KR20040044408A - 항 ｔｒａｉｌ-ｒ 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이하의 (a) 내지 (c)에서 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는 항 TRAIL-R1 및 R2 항체 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다.

(a) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2를 발현하는 암 세포에서 아팝토시스를 유도하는 활성을 갖는다.

(b) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2를 발현하는 인간 정상 세포에는 영향을 미치지 않는다.

(c) 인간 간 세포 상해를 유발하지 않는다.

Description

항 ＴＲＡＩＬ-Ｒ 항체 {Anti-TRAIL-R Antibodies}

생체 내에서 정상적인 세포 교대를 위해 생기는 생리적인 세포사는 아팝토시스라고 불리우며, 병리적인 세포사인 괴사(necrosis)와는 구별된다[Kerr, et al. (1972) Br. J. Cancer 26, 239 참조]. 아팝토시스는 배아 발생이나 림프구(T 세포 및 B 세포)의 선택 등의 과정에서 일반적으로 보여지는 현상이다[Itoh, S., et al. (1991) Cell 66, 233-243 참조]. 아팝토시스에 의해 본래 배제되어야 할 세포가 배제되지 않으면, 그것이 암, 루푸스, 헤르페스 바이러스 감염 등의 원인이 되는 경우가 있다고 여겨지고 있다. 또한, 본래 생존해야 할 세포가 아팝토시스에 의해 배제되어 버리면 AIDS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증, 다발성 경화증, 망막 색소 변성증, 재생 불량성 빈혈, 심근경색, 뇌졸중, 독성 물질에 의한간 장해 등의 질환이나 병태의 원인이 되는 경우가 있다[Kataoka, S., et al. (1996) The Oncologist 1, 399-401 참조].

아팝토시스에서는 세포 표면의 만곡, 핵 크로마틴의 응축, 염색체 DNA의 단편화, 미토콘드리아의 기능 소멸 등의 현상이 특징적으로 관찰된다. 내인성, 외인성의 여러가지 시그널이 이러한 세포의 변화를 야기한다고 여겨지고 있으며, 내인성인 것으로서 myc, bcl-2 등의 암 유전자나, p53 등의 암 억제 유전자가 아팝토시스의 유도에 관여하고 있다는 것이 보고되어 있다[가따오까 유끼로 등(1993) 실험 의학 11, 17, 2324-2328 참조]. 외인성 시그널로서는 화학 요법제나 방사선 등이 아팝토시스를 유도하는 것이 알려져 있다[가따오까 유끼로 등(1994) 최신 의학 49, 6, 1152-1157 참조].

이러한 아팝토시스에 관여하는 분자로서는 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 종양 괴사 인자-β(TNF-β), Fas 리간드 등의 종양 괴사 인자 패밀리(TNF 패밀리)에 속하는 분자가 동정되어 있다. TNF-α 및 TNF-β는 암 세포에서 아팝토시스를 유도한다는 보고가 있다[Schmid, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 1881 참조; Dealtry et al.(1987) Eur. J. Immunol. 17, 689 참조]. 마우스의 Fas 또는 Fas 리간드의 변이 개체는 자기 면역 질환의 상태를 나타내기 때문에, Fas 리간드가 말초에서의 자기 항원 반응성 림프구를 아팝토시스에 의해 배제하는 기능을 담당하는 것이 강하게 시사되어 있다[Krammer, et al. (1994) Curr. 0p. Immunol. 6, 279-289 참조; Nagata, et al.(1995) Science 267, 1449-1456 참조]. Fas에 특이적으로 결합하는, 작용제 활성을 지닌 마우스 모노클로날 항체는 암 세포에 대하여TNF-α와 동일한 정도의 아팝토시스 유도 활성을 나타내는 것이 보고되어 있다[Yonehara, et al. (1989) J. Exp. Med. 169. 1747-1756].

이들 TNF 패밀리 분자는 세포 표면의 특이적 수용체에 결합함으로써 세포 내에 시그널을 전달하고 있다. TNF 패밀리 분자의 수용체는 여러가지가 알려져 있으며, TNF 수용체 패밀리 분자라고 호칭된다.

TNF 수용체 패밀리 분자는 세포 외 도메인의 시스테인 풍부 반복서열의 존재에 의해 정의되는데, 그 중에서도 Fas 리간드 및 TNF-α의 수용체인 Fas 및 TNFR1은 초파리 자살 유전자인 reaper[Golstein, P., et al. (1995) Cell. 81, 185-186 참조; White, K., et al. (l994) Science 264, 677-683 참조]와 상동성을 나타내는 영역인 "데쓰 도메인(death domain)"이라고 불리우는 아팝토시스의 시그널 전달에 필수적인 영역을 세포 내에 갖는다. Fas의 활성화는 데쓰 도메인을 포함하는 어댑터 분자 FADD/MORT1의 회합을 촉진하며, FADD/M0RT1에 결합되어 있는 카스파제 (caspase)-8의 활성화를 야기한다. 활성화된 카스파제-8에 의해 하류의 카스파제 분자군을 순차적으로 활성화하여 최종적으로 세포를 아팝토시스로 유도한다 [Nagata, S., (1997) Cell 88, 355-365 참조].

최근, 아팝토시스를 유도하는 신규한 TNF 패밀리 분자가 발견되었다. 와일리(Wiley) 등[Immunity(1995) 3, 673-682 참조]은 이 분자를 "TNF 관련 아팝토시스 유도 리간드" 또는 간단하게 "TRAIL"이라고 명명하였다. 이 분자는 또한 "Apo-2 리간드" 또는 "Apo-2L"이라고도 불리우고 있다[Pitt, R. M., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 12687-12690 참조]. 편의상, 본 명세서에서 이 분자를 TRAIL이라고 부르기로 한다.

Fas 리간드와는 달리 유의적인 수준의 TRAIL은 많은 인간 조직 중에서 검출된다(예를 들면, 비장, 폐, 전립선, 흉선, 난소, 소장, 대장, 말초혈 림프구, 태반, 신장). 또한, 몇가지 세포주에서 상시적으로 전사된다. TRAIL은 Fas에 의한 사멸의 시그널 전달과 유사한 시간 틀(time frame) 내에서 TNF 유도성 아팝토시스보다도 매우 빨리 아팝토시스를 급속하게 활성화시키는 것도 시사되어 있다[Marsters, S. A., et al. (1996) Curr. Biol. 6, 750-752 참조].

TRAIL의 수용체로서 현재 다섯가지의 단백질이 동정되어 있다. TRAIL-R1("DR4"라고도 함) 및 TRAIL-R2("DR5"라고도 함)의 두가지 수용체는 모두 데쓰 도메인을 세포 내 영역에 갖는 것이 보고되어 있다. TRAIL-R1의 전사 산물은 비장, 말초혈 백혈구, 소장, 흉선을 포함하는 인간의 대부분의 조직 중에서 확인된다. TRAIL-R2의 전사 산물은 비장, 말초혈 림프구, 난소를 비롯한 많은 조직 중에서 확인되고 있다[Pan, G., et al. (1997) Science 276, 111-113 참조; Pan G., et al. (1997) Science 277, 815-818 참조; Walczak, H., et al. (1997) EMBO J 16(17) 5386-5397 참조].

TRAIL-R2에는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의한 두가지 형태가 존재하며, 암 세포에서는 440개의 아미노산으로 이루어지는 TRAIL-R2의 발현량이 많은 것이 보고되어 있다[Screaton, G. R., et al. (1997) Curr Biol 7(9), 693-696 참조; Arai, T., et al. (1998) Cancer Letters 133, 197-204 참조].

재조합형 인간 TRAIL은 TRAIL의 세포 외 영역으로 이루어지는 재조합 단백질이며, 이제까지 여러종류의 암 세포에서 아팝토시스를 유도하는 것이 보고되어 있다 [Griffith, T. S., et al. (1998) Curr. Opin. Immunol., 10, 559-563 참조].

또한, 재조합형 인간 TRAIL은 인간의 대장암 세포 및 유방암 세포를 이용하한 암에 걸린 마우스 모델에서 효과를 나타내고 있다[Walczak, H., et al. (1999) Nature Medicine 5, 2, 157-163 참조]. 마찬가지로 TNF 수용체 패밀리에 속하며, 아팝토시스 유도 활성을 갖는 TNF-α나 Fas 리간드와는 달리, TRAIL은 마우스 및 키노몰구스(cynomolgus)의 정상 조직에 대하여 상해를 끼치지 않았다[Ashkenazi, A., et al. (1999) J. Clin. Invest. 104, 155-162 참조].

이들 보고에 의해 TRAIL은 종양 선택적으로 세포사를 유도한다고 여겨졌지만, TRAIL의 수용체는 정상 세포에도 발현되고 있어 선택성의 이론적 뒷받침은 아직 되어 있지 않았다. 또한, 최근 재조합 인간 TRAIL이 인간 정상 간 실질 세포(hepatocyte)에서 아팝토시스를 유도하는 것이 보고되어 있으며[Jo, M., et al. (2000) Nature Medicine 6, No.5, 564-567 참조], 또한 인간 뇌 세포에서도 아팝토시스를 유도하는 것이 보고되었다[Nitsch, R., et al. (2000) The Lancet 356, 827-828 참조]. 간 세포에서 아팝토시스를 유도하는 작용제 항 Fas 항체는 매우 단시간만에 극증간염을 유발하여 마우스나 침팬지를 사망에 이르게 한다는 점에서 TRAIL의 간 세포에 대한 세포사 유도는 특히 큰 문제로서 주목받고 있으며, TRAIL을 인간에게 의약품으로서 사용하는 경우의 안전성에 의문이 던져지고 있었다[Nagata, S., (2000) Nature Medicine 6, 5, 502-503 참조].

TRAIL의 간 세포에 대한 세포사 유도 활성의 유무는 재조합 TRAIL 단백질의종류에 의존한다는 보고도 나와 있지만[Lawrence, D., et al. (2001) Nature Medicine 7, 4, 383-385 참조], 재조합 TRAIL 단백질의 안전성은 아직 연구 개발 중이다.

최근, 마우스에 투여했을 때 간 상해를 유발하지 않는 항 Fas 항체가 처음으로 보고되었다[Ichikawa, K., et al. (2000) International Immunology 12, No.4, 555-562 참조]. 간 상해를 유발하지 않는 것이 확인된 재조합형 Fas 리간드는 알려져 있지 않다. 이것은 리간드에서는 기대할 수 없는 활성을 가진 항체를 얻을 수 있음을 시사하고 있다. 그러나, 이 항체가 T 세포에서는 아팝토시스를 유도함에도 불구하고, 어떠한 이유로 간 독성을 나타내지 않는가라는 이론적인 배경은 밝혀져 있지 않으며, 예를 들어 TRAIL 등도 항원이 다른 경우에 독성이 없는 작용제 항체를 취득할 수 있는지의 여부는 명확하지 않다.

TRAIL은 TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2 또는 이들 양쪽에 작용하여 아팝토시스를 유도하지만, TRAIL이 간 세포에서 아팝토시스를 유도할 때 어떠한 수용체를 통해 시그널을 주는가는 명확하지 않다. 또한, 작용제 항체에 TRAIL-R1/R2 선택성을 부가함으로써 간 독성을 회피할 수 있는지와 같은 착상에 입각한 연구는 아직 이루어져 있지 않다.

악성 종양에 대해서는 암 세포를 제거하여 정상 조직 또는 세포를 보호하는 것이 유효한 치료 수단이 된다. 재조합형 인간 TRAIL에 의한 아팝토시스 유도를 작용기작으로 하는 약물은 암 세포를 제거할 수는 있어도 정상 조직, 특히 간, 뇌에 상해를 일으킬 가능성이 있다.

현재, 세포막 상에 존재하는 수용체인 CD20을 표적으로 한 키메라 항체, Her2/neu를 표적으로 한 인간화 항체 등의 모노클로날 항체가 악성 종양을 대상 질환으로서 사용되고 있으며, 그 치료 효과가 확인되고 있다. 항체는 혈중 반감기가 길고, 항원에 대한 특이성이 높다는 특징을 가져 항종양제로서 특히 유용하다. 예를 들면, 종양 특이적인 항원을 표적으로 한 항체라면, 투여한 항체는 종양에 집적될 것으로 추정되기 때문에 보체 의존적 세포 상해나 항체 의존적 세포 상해에 의한 면역 시스템의 암 세포에 대한 공격을 기대할 수 있다. 또한, 그 항체에 방사성 핵종이나 세포 독성 물질 등의 약제를 결합시킴으로써, 결합된 약제를 효율적으로 종양 부위에 송달할 수 있게 되고, 동시에 비특이적인 타조직으로의 상기 약제 도달량이 감소됨으로써 부작용의 경감도 기대할 수 있다. 종양 특이적 항원에 세포사를 유도하는 활성이 있는 경우에는 작용제 활성을 갖는 항체를 투여함으로써, 또는 종양 특이적 항원이 세포 증식 및 생존에 관여하는 경우에는 중화 활성을 갖는 항체를 투여함으로써 종양 특이적인 항체의 집적과 항체 활성에 의한 종양의 증식 억제 또는 퇴화가 기대된다.

항체는 상기한 바와 같이 그 특징으로부터 항종양제로서 적용하는 데 적절하다고 여겨지고 있다. 또한, TRAIL의 수용체에 대한 항체라면 재조합형 인간 TRAIL 자체로는 피할 수 없는 간에서의 상해를 피하고, 암 세포에 대해서는 동등한 아팝토시스 유도 활성을 갖는 것을 얻을 수 있을 가능성이 있다.

본 발명은 아팝토시스(apoptosis)에 관여하는 세포막 분자인 TRAIL 수용체 1(TRAIL-R1)또는 TRAIL 수용체 2(TRAIL-R2)를 인식하는 항 TRAIL 수용체(TRAIL-R) 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 항 TRAIL-R 항체를 유효 성분으로 하는, TRAIL-R을 발현하는 세포에서 기인하는 질환에 대한 예방 또는 치료제, 특히 악성 종양 치료제에 관한 것이다.

도 1은 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청액 중의 Colo205에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 2는 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청액 중의 Colo205에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 3은 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청액 중의 Colo205에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면(염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체 무첨가).

도 4는 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청액 중의 HUVEC에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5a는 인간 재조합형 TRAIL(양성 대조군)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5b는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(H-48-2)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5c는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(E-11-13)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5d는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(L-30-10)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5e는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(F-4-8)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5f는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(W-40-5)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5g는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(0304)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5h는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(0322)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5i는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(KMTR1)의 Colo205 및 정상인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5j는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(D1M)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5k는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(0304, 염소 항 인간 IgG 항체 무첨가)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 5l은 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체(KMTR1, 염소 항 인간 IgG 항체 무첨가)의 Colo205 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 도면.

도 6은 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 E-11-13, F-4-8, H-48-2, L-30-10, W-40-5를 1 ㎍/마우스 개체로 3회 격일간 투여했을 때의 종양 크기를 측정한 결과를 나타내는 도면.

도 7은 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 E-11-13을 4, 20, 100 ㎍/마우스 개체로 4회 투여했을 때의 종양 크기를 측정한 결과를 나타내는 도면.

도 8은 300 mm³의 암에 걸린 마우스에 대하여 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 E-11-13을 20 ㎍/마우스 개체로 3회 격일간 투여했을 때의 종양 크기를 측정한 결과를 나타내는 도면.

도 9는 100 mm³의 암에 걸린 마우스에 대하여 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 0304를 20 ㎍/마우스 개체로 3회 격일간 투여했을 때의 종양 크기를 측정한 결과를 나타내는 도면.

도 10은 100 mm³의 암에 걸린 마우스에 대하여 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 0304를 25 ㎍/마우스 개체로 3회 투여했을 때의 종양 크기를 측정한 결과를 나타낸 도면.

도 11a는 재조합형 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 Colo205 세포에 대한 세포사 유도 활성 (염소 항 인간 IgG 항체 무첨가)을 나타낸 도면.

도 11b는 재조합형 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 Colo205 세포에 대한 세포사 유도 활성 (염소 항 인간 IgG 항체 첨가)을 나타낸 도면.

본 발명의 제1 목적은 인간 TRAIL-R1 및(또는) 인간 TRAIL-R2에 결합할 수있고, 암 세포에 대하여 특이적으로 아팝토시스를 유도하며, 재조합 인간 TRAIL 단백질로는 상해를 일으킬 가능성이 있는 인간 정상 간 실질 세포에 대하여 상해를 유발하지 않는 신규한 항체, 또는 그와 유사한 분자를 제공하는 데 있다. 제2의 목적은 상기 항체, 또는 그와 유사한 분자를 유효 성분으로서 함유하는, 현재 치료 곤란한 고형 종양을 비롯한 각종 악성 종양의 예방 또는 치료제를 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 인간 TRAIL-R1 및 R2에 대한 항체 제조에 대하여 예의 연구한 결과, 유전자 공학 기술을 이용하여 인간 유래의 항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 인간 TRAIL-R1 또는 R2로 면역화시키고, 모노클로날 항체의 제조에 있어서 관용되고 있는 켈러 및 밀스테인 등의 방법[(1975) Nature 256, 495 참조]을 이용함으로써 신규한 TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2에 결합되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하고, 그 배양 상청액으로부터 상기 모노클로날 항체를 취득하는 데 성공하였다. 또한, 이 신규한 모노클로날 항체는 암 세포 표면에 있는 TRAIL-R1 및(또는) R2에 결합되어 암 세포 특이적으로 아팝토시스를 유도하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2에 결합되는 항체 또는 그의 기능적 단편.

상기 항체 또는 그의 기능적 단편은 이하의 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는 것이다.

(a) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2를 발현하는 암 세포에서 아팝토시스를 유도하는 활성을 갖는다.

(b) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2를 발현하는 인간 정상 세포에는 영향을 미치지 않는다.

(c) 인간 간 세포 상해를 유발하지 않는다.

본 발명에서는 상기한 (a) 내지 (c)의 모든 성질을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이 바람직하다. 또한, 상기 (a) 내지 (c) 중 하나 이상의 성질을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편으로서, ① TRAIL-R2에는 결합되지만, TRAIL-R1에는 결합되지 않는 것, 또는 ② TRAIL-R2 및 TRAIL-R1의 양자 모두에 결합되는 것도 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편에 포함된다.

(2) 상기 항체는 마우스-마우스 하이브리도마, 예를 들면 E-11-13, H-48-2, L-30-10, N-18-12, W-40-5, X-14-4, X-51-12, F-4-8, G-3-10, 0304 또는 KMTR1에 의해 생산되는 모노클로날 항체이며, 인간 항체인 것이 바람직하다. E-11-13, H-48-2, L-30-10, N-18-12, W-40-5, X-14-4, X-51-12, F-4-8, 0304 또는 KMTR1에 의해 생산되는 모노클로날 항체 타입은 면역글로불린 G(IgG)형이고, G-3-10에 의해 생산되는 모노클로날 항체 타입은 면역글로불린 M(IgM)형이다. 여기서, 상기 하이브리도마 중 H-48-2, E-11-13, F-4-8, L-30-10, 0304 및 KMTR1은 각각 국제 기탁되어 있으며, 그 기탁 정보는 이하와 같다.

명칭	수탁 번호	기탁일	기탁처
H-48-2	FERM BP-7599	2001년 5월 18일	독립행정법인산업기술종합연구소특허생물기탁 센터(일본 이바라기껭쯔꾸바시 히가시1쪼메 1반지 1주오다이6)
E-11-13	FERM BP-7698FERM BP-7770	2001년 8월 8일2001년 10월 11일
F-4-8	FERM BP-7699FERM BP-7768	2001년 8월 8일2001년 10월 11일
L-30-10	FERM BP-7700FERM BP-7769	2001년 8월 8일2001년 10월 11일
0304	FERM BP-8037	2002년 5월 10일
KMTR1	FERM BP-8038	2002년 5월 10일

암 세포로서는 대장암 세포 Colo205, 신경교종 유래 U251 세포 또는 T 세포 림프종 유래 Jurkat 세포를 들 수 있으며, 이들 세포 중에서 적절하게 선택된다.

(3) 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간의 조건에서 인간 간 세포에 대한 LD50치가 0.01 ㎍/㎖ 이상, 바람직하게는 0.1 ㎍/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 10 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 10 ㎍/㎖ 이상(예를 들면 100 ㎍/㎖ 이상임)이다. 한편, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간의 조건에서 암 세포(예를 들면 Colo205 세포, U251 세포 또는 Jurkat 세포)에 대한 LD50치가 100 ㎍/㎖ 이하, 바람직하게는 10 ㎍/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 0.7 ㎍/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.11 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 0.02 ㎍/㎖ 이하이다. 또한, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간세포에 대한 LD50치가 2 내지 100 ㎍/㎖이고, 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치가 0.02 내지 0.11 ㎍/㎖인 조합의 항체 또는 그의 기능적 단편이 본 발명에서 특히 바람직하다.

여기서, 본 발명의 항체의 상기 간 세포 또는 암 세포에 대한 LD50은 1 반응계당(1 웰당) 110 내지 120 ㎕의 반응 용량으로 행해졌을 때의 측정치이다.

(4) 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 2 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상, 보다 바람직하게는 50 배 이상(예를 들면, 50 배 내지 100 배), 더욱 바람직하게는 100 배 이상(예를 들면 100 배 내지 250 배), 더 더욱 바람직하게는 250 배 내지 1000 배, 가장 바람직하게는 1000 배 이상이다.

(5) 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은 종양(예를 들면, 누드 마우스에 이식된 Colo205 세포로부터 유래하는 것)의 증식을 억제하거나, 또는 종양을 퇴화시킬 수 있다. 이 경우, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 투여했을 때 종양 세포의 증식을 억제할 수 있는 기간 또는 종양을 퇴화시킬 수 있는 기간은 9일 이상, 바람직하게는 11일 이상, 더욱 바람직하게는 13일 이상이며, 이하 30일 이상, 60일 이상의 순서로 바람직하고, 120일 이상이 가장 바람직하다. 또한, 종양을 지닌 피검 동물(예를 들면, 암에 걸린 실험 동물, 체중 20 g으로 함)에 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 투여하는 양은 0.1 ㎍/신체(5 ㎍/kg)내지 100 ㎍/신체(5 mg/kg)이다. 예를 들면, 투여량은 100 ㎍/신체 또는 5 mg/kg, 바람직하게는 20 ㎍/신체 또는 1 mg/kg, 보다 바람직하게는 4 ㎍/신체 또는 200 ㎍/kg, 더욱 바람직하게는 1 ㎍/신체 또는 50 ㎍/kg이다. 또한, 0.5 ㎍/신체(25 ㎍/kg)를 투여할 수도 있다. 투여 빈도로서는 1 주일당 1회 내지 3회의 빈도 또는 격일 투여 등을 들 수 있다.

또한, 암에 걸린 마우스에서의 본 발명의 항체(예를 들면 0304 항체 또는 E-11-13 항체) 또는 그의 기능적 단편의 항종양 효과는 이하와 같다.

(a) 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 4 내지 6 주령의 마우스에게 20 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 4일 후에 평균 14 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있다. 이 경우, 평균 14 ％ 이상의 종양 축소를 7일 이상 유지할 수 있다.

(b) 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 4 내지 6 주령의 마우스에게 20 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 4일 후에 평균 65 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있다.

(c) 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 4 내지 6 주령의 마우스에게 20 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 7일 후에 평균 80 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있다. 이 경우, 평균 80 ％ 이상의 종양 축소를 4일 이상 유지할 수 있다.

(d) 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 12 주령의 마우스에게 25 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 3일 후에 평균 45 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있다.

(e) 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 12 주령의 마우스에게 25 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 5일 후에 평균 65 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있다. 이 경우, 평균 65 ％ 이상의 종양 축소를 27일 이상 유지할 수 있다.

(f) 300 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 4 내지 6 주령의 마우스에게 20 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 4일 후에 평균 39 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있다. 이 경우, 평균 39 ％ 이상의 종양 축소를 14일 이상 유지할 수 있다.

종양으로서는 대장암, 결장 직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 흑색종, 신장 세포암, 방광암, 백혈병, 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 난포막종, 남성 배종, 자궁 내막 과형성, 자궁 내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상세포종, 신경섬유종, 희돌기교세포종, 수아세포종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 과오아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상육종 및 윌름스 종양(Wilms tumor) 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을들 수 있다.

(6) 서열 17 및 19로 각각 표시되는, 하이브리도마 E-11-13이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 21 및 23으로 각각 표시되는, 하이브리도마 L-30-10이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 25 및 27로 각각 표시되는, 하이브리도마 H-48-2가 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 29 및 31로 각각 표시되는, 하이브리도마 0304가 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는 서열 33 및 35로 각각 표시되는, 하이브리도마 KMTR1이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.

상기 항체 또는 그의 기능적 단편은, 예를 들면 서열 16 및 18로 각각 표시되는, 하이브리도마 E-11-13으로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 20 및 22로 각각 표시되는, 하이브리도마 L-30-10으로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 24 및 26으로 각각 표시되는, 하이브리도마 H-48-2로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 28 및 30으로 각각 표시되는, 하이브리도마 0304로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는 서열 32 및 34로 각각 표시되는, 하이브리도마 KMTR1로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분의 아미노산 서열을 갖는 것이다.

(7) E-11-13, H-48-2, L-30-10, N-18-12, W-40-5, X-14-4, X-51-12, F-4-8,G-3-10, 0304 및 KMTR1로 이루어지는 군에서 선택되는, TRAIL-R2에 결합되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.

(8) 상기 하이브리도마를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 TRAIL-R2에 결합되는 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는, 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 제조 방법.

(9) 상기 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 단리하고, 이 유전자를 갖는 발현 벡터를 구축하고, 이 발현 벡터를 숙주에 도입하여 상기 모노클로날 항체를 발현시키고, 얻어지는 숙주, 숙주의 배양 상청액 또는 숙주의 분비물로부터 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는, 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 제조 방법.

숙주로서는 대장균(Escherichia coli), 효모 세포, 곤충 세포, 포유 동물 세포, 식물 세포 및 포유 동물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 들 수 있다.

(10) 상기 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 종양의 예방 또는 치료제.

여기서, 종양으로서는 대장암, 결장 직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 흑색종, 신장 세포암, 방광암, 백혈병, 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 난포막종, 남성 배종, 자궁 내막 과형성, 자궁 내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시 육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상세포종, 신경섬유종, 희돌기교세포종, 수아세포종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 과오아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상육종 및 윌름스 종양 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 명세서는 본원의 우선권 기초인 일본국 특허 출원 2001-150213호(2001년 5월 18일 출원), 일본국 특허 출원 2001-243040호(2001년 8월 9일 출원) 및 일본국 특허 출원 2001-314489호(2001년 10월 11일 출원) 명세서 및(또는) 도면에 기재된 내용을 포함한다.

항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체에 암 세포에 대하여 아팝토시스를 유도하는 활성이 있다고 보고되어 있다[Griffith, T. S., et al. (1999) J. Immunol. 162, 2597-2605 참조; Chuntharapai, A., et al. (2001) J. Immunol. 166, 4891-4898 참조]. 그러나, 이들 항체는 마우스로부터 유래된 것이다.

또한, 재조합 인간 TRAIL 단백질에서 문제가 되고 있는, 인간 정상 간 실질 세포에 대한 상해성에 대하여 문제가 된다.

놀랍게도 본 발명의 신규 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체는 인간 정상 조직으로부터 유래되는 세포에 대해서 뿐만 아니라, 재조합 인간 TRAIL 단백질에 의한 세포 상해성이 염려되는 정상 간 실질 세포에 대해서도 상해를 유발하는 부작용이 없다는 것이 판명되었다. 본 발명자들은 신규 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 취득함으로써, 안전성 및 치료 효과 향상의 가능성이라는 이점을 구비한 항체를 제조하는 데 세계에서 제일 먼저 성공하여 본 발명을 완성시켰다. 이 모노클로날 항체는 바람직하게는 인간 항체이며, 마우스 유래 항체에서 항상 문제가 되는 항원성은 이미 극복되어 있다.

상기 항체로서는 면역글로불린 G(IgG), A(IgA), E(IgE) 및 M(IgM) 중 어느 하나의 형태를 바람직하게 사용할 수 있지만, 통상은 IgG가 보다 바람직하다.

이하, 본 발명에서 사용하는 어구의 의미를 명확히 함으로써 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. TRAIL 및 그의 항체

본 발명의 항체는 종양 괴사 인자(TNF) 관련 아팝토시스 유도 리간드(TRAIL; TNF-related apoptosis-inducing ligand)의 수용체(TRAIL-R)에 대한 항체로서, ① TRAIL-R1에 반응하는 항체, ② TRAIL-R2에 반응하는 항체 및 ③ TRAIL-R1과 TRAIL-R2 양자에 반응하는 항체가 존재한다. 본 발명에서는 ①의 항체를 "항 TRAIL-R1 항체", ② 및 ③의 항체를 "항 TRAIL-R2 항체"라고도 한다. 또한, 본 명세서에서 TRAIL-R1과 TRAIL-R2 양쪽의 TRAIL 수용체를 편의적으로 합쳐서 설명하는 경우에는 "TRAIL-R1 및 R2"라고 하기도 한다. 따라서, 예를 들면 "TRAIL-R1 및 R2 발현 벡터"와 같이 기재한 경우에는(후술하는 실시예 1 참조), TRAIL-R1의 발현 벡터와 TRAIL-R2의 발현 벡터 두가지를 설명하는 것을 의미한다.

본 발명에서의 "항체"란 상기에 정의된 바와 같은 인간 TRAIL-R1 및 R2 또는 그 일부에 반응성을 갖는 항체 또는 항체의 일부로서, 이들 항체의 기능적 단편도 포함한다. "기능적 단편"이란 항체의 일부분(부분 단편)으로서, 항체의 항원에 대한 작용을 하나 이상 유지하는 것을 의미하며, 구체적으로는 F(ab')₂, Fab', Fab,Fv, 디술피드 결합 Fv, 단일쇄 Fv(scFv) 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd).

본 발명에서 "인간 항체"란 인간으로부터 유래한 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다.

본 발명의 항체로서는, 예를 들면 후술하는 실시예 7에 기재된 인간 TRAIL-R1 및 R2가 발현하는 암 세포에서 아팝토시스를 유도하는 특성을 갖는 각종 항체를 들 수 있다.

본 발명의 항체에는 항체를 구성하는 중쇄 및(또는) 경쇄 각각의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및(또는) 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체도 포함된다. 본 발명의 항체 아미노산 서열 중 상기와 같은 아미노산의 부분적 개변(결실, 치환, 삽입, 부가)을 행하기 위해서는, 그 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 부분적으로 개변하는 것을 하나의 방법으로서 들 수 있다. 이 염기 서열의 부분적 개변은 공지된 부위 특이적 변이 도입법(site specific mutagenesis)을 이용하여 표준 방법에 의해 도입할 수 있다(Proc Natl Acad Sci USA., 1984 Vol81: 5662). 여기서, 항체란 면역글로불린을 구성하는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 및 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 모든 영역이 면역글로불린을 코딩하는 유전자로부터 유래하는 면역글로불린이다.

본 발명의 항체에는 모든 면역글로불린 클래스 및 이소타입을 갖는 항체가포함된다.

본 발명의 항 TRAIL-R1 및 R2 항체는 하기와 같은 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 예를 들면, 상기에 정의한 바와 같은 인간 TRAIL-R1 및 R2 또는 그의 일부와, 항원의 항원성을 높이기 위한 적당한 물질(예를 들면, 소 혈청 알부민 등)의 결합물을 필요에 따라 면역보강제(프로인트의 완전 또는 불완전 면역보강제 등)와 함께 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스 등을 포함하는 비인간 포유 동물에 면역화시킨다. 또는, 인간 TRAIL-R1을 코딩하는 유전자, 또는 인간 TRAIL-R2를 코딩하는 유전자를 도입하여 TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2를 세포 표면에 과잉 발현하는 동물 세포를 투여함으로써 면역 감작을 행할 수 있다. 모노클로날 항체는 면역 감작 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와 자기 항체 생산능이 없는 골수종계 세포(미엘로마 세포)를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마를 배양하고, 면역화에 이용한 항원에 대하여 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 취득할 수 있다.

본 발명의 항체는 당업자에게 주지된 유전자 공학적 개변에 의해 다른 서브클래스로 변환된 것도 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 서브클래스를 IgG2 또는 IgG4로 변환함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도가 낮은 항체를 취득할 수 있다. 반대로, 본 발명의 항체의 서브클래스를 IgG1 또는 IgG3으로 변환함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도가 높은 항체를 취득할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 불변 영역의 아미노산 서열을 인위적으로 개변하거나, 또는 그러한 서열을 갖는 불변 영역 서열과 결합함으로써 Fc 수용체에 대한 결합도를 변화시킬 수도 있다. 또한, 본 발명의 항체에 요오드, 이트륨, 인듐, 테크네튬 등의 방사성 핵종(J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 Academic Press), 녹농균 독소, 디프테리아 독소, 리신 등의 세균 독소, 메토트렉세이트, 마이토마이신, 카리키아마이신 등의 화학 요법제(D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd.; M. L. Grossbard., Monoclonal Antibody-BasedTherapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc), 또는 마이탄시노이드 등의 전구약물(Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol. 52: 127; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 Vol.93: 8681)등을 결합시킴으로써 암 등의 질환 치료 효과를 더욱 증강시킬 수도 있다.

또한, 발명자들은 본 발명의 항체에 있어서 TRAIL-R2에 결합되고, TRAIL-R1에는 결합되지 않는 성질을 갖는 것에 인간 간 세포에 상해를 유발하지 않는 것이 포함되어 있는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 TRAIL-R2에 결합되는 항체 집단으로부터 TRAIL-R1에는 결합되지 않는 것을 선발하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 간 세포 상해성을 갖지 않는 항 TRAIL-R2 항체의 제조 방법도 제공한다. 그러나, 간 세포 상해성을 갖지 않는 본 발명의 항체는 TRAIL-R2에 결합되고, TRAIL-R1에는 결합되지 않는 성질을 갖는 것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 모노클로날 항체의 제조시에는 하기의 작업 공정을 포함한다. 즉, (1) 생체 고분자의 정제 및(또는) 항원 단백질을 세포 표면에 과잉 발현하는 세포의 제조(이들 생체 고분자 및(또는) 세포는 면역원으로서 사용됨), (2) 항원을 동물에 주사함으로써 면역화시킨 후, 혈액을 채취하여 그 항체 역가를 검정하여 비장 등의 적출 시기를 결정하고 나서, 항체 생산 세포를 제조하는 공정, (3) 골수종 세포(이하, "미엘로마"라고 함)의 제조, (4) 항체 생산 세포와 미엘로마의 세포 융합, (5) 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마 군의 선별, (6) 단일 세포 클론으로의 분할(클로닝), (7) 경우에 따라서는 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육, (8) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성 및 그 인식 특이성의 검토, 또는 표지 시약으로서의 특성 검정 등이다.

이하, 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체의 제조 방법을 상기 공정에 따라 상술하지만, 이 항체의 제조 방법은 이것으로 한정되지 않으며, 예를 들면 비장 세포 외의 항체 생산 세포 및 미엘로마를 사용할 수도 있다.

(1) 항원의 정제

항원으로서는 인간 TRAIL-R1 및 R2의 세포 외 영역과 인간 IgG의 Fc 영역의 융합 단백질(이하 "TRAIL-R1-hFc" 및 "TRAIL-R2-hFc"라고 함)을 사용할 수 있다. TRAIL-R1-hFc 및 TRAIL-R2-hFc는 TRAIL-R1 또는 R2와 인간 IgG의 Fc 영역과의 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 동물 세포용 발현 벡터에 삽입하고, 이 발현 벡터를 동물세포에 도입하고, 취득한 형질전환주의 배양 상청액으로부터 정제함으로써 취득할 수 있다. 또는 ALEXIS사 등에서 시판되고 있는 TRAIL-R1-hFc 및 TRAIL-R2-hFc를 사용할 수도 있다. 또한, 인간 세포주의 세포막 상에 존재하는 TRAIL-R1 및 R2 그 자체를 정제한 것도 항원으로서 사용할 수 있다. 또한, TRAIL-R1 및 R2의 1차 구조는 공지되어 있기 때문에[Pan, G., et al. (1997) Science 276, 111-113 및Science 277, 815-818 참조; Walczak, H., et al.(1997) EMBO J16(17) 5386-5397 참조], 당업자에게 주지된 방법에 의해 TRAIL-R1 및 R2의 아미노산 서열로부터 펩티드를 화학 합성하고, 이것을 항원으로서 사용할 수도 있다.

또한, 면역원으로서는 인간 TRAIL-R1 및 R2의 전장으로부터 세포 내 영역의 데쓰 도메인 및 데쓰 도메인으로부터 C 말단측의 아미노산을 제거한 인간 TRAIL-R1 및 R2(이하, "TRAIL-R1 및 R2delta"라고 함)를 갖는 발현 벡터 pEF-TRAIL-R1delta 및 pEF-TRAIL-R2delta를 L929 세포에 도입하고, 세포 표면에 TRAIL-R1 및 R2delta를 과잉 발현하는 세포도 유효하다. pEF-TRAIL-R1delta 및 pEF-TRAIL-R2delta는 각각 인간 TRAIL-R1delta 단백질을 코딩하는 DNA 및 인간 TRAIL-R2delta 단백질을 코딩하는 DNA를 동물 세포용 발현 벡터 pEFneo[Ohashi. H., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 158-162 참조]에 삽입함으로써 제조할 수 있다. 단, TRAIL-R1 및 R2를 코딩하는 DNA, 벡터, 숙주 등은 이것들로 한정되지 않는다.

구체적으로는 pEF-TRAIL-R1 및 R2delta로 L929 세포를 형질전환하여 얻어진 형질전환주를 배양하고, pEFneo 벡터가 삽입된 세포에서 획득되는 네오마이신 내성의 형질 및 염소 항 TRAIL-R1 및 R2 폴리클로날 항체(다코(DAK0)사 제조)를 사용한 TRAIL-R1 및 R2delta 발현 확인을 지표로, 인간 TRAIL-R1 및 R2delta를 그 세포 표면에 과잉 발현하는 L929 세포를 제조할 수 있다.

(2) 항체 생산 세포의 제조 공정

(1)에서 얻어진 항원과 프로인트의 완전 또는 불완전 면역보강제, 또는 알루미늄 칼륨 황산염과 같은 보조제를 혼합하고, 면역원으로서 실험 동물에 면역화시킨다. 실험 동물로서는 인간 유래의 항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 마우스가 가장 바람직하게 사용되는데, 그러한 마우스는 도미즈까 등의 문헌 [Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97:722]에 기재되어 있다.

마우스 면역화시의 면역원 투여 방법은 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피내 주사, 근육내 주사, 발바닥 주사 등 어떠한 것이든 좋지만, 피하 주사, 복강내 주사, 발바닥 주사 또는 정맥내 주사가 바람직하다.

면역화는 1회 또는 적당한 간격으로(바람직하게는 3일 내지 1 주일 또는 2 주일 간격으로) 복수회 반복하여 행할 수 있다. 그 후, 면역화된 동물의 혈청 중의 항원에 대한 항체 역가를 측정하고, 항체 역가가 충분히 높아진 동물을 항체 생산 세포의 공급원으로서 사용하면, 이후의 조작 효과를 높일 수 있다. 일반적으로는 최종 면역화 3 내지 5일 후의 동물 유래의 항체 생산 세포를 이후의 세포 융합에 사용하는 것이 바람직하다.

여기서 사용되는 항체 역가의 측정 방법으로서는 방사성 동위 원소 면역 정량법 (이하, "RIA법"이라고 함), 고상 효소 면역 정량법(이하, "ELISA법"이라고 함), 형광 항체법, 수동 혈구 응집 반응법 등 여러가지 공지된 기술을 들 수 있는데, 검출 감도, 신속성, 정확성 및 조작의 자동화 가능성 등의 관점에서 RIA법 또는 ELISA법이 보다 바람직하다.

본 발명에서의 항체 역가 측정은, 예를 들면 ELISA법에 따르면 이하에 기재하는 순서에 의해 행할 수 있다. 우선, 정제 또는 부분 정제된 재조합 인간 TRAIL-R1 및 R2를 ELISA용 96 웰 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착되지 않은 고상 표면을 항원과 관련없는 단백질, 예를 들면 소 혈청 알부민(이하, "BSA"라고 함)에 의해 피복하고, 이 표면을 세정한 후, 1차 항체로서 단계 희석한 시료(예를 들면, 마우스 혈청)와 접촉시켜 상기 항원에 시료 중의 항 TRAIL-R1 및 R2 항체를 결합시킨다. 또한, 2차 항체로서 효소 표지된 인간 항체에 대한 항체를 첨가하여 인간 항체에 결합시키고, 세정 후 이 효소의 기질을 첨가하여 기질 분해에 기초한 발색에 의한 흡광도 변화 등을 측정함으로써 항체 역가를 산출한다.

(3) 미엘로마의 제조 공정

미엘로마로서는 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유 동물로부터 유래하는 자체 항체 생산능이 없는 세포를 사용할 수 있지만, 일반적으로는 마우스로부터 얻어진 주화 세포(established cell), 예를 들면 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 미엘로마주 P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton, D. E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978)], P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)[Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511-519(1976)], Sp2/0-Ag14(SP-2) [Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270(1978)], P3X63Ag8.653 (653)[Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550(1979)], P3X63Ag8(X63)[Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497(1975)] 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 세포주는 적당한 배지, 예를 들면 8-아자구아닌 배지[글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타마이신 및 소 태아 혈청(이하, "FCS"라고 함)을 첨가한 RPMI-1640 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코프 개변 둘베코배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; 이하, "IMDM"이라고 함) 또는 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium; 이하, "DMEM"이라고 함)에서 계대 배양하지만, 세포 융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지(예를 들면, 10 ％ FCS를 포함하는 DMEM 배지)에서 계대 배양하고, 융합 당일에 2×10⁷개 이상의 세포수를 확보해 둔다.

(4) 세포 융합

항체 생산 세포는 형질 세포 및 그 전구 세포인 림프구이고, 이것은 개체의 어느 부위에서 얻어도 좋으며, 일반적으로는 비장, 림프절, 골수, 편도, 말초혈, 또는 이들을 적절하게 조합한 것 등으로부터 얻을 수 있지만, 비장 세포가 가장 일반적으로 사용된다.

최종 면역화 후, 소정의 항체 역가가 얻어진 마우스로부터 항체 생산 세포가 존재하는 부위, 예를 들면 비장을 적출하고, 항체 생산 세포인 비장 세포를 제조한다. 이 비장 세포와 공정 (3)에서 얻어진 미엘로마를 융합시키는 수단으로서 현재 가장 일반적으로 행해지고 있는 것은 세포 독성이 비교적 적고 융합 조작도 간단한 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 방법이다. 이 방법은, 예를 들면 이하의 순서로 이루어진다.

비장 세포와 미엘로마를 무혈청 배지(예를 들면, DMEM) 또는 인산 완충 생리 식염수(이하, "PBS"라고 함)로 잘 세정하고, 비장 세포와 미엘로마의 세포수비가 5:1 내지 10:1 정도가 되도록 혼합하여 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 침전된세포군을 잘 푼 후, 교반하면서 1 ㎖의 50 ％(w/v) 폴리에틸렌글리콜(분자량 1000 내지 4000)을 포함하는 무혈청 배지를 적가한다. 그 후, 10 ㎖의 무혈청 배지를 천천히 첨가한 후 원심분리한다. 다시 상청액을 버리고, 침전된 세포를 적량의 히포크산틴ㆍ아미노프테린ㆍ티미딘(이하, "HAT"라고 함)액 및 인간 인터루킨-6(이하, "IL-6"이라고 함)을 포함하는 정상 배지(이하, "HAT 배지"라고 함) 중에 현탁하여 배양용 플레이트(이하, "플레이트"라고 함)의 각 웰에 분주하고, 5 ％ 탄산 가스의 존재하에서 37 ℃로 2 주일 정도 배양한다. 도중에 적절하게 HAT 배지를 보충한다.

(5) 하이브리도마 군의 선택

상기 미엘로마 세포가 8-아자구아닌 내성주인 경우, 즉 히포크산틴ㆍ구아닌ㆍ포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT) 결손주인 경우, 융합되지 않은 상기 미엘로마 세포 및 미엘로마 세포끼리의 융합 세포는 HAT 함유 배지 중에서는 생존할 수 없다. 한편, 항체 생산 세포끼리의 융합 세포 또는 항체 생산 세포와 미엘로마 세포와의 하이브리도마는 생존할 수 있지만, 항체 생산 세포끼리의 융합 세포에는 수명이 있다. 따라서, HAT 함유 배지 중에서의 배양을 지속시킴으로써 항체 생산 세포와 미엘로마 세포와의 하이브리도마만이 살아 남고, 결과적으로 하이브리도마를 선택할 수 있다.

콜로니상으로 생육되어 온 하이브리도마에 대하여 HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지(이하, "HT 배지"라고 함)로의 배지 교환을 행한다. 이후, 배양 상청액의 일부를 채취하고, 예를 들면, ELISA법에 의해 항 TRAIL-R1 및 R2 항체역가를 측정한다. 단, ELISA용 항원으로서 상기 융합 단백질을 사용하는 경우에는, 인간 IgG의 Fc 영역에 특이적으로 결합되는 항체를 생산하는 클론을 선택하지 않도록 이 클론을 제거하는 조작이 필요하다. 그러한 클론의 유무는, 예를 들면 인간 IgG의 Fc 영역을 항원으로 한 ELISA 등에 의해 확인할 수 있다.

이상, 8-아자구아닌 내성의 세포주를 사용하는 방법을 예시했지만, 그 밖의 세포주도 하이브리도마의 선택 방법에 따라 사용할 수 있으며, 그 경우 사용하는 배지 조성도 변화된다.

(6) 클로닝 공정

(2)의 기재와 동일한 방법으로 항체 역가를 측정함으로써, 특이적 항체를 생산하는 것으로 판명된 하이브리도마를 별도의 플레이트로 옮겨 클로닝을 행한다. 이 클로닝 방법으로서는 플레이트의 1 웰에 1개의 하이브리도마가 포함되도록 희석하여 배양하는 한계 희석법, 연한천 배지 중에서 배양하여 콜로니를 회수하는 연한천법, 현미경 조작기 (micromanipulator)에 의해 1개씩 세포를 꺼내 배양하는 방법, 세포 분류기에 의해 1개의 세포를 분리하는 "소터 클론(sorter clone)법" 등을 들 수 있지만, 한계 희석법이 간편하여 자주 사용된다.

항체 역가가 확인된 웰에 대하여, 예를 들면 한계 희석법에 의한 클로닝을 2 내지 4회 반복하고, 안정적으로 항체 역가가 확인된 것을 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체 생산 하이브리도마주로서 선택한다.

또한, 본 발명의 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 생산 세포인 마우스-마우스 하이브리도마 H-48-2는, 평성 13년(2001년) 5월 18일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이6)에 국제 기탁되어 있다. 국제 기탁 번호는 FERM BP-7599이다. 또한, 하이브리도마 E-11-13은 수탁 번호 FERM BP-7698로서, 하이브리도마 F-4-8은 수탁 번호 FERM BP-7699로서, 하이브리도마 L-30-10은 수탁 번호 FERM BP-7700으로서 평성 13년(2001년) 8월 8일자로 국제 기탁되어 있다. 또한, 하이브리도마 0304는 수탁 번호 FERM BP-8037로서, 하이브리도마 KMTR1은 수탁 번호 FERM BP-8038로서 평성 14년(2002년) 5월 10일자로 국제 기탁되어 있다. 따라서, 예를 들면 마우스-마우스 하이브리도마를 사용하여 항체를 제조하는 경우에는 공정 (6)까지를 생략하고, 이하에 기재하는 공정 (7)로부터 항체의 제조를 행할 수 있다. 또한, 마우스 복수 중의 생체 내에서 배양하여 복수로부터 단리할 수도 있다.

(7) 하이브리도마 배양에 의한 모노클로날 항체의 제조

클로닝을 완료한 하이브리도마는 배지를 HT 배지에서 정상 배지로 바꾸어 배양한다. 대량 배양은 대형 배양 용기를 이용한 회전 배양, 또는 스피너 배양으로 행해진다. 이 대량 배양에서의 상청액을 겔 여과 등의 당업자에게 주지된 방법을 이용하여 정제함으로써, 본 발명의 예방 또는 치료제를 유효 성분으로서 함유하는 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 동일 계통의 마우스(예를 들면 BALB/c) 또는 Nu/Nu 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터 또는 토끼 등의 복강 내에서 이 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 예방 또는 치료제를 유효 성분으로 함유하는 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체를 대량 포함하는 복수를 얻을 수 있다. 정제의 간편한 방법으로서는 시판되고 있는 모노클로날 항체 정제 키트(예를 들면, MAbTrap GII 키트; 아머샴 파마시아 바이오텍사 제조) 등을 이용할 수도 있다.

이렇게 해서 얻어지는 모노클로날 항체는 인간 TRAIL-R1 및 R2에 대하여 높은 항원 특이성을 갖는다.

(8) 모노클로날 항체의 검정

이렇게 해서 얻어진 모노클로날 항체의 이소타입 및 서브클래스의 결정은 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 우선, 동정법으로서는 옥테르로니(Ouchterlony)법, ELISA법, 또는 RIA법을 들 수 있다. 옥테르로니법은 간편하기는 하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다.

한편, ELISA법 또는 RIA법을 이용한 경우에는 배양 상청액을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 또한 2차 항체로서 각종 면역글로불린 이소타입, 서브클래스에 대응하는 항체를 사용함으로써 모노클로날 항체의 이소타입, 서브클래스를 동정할 수 있다.

또한, 단백질의 정량은 폴린-로우리(Floin-Lowry)법 및 280 nm에서의 흡광도 [1.4(OD280)=면역글로불린 1 mg/㎖]로부터 산출하는 방법에 의해 행할 수 있다.

모노클로날 항체의 인식 에피토프의 동정은 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 우선, 모노클로날 항체가 인식하는 분자의 여러가지 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조시에는 공지된 올리고펩티드 합성 기술을 이용하여 그 분자의 여러가지 부분 펩티드를 제조하는 방법, 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적하는 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 바람직한 발현 플라스미드에 삽입하여대장균(Escherichia coli) 등의 숙주 내외에서 생산하는 방법 등이 있지만, 상기 목적을 위해서는 양자를 조합하여 사용하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 항원 단백질의 C 말단 또는 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차적으로 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조한 후, 이들에 대한 모노클로날 항체의 반응성을 검토하여 대략적인 인식 부위를 결정한다.

그 후, 더욱 미세하게 그 대응 부분의 올리고펩티드 또는 이 펩티드의 변이체 등을 당업자에게 주지된 올리고펩티드 합성 기술을 이용하여 여러가지로 합성하여, 본 발명의 예방 또는 치료제가 유효 성분으로서 함유되는 모노클로날 항체의 이들 펩티드에 대한 결합성을 조사하거나, 또는 이 모노클로날 항체와 항원의 결합에 대한 펩티드의 경쟁 억제 활성을 조사함으로써 에피토프를 한정한다. 여러종의 올리고펩티드를 얻기 위한 간편한 방법으로서 시판되고 있는 키트(예를 들면, SPOTs 키트(제노시스ㆍ바이오테크놀로지즈사 제조), 멀티핀 합성법을 이용한 일련의 멀티핀ㆍ펩티드 합성 키트(카이론사 제조) 등)를 이용할 수도 있다.

또한, 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 인간 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 적당한 벡터에 삽입하여 이것을 숙주(예를 들면, 포유류 세포 세포주, 대장균(Escherichia coli), 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산시킨 재조합형 항체를 제조할 수도 있다(P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles andpractice., 1993 ACADEMIC PRESS).

하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 제조하기 위해서는, 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 각각 코딩하는 DNA를 PCR법 등에 의해 제조하는 방법이 이용된다. 프라이머는 항 TRAIL-R 항체 유전자 또는 아미노산 서열로부터 설계한 올리고 DNA를, 주형으로서는 하이브리도마로부터 제조한 DNA를 사용할 수 있다. 이들 DNA를 하나의 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주에 도입하여 발현시키거나, 또는 이들의 DNA를 각각 적당한 벡터에 삽입하여 모두 발현시킨다.

벡터에는 숙주 미생물에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 플라스미드 DNA로서는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 효모 유래의 플라스미드등을 들 수 있으며, 파지 DNA로서는 λ 파지를 들 수 있다.

형질전환에 사용하는 숙주로서는 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 세균(대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등), 효모, 동물 세포 (COS 세포, CHO 세포 등), 곤충 세포를 들 수 있다.

숙주로의 유전자 도입 방법은 공지된 것이며, 임의의 방법(예를 들면, 칼슘 이온을 이용하는 방법, 전기천공법, 스페로플라스트법, 아세트산 리튬법, 인산 칼슘법, 리포펙션법 등)을 들 수 있다. 또한, 후술하는 동물에게 유전자를 도입하는 방법으로서는 미세주입법, ES 세포에 전기천공이나 리포펙션법을 이용하여 유전자를 도입하는 방법, 핵 이식법 등을 들 수 있다.

본 발명에서 항 TRAIL-R 항체는 형질전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 채취함으로써 얻을 수 있다. "배양물"이란 (a) 배양 상청액, (b) 배양 세포 또는 배양 균체 또는 그의 파쇄물, (c) 형질전환체의 분비물 중 어느 하나를 의미하는 것이다. 형질전환체를 배양하기 위해서는 사용하는 숙주에 적합한 배지를 사용하여 정치 배양법, 롤러 병에 의한 배양법 등이 이용된다.

배양 후, 목적 단백질이 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 항체를 채취한다. 또한, 목적 항체가 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는 배양액을 그대로 사용하거나, 원심분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 단백질의 단리와 정제에 사용되는 각종 크로마토그래피를 이용한 일반적인 생화학적 방법을 단독으로, 또는 적절하게 조합하여 이용함으로써 상기 배양물 중에서 목적하는 항체를 단리 및 정제할 수 있다.

또한, 트랜스제닉 동물 제조 기술을 이용하여 목적 항체의 유전자가 내재성 유전자에 삽입된 동물 숙주, 예를 들면 트랜스제닉 소, 트랜스제닉 염소, 트랜스제닉 양 또는 트랜스제닉 돼지를 제조하고, 그 트랜스제닉 동물로부터 분비되는 모유 중에서 그 항체 유전자로부터 유래하는 모노클로날 항체를 대량으로 취득할 수도 있다(Wright, G., et al. (1991) Bio/Technology 9, 830-834). 하이브리도마를 생체 내에서 배양하는 경우에는 배양하는 세포종의 특성, 시험 연구 목적 및 배양 방법 등의 여러가지 조건에 맞추어 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청액 중에 모노클로날 항체를 생산시키기 위해 사용되는 공지된 영양 배지, 또는공지된 기본 배지로부터 유도 및 제조되는 모든 영양 배지를 이용하여 실시할 수 있다.

(9) 항체의 성질

본 발명의 항체는 하기의 a) 내지 c)의 기능적 특성을 가지며, 각각의 특성은 예를 들면 각 항목에 기재된 방법에 의해 확인할 수 있다:

a) 인간 암 세포를 배양하고, 본 발명의 항체를 배지에 함유시켰을 때의 상기 세포의 생존율을 조사한 결과, TRAIL-R1 및(또는) R2를 발현하는 암 세포에서 아팝토시스를 유도하는 활성을 갖는다.

b) 인간 정상 조직 유래 세포를 배양하고, 본 발명의 항체를 배지에 함유시켰을 때의 상기 세포의 생존율을 조사한 결과, TRAIL-R1 및(또는) R2를 발현하는 정상 세포에는 영향을 미치지 않는다.

c) 인간 간 실질 세포를 배양하고, 본 발명의 항체를 배지에 함유시켰을 때의 상기 세포의 생존율을 조사한 결과, 간 세포 상해를 유발하지 않는다.

본 발명의 항체의 아팝토시스 유도 활성은 LD50치(소정의 실험 조건에서 세포 절반의 사멸을 초래하는 항체의 농도)를 지표로서 나타낼 수 있다. LD50치는 후술하는 실험 조건에서 100 ㎍/㎖ 이하, 바람직하게는 10 ㎍/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 0.7 ㎍/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.11 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 0.02 ㎍/㎖ 이하이다.

또한, "정상 세포에 영향을 미치지 않는다" 또는 "간 세포 상해를 유발하지 않는다"란 본 발명의 항체의 정상 세포(인간 간 세포)에 대한 아팝토시스 유도 활성이 현저히 높지 않은 것을 의미한다. LD50치를 지표로 했을 경우, 후술하는 실험 조건에서 0.01 ㎍/㎖ 이상, 바람직하게는 0.1 ㎍/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 10 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 10 내지 24 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 24 ㎍/㎖ 이상이다.

본 발명의 항체는 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 활성을 갖지만, 바람직하게는 상기 a)에 기재된 활성, 즉 암 세포에 대하여 아팝토시스를 유도하는 활성과, 상기 b) 및 c)에 기재된 활성, 즉 정상 세포, 특히 정상 간 실질 세포에는 상해를 유발하지 않는 활성을 겸비하는, 신규한 특성을 갖는 물질이다. 따라서, 본 발명의 항체는 악성 종양에 대한 예방 또는 치료제에 함유시키기 위한 성분으로서 유용하다.

정상 세포 또는 암 세포에 대한 아팝토시스 유도 활성은 LD50치를 지표로서 나타낼 수 있다. 본 발명에서의 LD50치는 이하와 같이 하여 산출할 수 있다. 정상 세포(예를 들면, 인간 간 세포) 또는 암 세포(예를 들면, 인간 대장암 세포주 Colo205; ATCC CCL-222)를 배양하고, 본 발명의 항체를 배지에 첨가하여 일정 시간 경과 후의 상기 세포의 생존율을 MTT 분석(Green, L. M. et al., J. Immunological Methods, 70: 257-268(1984)) 또는 LDH 분석 등에 의해 측정한다.

생존율과 첨가된 항체의 농도를 플롯팅한 그래프로부터 생존율 50 ％에 상당하는 항체 농도를 LD50치라고 한다.

LD50치는 그래프로부터 판독할 수도 있고, 회귀 계산에 의해 그래프 곡선의 식을 구함으로써 산출할 수도 있다.

암 세포 Colo205에 대한 시험에서는 96 웰의 바닥이 편평한 플레이트의 1개 웰당 100 ㎕의 배지에 2.5×10³의 세포를 접종하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂의 존재하에서 배양하여 항체를 다음날 첨가하고, 상기 환경하에 48 시간 놓은 후에 세포의 생존율을 측정하였다(반응액의 전량: 110 내지 120 ㎕). 본 발명에서는 상기 조건을 "세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간"이라고 기재한다.

정상 세포(간 세포)에 대한 시험에서는 96 웰의 바닥이 편평한 플레이트의 1개 웰당 100 ㎕의 배지에 7.5×10⁴의 세포를 접종하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂의 존재하에서 배양하여 항체를 다음날 첨가하고, 상기 환경하에 24 시간 놓은 후에 세포의 생존율을 측정하였다(반응액의 전량: 110 내지 120 ㎕). 본 발명에서는 상기 조건을 "세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간"이라고 기재한다.

본 발명의 항체에는 상기한 조건으로 LD50을 측정했을 때, 정상 세포(인간 간 세포)에 대하여 LD50치가 예를 들면 0.01 ㎍/㎖(10 ng/㎖) 이상, 바람직하게는 0.1 ㎍/㎖ 이상의 성질을 갖는 것이 포함된다. 정상 세포에 대한 LD50은 높을 수록 안전성이 높다고 할 수 있기 때문에 2 내지 100 ㎍/㎖의 LD50치를 갖는 항체가 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명의 항체에는 상기한 조건으로 LD50을 측정했을 때 암 세포에 대하여 LD50치가 예를 들면 100 ㎍/㎖ 이하, 바람직하게는 0.7 ㎍/㎖ 이하의 성질을 갖는 것이 포함된다. 암 세포에 대한 LD50은 낮을 수록 종양 세포 사멸 활성이 강하다고 할 수 있기 때문에 0.02 내지 0.11 ㎍/㎖의 LD50을 갖는 것이더욱 바람직하다. 특히, 본 발명의 E-11-13 항체, L-30-10 항체 및 KMTR1 항체는, 그 인간 간 세포에 대한 LD50치가 2 내지 100 ㎍/㎖ 이상(예를 들면, 2 내지 24 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 ㎍/㎖)이고, 암 세포에 대한 LD50치가 0.02 내지 0.11 ㎍/㎖의 성질을 갖고 있으며, 정상 세포에 대한 안전성과 종양 세포에 대한 아팝토시스 유도 효과를 겸비하고 있다. 또한, 놀랍게도 본 발명의 항체는 암에 걸린 마우스 모델에서의 종양 세포의 증식을 현저히 억제하였다.

여기서, "세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간"의 조건에서 측정했을 때의 정상 세포에 대한 LD50치와, "세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간"의 조건에서 측정했을 때의 암 세포에 대한 LD50치와의 비에 대하여 검토해 본다. 상기한 바와 같이 정상 세포에 대한 LD50은 높을 수록 안전성이 높고, 암 세포에 대한 LD50은 낮을 수록 종양 세포 사멸 활성이 강하기 때문에, 정상 세포에 대한 LD50치는 암 세포에 대한 LD50과 비교하여 그 비가 클 수록 유용하다고 할 수 있다(안전성이 높고, 암 세포에 대한 아팝토시스 유도 활성이 강함). 암 세포에 대한 정상 세포의 LD50의 비(정상 세포에 대한 LD50이 암 세포에 대한 LD50의 몇 배인가)를 N/C비라고 하면, 본 발명의 항체는 N/C=2 이상, 즉 정상 세포에 대한 LD50이 암 세포에 대한 LD50의 2 배 이상의 성질을 갖는 것이다. 바람직하게는 정상 세포에 대한 LD50이 암 세포에 대한 LD50의 10 배 이상(N/C=10 이상), 보다 바람직하게는 N/C=10 내지 25이고, 이하 순서대로 바람직한 범위가 N/C=50, N/C=50 이상, N/C=50 내지 100, N/C=100 이상, N/C=100 내지 1000이며, 더욱 바람직하게는 N/C=250 내지1000, 가장 바람직하게는 N/C=1000 이상이다.

<의약 조성물>

본 발명의 인간 항 TRAIL-R1 및 R2 항체가 정제된 제제를 함유하는 제제도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 제제는 바람직하게는 항체에 첨가하여 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 담체를 포함하고 있으며, 다른 항체 또는 항생 물질과 같은 다른 약제와의 혼합물일 수도 있다. 적절한 담체에는 생리적 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 글루코스액 및 완충 생리 식염수가 포함되지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체를 동결 건조(freeze-dry)하여, 필요할 때 상기와 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성하여 사용할 수도 있다. 이러한 예방 또는 치료제는 여러가지 형태로 투여할 수 있으며, 이들 투여 형태로서는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등에 의한 경구 투여, 또는 주사제, 점적제, 좌제 등에 의한 비경구 투여를 들 수 있다.

그 투여량은 증상, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 통상 경구 투여에서는 성인에 대하여 1일 약 0.01 mg 내지 1000 mg이며, 이것들을 1회 또는 몇회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여에서는 1회 약 0.01 mg 내지 1000 mg을 피하 주사, 근육 주사 또는 정맥 주사에 의해 투여할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 의약 조성물은 TRAIL-R1 및 R2를 발현하는 세포에서 기인할 가능성을 갖는 여러가지 질환 또는 증상의 치료 또는 예방으로의 적용이 가능하다. 그 질환 또는 증상으로서는 각종 악성 종양을 들 수 있다.

종양의 종류는 대장암, 결장 직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 흑색종, 신장세포암, 방광암, 백혈병, 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 난포막종, 남성 배종, 자궁 내막 과형성, 자궁 내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시 육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상세포종, 신경섬유종, 희돌기교세포종, 수아세포종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 과오아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상육종 및 윌름스 종양 등을 들 수 있으며, 본 발명의 항체를 적용할 때의 종양은 1종으로 한정되지 않고, 복수종의 종양이 병발한 것일 수도 있다.

<제제예>

본 발명의 분자는 물 또는 그 이외의 약리학적으로 허용될 수 있는 용액에 용해된 무균성 용액 또는 현탁액 앰플로서 사용된다. 또한, 무균 분말 제제(본 발명의 분자를 동결 건조하는 것이 바람직함)를 앰플에 충전해 두고, 사용시 약리학적으로 허용될 수 있는 용액으로 희석할 수도 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 그의 실시예에 기재되는 양태에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

<항원의 제조>

인간 TRAIL-R1 및 R2가 세포막상에 과잉 발현되고 있는 세포를 얻기 위해 인간 TRAIL-R1 및 R2의 전장 아미노산으로부터 세포내 영역의 데쓰 도메인 및 데쓰 도메인보다 C 말단측의 아미노산을 제외한 인간 TRAIL-R1 및 인간 TRAIL-R2 (이하 "TRAIL-R1 및 R2 delta"라고 함) 발현 플라스미드 벡터를 제조하였다. TRAIL-R1 및 R2 delta를 코딩하는 DNA는 PCR법에 의해 제조하였다.

(a) 전장 인간 TRAIL-R1 및 R2 발현 벡터의 제조

주형 PCR을 행하기에 앞서서, 주형으로서 사용한 것은 인간 TRAIL-R1 및 R2를 코딩하는 cDNA를 보유하는 플라스미드 벡터 pcDNA3-TRAIL-R1 및 pcDNA3-TRAIL-R2였다. pcDNA3-TRAIL-R1 및 pcDNA3-TRAIL-R2는 이하의 방법으로 제조되었다. 완전장 인간 TRAIL-R1 DNA 및 TRAIL-R2 DNA를, 그의 5' 말단에 EcoRI 서열을 부가하고 그의 3'말단에 NotI 서열과 정지 코돈을 부가하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 행하여 수식하였다. 인간 태반 유래 cDNA(Clontech사 제조)를 주형으로서, TRAIL-R1에 대해서는 프라이머로서: 5'-CACGAATTCACCATGGCGCCACCACCAGCT-3'(서열 1) 및 5'-TTTCTCGAGGCGGCCGCTTATCACTCCAAGGACACGGCAGAGCCTGTG-3'(서열 2)를, TRAIL-R2에 대해서는 프라이머로서: 5'-CACGAATTCGCCACCATGGAACAACGGGGACAG-3'(서열 3) 및 5'-TTTCTCGAGGCGGCCGCTCATTAGGACATGGCAGAGTCTGCATTACCT-3'(서열 4)를 합성하여, 플래티넘(platinum) PfxDNA 중합효소(GibcoㆍBRL사 제조)를 사용하여, (94 ℃, 20 초; 60 ℃ 30 초; 68 ℃, 90 초간)×30 사이클의 PCR 반응을 행하였다. 수식된 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2 서열을 EcoRI-NotI 단편으로 단리하고, 동일 효소로 분해된 pcDNA3(Invitrogen사 제조) 벡터에 연결하였다. 얻어진 플라스미드를 pcDNA3-TRAIL-R1 및 pcDNA3-TRAIL-R2라고 명명하였다. pcDNA3-TRAIL-R2에 조립된 TRAIL-R2는 선택적 스플라이싱(splicing)에 의해 형성된 2개의 단편 중에서, 1320 bp의 cDNA에 의해 코딩되는 440개의 아미노산을 형성하는 것이다. 이하, 실시예 중의 모든 PCR의 반응 온도 조절은 진앰프 (GeneAmp) PCR 시스템 9700 ((주) 퍼킨 엘머ㆍ재팬사 제조)를 사용하였다.

(b) 인간 TRAIL-R1 및 R2 delta 발현 벡터의 제조

인간 TRAIL-R1 및 R2 delta 발현 벡터를 이하의 방법으로 제조하였다. 1-351의 아미노산 서열을 갖는 TRAIL-R1 부분 펩티드, 및 1-348의 아미노산 서열을 갖는 TRAIL-R2 부분 펩티드를 포함하는 발현 플라스미드를 제조하기 위해, TRAIL-R1 및 R2 부분 펩티드의 5' 말단에 EcoRI 서열을 부가하고 3' 말단에 NotI 서열과 정지 코돈을 부가하는 PCR 반응을 행하였다. PCR은, TRAIL-R1에 대해서는 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-CACGAATTCACCATGGCGCCACCACCAGCT-3'(서열 1) 및 5'-TTCTACGAGCGGCTTATCACAGCCTCCTCCTCTGAGA-3'(서열 5)를, TRAIL-R2에 대해서는 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-CACGAATTCGCCACCATGGAACAACGGGGACAG-3'(서열 3) 및 5'-TTCTACGAGCGGCCGCTTATCACAAGTCTGCAAAGTCATC-3'(서열 6)을, 플래티넘 PfxDNA 중합효소(GibcoㆍBRL사 제조), 및 pcDNA3-TRAIL-R1, pcDNA3-TRAIL-R2를 사용하여, (94 ℃, 20 초; 65 ℃, 30 초; 및 68 ℃, 75 초간)×25 사이클의 조건으로 행하였다. 수식된 TRAIL-R1 및 R2의 부분 펩티드를, EcoRI-NotI 단편으로서 단리하였다. 그리고 이 EcoRI-NotI 단편을 EcoRI와 NotI 효소로 분해된 pEFneo 벡터에 연결하였다. 얻어진 플라스미드를 pEF-TRAIL-R1delta 및 pEF-TRAIL-R2delta라고 명명하였다.

(c) 인간 TRAIL-R1 및 R2 delta 발현 세포의 제조

(b)에서 제조한 pEFTRAIL-R1delta 및 pEF-TRAIL-R2delta를 LipofectAMINE Plus(GibcoㆍBRL사 제조)를 사용하여 L929 세포(American Type Culture Collection CCL-1)에 도입하였다. 유전자 도입은 메뉴얼의 방법에 의해 행하였다.

세포 배양용 플라스크(배양 면적 75 ㎠) 중에서 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양한 후, G418(GibcoㆍBRL사 제조)을 1 ㎎/㎖이 되도록 가하여, 1 주일 동안 배양하였다. 계속해서, 염소 항 인간 TRAIL-R1 폴리클로날 항체 및 염소 항 인간 TRAIL-R2 폴리클로날 항체(DAK0사 제조)를 사용한 FACS 분석을 행하여, 유전자 도입된 세포중에서 G418 내성 형질을 획득한 것이 351개의 아미노산을 포함하는 TRAIL-R1delta 및 348개의 아미노산을 포함하는 TRAIL-R2delta를 세포막 표면상에 발현하고 있음을 확인하였다.

PCR용 프라이머 등의 올리고뉴클레오티드의 합성은 전부 DNA 자동 합성기(모델 3948; (주) 퍼킨 엘머ㆍ재팬ㆍ어플라이드 바이오 시스템즈 사업부 제조)를 사용하여, 그 메뉴얼에 따라서 행하였다 [Matteucci, M.D. and Caruthers, M. H. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191 참조]. 각 올리고뉴클레오티드는 합성 종료 후, 지지체로부터 절단하여 탈보호를 행하고, 얻어진 용액을 건조 및 고형화시킨 후 증류수에 용해하여, 사용할 때까지 -20 ℃에서 동결 보존하였다.

<실시예 2> 인간 항체 생산 마우스의 제조

면역화에 사용한 마우스는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양쪽에 관해서 호모 접합체의 유전적 배경을 갖고 있고, 또한 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Ig κ쇄 트랜스 유전자(transgene)(KCo5)를 동시에 보유한다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 갖는 계통 A의 마우스와, 인간 Ig κ쇄 트랜스 유전자를 갖는 계통 B의 마우스와의 교배에 의해 제조하였다. 계통 A는 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양쪽에 대한 호모 접합체이고, 자손 전달 가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 보유하는 마우스 계통이고, 예를 들면 도미즈까의 보고 (Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97: 722)에 기재되어 있다. 또한, 계통 B는 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양쪽에 대한 호모 접합체이고, 인간 Ig κ 쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 보유하는 마우스 계통(유전자이식 쥐;트랜스제닉 마우스)이고, 예를 들면 피쉬윌드(Fishwild)의 보고(Nat Biotechnol., 1996 Vol 14: 845)에 기재되어 있다.

계통 A의 수컷 마우스와 계통 B의 암컷 마우스, 또는 계통 A의 암컷 마우스와 계통 B의 수컷 마우스의 교배에 의해 얻어지는 새끼 마우스를 도미즈까의 보고 (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97: 722)에 기재된 방법으로 분석하여, 혈청 중에 인간 Ig 중쇄 및 κ 경쇄가 동시에 검출되는 개체 (인간 항체 생산 마우스)를 선발하고 (Ishida ＆ Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract2000; Ishida, I. et al., Cloning ＆ Stem Cells 4, 85-96(2002)), 이하의 면역화 실험에 사용하였다. 면역화 실험에는 상기 마우스의 유전적 배경을 개변시킨 마우스(이시다 이사오(2002) 실험 의학 20, 6, 846-851)도 사용하였다. 또한, 상기 인간 항체 생산 마우스는 계약을 체결함으로써 기린 맥주 주식회사에서 입수가 가능하다.

<실시예 3> 인간 TRAIL-R1 및 R2에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조

본 실시예에 있어서 모노클로날 항체의 제조는 단일 클론 항체 실험 조작 입문(안도 다미에 저, 고단샤 발행 1991) 등에 기재되는 것과 같은 일반적 방법에 따라서 제조하였다. 면역원으로서의 인간 TRAIL-R1 및 R2는 실시예 1에서 제조한 TRAIL-R1 및 R2 delta 발현 L929 세포, 또는 인간 TRAIL-R1 및 R2의 세포외 영역과인간 IgG1의 Fc 영역이 융합된 단백질을 사용하였다. 피면역화 동물은 실시예 2에서 제조한 인간 면역글로불린을 생산하는 인간 항체 생산 마우스를 사용하였다.

인간 TRAIL-R1에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조를 목적으로 인간 항체 생산 마우스에게, 실시예 1에서 제조한 TRAIL-R1delta 발현 L929 세포(3×10⁶세포/마리)를 우측 발바닥에 1회 면역화하였다. 1회 면역화 후, 동세포를 좌우측 발바닥에 교대로 3일마다 10회 면역화하였다. 또한, 이하에 진술하는 비장 및 림프절의 취득 3일 전에 동세포를 양쪽 발바닥에 면역화하였다. 인간 TMIL-R2에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조를 목적으로 인간 항체 생산 마우스에게 실시예 1에서 제조한 TRAIL-R2delta 발현 L929 세포(1×10⁷세포/마리)를 복강내에 1회 면역화하였다. 1회 면역화 후, 동세포를 복강내에 1 주일마다 5회 또는 6회 면역화하였다. 또한, 이하에 진술하는 비장의 취득 3일 전에 동세포, 또는 인간 TRAIL-R2의 세포외 영역과 인간 IgG1의 Fc 영역이 융합된 단백질을 꼬리 정맥에 면역화하였다. 또한, 인간 항체 생산 마우스에게 인간 TMIL-R2의 세포외 영역과 인간 IgG1의 Fc 영역이 융합된 단백질을 완전 프로인트 면역보강제와 혼합하여 피하에 1회 면역화하고, 이후 동단백질을 불완전 프로인트 면역보강제와 혼합하여 피하에 2주일마다 2회 면역화하고, 또한 이하에 진술하는 비장의 취득 3일 전에 동단백질을 꼬리 정맥에 면역화하였다.

면역화된 마우스로부터 비장 및(또는) 림프절을 외과적으로 취득하여, 350 ㎎/㎖ 탄산수소나트륨, 50 단위/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스토렙토마이신을 포함하는무혈청 DMEM 배지(GibcoㆍBRL사 제조)(이하 "무혈청 DMEM 배지"라고 함) 10 ㎖ 중에 넣어, 메쉬(mesh)(세포 스트레이너(Cell strainer), 팔콘사 제조) 상에서 주걱을 사용하여 분쇄하였다. 메쉬를 통과한 세포 현탁액을 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 이 세포를 무혈청 DMEM 배지로 2회 세정하고 나서, 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 세포수를 측정하였다. 한편, 10 ％ FCS(시그마사 제조)를 포함하는 DMEM 배지 (GibcoㆍBRL사 제조)(이하 "혈청이 들어간 DMEM 배지"라고 함)에서, 37 ℃, 5 ％ 탄산 가스 존재하에 세포 농도가 1×10⁸세포/㎖를 넘지 않도록 배양한 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC CRL-1581)을 동일하게 무혈청 DMEM 배지로 세정하고, 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 세포수를 측정하였다. 회수한 세포의 현탁액과 마우스 미엘로마 현탁액을 세포수 5:1로 혼합하여 원심분리한 후, 상청액을 완전히 제거하였다. 이 펠릿에 융합제로서 50 ％(w/v) 폴리에틸렌글리콜 1500(베링거잉겔하임사 제조) 1 ㎖를, 피펫의 앞에서 펠릿을 교반하면서 천천히 첨가한 후, 사전에 37 ℃로 가온해 둔 무혈청 DMEM 배지 1 ㎖를 2회로 나눠 천천히 첨가하고, 또한 7 ㎖의 무혈청 DMEM 배지를 첨가하였다. 원심분리 후, 상청액을 제거하여 얻어진 융합 세포를, 이하에 기재한 한계 희석법에 의한 스크리닝에 제공하였다. 하이브리도마의 선택은 10 ％의 소 태아 혈청(Fetal Calf Serum, FCS)과 히포크산틴 (H), 아미노프테린(A), 티미딘(T) (이하 "HAT"라고 함: 시그마사 제조)를 함유하는 DMEM 배지 중에서 배양함으로써 행하였다. 또한, 10 ％ FCS와 HT(시그마사 제조)를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 한계 희석법에 의해 단일 클론을 얻었다. 배양은 96웰 마이크로타이터 플레이트(벡톤디킨슨사 제조) 중에서 행하였다. 항 인간 TRAIL-R1 및 R2 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 선택(스크리닝) 및 각각의 하이브리도마를 생산하는 인간 모노클로날 항체의 특징은 후술하는 효소 표지 면역 흡착 분석 (ELISA) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS), 또는 암 세포에 대한 세포사 유도 활성을 측정함으로써 행하였다.

실시예 4 및 실시예 5에 진술하는 ELISA, 및 실시예 6에서 기재하는 FACS 분석에 의해, 인간 면역글로불린 γ쇄(hIgγ) 및 인간 면역글로불린 경쇄 κ를 가지고, 또한 인간 TRAIL-R1 및(또는) R2에 특이적인 반응성을 갖는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마를 얻었다. 또한, 본 실시예를 포함시켜 이하의 어느 하나의 실시예 중에서, 그리고 실시예에 있어서 시험 결과로서 나타낸 표 또는 도면 중에서는, 각각의 본 발명의 인간 항 인간 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론은 기호를 사용하여 명명하였다. 또한, 해당 기호의 전후에 "항체"를 부착한 것은 각각의 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 또는 해당 하이브리도마로부터 단리된 항체 유전자(전장 또는 가변 영역)을 보유하는 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 항체를 의미한다. 또한 문맥상 분명한 범위에서, 하이브리도마 클론의 명칭이 항체의 명칭을 나타내는 경우가 있다. 이하의 하이브리도마 클론은 단일 클론를 나타낸다: 1-13, 1-18, 1-32, 1-40, 1-43, 2-6, 2-11, 2-12, 2-18, 2-47, 2-52, 3-1, 3-7, 3-10, 3-23, 3-33, 3-42, 3-53, 1-13-6, 1-32-9, 1-40-4, 1-43-43, 2-6-48, 2-11-5, 2-12-10, 2-47-11, 2-52-12, 3-10-19, 3-23-8, 3-33-7, 3-42-3, 3-53-15, 2-18-2, 3-1-7, E-11, E-14, L-30, N-18, X-14, E-11-13, E-14-4, F-4-2, F-4-8, H-48-2, L-30-10, N-18-12, W-40-5, X-14-4, X-51-4, X-51-12, A-11, G-3, H-34, I-22, I-35, J-21, J-26, K-8, K-16, K-57, L-4, P-28, P-36, W-42, X-13, X-60, Z-23,1-39, A-4-27, A-4-29, G-3-10, H-34-2, K-57-12 W-42-2, 0304, 0322, KMTR1 및 D1M.

이들 중 H-48-2는 평성 13년(2001년) 5월 18일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이6)에 국제 기탁하였다. 국제 기탁 번호는 FERM BP-7599이다. 또한, E-11-13, F-4-8 및 L-30-10은 평성 13년(2001년) 8월 8일자로 상기 기탁 센터에 국제 기탁하였다. 국제 기탁 번호는 E-11-13이 FERM BP-7698이고, F-4-8이 FERM BP-7699이고, L-30-10이 FERM BP-7700이다. 또한, E-11-13, F-4-8 및 L-30-10은 평성13년(2001년) 10월 11일자로 상기 기탁 센터에 국제 기탁하였다. 국제 기탁 번호는 E-11-13이 FERM BP-7770이고, F-4-8이 FERM BP-7768이고, L-30-10이 FERM BP-7769이다. 또한, 0304 및 KMTR1은 평성 14년(2002년) 5월 10일자로 상기 기탁 센터에 국제 기탁하였다. 국제 기탁 번호는 0304가 FERM BP-8037이고, KMTR1이 FERM BP-8038이다.

<실시예 4> 인간 면역글로불린 경쇄 κ(Igκ)를 갖는 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체 또는 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 검출

인간 TRAIL-R1 및 R2의 세포외 영역과 인간 IgG 1의 Fc 영역이 융합된 단백질(이하, 각각 "TRAIL-R1-hFc", "TRAIL-R2-hFc"라고 함(ALEXIS사 제조); TRAIL-R2-hFc에 있어서는 TRAIL-R2의 세포외 영역으로서 1-183 아미노산을 포함하는 것도 사용))을 O.5 ㎍/㎖ 인산 완충 생리식염수(이하 "PBS"라고 함)로 제조한 것을 50 ㎕씩, ELISA용 96 웰 마이크로플레이트(Maxisorp, 넝크사 제조)의 각 웰에 가하여, 실온에서 1 시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하여, TRAIL-R1-hFc 또는 TRAIL-R2-hFc를 마이크로플레이트에 흡착시켰다. 계속해서, 상청액을 버리고, 각 웰에 블로킹 시약(Super Block(등록 상표) Blocking Buffer, PIERCE사 제조)을 가하여, 실온에서 30분간 배양하여, TRAIL-R1-hFc 또는 TRAIL-R2-hFc가 결합되지 않은 부위를 블로킹하였다. 이와 같이 하여, 각 웰을 TRAIL-R1-hFc 또는 TRAIL-R2-hFc로 코팅한 마이크로플레이트를 제조하였다.

각 웰에, 각각의 하이브리도마의 배양 상청액(50 ㎕)을 가하고, 실온하에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 각 웰을 0.1 ％ 트윈 20 함유 PBS(PBS-T)로 2회 세정하였다. 계속해서, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제로 표지된 염소 항 인간 Igκ 항체 (50 ㎕/웰, Biosource International사 제조)를 10 ％ 블록 에이스(Block Ace, 다이니폰제약 가부시끼 가이샤 제조) 함유 PBS-T에 2000배 희석된 용액을, 각 웰에 50 ㎕ 가하여, 실온하에 30분 동안 배양하였다. 마이크로플레이트를 PBS-T로 3회 세정 후, TMB 발색 기질액(DAK0사 제조)을 각 웰에 100 ㎕씩 가하여, 실온하에서 20분간 배양하였다. 각 웰에 0.5 M 황산(100 ㎕/웰)을 가하여 반응을 멈추었다. 파장 450 nm(참조 파장 570 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(MTP-300, 코로나 전기사 제조)로 측정하였다. 또한, 하이브리도마 0304, 0322, KMTR1 및 D1M이 제조하는 항체는 실시예 10에 기재된 방법을 사용하여 취득한 정제 항체에 의해 상기 실험을 행하였다.

그 결과, 얻어진 항 인간 TRAIL-R1 및 R2 항체 중 일부의 항체의 성질을 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다. 하기 표 1은 취득한 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체의 서브클래스 및 교차 반응성을 나타내는 표이다. 하기 표 2는 취득한 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 서브클래스 및 교차 반응성을 나타내는 표이다.

<실시예 5> 각 모노클로날 항체의 서브클래스 동정

실시예 4와 동일한 방법에 의해, 각 웰을 TRAIL-R1-hFc 또는 TRAIL-R2-hFc로 코팅한 마이크로플레이트를 제조한 후에, 각 웰을 PBS-T로 2회 세정하였다.TRAIL-R1-hFc 또는 TRAIL-R2-hFc를 코팅한 마이크로플레이트의 각 웰에 실시예 4에서 취득한 각각의 하이브리도마의 배양 상청액(50 ㎕)을 가하여, 1 시간 동안 반응시킨 후, 각 웰을 PBS-T로 2회 세정하였다. 계속해서, 각 웰에 각각 홀스래디쉬 퍼옥시다아제로 표지된 양(sheep) 항 인간 IgG1 항체, 양 항 인간 IgG2 항체, 양 항 인간 IgG3 항체 또는 양 항 인간 IgG4 항체(각 2000배 희석, 50 ㎕/웰, The Binding Site사 제조)를 가하여, 실온하에서 1 시간 동안 배양하였다. PBS-T로 3회 세정한 후, 기질 완충액(TMB, 100 ㎕/웰, DAKO사 제조)를 각 웰에 가하여, 실온하에서 20분간 배양하였다. 계속해서, 0.5 M 황산(100 ㎕/웰)을 가하여, 반응을 멈추었다. 파장 450 nm(참조 파장 570 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(MTP-300, 코로나 전기사 제조)로 측정하였다. 또한, 하이브리도마 0304, 0322, KMTR1 및 D1M이 제조하는 항체는 실시예 10에 기재된 방법을 사용하여 취득한 정제 항체에 의해 상기 실험을 행하였다. 그의 결과를 상기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

<실시예 6> TRAIL-R1 및 R2 발현 세포에 대한 각 모노클로날 항체의 반응시험

실시예1에서 제조한 TRAIL-R1delta 발현 L929 세포 및 TRAIL-R2delta 발현 L929 세포에 대해 실시예 4에서 취득한 각 모노클로날 항체의 반응성을 FACS 분석으로 검토하였다. 2×10⁶/㎖의 농도로, L929 세포, TRAIL-R1delta 발현 L929 세포, TRAIL-R2delta 발현 L929 세포를, 1 ％ 토끼 혈청, 0.1 ％ NaN₃, 1 ％ FCS를 함유하는 PBS의 염색 완충액(SB: Staining Buffer)에 현탁하였다. 세포 현탁액(100 ㎕/웰)을 96 웰 환저 플레이트(벡톤디킨슨사 제조)에 분주하였다. 원심분리(2000 rpm, 4 ℃, 2 분)한 후, 상청액을 제거하여 실시예 3에서 배양한 하이브리도마의 배양 상청액 (50 ㎕)을 가하여 교반하고, 빙온하에서 30분간 정치하고 나서, 원심분리 (2000 rpm, 4 ℃, 2 분)하여 상청액을 제거하였다. 펠릿을 100 ㎕/웰의 SB로 2회 세정한 후, 0.0125 ㎎/㎖의 RPE 형광 표지 토끼 항 인간 IgκF(ab')₂항체(DAK0사 제조) 30 ㎕를 가하여, 빙온하에서 30분간 배양하였다. SB로 2회 세정한 후, 300 ㎕의 SB에 현탁하여, FACS(FACScan, 벡톤디킨슨사 제조)로 각 세포의 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, 모든 항체가 TRAIL-R1delta 발현 L929 세포 또는 TRAIL-R2delta 발현 L929 세포에만 강한 결합 활성을 가지고, L929 세포에의 결합 활성은 인정되지 않았기 때문에, TRAIL-R1 및 TRAIL-R2과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 알 수 있었다.

<실시예 7> 암 세포에 대한 세포사 유도 활성

실시예 3 또는 실시예 4 내지 실시예 6에서 얻어진 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체 또는 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청액을 사용하여 대장암 세포인 Colo205(ATCC CCL-222)에 대한 세포사 유도 활성을 측정하였다. 10 ％ FCS를 포함하는 RPMI 배지에서 배양하고 있었던 Colo205 세포를 2.5×10⁴개/㎖의 농도로 제조하여, 각 웰 100 ㎕ 씩을 96 웰 평저 플레이트(벡톤디킨슨사 제조)에 분주하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양한 후, 하이브리도마 배양 상청액을 50 ㎕/웰로 가하고, 또한 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체 또는 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체가 IgG인 경우, 최종 농도 5 ㎍/㎖가 되도록 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체(시그마사 제조)를 각 웰에 10 ㎕씩 가하였다. 취득된 하이브리도마의 일부에 대해서, 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가하지 않는 웰도 제조하였다. 양성 대조군으로서 인간 재조합 TRAIL 단백질(DAKO사 제조)를 최종 농도 100 ng/㎖로 사용하였다. 음성 대조군으로서 인간 IgG(Biogenesis사 제조)를 사용하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 48 시간 동안 배양한 후, MTS 시약 (Cell Titer 96 AQ_UEOUSNon-Radioactive Cell Proliferation Assay: 프로메가사 제조)를 설명서의 방법에 따라서 제조하여, 각 웰에 20 ㎕씩 첨가하였다. 또한, 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 2 시간 동안 배양한 후, 파장 490 nm(참조 파장 630 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(1420 ARV0 멀티 라벨 카운터: WALLAC사 제조)로 측정하고, 미토콘드리아의 환원능을 지표로 하여 세포의 생존율을 산정하였다. 각 웰의 세포 생존율을 하기 식에 의해 산출하였다.

생존율(％)=1OO×(a-b)/(c-b)

식 중, a는 피검 웰의 측정치를, b는 무세포 웰의 측정치를, c는 음성 대조군 웰의 측정치를 각각 나타낸다.

결과를 도 1 내지 3 및 하기 표 3 및 4에 나타내었다. 하기 표 3은 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청액 중의 Colo205및 인간 정상 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 표이고, 하기 표 4는 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청액 중의 Colo205 및 인간 정상 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성을 나타내는 표이다.

그 결과, 인간 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체는 음성 대조군과 비교하여 분명히 Colo205 세포에서 세포사를 유도하는 활성이 있음을 분명히 알 게 되었다. 또한, IgG의 일부의 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체로는 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체의 부재하(인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 교차반응이 없는 상태)에서도 세포사를 유도하는 활성이 있음이 확인되었다.

<실시예 8> 정상 세포에 대한 세포사 유도 활성

실시예 4 내지 6에서 얻어진 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청액을 사용하여, 정상 인간 제대 정맥 내피 세포인 HUVEC(Biowhittaker사 제조)에 대한 세포사 유도 활성을 측정하였다. EGM-2배지(Biowhittaker사 제조)에서 배양하고 있었던 HUVEC 세포를 5×10⁴개/㎖의 농도로 제조하여, 각 웰 100 ㎕씩을 96 웰 평저 플레이트(벡톤디킨슨사 제조)에 분주하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양한 후, 하이브리도마 배양 상청액을 50 ㎕/웰로 가하고, 또한 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체 또는 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체가 IgG인 경우, 최종 농도 5 ㎍/㎖가 되도록 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체(시그마사 제조)를 각 웰에 10 ㎕ 씩 가하였다. 음성 대조군으로서, 인간 IgG(Biogenesis사 제조)를 사용하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 48 시간 동안 배양한 후, MTS 시약(Cell Titer 96AQ_UEOUSNon-Radioactive Cell Proliferation Assay: 프로메가사 제조)을 설명서의 방법에 따라서 제조하여, 각 웰에 20 ㎕ 씩 첨가하였다. 또한, 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 2 시간 동안 배양한 후, 파장 490 nm(참조 파장 630 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(1420 ARV0 멀티 라벨 카운터: WALLAC사 제조)로 측정하고, 미토콘드리아의 환원능을 지표로서 세포의 생존율을 산정하였다. 각 웰의 세포 생존율은 실시예 7과 동일한 식에 의해 산출하였다.

결과를 도 4에 나타낸다. 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체와 음성 대조군과의 결과는 거의 동일하고, 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체가 HUVEC 세포에 대해 상해성을 나타내지 않는 것을 분명히 알 수 있었다.

<실시예 9> 인간 정상 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성

실시예 4 내지 6으로부터 얻어진 인간 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체를생산하는 하이브리도마의 배양 상청액을 사용하여, 정상 인간 간 실질 세포(Human Hepatocyte, 이하 "HH 세포"라고 함)(Tissue Transformation Techno1ogies사 제조)에 대한 세포사 유도 활성을 측정하였다. 우선 동결 HH 세포를 37 ℃에서 해동하고, CM5300 배지(CEDRA사 제조)를 사용하여 7.5×10⁵개/㎖의 농도로 제조한 후에, 각 웰 100 ㎕씩을 콜라겐 타입 I가 코팅되어 있는 96 웰 평저 플레이트(벡톤디킨슨사 제조)에 분주하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 4.5 시간 동안 배양한 후, 배지를 교환하였다. 또한, 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양하고, 다시 배지를 교환하였다. 그 후, 하이브리도마 배양 상청액을 50 ㎕/웰로 가하고, 또한 최종 농도 5 ㎍/㎖이 되도록 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체(시그마사 제조)를 각 웰에 10 ㎕ 씩 가하였다. 음성 대조군으로 인간 IgG(Biogenesis사 제조)를 사용하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양한 후, 현미경하에 HH 세포의 형태적 변화를 관찰하였다. 그 결과, 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체와 음성 대조군과의 결과는 거의 변하지 않기 때문에, 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체가 HH 세포에 대해서도 상해성을 나타내지 않는 것을 분명하게 알 수 있었다.

<실시예 10> 각 항체의 제조

실시예 4 또는 실시예 6 내지 7로부터 얻어진 하이브리도마의 배양 상청액에서의 인간 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체의 정제는 이하의 방법으로 행하였다. 인간 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체를 포함하는 배양 상청액을 rmpProtein A(아머샴 바이오 사이언스사 제조) 및 0.8×40 cm 컬럼(바이오래드사 제조)를 사용하고, 흡착 완충액으로서 PBS, 용출 완충액으로서 0.02 M 글리신 완충액 (pH 3)을 사용하여 친화도 정제하였다. 용출 분획은 1 M Tris(pH 9.0)을 첨가하고 pH 7.21 부근에 조정하였다. 제조된 항체 용액은, 투석막(10000 컷트, Spectrum Laboratories사 제조)을 사용하여 PBS로 치환하고, 공경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터 MIL LEX-GV(밀리포어사 제조)로 여과 멸균하여, 정제 인간 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 ㎎/㎖를 1.4의 OD로서 산출하였다.

인간 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체를 포함하는 배양 상청액의 제조는 이하의 방법으로 행하였다. 우선, 인간 항 TRAIL-R1 및 R2 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 10 ng/㎖의 재조합 인간 IL-6(R＆D Systems사 제조), 10 ％의 저농도 IgG 소 태아 혈청(HyClone사 제조) 함유 eRDF 배지(교꾸도 제약사 제조)에 순응시켰다. 이 순응시킨 하이브리도마를 동결 보존하였다. 다음으로, 그 일부를 항체 정제를 목적으로 소 인슐린(5 ㎍/㎖, GibcoㆍBRL사 제조), 인간 트랜스페린(5 ㎍/㎖, GibcoㆍBRL사 제조), 에탄올아민(0.01 mM, 시그마사 제조), 아셀레늄산나트륨(2.5×10^-5mM, 시그마사 제조), 10 ng/㎖의 재조합 인간 IL-6 (R＆D Systems사 제조), 1 ％의 저농도 IgG 소 태아 혈청(HyClone사 제조) 함유 eRDF 배지(교꾸도 제약사 제조)에 순응시켰다. 플라스크에서 배양하여 하이브리도마의 생세포 비율이 90 ％가 된 시점에서 배양 상청액을 회수하였다. 회수된 상청액은 10 ㎛와 0.2㎛의 필터(게르마늄사이언스사 제조)를 제공하여, 하이브리도마 등의 잔존 폐기물을 제거하였다.

<실시예 11> 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체에 의한 암 세포 및 인간 정상 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성

실시예 10에서 얻어진 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 사용하여 대장암 세포인 Colo205(ATCC CCL-222)에 대한 세포사 유도 활성을 측정하였다. 10 ％ FCS를 포함하는 RPMI 배지에서 배양한 Colo205 세포를 2.5×10⁴개/㎖의 농도로 제조하여, 각 웰 100 ㎕씩을 96 웰 평저 플레이트(벡톤디킨슨사 제조)에 분주하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양한 후, 정제 항체를 최종 농도 10, 100, 1000 ng/㎖이 되도록 10 ㎕/웰로 가하고, 또한 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체(시그마사 제조)를 최종 농도 10 ㎍/㎖이 되도록 각 웰에 10 ㎕씩 가하였다. 취득된 하이브리도마의 일부에 대해서, 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가하지 않는 웰을 제조하였다. 양성 대조군으로서 인간 재조합 TRAIL 단백질(R＆D SYSTEMS사 제조)를 최종 농도 O.1, 1, 10 ng/㎖로 사용하였다. 음성 대조군으로서 인간 항 HSA 항체를 사용하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 48 시간 동안 배양하여, 항체와 세포 표면의 수용체를 반응시켰다. 하나의 반응계당 용량은 120 ㎕이었다. 또한, 0304와 KMTR1에 대해서는 가교제인 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 모노클로날 항체를 가하지 않는 실험(표 5에서 (단독)으로 기재)도 행하였다. 이 경우, 하나의 반응계당 용량은 110 ㎕이었다. 배양 후 MTS 시약(Cell Titer 96 AQ_UEOUSNon-Radioactive Cell Proliferation Assay: 프로메가사 제조)를 설명서의 방법에 따라서 제조하여, 각 웰에 20 ㎕씩 첨가하였다. 또한, 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 2 시간 동안 배양한 후, 파장 490 nm(참조 파장 630 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(1420 ARV0 멀티 라벨 카운터: WALLAC사 제조)로 측정하고, 미토콘드리아의 환원능을 지표로서 세포의 생존율을 산정하였다. 각 웰의 세포 생존율은 실시예 7과 동일한 식에 의해 산출하였다.

다음으로, 실시예 10에서 얻어진 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 사용하여, HH 세포(Tissue Transformation Techno1ogies사 제조, In Vitro Technologies사 제조)에 대한 세포사 유도 활성을 측정하였다. 우선 동결 HH 세포를 37 ℃에서 해동하고, CM5300 배지(CEDRA사 제조)를 사용하여 7.5×10⁵개/㎖의 농도로 제조한 후에 각 웰 100 ㎕씩을 콜라겐 타입 I가 코팅되어 있는 96 웰 평저 플레이트(벡톤디킨슨사 제조)에 분주하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 4.5 시간 동안 배양한 후, 배지를 교환하였다. 또한, 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양하여, 배지를 무혈청 배지(인슐린 (20 ㎍/㎖, 시그마사 제조), 글루카곤(7 ng/㎖, 시그마사 제조), 히디로코르티손(hydrocortisone; 7.5 ㎍/㎖,시그마사 제조), 인간 EGF(20 ng/㎖, 벡톤디킨슨사 제조) 함유 DMEM 배지(시그마사 제조)) 또는 CM 5300 배지로 교환하였다. 그 후, 정제 항체를 최종 농도 O.1, 1, 10 ㎍/㎖가 되도록 10 ㎕/웰로 가하고, 또한 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체(시그마사 제조)를 최종 농도 10, 10O ㎍/㎖가 되도록 각 웰에 10 ㎕씩 가하였다. 취득한 하이브리도마의 일부에 대해서 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가하지 않는 웰을 제조하였다. 음성 대조군으로서 인간 항 HSA 항체를 사용하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양하여, 항체와 세포 표면의 수용체를 반응시켰다. 하나의 반응계당 용량은 120 ㎕이었다. 또한, 0304와 KMTR1에 대해서는 가교제인 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 모노클로날 항체를 가하지 않는 실험(표 5에서 (단독)으로 기재)도 행하였다. 이 경우의 하나의 반응계당 용량은 110 ㎕이었다. 배양 후 PBS로 HH 세포를 2회 세정하여 각 웰에 PBS를 100 ㎕ 가하고, 또한 트리톤(Triton) X-100을 최종 농도 0.8 ％가 되도록 10 ㎕/웰로 가하였다. 37 ℃에서 1 시간 정치하여 살아있는 HH 세포를 용해시키고, 가용화액 50 ㎕/웰을 다른 96 웰 평저 플레이트로 옮겨 LDH 분석을 행하였다. LDH 분석용 시약(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay: 프로메가사 제조)를 설명서의 방법에 따라서 제조하여, 각 웰에 50 ㎕ 씩 첨가하였다. 플레이트를 차광하여, 실온에서 30분간정치한 후, 반응 정지액(1 M 아세트산: 프로메가사 제조)를 50 ㎕/웰로 가하여, 파장 492 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(1420 ARVO 멀티 라벨 카운터: WALLAC사 제조)로 측정하였다. LDH의 효소 활성을 지표로서, 세포의 생존율을 산정하였다. 각 웰의 세포 생존율은 실시예 7과 동일한 식에 의해 산출하였다.

또한, 산출된 생존율을 사용하여 이하의 방법으로 LD50치를 계산하였다. 산출된 생존율을 세로축, 세포에 첨가한 항체의 농도를 가로축으로 한 그래프에 각항체 농도에 있어서의 생존율을 플롯팅하여, 플롯팅한 점에서 인접하는 것을 맺는 곡선을 그렸다. 이 곡선을 나타내는 식을 회귀 계산에 의해 구하고, 그 식으로부터 생존율이 50 ％에 해당하는 항체 농도를 계산하여 LD50치로 하였다.

결과를 도 5a 내지 5l, 및 표 5에 나타낸다. 도 5에서 흑색 원으로 실선 (-●-)은 정상 인간 간 실질 세포를, 마름모꼴로 점선(--◆--)은 Colo205 세포를 나타낸다. 또한, 도 5k, 도 5l은 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가하지 않은 실험의 결과를 나타낸다. 표 5는 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 대장암 세포 Colo205, 및 정상 인간 간 실질 세포에 대한 세포사 유도 활성 (LD50치)을 나타내는 표이다. 대장암 세포 Colo205에 대한 LD50치는 96 웰 평저 플레이트의 1 웰당 100 ㎕의 배지에 2.5×10³개의 세포를 접종하고, 다음날 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 세포에 가하고, 이 항체와의 반응 시간이 48 시간 경과했을 때의 LD50치이다. 정상 인간 간 실질 세포에 대한 LD50치는 96 웰 평저 플레이트의 1 웰당 100 ㎕의 배지에 7.5×10⁴개의 정상 세포(인간 간 세포)를 접종하고, 다음날 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 정상 세포(인간 간 세포)에 가하고, 이 항체와의 반응 시간이 24 시간 경과했을 때의 LD50치이다. 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체는 음성 대조군과 비교하여 분명히 Colo205 세포에서 세포사를 유도하는 활성이 있는 것이 분명하게 되었다. 또한, 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 E-11-13, L-30-10, KMTR1은 인간 재조합형 TRAIL이나 정제 항체 H-48-2와 비교하여, 인간 정상 간 실질 세포에 대한 독성이 낮은 것이분명하게 되었다.

또한, KMTR1은 실시예 4의 결과에서 TRAIL-R1과 TRAIL-R2와의 양 수용체에 결합하는 것이 분명해졌고, 이 항체는 TRAIL-R1과 TRAIL-R2 중 어느 하나의 수용체를 통해서라도 세포사 유도의 시그널을 보낼 수 있다는 것을 기대할 수 있다.

여기서 L-30-10은 10 ㎍/㎖를 간세포에 첨가하더라도 생존율 50 ％ 이상을 나타내기 때문에 L-30-10의 LD50은 10 ㎍/㎖ 이상이다. 항체 농도 및 생존율을 플롯팅한 그래프로부터 회귀 계산에 의해 LD50을 구했더니, 24 ㎍/㎖로 산출되었다. 또한, F-4-8은 0.1 ㎍/㎖를 간세포에 첨가시킨 시점에 생존율이 50 ％ 이하이기 때문에 F-4-8의 LD50은 0.1 ㎍/㎖ 이하이다. L-30-10과 마찬가지로 회귀 계산에 기초하여 LD50을 계산한 결과, 0.002 ㎍/㎖로 산출되었다. KMTR1과 D1M의 LD50은 둘 다 10 ㎍/㎖ 이상인 것을 확인하였다. 또한, 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가하지 않은 경우(이하 "단독의 경우"로 함), KMTR1은 100 ㎍/㎖의 항체량을 첨가하더라도 간 세포의 생존율이 50 ％를 하회하지 않기 때문에, 단독의 경우 LD50은 100 ㎍/㎖ 이상인 것을 확인하였다.

다음으로, 정상 인간 간 세포의 LD50이 Colo205 세포의 LD50의 몇배인지 그의 비(N/C 비)를 구하였다. 그 결과, 정제 항체 E-11-3은 N/C=25.45(10 배 이상), D1M은 N/C=67 이상(10 배 이상), 0304 단독일 때는 N/C=50(10 배 이상), L-30-10은 N/C= 240(100 배 이상), KMTR1 단독일 때는 N/C=1000 배 이상이었기 때문에, 어느쪽의 항체도 유효성 및 안전성이 우수하다는 것을 알 수 있었다 (표 5).

동일한 방법으로, 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체에 의한 세포사 유도 활성을, U251 세포(신경교종 유래, 리껜 유전자 뱅크 제RCB0461호), Jurkat 세포(T 세포 림프종 유래, 다이니폰 제약 가부시끼 가이샤 제조)에 대해서 검토하였다. U251 세포에 대한 시험으로는 96 웰 평저 플레이트의 1 웰당 100 ㎕의 배지에 1.0 ×10⁴개의 세포를 접종하고, 37 ℃, 5 ％ C0₂존재하에 배양하여, 항체를 다음날 첨가하고, 상기 환경하에서 48 시간 방치한 후에 세포의 생존율을 측정하였다. Jurkat 세포에 대한 시험으로는 96 웰 평저 플레이트의 1 웰당 100 ㎕의 배지에 4.0 ×10⁴개의 세포를 접종하여 항체를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂존재하에 48 시간 동안 배양한 후에 세포의 생존율을 측정하였다. 이하, 각 항체의 LD50치 (단위는 ㎍/㎖)를 나타낸다.

E-11-13의 U251 세포에 대한 LD50:0.3, Jurkat 세포에 대한 LD50:0.1.

L-30-10의 U251 세포에 대한 LD50:0.17, Jurkat 세포에 대한 LD50:0.13.

H-48-2의 U251 세포에 대한 LD50:0.24, Jurkat 세포에 대한 LD50:0.07.

F-4-8의 U251 세포에 대한 LD50:0.03, Jurkat 세포에 대한 LD50:0.004.

W-40-5의 U251 세포에 대한 LD50:1.0, Jurkat 세포에 대한 LD50:0.48.

또한, U251 세포에 대해서는 최종 농도 4 ㎍/㎖의 시스플라틴 주사액(닛본 가야꾸 주식회사 제조)를 항체와 동시에 첨가한 계에서 분석을 하였다.

<실시예 12> 암에 걸린 마우스 모델에 대한 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 효과

실시예 10에서 얻어진 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 효과를 이하에 기재하는 방법에 따라서 암에 걸린 마우스 모델을 사용하여 검토하였다.

4 내지 6 주령 Balb/c 누드 마우스(닛본구레아(주)사에서 구입)의 등쪽 피하에 대장암 세포 Colo205를 5×10⁶/마우스 개체로 이식하였다. 이식 1 주일 내지 10일 후에 생착된 종양의 크기를 측정하고, 평균하여 종양의 크기가 약 10O ㎣ 또는 300 ㎣이 되는 암에 걸린 마우스 5 또는 7 마리를 1 군으로 군분류하였다. 암에 걸린 마우스의 복강내에 정제 항체 1, 4, 20, 25, 100 ㎍/마우스 개체(200 ㎕의 PBS에 용해한 것)을 투여하여, 종양의 크기를 측정하였다. 항체의 음성 대조군으로서 동량의 인간 항 HSA 항체를 사용하였다.

이상의 실험 결과를 도 6 내지 10에 나타내었다. 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 E-11-13, F-4-8, H-48-2, L-30-10, W-40-5를 1 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는 H-48-2에서 퇴화 효과가 확인되고, E-11-13, L-30-10, F-4-8, W-40-5의 순서대로 항종양 효과가 약해져 있었다 (도 6). 도 6에서 3회 격일 투여했을 때에 1회 투여시부터 계산하여 적어도 13일간은 증식 억제 내지 퇴화 효과가 관찰되었다 (H-48-2 클론).

E-11-13을 4, 20, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는 투여한 마우스 전체에서 항종양 효과가 확인되었다. 20 ㎍/마우스 개체의 투여량에서 최상의 종양 퇴화 효과가 확인되었다 (도 7). 도 7에서, 4회 격일 투여했을 때에 1회 투여시부터 계산하여 적어도 11일간은 증식 억제 내지 퇴화 효과가 관찰되었다. 20 ㎍/마우스 개체로 4회 격일 투여(이식 7일 후, 9일 후, 11일 후, 13일 후에 투여)한 군에 있어서의 종양 체적의 시간에 따른 변화는 이하와 같았다.

1회 투여 2일 후(도 7의 9일에 해당)의 종양 체적의 평균은 109.5 ㎣,

1회 투여 4일 후(도 7의 11일에 해당)의 종양 체적의 평균은 85.1㎣,

1회 투여 6일 후(도 7의 13일에 해당)의 종양 체적의 평균은 64.3 ㎣,

1회 투여 8일 후(도 7의 15일에 해당)의 종양 체적의 평균은 61.8 ㎣.

1회 투여 11일 후(도 7의 18일에 해당)의 종양 체적의 평균은 78.9 ㎣.

투여 개시 4일 후의 종양 체적은 약 85.1 ㎣이고, 14 ％ 이상의 종양의 축소가 확인되었다. 이 축소는 투여 11일 후에도 유지되고 있고, 본 발명의 항체는 높은 항종양 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

또한, 평균하여 약 30O ㎣가 되는 암에 걸린 마우스 7 마리를 1 군으로서 E-11-13을 20 ㎍/마우스 개체로 투여한 결과, 현저한 종양 퇴화가 관찰되었다 (도8). 도 8에서 3회 격일 투여했을 때에, 1회 투여시부터 계산하여 적어도 18일간은 증식 억제 내지 퇴화 효과가 관찰되었다. 20 ㎍/마우스 개체로 3회 격일 투여(이식 9일 후, 11일 후, 13일 후에 투여)한 군에 있어서 종양 체적의 시간에 따른 변화는 이하와 같았다.

1회 투여 2일 후(도 8의 11일에 해당)의 종양 체적의 평균은 246.9 ㎣,

1회 투여 4일 후(도 8의 13일에 해당)의 종양 체적의 평균은 181.8 ㎣,

1회 투여 5일 후(도 8의 14일에 해당)의 종양 체적의 평균은 146.2㎣,

1회 투여 6일 후(도 8의 15일에 해당)의 종양 체적의 평균은 110.8 ㎣,

1회 투여 7일 후(도 8의 16일에 해당)의 종양 체적의 평균은 82.7 ㎣,

1회 투여 9일 후(도 8의 18일에 해당)의 종양 체적의 평균은 57.5 ㎣,

1회 투여 11일 후(도 8의 2O일에 해당)의 종양 체적의 평균은 81.3 ㎣,

1회 투여 13일 후(도 8의 22일에 해당)의 종양 체적의 평균은 108.1 ㎣,

1회 투여 15일 후(도 8의 24일에 해당)의 종양 체적의 평균은 127.8 ㎣,

1회 투여 18일 후(도 8의 27일에 해당)의 종양 체적의 평균은 163.3 ㎣,

투여 개시 4일 후의 종양 체적은 약 181.8 ㎣이고, 39 ％ 이상의 종양 축소가 확인되었다. 이 축소는 투여 18일 후에도 유지되어 있고, 본 발명의 항체는 높은 항종양 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

0304 항체의 활성 평가는 이하과 같이 행하였다. 6 주령 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아(주)사에서 구입)의 등쪽 피하에 대장암 세포 Colo205를 5×10⁶개/마우스 개체로 이식하였다. 이식 8일 후에 생착된 종양의 크기를 측정하고, 종양의 크기가 평균하여 약 10O ㎣이 되는 암에 걸린 마우스 5 마리를 1 군으로 군분류하였다. 암에 걸린 마우스의 복강내에 정제 항체 20 ㎍/마우스 개체(20O ㎕의 PBS에 용해한 것)을 투여하여, 종양의 크기를 측정하였다. 0304를 20 ㎍/마우스 개체로 3회 격일 투여(이식 8일 후, 10일 후, 12일 후에 투여)한 군에서는 투여한 마우스 전부에서 항종양 효과가 확인되었다 (도 9). 종양 체적의 시간에 따른 변화는 이하와 같았다.

1회 투여 2일 후(도 9의 10일에 해당)의 종양 체적의 평균은 142.092 ㎣,

1회 투여 4일 후(도 9의 12일에 해당)의 종양 체적의 평균은 34.138 ㎣,

1회 투여 7일 후(도 9의 15일에 해당)의 종양 체적의 평균은 18.641 ㎣,

1회 투여 11일 후(도 9의 19일에 해당)의 종양 체적의 평균은 9.339 ㎣.

투여 개시 4일 후의 종양 체적은 약 34.138 ㎣이고, 65 ％ 이상의 종양의 축소가 확인되었다. 이 축소는 투여 11일 후에도 유지되고 있고, 본 발명의 항체는 매우 높은 항종양 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

계속해서, 12 주령 Balb/c 누드 마우스(닛본구레아(주)사에서 구입)의 등쪽 피하에 대장암 세포 Colo205를 5×10⁶개/마우스 개체로 이식하였다. 이식 10일 후에 생착된 종양의 크기를 측정하고, 종양의 크기가 평균하여 약 10O ㎣이 되는 암에 걸린 마우스 5 마리를 1 군으로 군분류하였다. 암에 걸린 마우스의 복강내에 정제 항체 25 ㎍/마우스 개체(200 ㎕의 PBS에 용해한 것)을 투여하여, 종양의 크기를 측정하였다. 항체의 음성 대조군으로서 동량의 인간 항 HSA 항체를 사용하였다. 0304를 25 ㎍/마우스 개체로 3회 투여(이식 10일 후, 13일 후, 15일 후에 투여)한 군에서는 투여한 마우스 전부에서 항종양 효과가 확인되었다 (도 10). 종양 체적의 시간에 따른 변화는 이하와 같았다.

1회 투여 3일 후(도 10의 13일에 해당)의 종양 체적의 평균은 54.026 ㎣,

1회 투여 5일 후(도 10의 15일에 해당)의 종양 체적의 평균은 32.357 ㎣,

1회 투여 8일 후(도 10의 18일에 해당)의 종양 체적의 평균은 15.895 ㎣,

1회 투여 12일 후(도 10의 22일에 해당)의 종양 체적의 평균은 14.377 ㎣,

1회 투여 15일 후(도 10의 25일에 해당)의 종양 체적의 평균은 26.654 ㎣,

1회 투여 19일 후(도 10의 29일에 해당)의 종양 체적의 평균은 27.565 ㎣,

1회 투여 25일 후(도 10의 35일에 해당)의 종양 체적의 평균은 30.802 ㎣,

1회 투여 29일 후(도 10의 39일에 해당)의 종양 체적의 평균은 27.092 ㎣,

1회 투여 32일 후(도 10의 42일에 해당)의 종양 체적의 평균은 32.921 ㎣.

1회 투여 12일 후(도 10의 22일에 해당)에 5 마리 중 3 마리에서 종양의 소실이 확인되었다.

1회 투여 3일 후의 종양 체적은 평균 54.626 ㎣이고, 45 ％ 이상의 종양의 축소가 확인되었다. 또한, 투여 5일 후의 종양 체적의 평균은 32.357 ㎣이고, 65 ％ 이상의 종양의 축소가 확인되었다. 이 축소는 투여 32일 후에도 유지되고 있고, 적어도 27일은 65 ％ 이상의 축소가 유지되고 있었다. 따라서, 본 발명의 항체는 매우 높은 항종양 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

또한, 도 10에서 1회 투여시부터 계산하여 적어도 32일간은 증식 억제 내지 퇴화 효과가 관찰되었다.

또한, 도 9 및 10에서 "비히클(Vehicle)"은 항체를 투여함에 있어서 용해시키기 위한 매체로서 사용한 PBS(200 ㎕)를 나타낸다.

0304, KMTR1는 실시예 11에서 나타내고 있는 바와 같이 항체 단독의 경우에도 세포사 유도 활성을 나타내는 항체이고, 또한 0304는 본 실시예에서 나타낸 바와 같이 암에 걸린 마우스 모델에 있어서도 현저한 항종양 효과가 확인되었다. 이와 같이 단독으로 세포사 유도 활성 및 항종양 활성을 나타내는 항체는 TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2을 발현하고 있는 세포에서 기인된 질환에 대한 예방 또는 치료제, 특히 악성 종양 치료약을 투여하는 대상이 되는 환자의 생리적 상황(예를 들면, 면역 세포의 종류, 수 등)에 의존하지 않고 항종양 활성을 나타내는 가능성이 기대된다.

<실시예 13> 정제 인간 항 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2에 대한 결합 친화성

실시예 10에서 얻어진 정제 인간 항 TRAIL-R 모노클로날 항체의 TRAIL-R에 대한 결합 친화성을, 이하에 기재하는 방법에 따라서 BIACORE 2000(비어코어 가부시끼 가이샤 제조)를 사용하여 검토하였다.

1) TRAIL-R1-hFc, TRAIL-R2-hFc의 고정화

TRAIL-R1-hFc 또는 TRAIL-R2-hFc를 10 mM 아세트산(pH 4.0) 중에 최종 농도 10 ㎍/㎖가 되도록 희석하여, 아민커플링법으로 센서칩 CM 5에 고정화하였다. 고정화 조건은 하기와 같고, NHS 활성화, 에탄올아민 블록킹은 취급 설명서에 기재된 방법에 따랐다. TRAIL-R1-hFc 및 TRAIL-R2-hFc의 커플링은 취급 설명서에 기재된 수동 주입에 의해 실시하였다.

(고정화 조건)

유속:5 ㎕/분

NHS 활성화:7 분간

커플링:수동 주입

에탄올아민 블로킹:7 분간

상기 조건에 의해, 센서칩 상에 TRAIL-R1-hFc 377.4 RU가 고정화되고, TRAIL-R2-hFc 495.4 RU가 고정화된 것이 확인되었다.

2) 재생 조건 및 재현성의 확인

20 ㎍/㎖의 정제 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체 2-6을 TRAIL-R1-hFc를 고정화한 센서칩 상에 2 분간 첨가하여, 항체가 TRAIL-R1-hFc와 결합한 것을 확인하였다. 그 후, 50 mM NaOH를 15 초간 첨가하여, 결합된 항체가 TRAIL-R1-hFc에서 완전히 해리된 (이하, 완전히 해리된 것을 "재생"이라고 함) 것을 확인하였다. 계속해서, 재생된 TRAIL-R1-hFc에 대해 유속 20 ㎕/분으로 정제 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체 2-6을 KINJECT법(1 분간 결합, 1 분간 해리)으로 첨가한 후에 50 mM NaOH를 15 초간 첨가하여, TRAIL-R1-hFc를 재생시키는 사이클을 9회 반복하였다. 상기 사이클을 9회 반복한 후에도 센서칩 상에 고정화되는 TRAIL-R1-hFc량 및 항체 결합량의 변화는 확인되지 않았기 때문에, 50 mM NaOH의 15 초간 첨가로, TRAIL-R1-hFc가 실활되지 않고 재생되는 것이 분명하게 되었다. 동일한 검토를, TRAIL-R2-hFc를 고정화된 센서칩과 20 ㎍/㎖의 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 E-11-13을 사용하여 행하고, 동일 재생 조건으로 TRAIL-R2-hFc가 재생 가능한 것을 확인하였다.

3) 상호 작용 검토

정제 인간 항 TRAIL-R1 모노클로날 항체 1-13, 2-6, 2-12를, 각각 HBS-EP(비어코어 가부시끼 가이샤 제조) 중에 2.1, 4.2, 8.4, 16.8, 33.5, 67.0, 134.0 nM로 단계적으로 희석하고, 각 항체의 희석 계열을 유속 20 ㎕/분으로 KINJECT법(2 분간 결합, 6 분간 해리)를 사용하여 순서대로 첨가하여, 센서그램을 취득하였다. 마찬가지로, 정제 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체 E-11-13, L-30-10, H-48-2, F-4-8, W-40-6, X-14-4를, 각각 HBS-EP(비어코어 가부시끼 가이샤 제조) 중에 0.52, 1.05, 2.1, 2.09, 4.19, 8.38 nM로 단계적으로 희석하고, 각 항체의 희석 계열을 유속 20 ㎕/분으로 KINJECT법(2 분간 결합, 2 분간 해리)를 사용하여 순서대로 첨가하여, 센서그램을 취득하였다. 각 항체에 대해서, 각각의 센서그램을 사용하여 BIAevaluation 소프트 버전 3.2(비어코어 가부시끼 가이샤 제조)에 의해 반응속도를 분석하였다. 핏팅 모델(Fitting model)로서 2가 모델(Bivalent model)을 사용하여 전체적 핏팅(Global fitting)을 하여 결합 속도 상수, 해리 속도 상수를 구하였다. 또한, 이 두개의 상수에서 산출되는 해리 상수(Kd치)를 산출하였다. 또한, 핏팅에 사용한 센서그램은 대조군 세포를 빼고, 또한 완충액에 대해 보정한 것이다. 결과를 표 6 및 표 7에 나타내었다. 표 중의 kass는 결합 속도 상수를,kdiss는 해리 속도 상수를, K_D는 해리 상수를 나타낸다.

<실시예 14> 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자의 제조 및 재조합 항체 발현 벡터의 구축

(1) E-11-13, L-30-10, H-48-2 항체 유전자의 cDNA 클로닝과 발현 벡터 제조

하이브리도마 E-11-13, L-30-10, H-48-2를 10 ng/㎖ 재조합 인간 IL-6(R＆D SYSTEMS사 제조), 10 ％ 저농도 IgG 소 태아 혈청(HyClone사 제조) 함유 eRDF 배지(교꾸도 제약사 제조)에서 배양하고, 원심분리에 의해 세포를 수집한 후, TRIZOL(GibcoㆍBRL사 제조)를 첨가하여 취급설명서에 따라서 전체 RNA를 추출하였다. 항체 cDNA의 가변 영역의 클로닝은 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech사 제조)를 사용하여, 첨부된 설명서에 따라서 행하였다.

5 ㎍의 전체 RNA를 주형으로 제1 가닥 cDNA를 제조하였다.

1) 제1 가닥 cDNA의 합성

전체 RNA:5 ㎍/3 ㎕

5' CDS:1 ㎕

SMART 올리고:1 ㎕

상기 조성의 반응액을 70 ℃에서 2 분간 배양한 후,

5×완충액:2 ㎕

DTT:1 ㎕

dNTP 혼합물:1 ㎕

수퍼스크립트(Superscript) II:1 ㎕

을 가하고 42 ℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다.

또한, 100 ㎕의 트리신 완충액(Tricine Buffer)을 가한 후, 72 ℃에서 7분간 배양하고, 제1 가닥 cDNA를 취득하였다.

2) PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭 및 재조합 항체 발현 벡터의 구축

cDNA의 증폭에는 다까라(Takara)사의 Z-Taq를 사용하였다.

cDNA:2 ㎕

10x Z-Taq 완충액:5 ㎕

dNTP 혼합물:4 ㎕

Z-Taq:1 ㎕

프라이머 1

프라이머 2

상기 조성의 반응액을 2차 증류수로 최종 용량 50 ㎕로 하여, PCR에 제공하였다.

중쇄의 증폭에는 UMP(SMART RACE cDNA 증폭 키트; Clontech사 제조)와 hh-6프라이머(5'-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3')(서열 7)를 사용하여, 98 ℃ 1 초, 68 ℃ 30 초의 사이클을 30회 반복하였다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하여, NUMP(SMART RACE cDNA 증폭 키트; Clontech사 제조)와 hh-3프라이머(5'-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3'(서열 8)를 사용하여, 98 ℃ 1 초, 68 ℃ 30 초의 사이클을 20회 반복하였다. 이 후, 증폭된 PCR 산물을 PCR 정제 키트(퀴아젠사 제조)에 의해 정제하여, hh-4(5'-GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT GG-3')(서열 9)을 프라이머로서, 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보에서 E-11-13, L-30-10, H-48-2의 3개 클론은 N 말단 영역의 서열이 일치하고 있는 것을 알 수 있었기 때문에, 서브 클로닝 및 염기 서열 결정에는 공통의 프라이머를 사용하였다. 서열 정보를 기초로, tnH48KBgl(5'-ATA TAG ATC TCT CAG TTA GGA CCC AGA GGG AAC C-3')(서열 10)를 합성하여, 이 프라이머를 사용하여 반대 방향에서도 서열을 결정하였다. 특이적 프라이머와 tnCHNhe (5'-GAT GGG CCC TTG GTG CTA GCT GAG GAG ACG G-3')(서열 11)을 사용하여 PCR을 행하여 (98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초), 중쇄 증폭 cDNA 단편을 SalI, NheI으로 분해하고, 동일 효소로 분해된 N5 KG1-Val Lark 벡터(IDEC Pharmaceuticals, N5 KG1(미국 특허 제6,001,358호의 개변 벡터))에 도입하였다. 삽입된 서열이 직접 서열분석에 의해서 결정된 서열과 동일하다는 것을, 상기 벡터를 주형으로 서열을 결정함으로써 확인하였다.

경쇄는 UMP(SMART RACE cDNA 증폭 키트; Clontech사 제조)와 hk2(5'-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3') (서열 12) 프라이머를 사용하여, 98 ℃ 1 초, 68 ℃ 30 초의 사이클을 30회 반복하고 증폭하였다. 또한, 이 반응액 1 ㎕을 주형으로 하고, NUMP(SMART RACE cDNA 증폭 키트; Clontech사 제조)와 hk-6(5'-T GGC GGG AAG ATG AAG ACA GAT GGT G-3'(서열 13)을 사용하여, 98 ℃ 1 초, 68 ℃ 30 초의 사이클을 20회 반복하였다. 이 후, 증폭된 PCR 산물을 PCR 정제 키트(퀴아젠사 제조)에 의해 정제하여, hk-6(5'-tggc ggg aag atg aag aca gat ggt g-3') 프라이머를 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보로부터, 3개 클론 전부에서 N 말단 영역의 서열이 일치하고 있는 것을 알았기 때문에 서브 클로닝에는 공통의 프라이머를 사용하였다. 서열 정보를 기초로, tnH48Hsal(5'-ATA TGT CGA CTA CGG GGG GGC TTT CTG AGA GTC-3')(서열 14)을 합성하고, 이 프라이머를 사용하여, 반대 방향으로부터도 서열을 결정하였다. 특이적 프라이머와 tnCkBsi(5'-AAG ACA GAT GGT GCA GCC ACC GTA CGT TTG AT-3')(서열 15)을 사용하여 PCR을 행하여 (98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초), 경쇄 증폭 cDNA 단편을 BglII, BsiWI으로 분해하여, 동일 효소로 분해된 N5 KG1-Val Lark 벡터에 도입하였다. 삽입된 서열이 직접 서열분석에 의해서 결정된 서열과 동일하다는 것을, 상기 벡터를 주형으로 서열을 결정함으로써 확인하였다.

E-11-13 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.

<E-11-13 중쇄 가변 영역>(서열 16)

<E-11-13 중쇄 가변 영역>(서열 17)

<E-11-13 경쇄 가변 영역>(서열 18)

<E-11-13 경쇄 가변 영역>(서열 19)

중쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 16의 5' 말단에서 30 번째의 아데닌 (A)로부터 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 461 번째의 아데닌(A)와 462 번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에서중쇄 가변 영역은 서열 17의 N 말단에서 144 번째의 세린 (S) 잔기까지이고, 145 번째의 알라닌(A) 이후가 불변 영역이다. 정제된 중쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열 17의 N 말단에서 26 번째의 세린(S)까지이고, 성숙체의 N 말단은 서열 17의 27 번째의 글루타민(Q)인 것이 분명해졌다.

경쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 18의 5' 말단에서 35 번째의 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단에서 415 번째의 아데닌(A)까지이다. 아미노산 서열에서 가변 영역은 서열 19의 N 말단에서 127 번째의 리신(K)까지이다. 정제된 경쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열 19의 N 말단에서 20 번째의 글리신(G)까지이고, 성숙체의 N 말단은 서열 19의 21 번째의 글루탐산(E)인 것이 분명하게 되었다.

L-30-10 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.

<L-30-10 중쇄 가변 영역>(서열 20)

<L-30-10 중쇄 가변 영역>(서열 21)

<L-30-10 경쇄 가변 영역>(서열 22)

<L-30-10 경쇄 가변 영역>(서열 23)

중쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 20의 5' 말단에서 30 번째의 아데닌(A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 461 번째의 아데닌(A)와 462 번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에서 중쇄 가변 영역은 서열 21의 N 말단에서 144 번째의 세린(S) 잔기까지이고, 145 번째의 알라닌(A) 이후가 불변 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P 버전 2)에 의해 중쇄의 시그널 서열은 서열 21의 N 말단에서 26 번째의 세린(S)까지로 예측되었다. 정제된 중쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열 21의 N 말단에서 26 번째의 세린(S)까지이고, 성숙체의 N 말단은 서열 21의 27번째의 글루타민(Q)인 것이 분명하게 되었다.

경쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 22의 5' 말단에서 31 번째의 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단에서 411 번째의 아데닌(A)까지이다. 아미노산 서열에서 가변 영역은 서열 23의 N 말단에서 127 번째의 리신(K)까지이다. 정제된 경쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열 23의 N 말단에서 20 번째의 글리신(G)까지이고, 성숙체의 N 말단은 서열 23의 21 번째의 글루탐산(E)인 것이 분명하게 되었다.

H-48-2 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.

<H-48-2 중쇄 가변 영역>(서열 24)

<H-48-2 중쇄 가변 영역>(서열 25)

<H-48-2 경쇄 가변 영역>(서열 26)

<H-48-2 경쇄 가변 영역>(서열 27)

중쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 24의 5' 말단에서 29 번째의 아데닌(A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 항체 가변 영역과 불변 영역의 경계는 5' 말단에서 484 번째의 아데닌(A)와 485 번째의 구아닌(G)사이에 위치한다. 아미노산 서열에서 중쇄 가변 영역은 서열 25의 N 말단에서 152 번째의 세린(S) 잔기까지이고, 153 번째의 알라닌(A) 이후가 불변 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P 버전 2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열 25의 N 말단에서 26 번째의 세린(S)까지로 예측되었다. 정제된 중쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열 25의 N 말단에서 26 번째의 세린(S)까지이고, 성숙체의 N 말단은 서열 25의 27 번째의 글루타민(Q)인 것이 분명하게 되었다.

경쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 26의 5' 말단에서 31 번째의 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단에서 417 번째의 아데닌(A)까지이다. 아미노산 서열에서 가변 영역은 서열 27의 N 말단에서 129 번째의 리신(K)까지이다. 정제된경쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열 27의 N 말단에서 20 번째의 글리신(G)까지이고, 성숙체의 N 말단은 서열 27의 21 번째의 글루탐산(E)인 것이 분명하게 되었다.

(2) 0304 항체 유전자의 cDNA 클로닝과 발현 벡터 제조

하이브리도마 0304를 원심분리에 의해서 수집하여 RNA 추출 시약 ISOGEN(일본 유전자사 제조)를 사용하여 프로토콜에 따라서, 약 900 ㎍의 RNA를 정제하였다. 다음으로 300 ㎍의 RNA에서 Oligotex^TM-dT 30 <Super>(다까라 주조사 제조)에 의해 13 ㎍의 polyA⁺RNA를 얻었다. 얻어진 polyA⁺RNA를 재료로서 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech사 제조)를 사용하여, 그 첨부된 설명서를 따라서 클로닝 실험을 실시하여, 항체 유전자의 가변 영역의 cDNA를 취득하였다. 구체적으로는, 정제된 polyA⁺RNA 1.0 ㎍을 재료로서, 역전사 효소에 의한 제1 가닥 cDNA 합성을 행하였다. 얻어진 cDNA를 주형으로 인간 항체의 중쇄(이하, 중쇄는 H쇄라고 함) 불변 영역, 및 경쇄(이하, 경쇄는 L쇄라고 함) 불변 영역 DNA 각각에 특이적인 PCR용 프라이머(H쇄용: IgG1p, L쇄용: hk-2)와 SMART RACE cDNA 증폭 키트 부속의 UMP 프라이머(합성된 cDNA의 5' 말단에 제조되는 공통 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드)를 프라이머 셋트로서 사용하고 PCR에 의한 H쇄 리더 서열과 가변 영역(이하, HV라고 함) 및 L쇄 리더 서열과 가변 영역(이하, LV라고 함)의 증폭을 행하였다. PCR은 LA PCR용 Taq DNA 중합효소인 TaKaRa LA Taq^TM(다까라 주조사 제조)를 사용하였다. 주형 DNA를 1×LA PCR 완충액 II (Mg²⁺첨가), dNTP 혼합물 각 400 μM(최종 농도), 프라이머 2종 각 0.2 μM, TaKaRa LA Taq 2.5 U/50 ㎕을 포함하는 용액에 첨가하여, 터치다운 PCR (94 ℃ 5 초 및 72 ℃ 3 분(5 사이클)→ 94 ℃ 5 초, 70 ℃ 10 초 및 72 ℃ 3 분(5 사이클)→ 94 ℃ 5 초, 68 ℃ 10 초 및 72 ℃ 3 분(20 사이클))로 반응하였다. 증폭된 PCR 단편은 에탄올 침전으로 회수한 후, 아가로스겔 전기영동으로 회수하여, 멤브레인을 사용하는 DNA 정제 키트인 QIA 퀵 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)로써 정제하였다. 정제된 HV 및 LV 단편에 대해 ABI PRISM^?의 3700 DNA 분석기(Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 DNA 염기 서열을 결정하였다. 또한, HV 및 LV의 증폭 단편은 각각 TA 클로닝법을 사용하는 pGEM^?-T Easy 벡터 시스템(프로메가사 제조)에 서브클로닝을 행하여, 얻어진 클론의 플라스미드 DNA에 대해서 삽입체 DNA의 염기 서열을 분석하여 PCR 산물의 직접 서열 분석 결과와 비교하였다. DNA 염기 서열 결정을 위해 사용한 프라이머의 서열(H쇄: hh-4, L쇄: hk-5 및 hk-6, 및 pGEM^?-T Easy 벡터용: SP6과 T7)은 하기 표 8에 나타내었다. HV 및 LV의 각 PCR 단편의 직접 서열 분석 결과와 서브클로닝된 복수의 클론의 DNA 염기 서열 분석 결과는 완전히 일치하였다.

0304 항체 L쇄의 DNA를 주형으로, 동 L쇄의 리더 서열과 가변 영역의 말단에 연결을 위한 제한 효소 부위를 부가하도록 디자인한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 사용된 프라이머 셋트는 표 8(C23LBCL 및 C23LBsi)에 서열을 나타내었다. 얻어진 PCR 단편은 에탄올 침전으로 회수한 후, 제한 효소 BglII로 분해 처리하고, 또한 BsiWI으로 절단 처리하여, 아가로스겔 전기영동으로 약 400 bp의 단편을 회수하여, 멤브레인을 사용하는 DNA 정제 키트인 QIA 퀵 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)로 정제하였다. 다른쪽의 벡터인 N5 KG4-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1(미국 특허 제6,001,358호의 개변 벡터))에 대해서는 마찬가지로 제한 효소 BglII, BsiWI 처리를 차례로 행한 후, 탈인산화 처리로서 알칼리성 포스파타제(E. coliC75)(다까라주조사 제조)로써 처리한 후에, 아가로스겔 전기영동과 DNA 정제 키트로 약 9 kb 정도의 DNA를 회수하였다. 이들 2개의 단편을 T4 DNA 리가아제(ligase)를 사용하여 라이게이션하고, 대장균(Escherichia coli) DH5α에 도입하여 형질전환체를 얻었다. N5KG4-Val Lark에 0304 항체 L쇄의 리더+ 가변 영역이 삽입된 플라스미드 DNA인 N5KG4-0304L을 선택하고, 삽입 단편 주변의 DNA 염기 서열을 결정하여 DNA 염기 서열에 이변 등이 없는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 N5KG4-0304L에 H쇄 가변 영역 등을 삽입하기 위해 본 플라스미드 DNA를 제한 효소 NheI, 및 SalI에서 차례로 절단하고, 또한 탈인산화를 행한 후, 약 9.3 kb의 벡터 DNA를 정제하였다. 한편, 항체의 H쇄의 플라스미드 DNA를 주형으로 0304 항체 H쇄 유전자의 리더 서열과 가변 영역을 PCR로 증폭하였다. 증폭을 위한 프라이머 셋트(T0304Sal 및 T0304Nhe)의 서열을 표 8에 나타내었다.

얻어진 PCR 단편을 제한 효소 NheI와 SalI으로 절단 처리를 행하고, 아가로스겔 전기영동으로 약 450 bp의 단편을 정제하였다. 이들 2종의 DNA를 라이게이션하고, 대장균(Escherichia coli)에 도입하여 형질전환체를 얻어, 목적으로 하는 H쇄의 리더 서열과 가변 영역이 삽입된 클론을 선택하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR 증폭으로 삽입된 서열이 주형으로 한 유전자 서열과 차이가 없는 것을 확인하였다.

0304 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.

<0304 중쇄 가변 영역>(서열 28)

<0304 중쇄 가변 영역>(서열 29)

<0304 경쇄 가변 영역>(서열 30)

<0304 경쇄 가변 영역>(서열 31)

중쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 28의 5' 말단에서 55 번째의 아데닌(A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 5' 말단에서 489 번째의 아데닌(A)까지가 항체 가변 영역이다. 아미노산 서열에서 중쇄 가변 영역은 서열 29의 N 말단에서 145 번째의 세린(S) 잔기까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P 버전 2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열 29의 N 말단에서 19 번째의 세린(S)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열 29의 20 번째의 글루타민(Q)인 것으로 생각된다.

경쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 30의 5' 말단에서 34 번째의 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단에서 414 번째의 아데닌(A)까지이다. 아미노산 서열에서 가변 영역은 서열 31의 N 말단에서 127 번째의 리신(K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P 버전 2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열 31의 N 말단에서 20 번째의 글리신(G)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열 31의21 번째의 글루탐산(E)인 것으로 생각된다.

(3) KMTR1 항체 유전자의 cDNA 클로닝

하이브리도마 KMTR1 세포를 원심분리에 의해서 수집하여 RNA 추출 시약 ISOGEN(일본 유전자사 제조)를 사용하여 프로토콜에 따라서, 약 900 ㎍의 RNA를 정제하였다. 다음으로 300 ㎍의 RNA에서 Oligotex^TM-dT 30 <Super>(다까라 주조사 제조)에 의해 13 ㎍의 polyA⁺RNA를 얻었다. 얻어진 polyA⁺RNA를 재료로서 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech사 제조)를 사용하여, 그 첨부된 설명서를 따라서 클로닝 실험을 실시하여, 항체 유전자의 가변 영역의 cDNA를 취득하였다. 구체적으로는, 정제된 polyA⁺RNA 1.0 ㎍을 재료로서, 역전사 효소에 의한 제1 가닥 cDNA 합성을 행하였다. 얻어진 cDNA를 주형으로 인간 항체의 중쇄(이하, 중쇄는 H쇄라고 함) 불변 영역, 및 경쇄(이하, 경쇄는 L쇄라고 함) 불변 영역 DNA 각각에 특이적인PCR용 프라이머(H쇄용: IgG1p, L쇄용: hk-2)와 SMART RACE cDNA 증폭 키트 부속의 UMP 프라이머(합성된 cDNA의 5' 말단에 제조되는 공통 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드)를 프라이머 셋트로서 사용하고 PCR에 의한 H쇄 리더 서열과 가변 영역(이하, HV라고 함) 및 L쇄 리더 서열과 가변 영역(이하, LV라고 함)의 증폭을 행하였다. PCR은 LA PCR용 Taq DNA 중합효소인 TaKaRa LA Taq^TM(다까라 주조사 제조)를 사용하였다. 주형 DNA를 1×LA PCR 완충액 II (Mg²⁺첨가), dNTP 혼합물 각 400 μM(최종 농도), 프라이머 2종 각 0.2 μM, TaKaRa LA Taq 2.5 U/50 ㎕을 포함하는 용액에 첨가하여, 터치다운 PCR (94 ℃ 5 초 및 72 ℃ 3 분(5 사이클)→ 94 ℃ 5 초, 70 ℃ 10 초 및 72 ℃ 3 분(5 사이클)→ 94 ℃ 5 초, 68 ℃ 10 초 및 72 ℃ 3 분(20 사이클))로 반응하였다. 증폭된 PCR 단편은 에탄올 침전으로 회수한 후, 아가로스겔 전기영동으로 회수하여, 멤브레인을 사용하는 DNA 정제 키트인 QIA 퀵 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)로써 정제하였다. 정제된 HV 및 LV 단편에 대해 ABI PRISM^?의 3700 DNA 분석기(Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 DNA 염기 서열을 결정하였다. 또한, HV 및 LV의 증폭 단편은 각각 TA 클로닝법을 사용하는 pGEM^?-T Easy 벡터 시스템(프로메가사 제조)에 서브클로닝을 행하여, 얻어진 클론의 플라스미드 DNA에 대해서 삽입체 DNA의 염기 서열을 분석하여 PCR 산물의 직접 서열 분석 결과와 비교하였다. DNA 염기 서열 결정을 위해 사용한 프라이머의 서열(H쇄: hh-4, L쇄: hk-5 및 hk-6, 및 pGEM^?-T Easy 벡터용: SP6과 T7)은 상기 표 8에나타내었다. HV 및 LV의 각 PCR 단편의 직접 서열 분석 결과와 서브클로닝된 복수의 클론의 DNA 염기 서열 분석 결과는 완전히 일치하였다.

결정할 수 있는 KMTR1 세포에서 발현되는 인간 항체 유전자의 H쇄 및 L쇄의 DNA 염기 서열과 아미노산 서열을 나타내었다.

<KMTR1 중쇄 가변 영역>(서열 32)

<KMTR1 중쇄 가변 영역>(서열 33)

<KMTR1 경쇄 가변 영역>(서열 34)

<KMTR1 경쇄 가변 영역>(서열 35)

중쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 32의 5' 말단에서 81 번째의 아데닌(A)에서 시작되는 ATG 코돈이고, 5' 말단에서 497 번째의 아데닌(A)까지가 항체 가변 영역이다. 아미노산 서열에서 중쇄 가변 영역은 서열 33의 N 말단에서 139 번째의 세린(S) 잔기까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P 버전 2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열 33의 N 말단에서 19 번째의 시스테인(C)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열 33의 20 번째의 글루탐산(E)인 것으로 생각된다.

경쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 34의 5' 말단에서 66 번째의 A에서 시작되는 ATG 코돈이고, 가변 영역은 5' 말단에서 443 번째의 아데닌(A)까지이다. 아미노산 서열에서 가변 영역은 서열 35의 N 말단에서 126 번째의 리신(K)까지이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P 버전 2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열 35의N 말단에서 19 번째의 글리신(G)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열 35의 20 번째의 글루탐산(E)인 것으로 생각된다.

<실시예 15> 재조합형 항체의 제조

실시예 14에서 구축한 재조합형 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 재조합형 항체 발현 세포를 제조하였다. 발현을 위한 숙주 세포에는 예를 들면, CH0세포의 dhfr 결손주(ATCC CRL-9096)를 사용하였다. 숙주 세포에의 벡터의 도입은 전기천공에 의해 실시하였다. 항체 발현 벡터 약 2 ㎍을 제한 효소로 선형화하고, Bio-Rad 전기천공기를 사용하여 350 V, 500 μF의 조건으로 4×10⁶개의 CHO 세포에 유전자를 도입하여, 96 웰 배양 플레이트에 접종하였다. 발현 벡터의 선별 마커에 대응한 약제를 첨가하여 배양을 계속하였다. 콜로니를 확인한 후, 실시예 4에 나타낸 방법에 의해서, 항체 발현주를 선별하였다. 선별된 세포로부터의 항체 정제는 실시예 10에 따라서 행하였다.

<실시예 16> 재조합형 항체에 의한 암 세포에 대한 세포사 유도 활성

실시예 15에서 얻어진 재조합형 인간 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 사용하여 대장암 세포인 Colo205(ATCC CCL-222)에 대한 세포사 유도 활성을 측정하였다. 10 ％ FCS를 포함하는 RPMI 배지에서 배양하고 있었던 Colo205 세포를 1.0×10⁵개/㎖의 농도로 제조하여, 각 웰 100 ㎕씩을 96 웰 평저 플레이트(벡톤디킨슨사 제조)에 분주하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양한 후, 정제 항체 E 11(CHO-3), H48(CHO-3)를 최종 농도 10, 100, 1000, 10000 ng/㎖이 되도록 10㎕/웰로 가하고, 또한 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체(시그마사 제조)를 최종 농도 10, 10O ㎍/㎖이 되도록 각 웰에 10 ㎕씩 가하였다. 취득한 하이브리도마에 대해서, 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가하지 않는 웰도 제조하였다. 양성 대조군으로서, 인간 재조합 TRAIL 단백질 (R＆D SYSTEMS사 제조)를 최종 농도 1, 10 ng/㎖로 사용하였다. 음성 대조군으로서 인간 항 HSA 항체를 사용하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 48 시간 동안 배양한 후, MTS 시약(Cell Titer 96AQ_UEOUSNon-Radioactive Cell Proliferation Assay: 프로메가사 제조)를 설명서의 방법에 따라서 제조하여, 각 웰에 20 ㎕ 씩 첨가하였다. 또한, 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에 2 시간 동안 배양한 후, 파장 490 nm(참조 파장 630 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(1420 ARV0 멀티 라벨카운터: WALLAC사 제조)로 측정하고, 미토콘드리아의 환원능을 지표로서 세포의 생존율을 산정하였다. 각 웰의 세포 생존율은 실시예 7과 동일한 식에 의해 산출하였다.

결과를 도 11a, 11b에 나타낸다. 도 11a는 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가하지 않은 실험의 결과를, 도 11b는 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가한 실험의 결과를 각각 나타낸다.

도 11a에서 재조합형 항체인 E11(CHO-3), H48(CH0-3)는 항체 단독의 경우에도 Colo205 세포에서 세포사를 유도하는 활성이 있는 것이 분명하게 되었다. 또한, 도 11b에서 염소 항 인간 IgG(γ) 특이적 폴리클로날 항체를 첨가한 경우, 하이브리도마의 배양 상청액에서 정제된 항체와 동등한 세포사 유도 활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 자체가 참고로 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.

본 발명에 의해, TRAIL-R1 및 R2를 발현하고 있는 세포에서 기인하는 질환에 대한 예방 또는 치료제, 특히 악성 종양 치료약으로서 유용하고, 또한 간에 대한 상해성을 피할 수 있는 매우 안전성이 높은 분자가 제공되었다.

<서열목록 설명>

서열 1: 합성 DNA

서열 2: 합성 DNA

서열 3: 합성 DNA

서열 4: 합성 DNA

서열 5: 합성 DNA

서열 6: 합성 DNA

서열 7: 합성 DNA

서열 8: 합성 DNA

서열 9: 합성 DNA

서열 10: 합성 DNA

서열 11: 합성 DNA

서열 12: 합성 DNA

서열 13: 합성 DNA

서열 14: 합성 DNA

서열 15: 합성 DNA

서열 36: 합성 DNA

서열 37: 합성 DNA

서열 38: 합성 DNA

서열 39: 합성 DNA

서열 40: 합성 DNA

서열 41: 합성 DNA

서열 42: 합성 DNA

서열 43: 합성 DNA

서열 44: 합성 DNA

서열 45: 합성 DNA

Claims (62)

1. TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2에 결합되는 항체 또는 그의 기능적 단편.
2. 제1항에 있어서,

   (a) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2를 발현하는 암 세포에서 아팝토시스 (apoptosis)를 유도하는 활성을 가짐,

   (b) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2를 발현하는 인간 정상 세포에는 영향을 미치지 않음, 및

   (c) 인간 간 세포 상해를 유발하지 않음

   중에서 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
3. (a) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2를 발현하는 암 세포에서 아팝토시스를 유도하는 활성을 가짐,

   (b) TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2를 발현하는 인간 정상 세포에는 영향을 미치지 않음, 및

   (c) 인간 간 세포 상해를 유발하지 않음

   의 모든 성질을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, TRAIL-R2에는 결합되지만, TRAIL-R1에는 결합되지 않는 항체 또는 그의 기능적 단편.
5. 제2항 또는 제3항에 있어서, TRAIL-R2 및 TRAIL-R1 모두에 결합되는 항체 또는 그의 기능적 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스-마우스 하이브리도마 (hybridoma)에 의해 생산되는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 0.01 ㎍/㎖ 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 0.1 ㎍/㎖ 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 2 내지 10 ㎍/㎖인 항체 또는 그의 기능적 단편.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 10 ㎍/㎖ 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 10 내지 100 ㎍/㎖인 항체 또는 그의 기능적 단편.
13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 100 ㎍/㎖ 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 2.5×10³및 반응 시간48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치가 100 ㎍/㎖ 이하인 항체 또는 그의 기능적 단편.
15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치가 10 ㎍/㎖ 이하인 항체 또는 그의 기능적 단편.
16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치가 0.7 ㎍/㎖ 이하인 항체 또는 그의 기능적 단편.
17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치가 0.02 내지 0.11 ㎍/㎖인 항체 또는 그의 기능적 단편.
18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치가 0.02 ㎍/㎖ 이하인 항체 또는 그의 기능적 단편.
19. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 2 내지 100 ㎍/㎖이고, 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치가 0.02 내지 0.11 ㎍/㎖인 항체 또는 그의 기능적 단편.
20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 2 배 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
21. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 10 배 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 50 배 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
23. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 50 배 내지 100 배인 항체 또는 그의 기능적 단편.
24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 100 배 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
25. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 100 배 내지 1000 배인 항체 또는 그의 기능적 단편.
26. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 250 배 내지 1000 배인 항체 또는 그의 기능적 단편.
27. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포수 7.5×10⁴및 반응 시간 24 시간에서의 인간 간 세포에 대한 LD50치가 세포수 2.5×10³및 반응 시간 48 시간에서의 암 세포에 대한 LD50치의 1000 배 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
28. 제8항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 용량이 110 내지 120 ㎕인 항체 또는 그의 기능적 단편.
29. 제2항, 제3항 및 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포가 Colo205 세포인 항체 또는 그의 기능적 단편.
30. 제2항 또는 제3항에 있어서, 암 세포가 Colo205 세포, U251 세포 또는 Jurkat 세포인 항체 또는 그의 기능적 단편.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 증식을 억제하거나, 또는 종양을 퇴화시킬 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
32. 제31항에 있어서, 종양이 대장암, 결장 직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 흑색종, 신장 세포암, 방광암, 백혈병, 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 난포막종, 남성 배종, 자궁 내막 과형성, 자궁 내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시 육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상세포종, 신경섬유종, 희돌기교세포종, 수아세포종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 과오아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상육종 및 윌름스 종양 (Wilms tumor) 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인 항체 또는 그의 기능적 단편.
33. 제31항에 있어서, 종양이 누드 마우스에 이식된 Colo205 세포로부터 유래하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편.
34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 증식을 억제하거나, 또는 종양을 퇴화시킬 수 있는 기간이 9일 이상인 항체 또는 그의 기능적 단편.
35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 기능적 단편의 투여량이 100 ㎍/신체 또는 5 mg/kg인 항체 또는 그의 기능적 단편.
36. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 기능적 단편의투여량이 20 ㎍/신체 또는 1 mg/kg인 항체 또는 그의 기능적 단편.
37. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 기능적 단편의 투여량이 4 ㎍/신체 또는 200 ㎍/kg인 항체 또는 그의 기능적 단편.
38. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 기능적 단편의 투여량이 1 ㎍/신체 또는 50 ㎍/kg인 항체 또는 그의 기능적 단편.
39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 G형 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
40. 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 4 내지 6 주령의 마우스에게 20 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 4일 후에 평균 14 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
41. 제40항에 있어서, 평균 14 ％ 이상의 종양 축소를 7일 이상 유지할 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
42. 제40항에 있어서, 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 4 내지 6 주령의 마우스에게 20 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 4일 후에 평균 65 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
43. 제40항에 있어서, 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 4 내지 6 주령의 마우스에게 20 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 7일 후에 평균 80 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
44. 제43항에 있어서, 평균 80 ％ 이상의 종양 축소를 4일 이상 유지할 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
45. 제40항에 있어서, 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 12 주령의 마우스에게 25 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 3일 후에 평균 45 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
46. 제45항에 있어서, 100 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 12 주령의 마우스에게 25 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 5일 후에 평균 65 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
47. 제46항에 있어서, 평균 65 ％ 이상의 종양 축소를 27일 이상 유지할 수 있는항체 또는 그의 기능적 단편.
48. 제40항에 있어서, 300 mm³의 종양을 갖는, 암에 걸린 4 내지 6 주령의 마우스에게 20 ㎍/마우스 개체의 농도로 투여했을 때, 첫회 투여 4일 후에 평균 39 ％ 이상의 종양 축소를 일으킬 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
49. 제48항에 있어서, 평균 39 ％ 이상의 종양 축소를 14일 이상 유지할 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편.
50. 제40항에 있어서, 0304 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
51. 제40항에 있어서, E-11-13 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
52. 하이브리도마 E-11-13, H-48-2, L-30-10, N-18-12, W-40-5, X-14-4, X-51-12, F-4-8, G-3-10, 0304 또는 KMTR1에 의해 생산되는, TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2에 결합되는 항체 또는 그의 기능적 단편.
53. 수탁 번호가 FERM BP-7599인 하이브리도마 H-48-2, 수탁 번호가 FERM BP-7698 또는 FERM BP-7770인 하이브리도마 E-11-13, 수탁 번호가 FERM BP-7699 또는FERM BP-7768인 하이브리도마 F-4-8, 수탁 번호가 FERM BP-7700 또는 FERM BP-7769인 하이브리도마 L-30-10, 수탁 번호가 FERM BP-8037인 하이브리도마 0304 또는 수탁 번호가 FERM BP-8038인 하이브리도마 KMTR1에 의해 생산되는, TRAIL-R1 및(또는) TRAIL-R2에 결합되는 항체 또는 그의 기능적 단편.
54. 서열 17 및 19로 각각 표시되는, 하이브리도마 E-11-13이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 21 및 23으로 각각 표시되는, 하이브리도마 L-30-10이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 25 및 27로 각각 표시되는, 하이브리도마 H-48-2가 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 29 및 31로 각각 표시되는, 하이브리도마 0304가 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는 서열 33 및 35로 각각 표시되는, 하이브리도마 KMTR1이 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
55. 서열 16 및 18로 각각 표시되는, 하이브리도마 E-11-13으로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 20 및 22로 각각 표시되는, 하이브리도마 L-30-10으로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 24 및 26으로 각각 표시되는, 하이브리도마 H-48-2로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 서열 28 및 30으로 각각 표시되는, 하이브리도마 0304로부터 단리된 핵산 서열에의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는 서열 32 및 34로 각각 표시되는, 하이브리도마 KMTR1로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 성숙 부분의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편.
56. E-11-13, H-48-2, L-30-10, N-18-12, W-40-5, X-14-4, X-51-12, F-4-8, G-3-10, 0304 및 KMTR1로 이루어지는 군에서 선택되는, TRAIL-R2에 결합되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
57. 수탁 번호가 FERM BP-7599인 하이브리도마 H-48-2, 수탁 번호가 FERM BP-7698 또는 FERM BP-7770인 하이브리도마 E-11-13, 수탁 번호가 FERM BP-7699 또는 FERM BP-7768인 하이브리도마 F-4-8, 수탁 번호가 FERM BP-7700 또는 FERM BP-7769인 하이브리도마 L-30-10, 수탁 번호가 FERM BP-8037인 하이브리도마 0304 또는 수탁 번호가 FERM BP-8038인 하이브리도마 KMTR1로부터 선택되는, TRAIL-R2에 결합되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
58. 제56항 또는 제57항에 기재된 하이브리도마를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 TRAIL-R2에 결합되는 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는, 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 제조 방법.
59. 제56항 또는 제57항에 기재된 하이브리도마로부터 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 단리하고, 이 유전자를 갖는 발현 벡터를 구축하고, 이 발현 벡터를 숙주에 도입하여 상기 모노클로날 항체를 발현시키고, 얻어지는 숙주, 숙주의 배양 상청액 또는 숙주의 분비물로부터 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는, 항 TRAIL-R2 모노클로날 항체의 제조 방법.
60. 제59항에 있어서, 숙주가 대장균(Escherichia coli), 효모 세포, 곤충 세포, 포유 동물 세포, 식물 세포 및 포유 동물로 이루어지는 군에서 선택되는 것 중 어느 하나인 제조 방법.
61. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 종양의 예방 또는 치료제.
62. 제61항에 있어서, 종양이 대장암, 결장 직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 흑색종, 신장 세포암, 방광암, 백혈병, 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 난포막종, 남성 배종, 자궁 내막 과형성, 자궁 내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시 육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상세포종, 신경섬유종, 희돌기교세포종, 수아세포종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 과오아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상육종 및 윌름스 종양 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인 예방 또는 치료제.