒトＴＲＡＩＬ−ＲＩに対するヒトモノクローナル抗体の調製を目的として、ヒト抗体産生マウスに、実施例１で作製したＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞（３×１０^６細胞／匹）を右足蹠に初回免疫した。初回免疫から以降、同細胞を左右足蹠交互に、３日間毎に１０回免疫した。さらに以下に述べる脾臓及びリンパ節の取得３日前に同細胞を両足蹠に免疫した。ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対するヒトモノクローナル抗体の調製を目的として、ヒト抗体産生マウスに、実施例１で作製したＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞（１×１０^７細胞／匹）を腹腔内に初回免疫した。初回免疫から以降、同細胞を腹腔内に、１週間毎に５回または６回免疫した。さらに以下に述べる脾臓の取得３日前に同細胞、またはヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２の細胞外領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とが融合したタンパク質を尾静脈に免疫した。また、ヒト抗体産生マウスにヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２の細胞外領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とが融合したタンパク質を完全フロイントアジュバンドと混合して皮下に初回免疫し、以降同タンパク質を不完全フロイントアジュバンドと混合して皮下に２週間毎に２回免疫し、さらに以下に述べる脾臓の取得３日前に同タンパク質を尾静脈に免疫した。
免疫されたマウスから脾臓及び／又はリンパ節を外科的に取得し、３５０ｍｇ／ｍｌ炭酸水素ナトリウム、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ培地（ギブコビーアールエル社製）（以下「無血清ＤＭＥＭ培地」という）１０ｍｌ中に入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつぶした。メッシュを通過した細胞懸濁掖を遠心して細胞を沈澱させた後、この細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄してから、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。一方、１０％ＦＣＳ（シグマ社製）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）（以下「血清入りＤＭＥＭ培地」という）にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０^８細胞／ｍｌを越えないように培養したミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）を同様に無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。回収した細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数５：１で混合し、遠心後、上清を完全に除去した。このペレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍｌを、ピペットの先でペレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地１ｍｌを２回に分けてゆっくり添加し、さらに７ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地を添加した。遠心後、上清を除去して得られた融合細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニングに供した。ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）とヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）（以下「ＨＡＴ」という。：シグマ社製）を含有するＤＭＥＭ培地中で培養することにより行った。さらに、１０％ＦＣＳとＨＴ（シグマ社製）とを含有するＤＭＥＭ培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。培養は、９６穴マイクロタイタープレート（ベクトンディッキンソン社製）中で行った。抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの選択（スクリーニング）及び各々のハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の特徴付けは、後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、あるいは癌細胞に対する細胞死誘導活性を測定することにより行った。
実施例４及び実施例５に述べるＥＬＩＳＡ、並びに実施例６で記載するＦＡＣＳ解析により、ヒト免疫グロブリンγ鎖（ｈＩｇγ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖κを有し、かつヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＲ２に特異的な反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する多数のハイブリドーマを得た。なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに実施例における試験結果として示した表又は図中においては、各々の本発明のヒト抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは記号を用いて命名した。
また、当該記号の前後に「抗体」を付したものは、それぞれのハイブリドーマにより産生される抗体、または当該ハイブリドーマから単離された抗体遺伝子（全長あるいは可変領域）を保持する宿主細胞により生産された組換え抗体を意味する。また文脈上明らかな範囲において、ハイブリドーマクローンの名称が抗体の名称をあらわす場合がある。以下のハイブリドーマクローンはシングルクローンを表す：１−１３、１−１８、１−３２、１−４０、１−４３、２−６、２−１１、２−１２、２−１８、２−４７、２−５２、３−１、３−７、３−１０、３−２３、３−３３、３−４２、３−５３、１−１３−６、１−３２−９、１−４０−４、１−４３−４３、２−６−４８、２−１１−５、２−１２−１０、２−４７−１１、２−５２−１２、３−１０−１９、３−２３−８、３−３３−７、３−４２−３、３−５３−１５、２−１８−２、３−１−７、Ｅ−１１、Ｅ−１４、Ｌ−３０、Ｎ−１８、Ｘ−１４、Ｅ−１１−１３、Ｅ−１４−４、Ｆ−４−２、Ｆ−４−８、Ｈ−４８−２、Ｌ−３０−１０、Ｎ−１８−１２、Ｗ−４０−５、Ｘ−１４−４、Ｘ−５１−４、Ｘ−５１−１２、Ａ−１１、Ｇ−３、Ｈ−３４、Ｉ−２２、Ｉ−３５、Ｊ−２１、Ｊ−２６、Ｋ−８、Ｋ−１６、Ｋ−５７、Ｌ−４、Ｐ−２８、Ｐ−３６、Ｗ−４２、Ｘ−１３、Ｘ−６０、Ｚ−２３、１−３９、Ａ−４−２７、Ａ−４−２９、Ｇ−３−１０、Ｈ−３４−２、Ｋ−５７−１２ Ｗ−４２−２、０３０４、０３２２、ＫＭＴＲ１及びＤ１Ｍ。それらのうちＨ−４８−２は、平成１３年（２００１年）５月１８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託した。国際寄託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７５９９である。また、Ｅ−１１−１３、Ｆ−４−８及びＬ−３０−１０は、平成１３年（２００１年）８月８日付けで上記寄託センターに国際寄託した。国際寄託番号は、Ｅ−１１−１３がＦＥＲＭ ＢＰ−７６９８であり、Ｆ−４−８がＦＥＲＭ ＢＰ−７６９９であり、Ｌ−３０−１０がＦＥＲＭ ＢＰ−７７００である。また、Ｅ−１１−１３、Ｆ−４−８およびＬ−３０−１０は、平成１３年（２００１年）１０月１１日付けで上記寄託センターに国際寄託した。国際寄託番号は、Ｅ−１１−１３がＦＥＲＭ ＢＰ−７７７０であり、Ｆ−４−８がＦＥＲＭ ＢＰ−７７６８であり、Ｌ−３０−１０がＦＥＲＭ ＢＰ−７７６９である。また、０３０４およびＫＭＴＲ１は、平成１４年（２００２年）５月１０日付けで上記寄託センターに国際寄託した。国際寄託番号は、０３０４がＦＥＲＭ ＢＰ−８０３７であり、ＫＭＴＲ１がＦＥＲＭ ＢＰ−８０３８である。
実施例４ ヒト免疫グロブリン軽鎖κ（Ｉｇκ）を有する、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体又はヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の検出
ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の細胞外領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とが融合したタンパク質（以下、それぞれ「ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ」、「ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃ」という。（ＡＬＥＸＩＳ社製。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃに関しては、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の細胞外領域として１−１８３アミノ酸からなるものも使用））を０．５μｇ／ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という。）に調製したものを５０μｌずつ、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ヌンク社製）の各ウェルに加え、室温で１時間あるいは４℃で一晩インキュベートし、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え、室温で３０分間インキュベートし、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃが結合していない部位をブロックした。このようにして、各ウェルをＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃでコーティングしたマイクロプレートを作製した。
各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、室温下で１時間反応させた後、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ヒトＩｇκ抗体（５０μｌ／ウェル、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を１０％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有ＰＢＳ−Ｔで２０００倍に希釈した溶液を、各ウェルに５０μｌ加え、室温下３０分インキュベートした。マイクロプレートを、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＴＭＢ発色基質液（ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μｌずつ加え、室温下で２０分間インキュベートした。各ウェルに０．５Ｍ硫酸（１００μｌ／ウェル）を加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００、コロナ電気社製）で測定した。また、ハイブリドーマ０３０４、０３２２、ＫＭＴＲ１及びＤ１Ｍの作製する抗体は、実施例１０に記載の方法を用いて取得した精製抗体により上記実験を行った。
その結果、得られた抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２抗体のうち一部の抗体の性質を表１及び表２に示す。表１は、取得したヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体のサブクラス及び交差反応性を示す表である。表２は、取得したヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体のサブクラス及び交差反応性を示す表である。

実施例５ 各モノクローナル抗体のサブクラス同定
実施例４と同様の方法により、各ウェルをＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃでコーティングしたマイクロプレートを作製した後に、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃをコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、実施例４で取得した各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、１時間反応させた後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで、各ウェルにそれぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヒツジ抗ヒトＩｇＧ１抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ２抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ３抗体又はヒツジ抗ヒトＩｇＧ４抗体（各２０００倍希釈、５０μｌ／ウェル、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社製）を加え、室温下で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、基質緩衝液（ＴＭＢ、１００μｌ／ウェル、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに加え、室温下で２０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍ硫酸（１００μｌ／ウェル）を加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。また、ハイブリドーマ０３０４、０３２２、ＫＭＴＲ１及びＤ１Ｍの作製する抗体は、実施例１０に記載の方法を用いて取得した精製抗体により上記実験を行った。その結果を前記表１及び表２に示す。
実施例６ ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２発現細胞に対する各モノクローナル抗体の反応試験
実施例１で調製したＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞に対する、実施例４で取得した各モノクローナル抗体の反応性の検討を、ＦＡＣＳ解析で行った。２×１０^６／ｍｌの濃度で、Ｌ９２９細胞、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞を、１％ウサギ血清入り、０．１％ＮａＮ_３、１％ＦＣＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に浮遊させた。細胞浮遊液（１００μｌ／ウェル）を９６穴丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分）した後、上清を除去し、実施例３で培養したハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加えて撹拌し、氷温下３０分間静置してから、遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分）して上清を除去した。ペレットを１００μｌ／ウェルのＳＢで２回洗浄した後、０．０１２５ｍｇ／ｍｌのＲＰＥ蛍光標識ウサギ抗ヒトＩｇκ Ｆ（ａｂ’）_２抗体（ＤＡＫＯ社製）３０μｌを加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、３００μｌのＳＢに懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。その結果、いずれの抗体もＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａ発現Ｌ９２９細胞にのみ強い結合活性を有し、Ｌ９２９細胞への結合活性は認められなかったことから、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２と特異的に結合する抗体であることがわかった。
実施例７ 癌細胞に対する細胞死誘導活性
実施例３または実施例４乃至実施例６から得られたヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体又はヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を用いて、大腸癌細胞であるＣｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２２２）に対する細胞死誘導活性を測定した。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で培養していたＣｏｌｏ２０５細胞を２．５×１０^４／ｍｌの濃度に調製し、各ウェル１００μｌずつを９６穴平底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養した後、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌ／ウェルで加え、さらに、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体又はヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体がＩｇＧの場合、終濃度５μｇ／ｍｌになるようにヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体（シグマ社製）を各ウェルに１０μｌずつ加えた。取得したハイブリドーマの一部について、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加しないウェルも作製した。陽性コントロールとして、ヒト組換えＴＲＡＩＬタンパク質（ＤＡＫＯ社製）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌで使用した。陰性コントロールとして、ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）を使用した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で４８時間培養した後、ＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱ_{ＵＥＯＵＳ} Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ：プロメガ社製）を説明書の方法に従い調製し、各ウェルに２０μｌずつ添加した。さらに３７℃、５．０％炭酸ガス下で２時間培養した後、波長４９０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（１４２０ ＡＲＶＯマルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定し、ミトコンドリアの還元能を指標として、細胞の生存率を算定した。各ウェルの細胞の生存率を、下記式により算出した：生存率（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）（式中、ａは被検ウエルの測定値を、ｂは無細胞ウエルの測定値を、ｃは陰性コントロールのウエルの測定値をそれぞれ表わす）。結果を図１〜３並びに表３及び４に示す。表３は、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清中の、Ｃｏｌｏ２０５及びヒト正常肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す表であり、表４は、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清中の、Ｃｏｌｏ２０５及びヒト正常肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す表である。

その結果、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体は、陰性コントロールと比較して明らかにＣｏｌｏ２０５細胞に細胞死を誘導する活性があることが明らかとなった。さらに、ＩｇＧである一部のヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体では、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体非存在下（ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体のクロスリンクが無い状態）においても細胞死を誘導する活性があることが示された。
実施例８ 正常細胞に対する細胞死誘導活性
実施例４乃至６から得られた、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を用いて、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞であるＨＵＶＥＣ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）に対する細胞死誘導活性を測定した。ＥＧＭ−２培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で培養していたＨＵＶＥＣ細胞を５×１０^４／ｍｌの濃度に調製し、各ウェル１００μｌずつを９６穴平底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養した後、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌ／ウェルで加え、さらに、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体又はヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体がＩｇＧの場合、終濃度５μｇ／ｍｌになるようにヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体（シグマ社製）を各ウェルに１０μｌずつ加えた。陰性コントロールとして、ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）を使用した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で４８時間培養した後、ＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱ_{ＵＥＯＵＳ} Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ：プロメガ社製）を説明書の方法に従い調製し、各ウェルに２０μｌずつ添加した。さらに３７℃、５．０％炭酸ガス下で２時間培養した後、波長４９０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（１４２０ ＡＲＶＯマルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定し、ミトコンドリアの還元能を指標として、細胞の生存率を算定した。各ウェルの細胞の生存率は実施例７と同様な式により算出した。
結果を図４に示す。ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体と陰性コントロールとの結果はほぼ同一となり、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体がＨＵＶＥＣ細胞に対して傷害性を示さないことが明らかとなった。
実施例９ ヒト正常肝実質細胞に対する細胞死誘導活性
実施例４乃至６から得られたヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を用いて、正常ヒト肝実質細胞Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ（以下「ＨＨ細胞」という）（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に対する細胞死誘導活性を測定した。まず凍結ＨＨ細胞を３７℃で融解し、ＣＭ５３００培地（ＣＥＤＲＡ社製）を用いて７．５×１０^５／ｍｌの濃度に調製した後に、各ウェル１００μｌずつをコラーゲンタイプＩがコートされている９６穴平底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で４．５時間培養した後、培地の交換を行った。さらに３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養し、再度培地の交換を行った。その後、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌ／ウェルで加え、さらに、終濃度５μｇ／ｍｌになるようにヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体（シグマ社製）を各ウェルに１０μｌずつ加えた。陰性コントロールとして、ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）を使用した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養した後、顕微鏡下でＨＨ細胞の形態的変化を観察した。その結果、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体と陰性コントロールとの結果はほぼ変わりないことから、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体がＨＨ細胞に対しても傷害性を示さないことが明らかとなった。
実施例１０ 各抗体の調製
実施例４または実施例６乃至７から得られたハイブリドーマの培養上清からのヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体の精製は以下の方法で行った。ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体を含む培養上清をｒｍｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）及び０．８×４０ｃｍカラム（バイオラッド社製）を用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてＰＢＳに置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社製）でろ過滅菌し、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．４ ＯＤとして算出した。
ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体を含む培養上清の調製は以下の方法にて行った。まず、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１０ｎｇ／ｍｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１０％Ｌｏｗ ＩｇＧ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）に馴化した。この馴化したハイブリドーマを凍結保存した。次に、その一部を抗体精製を目的として、ウシインシュリン（５μｇ／ｍｌ、ギブコビーアールエル社製）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、ギブコビーアールエル社製）、エタノールアミン（０．０１ｍＭ、シグマ社製）、亜セレン酸ナトリウム（２．５ｘ１０^−５ｍＭ、シグマ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１％Ｌｏｗ ＩｇＧ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）に馴化した。フラスコにて培養し、ハイブリドーマの生細胞率が９０％になった時点で培養上清を回収した。回収した上清は、１０μｍと０．２μｍのフィルター（ゲルマンサイエンス社製）に供し、ハイブリドーマ等の雑排物を除去した。
実施例１１ 精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体による、癌細胞及びヒト正常肝実質細胞に対する細胞死誘導活性
実施例１０から得られた精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を用いて、大腸癌細胞であるＣｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２２２）に対する細胞死誘導活性を測定した。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で培養していたＣｏｌｏ２０５細胞を２．５×１０^４／ｍｌの濃度に調製し、各ウェル１００μｌずつを９６穴平底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養した後、精製抗体を終濃度１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌになるように１０μｌ／ウェルで加え、さらにヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体（シグマ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌになるように、各ウェルに１０μｌずつ加えた。取得したハイブリドーマの一部について、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加しないウェルを作製した。陽性コントロールとして、ヒト組換えＴＲＡＩＬタンパク質（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を終濃度０．１、１、１０ｎｇ／ｍｌで使用した。陰性コントロールとして、ヒト抗ＨＳＡ抗体を使用した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で４８時間培養し、抗体と細胞表面の受容体を反応させた。ひとつの反応系あたりの容量は１２０μｌであった。なお、０３０４とＫＭＴＲ１については、クロスリンカーであるヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的モノクローナル抗体を加えない実験（表５において（単独）と記載）も行った。この場合のひとつの反応系あたりの容量は１１０μｌであった。培養の後、ＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６ ＡＱ_{ＵＥＯＵＳ} Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ：プロメガ社製）を説明書の方法に従い調製し、各ウェルに２０μｌずつ添加した。さらに３７℃、５．０％炭酸ガス下で２時間培養した後、波長４９０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（１４２０ ＡＲＶＯマルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定し、ミトコンドリアの還元能を指標として、細胞の生存率を算定した。各ウェルの細胞の生存率は実施例７と同様な式により算出した。
次に、実施例１０から得られたヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を用いて、ＨＨ細胞（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に対する細胞死誘導活性を測定した。まず凍結ＨＨ細胞を３７℃で融解し、ＣＭ５３００培地（ＣＥＤＲＡ社製）を用いて７．５×１０^５／ｍｌの濃度に調製した後に、各ウェル１００μｌずつをコラーゲンタイプＩがコートされている９６穴平底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で４．５時間培養した後、培地の交換を行った。さらに３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養し、培地を無血清培地（インシュリン（２０μｇ／ｍｌ、シグマ社製）、グルカゴン（７ｎｇ／ｍｌ、シグマ社製）、ハイドロコルチゾン（７．５μｇ／ｍｌ、シグマ社製）、ヒトＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、ベクトンディッキンソン社製）含有ＤＭＥＭ培地（シグマ社製））又はＣＭ５３００培地へ交換した。その後、精製抗体を終濃度０．１、１、１０μｇ／ｍｌになるように１０μｌ／ウェルで加え、さらにヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体（シグマ社製）を終濃度１０、１００μｇ／ｍｌになるように各ウェルに１０μｌずつ加えた。取得したハイブリドーマの一部について、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加しないウェルを作製した。陰性コントロールとしてヒト抗ＨＳＡ抗体を使用した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養し、抗体と細胞表面の受容体を反応させた。ひとつの反応系あたりの容量は１２０μｌであった。なお、０３０４とＫＭＴＲ１については、クロスリンカーであるヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的モノクローナル抗体を加えない実験（表５において（単独）と記載）も行った。この場合のひとつの反応系あたりの容量は１１０μｌであった。培養の後、ＰＢＳでＨＨ細胞を２回洗浄し、各ウェルにＰＢＳを１００μｌ加え、さらにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を終濃度０．８％になるように１０μｌ／ウェルで加えた。３７℃で１時間静置し生きているＨＨ細胞を溶解させ、可溶化液５０μｌ／ウェルを異なる９６穴平底プレートへ移しＬＤＨアッセイに供した。ＬＤＨアッセイ用試薬（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ：プロメガ社製）を説明書の方法に従い調製し、各ウェルに５０μｌずつ添加した。プレートを遮光し、室温で３０分間静置した後、反応停止液（１Ｍ酢酸：プロメガ社製）を５０μｌ／ウェルで加え、波長４９２ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（１４２０ＡＲＶＯマルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）にて測定した。ＬＤＨの酵素活性を指標として、細胞の生存率を算定した。各ウェルの細胞の生存率は実施例７と同様な式により算出した。
さらに、算出した生存率を用いて以下の方法でＬＤ５０値を計算した。算出した生存率を縦軸、細胞に添加した抗体の濃度を横軸にとったグラフに、各抗体濃度における生存率をプロットし、プロットした点で隣り合うものを結び曲線を引いた。この曲線を表す式を回帰計算により求め、その式から生存率が５０％に該当する抗体濃度を計算し、ＬＤ５０値とした。
結果を図５ａ〜１並びに表５に示す。図５において、黒丸で実線（−●−）は正常ヒト肝実質細胞を、ひし形で点線（−−◆−−）はＣｏｌｏ２０５細胞を表わす。また、図５ｋ、図５ｌはヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加しない実験の結果を示す。表５は、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５、及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性（ＬＤ５０値）を示す表である。大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５に対するＬＤ５０値は、９６穴平底プレートの１穴当たり１００μｌの培地に２．５×１０^３の細胞を播種し、翌日精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を細胞に加え、該抗体との反応時間が４８時間を経過した時のＬＤ５０値である。正常ヒト肝実質細胞に対するＬＤ５０値は、９６穴平底プレートの１穴当たり１００μｌの培地に７．５×１０^４の正常細胞（ヒト肝細胞）を播種し、翌日精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を正常細胞（ヒト肝細胞）に加え、該抗体との反応時間が２４時間を経過した時のＬＤ５０値である。精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体は、陰性コントロールと比較して明らかにＣｏｌｏ２０５細胞に細胞死を誘導する活性があることが明らかとなった。さらに、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体Ｅ−１１−１３、Ｌ−３０−１０、ＫＭＴＲ１は、ヒト組換え型ＴＲＡＩＬや精製抗体Ｈ−４８−２と比較して、ヒト正常肝実質細胞に対する毒性が低いことが明らかとなった。
また、ＫＭＴＲ１は実施例４の結果よりＴＲＡＩＬ−Ｒ１とＴＲＡＩＬ−Ｒ２との両レセプターに結合することが明らかとなっており、この抗体はＴＲＡＩＬ−Ｒ１とＴＲＡＩＬ−Ｒ２とのどちらのレセプターを介しても細胞死誘導のシグナルを入れることが期待できる。
ここで、Ｌ−３０−１０は１０μｇ／ｍｌを肝細胞に添加しても生存率５０％以上を示したことから、Ｌ−３０−１０のＬＤ５０は１０μｇ／ｍｌ以上である。抗体濃度及び生存率をプロットしたグラフから回帰計算によりＬＤ５０を求めたところ、２４μｇ／ｍｌと算出された。また、Ｆ−４−８は０．１μｇ／ｍｌを肝細胞に添加した時点で生存率が５０％以下であったことから、Ｆ−４−８のＬＤ５０は０．１μｇ／ｍｌ以下である。Ｌ−３０−１０と同様に回帰計算に基づいてＬＤ５０を計算した結果、０．００２μｇ／ｍｌと算出された。ＫＭＴＲ１及びＤ１ＭのＬＤ５０は、ともに１０μｇ／ｍｌ以上であることを確認した。また、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加していない時（以下「単独の時」とする）、ＫＭＴＲ１は１００μｇ／ｍｌの抗体量を添加しても肝臓細胞の生存率が５０％を下回ることは無かったことから、単独の時のＬＤ５０は１００μｇ／ｍｌ以上であることを確認した。
次に、正常ヒト肝細胞のＬＤ５０がＣｏｌｏ２０５細胞のＬＤ５０の何倍であるか、その比（Ｎ／Ｃ比）を求めた。その結果、精製抗体Ｅ−１１−３はＮ／Ｃ＝２５．４５（１０倍以上）、Ｄ１ＭはＮ／Ｃ＝６７以上（１０倍以上）、０３０４単独の時はＮ／Ｃ＝５０（１０倍以上）、Ｌ−３０−１０はＮ／Ｃ＝２４０（１００倍以上）、ＫＭＴＲ１単独の時はＮ／Ｃ＝１０００倍以上であり、いずれの抗体も有効性及び安全性に優れていることが分かった（表５）。

同様の方法で、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体による細胞死誘導活性を、Ｕ２５１細胞（神経膠腫由来、理研ジーンバンクＮｏ．ＲＣＢ０４６１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞リンパ腫由来、大日本製薬株式会社製）について検討した。Ｕ２５１細胞に対する試験では、９６穴平底プレートの１穴あたり１００μｌの培地に１．０ｘ１０^４の細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養し、抗体を翌日添加し、前記環境下に４８時間置いた後に細胞の生存率を測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する試験では、９６穴平底プレートの１穴あたり１００μｌの培地に４．０ｘ１０^４の細胞を播種し、抗体を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で４８時間培養した後に細胞の生存率を測定した。以下、各抗体のＬＤ５０値（単位はμｇ／ｍｌ）を示す。
Ｅ−１１−１３のＵ２５１細胞に対するＬＤ５０：０．３、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＬＤ５０：０．１。
Ｌ−３０−１０のＵ２５１細胞に対するＬＤ５０：０．１７、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＬＤ５０：０．１３。
Ｈ−４８−２のＵ２５１細胞に対するＬＤ５０：０．２４、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＬＤ５０：０．０７。
Ｆ−４−８のＵ２５１細胞に対するＬＤ５０：０．０３、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＬＤ５０：０．００４。
Ｗ−４０−５のＵ２５１細胞に対するＬＤ５０：１．０、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＬＤ５０：０．４８。
なお、Ｕ２５１細胞に対しては終濃度４μｇ／ｍｌのシスプラチン注射液（日本化薬株式会社製）を抗体と同時に添加した系でアッセイを行った。
実施例１２ マウス担癌モデルに対する精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の効果
実施例１０から得られたヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の効果を、以下に記載する方法に従ってマウス担癌モデルを用いて検討した。
４〜６週令のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア（株）社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５を５×１０^６／マウス個体で移植した。移植１週間〜１０日後に、生着した腫瘍の大きさを測定し、平均して腫瘍の大きさが約１００ｍｍ^３又は３００ｍｍ^３となる担癌マウス５あるいは７匹を１群として群分けした。担癌マウスの腹腔内に、精製抗体１、４、２０、２５、１００μｇ／マウス個体（２００μｌのＰＢＳに溶解したもの）を投与し、腫瘍の大きさを測定した。抗体の陰性コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、同量のヒト抗ＨＳＡ抗体を使用した。
以上の実験の結果を図６〜１０に示す。精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体Ｅ−１１−１３、Ｆ−４−８、Ｈ−４８−２、Ｌ−３０−１０、Ｗ−４０−５を１μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｈ−４８−２に退縮効果が見られ、Ｅ−１１−１３、Ｌ−３０−１０、Ｆ−４−８、Ｗ−４０−５の順で抗腫瘍効果が弱くなっていた（図６）。図６において、３回隔日投与した時に、初回投与時から計算して少なくとも１３日間は増殖抑制〜退縮効果が観察された（Ｈ−４８−２クローン）。
Ｅ−１１−１３を４、２０、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、投与したマウス全てにおいて抗腫瘍効果が確認された。２０μｇ／マウス個体の投与量において最も腫瘍退縮効果が見られた（図７）。図７において、４回隔日投与した時に、初回投与時から計算して少なくとも１１日間は増殖抑制〜退縮効果が観察された。２０μｇ／マウス個体で４回隔日投与（移植７日後、９日後、１１日後、１３日後に投与）した群における腫瘍体積の経時変化は以下の通りであった。
初回投与２日後（図７の９日に該当）の腫瘍体積の平均は１０９．５ｍｍ^３、
初回投与４日後（図７の１１日に該当）の腫瘍体積の平均は８５．１ｍｍ^３、
初回投与６日後（図７の１３日に該当）の腫瘍体積の平均は６４．３ｍｍ^３、
初回投与８日後（図７の１５日に該当）の腫瘍体積の平均は６１．８ｍｍ^３。
初回投与１１日後（図７の１８日に該当）の腫瘍体積の平均は７８．９ｍｍ^３。
投与開始４日後の腫瘍体積は約８５．１ｍｍ^３であり、１４％以上の腫瘍の縮小が認められた。この縮小は投与１１日後でも維持されており、本発明の抗体は高い抗腫瘍効果を有することが示された。
さらに、平均して約３００ｍｍ^３となる担癌マウス７匹を１群として、Ｅ−１１−１３を２０μｇ／マウス個体で投与した結果、顕著な腫瘍退縮が観察された（図８）。図８において、３回隔日投与した時に、初回投与時から計算して少なくとも１８日間は増殖抑制〜退縮効果が観察された。２０μｇ／マウス個体で３回隔日投与（移植９日後、１１日後、１３日後に投与）した群における腫瘍体積の経時変化は以下の通りであった。
初回投与２日後（図８の１１日に該当）の腫瘍体積の平均は２４６．９ｍｍ^３、
初回投与４日後（図８の１３日に該当）の腫瘍体積の平均は１８１．８ｍｍ^３、
初回投与５日後（図８の１４日に該当）の腫瘍体積の平均は１４６．２ｍｍ^３、
初回投与６日後（図８の１５日に該当）の腫瘍体積の平均は１１０．８ｍｍ^３。
初回投与７日後（図８の１６日に該当）の腫瘍体積の平均は８２．７ｍｍ^３。
初回投与９日後（図８の１８日に該当）の腫瘍体積の平均は５７．５ｍｍ^３。
初回投与１１日後（図８の２０日に該当）の腫瘍体積の平均は８１．３ｍｍ^３。
初回投与１３日後（図８の２２日に該当）の腫瘍体積の平均は１０８．１ｍｍ^３。
初回投与１５日後（図８の２４日に該当）の腫瘍体積の平均は１２７．８ｍｍ^３。
初回投与１８日後（図８の２７日に該当）の腫瘍体積の平均は１６３．３ｍｍ^３。
投与開始４日後の腫瘍体積は約１８１．８ｍｍ^３であり、３９％以上の腫瘍の縮小が認められた。この縮小は投与１８日後でも維持されており、本発明の抗体は高い抗腫瘍効果を有することが示された。
０３０４抗体の活性評価は以下の様に行った。６週令のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア（株）社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５を５×１０^６／マウス個体で移植した。移植８日後に、生着した腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが平均して約１００ｍｍ^３になるように担癌マウス５匹を１群として群分けした。担癌マウスの腹腔内に、精製抗体２０μｇ／マウス個体（２００μｌのＰＢＳに溶解したもの）を投与し、腫瘍の大きさを測定した。０３０４を２０μｇ／マウス個体で３回隔日投与（移植８日後、１０日後、１２日後に投与）した群では、投与したマウス全てにおいて抗腫瘍効果が確認された（図９）。腫瘍体積の経時変化は以下の通りであった。
初回投与２日後（図９の１０日に該当）の腫瘍体積の平均は１４２．０９２ｍｍ^３、
初回投与４日後（図９の１２日に該当）の腫瘍体積の平均は３４．１３８ｍｍ^３、
初回投与７日後（図９の１５日に該当）の腫瘍体積の平均は１８．６４１ｍｍ^３、
初回投与１１日後（図９の１９日に該当）の腫瘍体積の平均は９．３３９ｍｍ^３。
投与開始４日後の腫瘍体積は約３４．１３８ｍｍ^３であり、６５％以上の腫瘍の縮小が認められた。この縮小は投与１１日後でも維持されており、本発明の抗体は極めて高い抗腫瘍効果を有することが示された。
次いで、１２週令のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア（株）社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５を５×１０^６／マウス個体で移植した。移植１０日後に生着した腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが平均して約１００ｍｍ^３になるように担癌マウス５匹を１群として群分けした。担癌マウスの腹腔内に、精製抗体２５μｇ／マウス個体（２００μｌのＰＢＳに溶解したもの）を投与し、腫瘍の大きさを測定した。抗体の陰性コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、同量のヒト抗ＨＳＡ抗体を使用した。０３０４を２５μｇ／マウス個体で３回投与（移植１０日後、１３日後、１５日後に投与）した群では、投与したマウス全てにおいて抗腫瘍効果が確認された（図１０）。腫瘍体積の経時変化は以下の通りであった。
初回投与３日後（図１０の１３日に該当）の腫瘍体積の平均は５４．６２６ｍｍ^３、
初回投与５日後（図１０の１５日に該当）の腫瘍体積の平均は３２．３５７ｍｍ^３、
初回投与８日後（図１０の１８日に該当）の腫瘍体積の平均は１５．８９５ｍｍ^３、
初回投与１２日後（図１０の２２日に該当）の腫瘍体積の平均は１４．３７７ｍｍ^３、
初回投与１５日後（図１０の２５日に該当）の腫瘍体積の平均は２６．６５４ｍｍ^３、
初回投与１９日後（図１０の２９日に該当）の腫瘍体積の平均は２７．５６５ｍｍ^３、
初回投与２５日後（図１０の３５日に該当）の腫瘍体積の平均は３０．８０２ｍｍ^３、
初回投与２９日後（図１０の３９日に該当）の腫瘍体積の平均は２７．０９２ｍｍ^３、
初回投与３２日後（図１０の４２日に該当）の腫瘍体積の平均は３２．９２１ｍｍ^３。
初回投与１２日後（図１０の２２日に該当）に、５匹中３匹で腫瘍の消失が確認された。
初回投与３日後の腫瘍体積は平均５４．６２６ｍｍ^３であり、４５％以上の腫瘍の縮小が認められた。さらに、投与５日後の腫瘍体積の平均は３２．３５７ｍｍ^３であり、６５％以上の腫瘍の縮小が認められた。この縮小は投与３２日後でも維持されており、少なくとも２７日は６５％以上の縮小が維持されていた。したがって、本発明の抗体は極めて高い抗腫瘍効果を有することが示された。
さらに、図１０において、初回投与時から計算して少なくとも３２日間は増殖抑制〜退縮効果が観察された。
なお、図９及び１０において、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は抗体を投与するにあたり溶解する為の媒体として使用したＰＢＳ（２００μｌ）を示す。
０３０４、ＫＭＴＲ１は実施例１１において示されているように、抗体単独の時においても細胞死誘導活性を示す抗体であり、さらに０３０４は本実施例で示されるようにマウス担癌モデルにおいても顕著な抗腫瘍効果が確認されている。この様に単独で細胞死誘導活性及び抗腫瘍活性を示す抗体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現している細胞に起因する疾患に対する予防又は治療剤、特に悪性腫瘍治療薬を投与する対象となる患者の生理的状況（例えば免疫細胞の種類、数など）に依存することなく抗腫瘍活性を示す可能性が期待される。
実施例１３ 精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体のＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する結合親和性
実施例１０から得られた精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒモノクローナル抗体のＴＲＡＩＬ−Ｒに対する結合親和性を、以下に記載する方法に従ってＢＩＡＣＯＲＥ ２０００（ビアコア株式会社製）を用いて検討した。
１）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃの固定化
ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃを１０ｍＭ Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ（ｐＨ４．０）で終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう希釈し、アミンカップリング法でセンサーチップＣＭ５に固定化した。固定化条件は下記の通りであり、ＮＨＳ活性化、エタノールアミンブロッキングは取扱説明書記載の方法に従った。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃのカップリングは、取扱説明書に記載のあるマニュアルインジェクションにより実施した。
（固定化条件）
流速 ５μｌ／分
ＮＨＳ活性化 ７分間
カップリング マニュアルインジェクション
エタノールアミンブロッキング ７分間
上記条件により、センサーチップ上にＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃが３７７．４ＲＵが固定化され、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃが４９５．４ＲＵが固定化されたことが確認された。
２）再生条件及び再現性の確認
２０μｇ／ｍｌの精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体２−６を、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃを固定化したセンサーチップ上に２分間添加し、抗体がＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃと結合したことを確認した。その後、５０ｍＭ ＮａＯＨを１５秒間添加し、結合した抗体がＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃから完全に解離した（以下、完全に解離したことを「再生」という）ことを確認した。次いで、再生したＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃに対し、流速２０μｌ／分で精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体２−６をＫＩＮＪＥＣＴ法（１分間結合、１分間解離）で添加した後に５０ｍＭ ＮａＯＨを１５秒間添加し、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃを再生させる、というサイクルを９回繰返した。前記サイクルを９回繰返した後も、センサーチップ上に固定化したＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃ量および抗体の結合量に変化は認められかったことから、５０ｍＭ ＮａＯＨの１５秒間添加で、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ｈＦｃが失活することなく再生されることが明らかとなった。同様の検討を、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃを固定化したセンサーチップと２０μｇ／ｍｌの精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体Ｅ−１１−１３を用いて行い、同じ再生条件でＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｈＦｃが再生可能であることを確認した。
３）相互作用検討
精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体１−１３、２−６、２−１２をそれぞれＨＢＳ−ＥＰ（ビアコア株式会社製）で、２．１、４．２、８．４、１６．８、３３．５、６７．０、１３４．０ｎＭに段階希釈し、各抗体の希釈系列を流速２０μｌ／分でＫＩＮＪＥＣＴ法（２分間結合、６分間解離）を用いて順に添加し、センサーグラムを取得した。同様に、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体Ｅ−１１−１３、Ｌ−３０−１０、Ｈ−４８−２、Ｆ−４−８、Ｗ−４０−６、Ｘ−１４−４をそれぞれＨＢＳ−ＥＰ（ビアコア株式会社製）で、０．５２、１．０５、２．１、２．０９、４．１９、８．３８ｎＭに段階希釈し、各抗体の希釈系列を流速２０μｌ／分でＫＩＮＪＥＣＴ法（２分間結合、２分間解離）を用いて順に添加し、センサーグラムを取得した。各抗体について、それぞれのセンサーグラムを用いて、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフト ｖｅｒ３．２（ビアコア株式会社製）によりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行った。Ｆｉｔｔｉｎｇ ｍｏｄｅｌとしてＢｉｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｅｌを用いてＧｌｏｂａｌ ｆｉｔｔｉｎｇを行い、結合速度定数、解離速度定数を求めた。また、この二つの定数から算出される解離定数（Ｋｄ値）を算出した。なお、ｆｉｔｔｉｎｇに用いたセンサーグラムはコントロールセルを差し引き、さらにｂｕｆｆｅｒ補正したものである。結果を表６及び表７に示す。表中のｋａｓｓは結合速度定数を、ｋｄｉｓｓは解離速度定数を、Ｋ_Ｄは解離定数を示す。

実施例１４ モノクローナル抗体をコードする遺伝子の調製及び組換え抗体発現ベクターの構築
（１）Ｅ−１１−１３、Ｌ−３０−１０、Ｈ−４８−２抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングと発現ベクター作製
ハイブリドーマＥ−１１−１３、Ｌ−３０−１０、Ｈ−４８−２を１０ｎｇ／ｍｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１０％Ｌｏｗ ＩｇＧ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）で培養し、遠心分離により細胞を集めた後ＴＲＩＺＯＬ（ギブコビーアールエル社製）を添加し、取扱説明書にしたがってＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クローンテック社製）を用い、添付の説明書にしたがって行った。
５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作製した。
１）１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５μｇ／３μｌ
５’ＣＤＳ １μｌ
ＳＭＡＲＴ ｏｌｉｇｏ １μｌ
上記組成の反応液を７０℃で２分間インキュベートした後、
５×Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
ＤＴＴ １μｌ
ＤＮＴＰ ｍｉｘ １μｌ
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌ
を加え４２℃で１．５時間インキュベートした。
さらに、１００μｌのＴｒｉｃｉｎｅ Ｂｕｆｆｅｒを加えた後、７２℃で７分間インキュベートし、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを取得した。
２）ＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅及び組換え抗体発現ベクターの構築
ｃＤＮＡの増幅には、Ｔａｋａｒａ社のＺ−Ｔａｑを用いた。
ｃＤＮＡ ２μｌ
１０ｘＺ−Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ ４μｌ
Ｚ−Ｔａｑ １μｌ
プライマー１
プライマー２
上記組成の反応液を再蒸留水にて最終容量５０μｌとし、ＰＣＲに供した。
重鎖の増幅には、ＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とｈｈ−６プライマー（５’−ＧＧＴ ＣＣＧ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＴＣ ＣＴＴ−３’）（配列番号７）を用い、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とｈｈ−３プライマー（５’−ＧＴＧ ＣＡＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＣＣ ＴＧ−３’）（配列番号８）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。この後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）により精製し，ｈｈ−４（５’−ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＧ−３’）（配列番号９）をプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報から、Ｅ−１１−１３、Ｌ−３０−１０、Ｈ−４８−２の３クローンはＮ末領域の配列が一致していることが分かったため、サブクローニング及び塩基配列決定には共通のプライマーを使用した。配列情報を基に、ｔｎＨ４８ＫＢｇｌ（５’−ＡＴＡ ＴＡＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＣＡＧ ＴＴＡ ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＡＡＣ Ｃ−３’）（配列番号１０）を合成し、このプライマーを用いて反対方向からも配列を決定した。特異的プライマーとｔｎＣＨＮｈｅ（５’−ＧＡＴ ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ Ｇ−３’）（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行い（９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）、重鎖増幅ｃＤＮＡ断片をＳａｌＩ、ＮｈｅＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｌａｒｋベクター（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎ５ＫＧ１（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６００１３５８）の改変ベクター）に導入した。挿入された配列がｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅによって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
軽鎖は、ＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とｈｋ−２（５’−ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＧＡ ＧＣ−３’）（配列番号１２）プライマーを使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とｈｋ−６（５’−Ｔ ＧＧＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＧＴ Ｇ−３’）（配列番号１３）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。この後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）により精製し、ｈｋ−６（５’−ｔｇｇｃ ｇｇｇ ａａｇ ａｔｇ ａａｇ ａｃａ ｇａｔ ｇｇｔ ｇ−３’）プライマーを用いて塩基配列を決定した。配列情報から、３クローン全てにおいてＮ末領域の配列が一致していることがわかったため、サブクローニングには共通のプライマーを使用した。配列情報を基に、ｔｎＨ４８Ｈｓａｌ（５’−ＡＴＡ ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＴＡ ＣＧＧ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＴＣ−３’）（配列番号１４）を合成し、このプライマーを用いて、反対方向からも配列を決定した。特異的プライマーとｔｎＣｋＢｓｉ（５’−ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＴＡ ＣＧＴ ＴＴＧ ＡＴ−３’）（配列番号１５）を用いてＰＣＲを行い（９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）、軽鎖増幅ｃＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ、ＢｓｉＷＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｌａｒｋベクターに導入した。挿入された配列がｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅによって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
Ｅ−１１−１３重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。

重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号１６の５’末端から３０番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４６１番目のアデニン（Ａ）と４６２番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号１７のＮ末端から１４４番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４５番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。精製された重鎖蛋白質のＮ末端分析により、重鎖のシグナル配列は配列番号１７のＮ末端より２６番目のセリン（Ｓ）までであり、成熟体のＮ末端は配列番号１７の２７番目のグルタミン（Ｑ）であることが明らかとなった。
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号１８の５’末端から３５番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４１５番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号１９のＮ末端から１２７番目のリジン（Ｋ）までである。精製された軽鎖蛋白質のＮ末端分析により、軽鎖のシグナル配列は配列番号１９のＮ末端より２０番目のグリシン（Ｇ）までであり、成熟体のＮ末端は配列番号１９の２１番目のグルタミン酸（Ｅ）であることが明らかとなった。
Ｌ−３０−１０重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。

重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号２０の５’末端から３０番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４６１番目のアデニン（Ａ）と４６２番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号２１のＮ末端から１４４番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４５番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号２１のＮ末端より２６番目のセリン（Ｓ）までと予測された。精製された重鎖蛋白質のＮ末端分析により、重鎖のシグナル配列は配列番号２１のＮ末端より２６番目のセリン（Ｓ）までであり、成熟体のＮ末端は配列番号２１の２７番目のグルタミン（Ｑ）であることが明らかとなった。
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号２２の５’末端から３１番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４１１番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号２３のＮ末端から１２７番目のリジン（Ｋ）までである。精製された軽鎖蛋白質のＮ末端分析により、軽鎖のシグナル配列は配列番号２３のＮ末端より２０番目のグリシン（Ｇ）までであり、成熟体のＮ末端は配列番号２３の２１番目のグルタミン酸（Ｅ）であることが明らかとなった。
Ｈ−４８−２重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。

重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号２４の５’末端から２９番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４８４番目のアデニン（Ａ）と４８５番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号２５のＮ末端から１５２番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１５３番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号２５のＮ末端より２６番目のセリン（Ｓ）までと予測された。精製された重鎖蛋白質のＮ末端分析により、重鎖のシグナル配列は配列番号２５のＮ末端より２６番目のセリン（Ｓ）までであり、成熟体のＮ末端は配列番号２５の２７番目のグルタミン（Ｑ）であることが明らかとなった。
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号２６の５’末端から３１番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４１７番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号２７のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。精製された軽鎖蛋白質のＮ末端分析により、軽鎖のシグナル配列は配列番号２７のＮ末端より２０番目のグリシン（Ｇ）までであり、成熟体のＮ末端は配列番号２７の２１番目のグルタミン酸（Ｅ）であることが明らかとなった。
（２）０３０４抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングと発現ベクター作製
ハイブリドーマ０３０４を遠心によって集め、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてプロトコールに従い、約９００μｇのＲＮＡを精製した。次に、３００μｇのＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅｘ^ＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（宝酒造社製）により１３μｇのｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡを得た。得られたｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡを材料としてＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クローンテックカンパニー社製）を用いて、その添付の説明書に従ってクローニング実験を実施して、抗体遺伝子の可変領域のｃＤＮＡを取得した。具体的には、精製したｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡ１．０μｇを材料として、逆転写酵素によるファーストストランドｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体の重鎖（以下、重鎖はＨ鎖とも称す）定常領域、および軽鎖（以下、軽鎖はＬ鎖とも称す）定常領域ＤＮＡ各々に特異的なＰＣＲ用プライマー（Ｈ鎖用：ＩｇＧ１ｐ、Ｌ鎖用：ｈｋ−２）とＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ付属のＵＭＰプライマー（合成したｃＤＮＡの５’末端に作製される共通配列に相補的なオリゴヌクレオチド）をプライマーセットとして使用しＰＣＲによるＨ鎖リーダ配列と可変領域（以下、ＨＶとも称す）及びＬ鎖リーダ配列と可変領域（以下、ＬＶとも称す）の増幅を行った。ＰＣＲは、ＬＡ ＰＣＲ用Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅであるＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ^ＴＭ（宝酒造社製）を使用した。テンプレートＤＮＡを１×ＬＡＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ^２＋ｐｌｕｓ）、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ各４００μＭ（最終濃度）、プライマー２種各０．２μＭ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ２．５Ｕ／５０μｌを含む溶液に添加して、タッチダウンＰＣＲ（９４℃５秒及び７２℃３分（５サイクル）→９４℃５秒、７０℃１０秒及び７２℃３分（５サイクル）→９４℃５秒、６８℃１０秒及び、７２℃３分（２０サイクル））で反応した。増幅したＰＣＲ断片は、エタノール沈澱で回収した後、アガロースゲル電気泳動で回収し、メンブランを用いるＤＮＡ精製キットであるＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製した。精製したＨＶおよびＬＶ断片について、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ登録商標 ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用してＤＮＡ塩基配列を決定した。また、ＨＶ及びＬＶの増幅断片は、それぞれＴＡクローニング法を用いるｐＧＥＭ登録商標−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）にサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドＤＮＡについてインサートＤＮＡの塩基配列を解析してＰＣＲ産物の直接シーケンス解析結果と比較した。ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたプライマーの配列（Ｈ鎖：ｈｈ−４、Ｌ鎖：ｈｋ−５及びｈｋ−６、及びｐＧＥＭ登録商標−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ用：ＳＰ６とＴ７）は表８に示した。ＨＶ及びＬＶの各ＰＣＲ断片の直接シーケンス解析結果とサブクローニングされた複数のクローンのＤＮＡ塩基配列解析結果は完全に一致した。
０３０４抗体Ｌ鎖のＤＮＡを鋳型として、同Ｌ鎖のリーダー配列と可変領域を、末端に連結のための制限酵素部位を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。用いたプライマーセットは、表８（Ｃ２３ＬＢＣＬ及びＣ２３ＬＢｓｉ）に配列を示した。得られたＰＣＲ断片は、エタノール沈澱で回収した後、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩで消化処理し、更にＢｓｉＷ Ｉでの切断処理を行い、アガロースゲル電気泳動で約４００ｂｐの断片を回収し、メンブランを用いるＤＮＡ精製キットであるＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製した。他方、ベクターであるＮ５ＫＧ４−Ｖａｌ Ｌａｒｋ（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎ５ＫＧ１（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６００１３５８）の改変ベクター）については同様に制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ、ＢｓｉＷ Ｉ処理を順次行った後、脱リン酸化処理としてＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（宝酒造社製）にて処理した後に、アガロースゲル電気泳動とＤＮＡ精製キットで約９ｋｂ弱のＤＮＡを回収した。これら２つの断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーションして、大腸菌ＤＨ５αへ導入して形質転換体を得た。Ｎ５ＫＧ４−Ｖａｌ Ｌａｒｋに０３０４抗体Ｌ鎖のリーダー＋可変領域が挿入されたプラスミドＤＮＡ、Ｎ５ＫＧ４−０３０４Ｌを選択して挿入断片周辺のＤＮＡ塩基配列を決定してＤＮＡ塩基配列に変異等がないことを確認した。こうして得られたＮ５ＫＧ４−０３０４ＬにＨ鎖可変領域等を挿入するため、本プラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｈｅＩ、及び、ＳａｌＩで順次切断し、さらに脱リン酸化を行った後、約９．３ｋｂのベクターＤＮＡを精製した。一方、抗体のＨ鎖のプラスミドＤＮＡを鋳型として、０３０４抗体Ｈ鎖遺伝子のリーダー配列と可変領域をＰＣＲで増幅した。増幅のためのプライマーセット（Ｔ０３０４Ｓａｌ及びＴ０３０４Ｎｈｅ）の配列を表８に示した。
得られたＰＣＲ断片について制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩによる切断処理を行い、アガロースゲル電気泳動で約４５０ｂｐの断片を精製した。これら２種のＤＮＡをライゲーションして大腸菌へ導入して形質転換体を得て、目的とするＨ鎖のリーダー配列と可変領域が挿入されたクローンを選択した。挿入部分のＤＮＡ塩基配列を決定して、ＰＣＲ増幅して挿入された配列に鋳型とした遺伝子配列と相違がないことを確認した。
０３０４重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。

重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号２８の５’末端から５５番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、５’末端から４８９番目のアデニン（Ａ）までが抗体可変領域である。アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号２９のＮ末端から１４５番目のセリン（Ｓ）残基までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号２９のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号２９の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号３０の５’末端から３４番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４１４番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号３１のＮ末端から１２７番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号３１のＮ末端より２０番目のグリシン（Ｇ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号３１の２１番目のグルタミン酸（Ｅ）であるものと考えられる。

（３）ＫＭＴＲ１抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニング
ハイブリドーマＫＭＴＲ１細胞を遠心によって集め、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてプロトコールに従い、約９００μｇのＲＮＡを精製した。次に、３００μｇのＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅｘ^ＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（宝酒造社製）により１３μｇのｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡを得た。得られたｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡを材料としてＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クローンテックカンパニー社製）を用いて、その添付の説明書に従ってクローニング実験を実施して、抗体遺伝子の可変領域のｃＤＮＡを取得した。具体的には、精製したｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡ１．０μｇを材料として、逆転写酵素によるファーストストランドｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体の重鎖（以下、重鎖はＨ鎖とも称す）定常領域、および軽鎖（以下、軽鎖はＬ鎖とも称す）定常領域ＤＮＡ各々に特異的なＰＣＲ用プライマー（Ｈ鎖用：ＩｇＧ１ｐ、Ｌ鎖用：ｈｋ−２）とＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ付属のＵＭＰプライマー（合成したｃＤＮＡの５’末端に作製される共通配列に相補的なオリゴヌクレオチド）をプライマーセットとして使用しＰＣＲによるＨ鎖リーダ配列と可変領域（以下、ＨＶとも称す）及びＬ鎖リーダ配列と可変領域（以下、ＬＶとも称す）の増幅を行った。ＰＣＲは、ＬＡ ＰＣＲ用Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅであるＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ^ＴＭ（宝酒造社製）を使用した。
テンプレートＤＮＡを１×ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ^２＋ｐｌｕｓ）、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ各４００μＭ（最終濃度）、プライマー２種各０．２μＭ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ２．５Ｕ／５０μｌを含む溶液に添加して、タッチダウンＰＣＲ（９４℃５秒及び７２℃３分（５サイクル）→９４℃５秒、７０℃１０秒及び７２℃３分（５サイクル）→９４℃５秒、６８℃１０秒及び、７２℃３分（２０サイクル））で反応した。増幅したＰＣＲ断片は、エタノール沈澱で回収した後、アガロースゲル電気泳動で回収し、メンブランを用いるＤＮＡ精製キットであるＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製した。精製したＨＶおよびＬＶ断片について、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ登録商標 ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用してＤＮＡ塩基配列を決定した。また、ＨＶ及びＬＶの増幅断片は、それぞれＴＡクローニング法を用いるｐＧＥＭ登録商標−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）にサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドＤＮＡについてインサートＤＮＡの塩基配列を解析してＰＣＲ産物の直接シーケンス解析結果と比較した。
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたプライマーの配列（Ｈ鎖：ｈｈ−４、Ｌ鎖：ｈｋ−５及びｈｋ−６、及びｐＧＥＭ登録商標−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ用：ＳＰ６とＴ７）は前記表８に示した。ＨＶ及びＬＶの各ＰＣＲ断片の直接シーケンス解析結果とサブクローニングされた複数のクローンのＤＮＡ塩基配列解析結果は完全に一致した。決定できたＫＭＴＲ１細胞に発現するヒト抗体遺伝子のＨ鎖及びＬ鎖のＤＮＡ塩基配列とアミノ酸配列を示す。

重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号３２の５’末端から８１番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、５’末端から４９７番目のアデニン（Ａ）までが抗体可変領域である。アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号３３のＮ末端から１３９番目のセリン（Ｓ）残基までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号３３のＮ末端より１９番目のシステイン（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号３３の２０番目のグルタミン酸（Ｅ）であるものと考えられる。
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号３４の５’末端から６６番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４４３番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号３５のＮ末端から１２６番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号３５のＮ末端より１９番目のグリシン（Ｇ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号３５の２０番目のグルタミン酸（Ｅ）であるものと考えられる。
実施例１５ 組換え型抗体の作製
実施例１４で構築した組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞には、例えばＣＨＯ細胞のｄｈｆｒ欠損株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）を用いた。宿主細胞へのベクターの導入はエレクトロポレーションにより実施した。抗体発現ベクター約２μｇを制限酵素で線状化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｅｒをもちいて３５０Ｖ、５００μＦの条件で、４ｘ１０^６個のＣＨＯ細胞に遺伝子を導入し、９６ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに播種した。発現ベクターの選択マーカーに対応した薬剤を添加して培養を継続した。コロニーを確認した後、実施例４に示した方法によって、抗体発現株を選別した。選別した細胞からの抗体精製は、実施例１０にしたがって行った。
実施例１６ 組換え型抗体による癌細胞に対する細胞死誘導活性
実施例１５から得られた組換え型ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を用いて、大腸癌細胞であるＣｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２２２）に対する細胞死誘導活性を測定した。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で培養していたＣｏｌｏ２０５細胞を１．０×１０^５／ｍｌの濃度に調製し、各ウェル１００μｌずつを９６穴平底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養した後、精製抗体Ｅ１１（ＣＨＯ−３）、Ｈ４８（ＣＨＯ−３）を終濃度１０、１００、１０００、１００００ｎｇ／ｍｌになるように１０μｌ／ウェルで加え、さらにヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体（シグマ社製）を終濃度１０、１００μｇ／ｍｌになるように、各ウェルに１０μｌずつ加えた。取得したハイブリドーマについて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加しないウェルも作製した。陽性コントロールとして、ヒト組換えＴＲＡＩＬタンパク質（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を終濃度１、１０ｎｇ／ｍｌで使用した。陰性コントロールとして、ヒト抗ＨＳＡ抗体を使用した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で４８時間培養した後、ＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱ_{ＵＥＯＵＳ} Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ：プロメガ社製）を説明書の方法に従い調製し、各ウェルに２０μｌずつ添加した。さらに３７℃、５．０％炭酸ガス下で２時間培養した後、波長４９０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（１４２０ ＡＲＶＯマルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定し、ミトコンドリアの還元能を指標として、細胞の生存率を算定した。各ウェルの細胞の生存率は実施例７と同様な式により算出した。
結果を図１１ａ、１１ｂに示す。図１１ａはヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加していない実験の結果を、図１１ｂはヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加した実験の結果を、それぞれ示す。
図１１ａより、組換え型抗体であるＥ１１（ＣＨＯ−３）、Ｈ４８（ＣＨＯ−３）は抗体単独の時でもＣｏｌｏ２０５細胞に細胞死を誘導する活性があることが明らかとなった。また、図１１ｂより、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体を添加した場合、ハイブリドーマの培養上清から精製した抗体と同等の細胞死誘導活性を示すことが明らかとなった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２を発現している細胞に起因する疾患に対する予防又は治療剤、特に悪性腫瘍治療薬として有用であり、かつ肝臓への傷害性が回避することができる、極めて安全性の高い分子が提供された。
配列表フリーテキスト
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号３６：合成ＤＮＡ
配列番号３７：合成ＤＮＡ
配列番号３８：合成ＤＮＡ
配列番号３９：合成ＤＮＡ
配列番号４０：合成ＤＮＡ
配列番号４１：合成ＤＮＡ
配列番号４２：合成ＤＮＡ
配列番号４３：合成ＤＮＡ
配列番号４４：合成ＤＮＡ
配列番号４５：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清中のＣｏｌｏ２０５に対する細胞死誘導活性を示す図。
図２は、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清中のＣｏｌｏ２０５に対する細胞死誘導活性を示す図。
図３は、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清中のＣｏｌｏ２０５に対する細胞死誘導活性を示す図（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）特異的ポリクローナル抗体 無添加）。
図４は、ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清中のＨＵＶＥＣに対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ａは、ヒト組換え型ＴＲＡＩＬ（陽性コントロール）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｂは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（Ｈ−４８−２）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｃは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（Ｅ−１１−１３）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｄは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（Ｌ−３０−１０）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｅは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（Ｆ−４−８）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｆは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（Ｗ−４０−５）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｇは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（０３０４）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｈは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（０３２２）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｉは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（ＫＭＴＲ１）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｊは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（Ｄ１Ｍ）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｋは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（０３０４、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体無添加）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図５ｌは、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（ＫＭＴＲ１、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体無添加）のＣｏｌｏ２０５及び正常ヒト肝実質細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
図６は、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体Ｅ−１１−１３、Ｆ−４−８、Ｈ−４８−２、Ｌ−３０−１０、Ｗ−４０−５を、１μｇ／マウス個体で３回隔日投与したときの腫瘍の大きさを測定した結果を示す図。
図７は、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体Ｅ−１１−１３を４、２０、１００μｇ／マウス個体で４回投与したときの腫瘍の大きさを測定した結果を示す図。
図８は、３００ｍｍ^３の担癌マウスに対し、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体Ｅ−１１−１３を２０μｇ／マウス個体で３回隔日投与したときの腫瘍の大きさを測定した結果を示す図。
図９は、１００ｍｍ^３の担癌マウスに対し、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体０３０４を２０μｇ／マウス個体で３回隔日投与したときの腫瘍の大きさを測定した結果を示す図。
図１０は、１００ｍｍ^３の担癌マウスに対し、精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体０３０４を２５μｇ／マウス個体で３回投与したときの腫瘍の大きさを測定した結果を示す図。
図１１ａは、組換え型精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体のＣｏｌｏ２０５細胞に対する細胞死誘導活性（ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体無添加）を示す図。
図１１ｂは、組換え型精製ヒト抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体のＣｏｌｏ２０５細胞に対する細胞死誘導活性（ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体添加）を示す図。

【００２９】
ルエル社製）を使用して、（９４℃、２０秒；６０℃、３０秒；６８℃、９０秒間）×３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。修飾されたＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２配列を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片として単離し、同一酵素で解裂されていたｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターに連結した。得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と命名した。ｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に組み込まれたＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、選択的スプライシングにより形成された２つの断片の中で、１３２０ｂｐのｃＤＮＡにコードされる４４０アミノ酸から成るものである。以下、実施例中のすべてのＰＣＲの反応温度調節は、ジーンアンプＰＣＲシステム９７００；（株）パーキンエルマー・ジャパン社製を使用した。
ｂ）ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ発現ベクターの調製
ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ発現ベクターを以下の方法にて調製した。１−３５１のアミノ酸配列を持つＴＲＡＩＬ−Ｒ１部分ペプチド、及び、１−３４８のアミノ酸配列を持つＴＲＡＩＬ−Ｒ２部分ペプチドからなる発現プラスミドを作製するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２部分ペプチドの５’末端にＥｃｏＲＩ配列、３’末端にＮｏｔＩ配列と終止コドンを付加する為のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１についてはオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＴＣＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＡ−３’（配列番号５）を、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２についてはオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＴＣＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＣＡＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号６）を、プラチナＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（ギブコビーアールエル社製）、及びｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を使用して、（９４℃、２０秒；６５℃、３０秒；及び６８℃、７５秒間）×２５サイクルの条件で行った。修飾されたＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の部分ペプチドを、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片として単離した。そしてこのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ酵素で解裂したｐＥＦｎｅｏベクターに連結した。得られたプラスミドをｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ及びｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａと命名した。
ｃ）ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２ｄｅｌｔａ発現細胞の作製
ｂ）で作製したｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｄｅｌｔａ及びｐＥＦ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｄｅｌｔａを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ（ギブコビーアールエル社製）を用いて、Ｌ９２９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｏ．ＣＣＬ−１）に導入した。遺伝子導入はマニュアルの方法にて行った。

【００５４】
上記組成の反応液を再蒸留水にて最終容量５０μｌとし、ＰＣＲに供した。
重鎖の増幅には、ＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とｈｈ−６プライマー（５’−ＧＧＴ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＡＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＴＣ ＣＴＴ−３’）（配列番号７）を用い、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とｈｈ−３プライマー（５’−ＧＴＧ ＣＡＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＣＣ ＴＧ−３’）（配列番号８）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。この後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）により精製し，ｈｈ−４（５’−ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＧ−３’）（配列番号９）をプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報から、Ｅ−１１−１３、Ｌ−３０−１０、Ｈ−４８−２の３クローンはＮ末領域の配列が一致していることが分かったため、サブクローニング及び塩基配列決定には共通のプライマーを使用した。配列情報を基に、ｔｎＨ４８Ｈｓａｌ（５’−ＡＴＡ ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＴＡ ＣＧＧ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＴＣ−３’）（配列番号１４）を合成し、このプライマーを用いて反対方向からも配列を決定した。特異的プライマーとｔｎＣＨＮｈｅ（５’−ＧＡＴ ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ Ｇ−３’）（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行い（９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）、重鎖増幅ｃＤＮＡ断片をＳａｌＩ、ＮｈｅＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｌａｒｋベクター（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎ５ＫＧ１（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ６００１３５８）の改変ベクター）に導入した。挿入された配列がｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅによって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
軽鎖は、ＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とｈｋ−２（５’−ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＧＡ ＧＣ−３’）（配列番号１２）プライマーを使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とｈｋ−６（５’−Ｔ ＧＧＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＧＴ Ｇ−３’）（配列番号１３）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。こ

【００５５】
の後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）により精製し、ｈｋ−６（５’−ｔｇｇｃ ｇｇｇ ａａｇ ａｔｇ ａａｇ ａｃａ ｇａｔ ｇｇｔ ｇ−３’）プライマーを用いて塩基配列を決定した。配列情報から、３クローン全てにおいてＮ末領域の配列が一致していることがわかったため、サブクローニングには共通のプライマーを使用した。配列情報を基に、ｔｎＨ４８ＫＢｇｌ（５’−ＡＴＡ ＴＡＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＣＡＧ ＴＴＡ ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＡＡＣ Ｃ−３’）（配列番号１０）を合成し、このプライマーを用いて、反対方向からも配列を決定した。特異的プライマーとｔｎＣｋＢｓｉ（５’−ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＴＡ ＣＧＴ ＴＴＧ ＡＴ−３’）（配列番号１５）を用いてＰＣＲを行い（９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）、軽鎖増幅ｃＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ、ＢｓｉＷＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｌａｒｋベクターに導入した。挿入された配列がｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅによって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
Ｅ−１１−１３重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
＜Ｅ−１１−１３ 重鎖可変領域＞（配列番号１６）

＜Ｅ−１１−１３ 重鎖可変領域＞（配列番号１７）

Claims (62)

1. ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する抗体又はその機能的断片。
2. 以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
   （ａ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現している癌細胞にアポトーシスを誘導する活性を有する
   （ｂ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現しているヒト正常細胞には影響を及ぼさない
   （ｃ）ヒト肝臓細胞傷害を誘発しない
3. 以下の（ａ）〜（ｃ）のすべての性質を有する抗体又はその機能的断片。
   （ａ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現している癌細胞にアポトーシスを誘導する活性を有する
   （ｂ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現しているヒト正常細胞には影響を及ぼさない
   （ｃ）ヒト肝臓細胞傷害を誘発しない
4. ＴＲＡＩＬ−Ｒ２には結合するがＴＲＡＩＬ−Ｒ１には結合しない請求項２又は３記載の抗体又はその機能的断片。
5. ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合しＴＲＡＩＬ−Ｒ１にも結合する請求項２又は３記載の抗体又はその機能的断片。
6. マウス−マウスハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
7. ヒト抗体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
8. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が０．０１μｇ／ｍｌ以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
9. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が０．１μｇ／ｍｌ以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
10. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が２−１０μｇ／ｍｌである請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
11. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が１０μｇ／ｍｌ以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
12. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が１０−１００μｇ／ｍｌである請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
13. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が１００μｇ／ｍｌ以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
14. 細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値が１００μｇ／ｍｌ以下である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
15. 細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値が１０μｇ／ｍｌ以下である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
16. 細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値が０．７μｇ／ｍｌ以下である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
17. 細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値が０．０２−０．１１μｇ／ｍｌである請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
18. 細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値が０．０２μｇ／ｍｌ以下である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
19. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が２−１００μｇ／ｍｌであり、かつ、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値が０．０２−０．１１μｇ／ｍｌである請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
20. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の２倍以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
21. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の１０倍以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
22. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の５０倍以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
23. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の５０倍−１００倍である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
24. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の１００倍以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
25. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の１００倍−１０００倍である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
26. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の２５０倍−１０００倍である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
27. 細胞数７．５ｘ１０^４及び反応時間２４時間におけるヒト肝細胞に対するＬＤ５０値が、細胞数２．５ｘ１０^３及び反応時間４８時間における癌細胞に対するＬＤ５０値の１０００倍以上である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
28. 反応容量が１１０〜１２０μｌである請求項８〜２７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
29. 癌細胞がＣｏｌｏ２０５細胞である請求項２、３、及び１４〜２８のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
30. 癌細胞が、Ｃｏｌｏ２０５細胞、Ｕ２５１細胞又はＪｕｒｋａｔ細胞である請求項２又は３記載の抗体又はその機能的断片。
31. 腫瘍の増殖を抑制し、又は腫瘍を退縮させることができる請求項１〜３０のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
32. 腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫及びウィルムス腫瘍等からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項３１記載の抗体又はその機能的断片。
33. 腫瘍が、ヌードマウスに移植されたＣｏｌｏ２０５細胞に由来するものである請求項３１記載の抗体又はその機能的断片。
34. 腫瘍の増殖を抑制し、又は腫瘍を退縮させることができる期間が少なくとも９日間である請求項３１〜３３のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
35. 抗体又はその機能的断片の投与量が１００μｇ／ｂｏｄｙ又は５ｍｇ／ｋｇである請求項３１〜３４のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
36. 抗体又はその機能的断片の投与量が２０μｇ／ｂｏｄｙ又は１ｍｇ／ｋｇである請求項３１〜３４のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
37. 抗体又はその機能的断片の投与量が４μｇ／ｂｏｄｙ又は２００μｇ／ｋｇである請求項３１〜３４のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
38. 抗体又はその機能的断片の投与量が１μｇ／ｂｏｄｙ又は５０μｇ／ｋｇである請求項３１〜３４のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
39. イムノグロブリンＧ型抗体であることを特徴とする、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
40. １００ｍｍ^３の腫瘍を有する４〜６週齢の担癌マウスに２０μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与４日後に平均１４％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる抗体又はその機能的断片。
41. 平均１４％以上の腫瘍の縮小を少なくとも７日維持することができる請求項４０記載の抗体又はその機能的断片。
42. １００ｍｍ^３の腫瘍を有する４〜６週齢の担癌マウスに２０μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与４日後に平均６５％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる請求項４０記載の抗体又はその機能的断片。
43. １００ｍｍ^３の腫瘍を有する４〜６週齢の担癌マウスに２０μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与７日後に平均８０％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる請求項４０記載の抗体又はその機能的断片。
44. 平均８０％以上の腫瘍の縮小を少なくとも４日維持することができる請求項４３記載の抗体又はその機能的断片。
45. １００ｍｍ^３の腫瘍を有する１２週齢の担癌マウスに２５μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与３日後に平均４５％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる請求項４０記載の抗体又はその機能的断片。
46. １００ｍｍ^３の腫瘍を有する１２週齢の担癌マウスに２５μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与５日後に平均６５％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる請求項４５記載の抗体又はその機能的断片。
47. 平均６５％以上の腫瘍の縮小を少なくとも２７日維持することができる請求項４６記載の抗体又はその機能的断片。
48. ３００ｍｍ^３の腫瘍を有する４〜６週齢の担癌マウスに２０μｇ／マウス個体の濃度で投与したときに、初回投与４日後に平均３９％以上の腫瘍の縮小を引き起こすことができる請求項４０記載の抗体又はその機能的断片。
49. 平均３９％以上の腫瘍の縮小を少なくとも１４日維持することができる請求項４８記載の抗体又はその機能的断片。
50. ０３０４抗体である請求項４０記載の抗体又はその機能的断片。
51. Ｅ−１１−１３抗体である請求項４０記載の抗体又はその機能的断片。
52. ハイブリドーマＥ−１１−１３、Ｈ−４８−２、Ｌ−３０−１０、Ｎ−１８−１２、Ｗ−４０−５、Ｘ−１４−４、Ｘ−５１−１２、Ｆ−４−８、Ｇ−３−１０、０３０４又はＫＭＴＲ１により産生される、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する抗体又はその機能的断片。
53. 受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７５９９であるハイブリドーマＨ−４８−２、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７６９８若しくはＦＥＲＭ ＢＰ−７７７０であるハイブリドーマＥ−１１−１３、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７６９９若しくはＦＥＲＭ ＢＰ−７７６８であるハイブリドーマＦ−４−８、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７７００若しくはＦＥＲＭ ＢＰ−７７６９であるハイブリドーマＬ−３０−１０、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−８０３７であるハイブリドーマ０３０４又は受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−８０３８であるハイブリドーマＫＭＴＲ１により産生される、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する抗体又はその機能的断片。
54. 配列番号１７及び１９にそれぞれ示される、ハイブリドーマＥ−１１−１３の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２１及び２３にそれぞれ示される、ハイブリドーマＬ−３０−１０の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２５及び２７にそれぞれ示される、ハイブリドーマＨ−４８−２の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２９及び３１にそれぞれ示される、ハイブリドーマ０３０４の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は配列番号３３及び３５にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭＴＲ１の産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
55. 配列番号１６及び１８にそれぞれ示される、ハイブリドーマＥ−１１−１３から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２０及び２２にそれぞれ示される、ハイブリドーマＬ−３０−１０から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２４及び２６にそれぞれ示される、ハイブリドーマＨ−４８−２から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２８及び３０にそれぞれ示される、ハイブリドーマ０３０４から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は配列番号３２及び３４にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭＴＲ１から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
56. Ｅ−１１−１３、Ｈ−４８−２、Ｌ−３０−１０、Ｎ−１８−１２、Ｗ−４０−５、Ｘ−１４−４、Ｘ−５１−１２、Ｆ−４−８、Ｇ−３−１０、０３０４及びＫＭＴＲ１からなる群から選ばれる、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
57. 受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７５９９であるハイブリドーマＨ−４８−２、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７６９８若しくはＦＥＲＭ ＢＰ−７７７０であるハイブリドーマＥ−１１−１３、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７６９９若しくはＦＥＲＭ ＢＰ−７７６８であるハイブリドーマＦ−４−８、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７７００若しくはＦＥＲＭ ＢＰ−７７６９であるハイブリドーマＬ−３０−１０、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−８０３７であるハイブリドーマ０３０４又は受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−８０３８であるハイブリドーマＫＭＴＲ１から選ばれる、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
58. 請求項５６又は５７記載のハイブリドーマを培養し、得られる培養物からＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する抗体を採取することを特徴とする、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の製造方法。
59. 請求項５６又は５７記載のハイブリドーマから抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清又は宿主の分泌物から抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体を採取することを特徴とする、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体の製造方法。
60. 宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞並びに哺乳動物からなる群から選ばれるいずれかのものである請求項５９記載の製造方法。
61. 請求項１〜５５のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効成分として含有する、腫瘍の予防又は治療剤。
62. 腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫及びウィルムス腫瘍等からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項６１記載の予防又は治療剤。

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