JPS6363625A - ヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １及りへ仕肚た１ 本発明は、ヒト動脈硬化症関連抗原を特異的に認識する
ヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体およびその製造法
に関する。さらに本発明は、ヒト動脈硬化症関連抗原の
定量およびそれに基づく動脈硬化症の診断、ヒト動脈硬
化症の病巣に対するイメージング診断などに有用なヒ゛
ト動脈硬化症関連抗原認識モノクロナル抗体を提供する
ものである。

来の汁１および。題占 動脈硬化症（Ａ　ｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）は
大動脈、冠動脈、脳動脈および脈動脈等の筋型動脈に多
く発生し、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等の主因となる疾
患であ。

その病因として血漿コレステロールの上昇、内皮傷害、
血小板凝集、内膜肥厚、粥腫の形成等が提唱されている
。しかしその成因はほとんど解析されていないのが現状
である。

正常な大動脈は内皮、弾性繊維と平滑筋細胞よりなる中
膜、弾性繊維よりなる外股の３層により構築されている
。この大動脈が何らかの原因でこの内皮と中膜の境界が
肥厚し、細胞の異常繁殖、壊死が生ずるといわゆる動、
報硬化症として出現する。

すなわち、心筋梗塞、脳梗塞等の重篤な疾患が生ずる原
因として、 ■　コレステロールをはじめとする脂質の動脈壁細胞な
らびに細胞間への蓄積による粥腫形成、■　細胞増殖に
伴う内膜肥厚および ■　内皮の損傷ならびに内膜の肥厚に伴う血小板の凝集 どうの種々の理由により動脈血管の閉塞がもたらされる
ことである。その結果、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等の
疾患を発現するものと推定される。

上記内膜Ｉ！厚部分には イ）大量の脂質を取り込んだ泡沫細胞の出現口）細胞間
への脂質の蓄積、 ハ）内膜での平滑筋細胞の増殖、 二）　結合組織の増成とカルシウムの沈着、ホ）血小板
の凝集と血栓形成、 等が認められる。

従来、ヒト動脈硬化症の診断法としては、血中コレステ
ロール値の測定、リボ蛋白組成の分析、凝固因子、の検
索などから危険度を予測する間接的な方法と、動脈壁の
音波の伝搬速度や反射エコーを利用して動脈硬化の進展
度を測定したり、動脈血管内に像映剤を注入して動脈の
狭窄像を直接観察する方法とがある。

しかしながら、上記の間接法における血中危険因子の測
定は動脈硬化症の直接因子を測定しているものではなく
、確度の高い診断法とは言えない。

一方、反射エコー法、血管像映法による直接診断法はい
ずれも動脈硬化症による血管の狭窄度を測定する方法で
あり、動脈硬化の進展度そのものを測定する方法ではな
、い、しかも血管像映法は像映剤を動脈内に注入するた
めに技術的な危険性を伴う。

従って、手軽にでき、かつヒト動脈硬化症に特異性の高
い診断法が望まれている。しかしながら動脈硬化症を診
断するための直接的な血中指標物質ならびに動脈硬化具
を直接認識する指標物質は何ら見出されていないのが現
状である。

ｕ″Ｉ！　　を　−るための−「 本発明は前述した問題点を解決するものであり、本発明
者等は、ヒト動脈硬化症に直接作用する因子について鋭
意研究した結果、動脈硬化症患者からの血清または動脈
硬化病巣部位を抗原として、家族性高コレステロール血
症、心筋梗塞、脳梗塞等のヒト動脈硬化症の関連抗原を
特異的に認識するモノクロナル抗体産生細胞を単芯し、
この細胞からヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体を得
ることに成功した。

すなわち本発明は、ヒト動脈硬化症関連抗原を特異的に
認識するヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体に関する
ものである。さらに本発明は、ヒト動脈硬化症関連抗原
を含有する溶液で、ヒトを除く哺乳動物を免疫し、該動
物の抗体産生リンパ球とミエローマ細胞とを細胞融合さ
せて抗ヒト動脈硬化症抗体産生融合細胞を単文１し、次
いで抗ヒト動脈硬化症抗体産生融合細胞を培養すること
を特徴とするヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体の製
造法に関する。

本発明のモノクロナル抗体は、好適な簡便法として、抗
ヒト動脈硬化症抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合
細胞から産生ずることができる。

この製造法は特に限定されるものではなく、例えば、ま
ずヒト動脈硬化症抗原をもちいて常法によりヒトを除く
哺乳動物を感作する。ここで用いうるヒト動脈硬化症抗
原としては、例えば家族性高コレステロール患者血清や
脳梗塞、心筋梗塞患者血清のようなヒト動脈硬化症患者
から分離した血清および動脈硬化病巣部位（特に内膜肥
厚部分）のホモゲネートを挙げることができる。ついで
感作された動物のＷ臓、特に胸腺、末梢リンパ節や末梢
血より抗ヒト動脈硬化窪抗体産生のリンパ球を単離して
抗ヒト動脈硬化症抗体産生細胞を得る。

さらにこの細胞は、ミエローマ細胞と常法により融合さ
せ、抗体産生性融合細胞を得る。この融合細胞を複数の
ウェルに分注し、培養し、各ウェルの上清を酵素免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ法）、間接蛍光抗体法等の手段により
分析しヒト動脈硬化患者血清あるいはヒト動脈硬化病巣
にのみ特異的に結合し、正常ヒト血清あるいは正常動脈
壁は認識しないヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体産
生細胞を単離し、さらにこれを直接組織培養するか、ま
たは哺乳動物、例えばマウスやモルモットの腹腔に移植
して腫瘍を形成させて腹水から産生された目的とするモ
ノクロナル抗体を採取し、精製する。

かくして、本発明者等は、ヒト動脈硬化症関連抗原を特
異的に認識する新規ヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗
体を単離することに成功した。

このうち、高コレステロール患者、脳梗塞患者、心筋梗
塞患者血清を抗原として得られたモノクロナル抗体Ｙ１
１９１．Ｓ工１２Ａはヒト患者血清に認められる動脈硬
化症関連抗原を特異的に認識するモノクロナル抗体で、
免疫グロブリンクラスはそれぞれＩｇＧおよびＩｇＭに
分類される。

更に、動脈硬化症患者の内膜肥厚部分のホモゲネートを
抗原としてモノクロナル抗体Ｔ２５５ＡおよびＴ２５６
Ｃを得ることができた。このモノクロナル抗体Ｔ２５５
Ａは免疫グロブリンクラスＩｇＧにそしてＴ２５６Ｃは
ＩｇＭに分類されるもので、動脈硬化巣を特異的に認識
していることが示された。

これらのモノクロナル抗体Ｙ１１９１．Ｓ１１２Ａ、Ｔ
２５５ＡおよびＴ２５６Ｃはいずれもヒト患者血清ある
いは動脈璧ホモゲネートを抗原として感作し作製したも
ので、Ｗ　ＨＨＬ家兎血清ならびに動脈壁ホモゲネート
を抗原として作製したモノクロナル抗体とは異なる新規
なものであった。

さらにこのモノクロナル抗体は、必要に応じてそのまま
、またはその蛋白分解酵素処理による分解産物であるＦ
　（ａｂ’　）２．　Ｆ　ａｂ’としてヒト動脈硬化症
の進展等を潤定する試薬として用いることができる。ち
なみに、このモノクロナル抗体の認識する抗原は、ヒト
動脈硬化症の病巣部位のみならず患者血清中にも存在し
ている。それゆえ採取した血清を、モノクロナル抗体を
反応試薬として、例えばアルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ等の酵素、放射性
同位元素、蛍光物質等の認識物質を用いた種々の免疫測
定法、例えば競合法またはサンドイツチ法や凝集反応ま
たは凝集阻止反応による測定法またはそれらの改良測定
法等公知の方法により、その抗原を定量または定性し、
その結果から動脈硬化の進展度を判断することができる
ものである。

さらにまたこのモノクロナル抗体を用いて、ヒト動脈硬
化症の病巣部位の存在または広がりを検査することがで
きる。即ち放射性同位元素、例えばＮａ”’　Ｉ　、Ｎ
ａＩ２コニやＮＩＬ′２５工等を用いクロラミンＴ法、
酵素法等にてヨードを、又５ｎＣ１ｚ等還元剤の存在下
にＮ　ａ　””ＴｃＯ、（過テクネチウム酸ナトリウム
）生理食塩液を加えることによりテクネチウムを、又適
当なキレート剤（無水り、ＴＰ＾、Ｄ　１ｅｔｈｙｌｅ
ｎｅ　Ｔｒｉａｉｅｉｎｅ　Ｐｅｎｔａ　Ａｃｅｔｉｃ
　ａｃｉｄ等の所謂Ｂ　１ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌキレー
ト）を介しインジウム＜目’Ｉｎ）を上記のモノクロナ
ル抗体又はそのＦ（ａｂ’　）　２　、　Ｆ　ａｂフラ
グメント等に結合させる。これを無菌無毒性媒体に加え
静脈内に投与し、一定時間後に病巣部位に結合した結果
をガンマカメラ等を用いて体内の放射能分布に基づ髪゛
たシンチグラムを得る。このシンチグラムより、脳梗塞
、心筋梗塞等のヒト動脈硬化症の病巣部位の存在または
広がりを検査することができるものである。

及１匠 次いで本発明の実施例を挙げるが、本発明は何らこれに
よって限定されるものではない。

（１）モノクロナル抗体の作製 家族性高コレステロール患者血清の８名分を混合しこの
２０μｌを、８０μ！の燐酸緩衝液にて５倍に希釈し１
００μｌのフロイント完全アジュバントを加えてよく混
和した。得られたエマルジョンをＢＡＬＢ／ｅマウスの
皮下に投与した。−週間後に同様の投与を行い、さらに
三′ｉ１闇後に５倍稀釈した血清のみを１００μ！腹腔
内に投与した。

Ｒ終免疫として２００μｌの５倍希釈血清を腹腔的投与
？麦、４日日に牌臓を取り出した。牌細胞はＨＨＢＳ（
ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　）ｔａｎｋｓ　Ｂａ１
ａｎｃｅｄ　５ａｌｔＳｏｌｎ、）にてよく洗浄し、同
様に洗浄したマウスミエローマ細胞株Ｐ　３／Ｕ　１と
４：１の割合で混合し、１０００ｒｐ輪で５分間遠心し
た。

得られた沈渣を５０％ポリエチレングリコール４０００
を含むＤ’ＭＥＭ（−）培地１ｚ１に浮遊させ、２分間
放置した０次いで、Ｄ’ＭＥＭ（−）培地４０ｘｌを徐
々に加えて稀釈後、８００　ｒｐｍにて５分間遠心した
０次いで得られた細胞を２０％の牛胎児血清を含むＨＡ
Ｔ培地８０１１に懸濁し、０．２ｘｌづつを９６ウエル
の組織培養プレートに分注した。

２〜４日毎に半量づつ培地を交換し、１２日後の培養上
清について抗体価を調べたところ、３８４ウエル中１２
ウエルで強い抗体活性が見られた０次いで限界稀釈法に
よりクローニングを行った結果、計５株の融合細胞が単
離された。これらをプリスタンで処理されたＢ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に注入し、１０〜２０日後
にその腹水を採取してモノクロナル抗体を得た。この５
株の融合細胞の内、Ｙ１１９１．ｍ胞株から得られたＹ
１１９１モノクロナル抗体は、オフタロニー法による免
疫グロブリンクラスはＩｇＧ、に分類されるもので、ヒ
ト血清中の動脈硬化症関連抗原を特異的に認識するモノ
クロナル抗体である。

（２）　　Ｙ１１９１モノクロナル抗体による患者血清
の測定 １０００倍稀釈した被検血清（Ｆ　Ｈ、家族性高コレス
テロール患者血清、ＭＩ；心筋梗塞患者血清、ＡＰＯ，
脳梗塞患者血清、Ｎ；正常者血清）５０μｌを、ＥＬＩ
ＳＡ用マイクロプレートく住友ベークライト社製）に加
え、４℃にて一晩放置し吸着させた。１％ＢＳＡおよび
１％ヤギ血清を含む溶液でマイクロプレート分処理後、
Ｙ１１９１モノクロナル抗体溶液を５０μ！添加し、３
７℃にて２時間反応させた。次いで洗浄後、１０，００
０倍稀釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩ
　ｇＧ　（ｔａｇｏ社製）を５０μ！添加して３７℃で
１時間反応させ、洗浄後、１ａｇ／ｘｉバラニトロフェ
ニルリン酸２ナトリウム塩、０．０１％ＭｇＣｌ２を含
む１ｍＭジェタノールアミンｉＪＥ衝液（ｐＨ９，８）
を１００ｚｉ加え、３７°Ｃにて２時間反応させた。

マイクロプレート用比色計（バ・イオ・ラット社製〉　
。

を用い吸光度（ＯＤ４゜５ｎｍ）を測定し動脈硬化症関
連抗原活性値としな、その結果を、第１表に患者血清お
よび第２表に正常者血清の結果として示す。

本発明のＹ１１９１モノクロナル抗体は、家族性高コレ
ステロール患者血清（ＦＨ）、心筋梗塞患者血清（ＭＩ
）、脳梗塞患者血清（Ａ　Ｐ　Ｏ）のヒト動脈硬化症を
強く認識し高い値を示した。しかも正常者血清（Ｎ）に
対する値は小さいことが明らかであり、このモノクロナ
ル抗体はヒト血清中の動脈硬化症関連抗原を特異的に認
識したものであると判断できる。

第１表 疾患名・・・ＦＨ：家族性高コレステロール血症Ｍ工：
心筋梗塞 ＡＰＯ：脳梗塞 判定基準・・・ＥＬＩＳＡ（ＯＤ、。Ｓ）の値による１
、０以上：４＋ ０．５〜１．０：３十 ０．３〜０．５：２＋ ０．２〜０．３：＋ ０．１〜０．２：± ０．１以下：一 判定基準μ・ＥＬＩＳＡ（ＯＤ、。Ｓ）の値による１、
０以上：４＋ ０．５〜１．０：３＋ ０．３〜０．５：２＋ ０．２〜０．３：＋ ０．１〜０．２：± ０．１以下ニー 以上の結果を第１図にまとめた。第１図から明らかなよ
うに、高コレステロール血症患者、心筋梗塞患者および
脳梗塞患者血清はいずれも正常者血清よりも高い値を示
した。

（３）　　Ｙ１１９１モノクロナル抗体と反応するヒト
血清動脈硬化症関連抗原物質 家族性高コレステロール血症患者血清をＳＤＳ添加ポリ
アクリルアマイドゲルにて１００Ｖ、２時間電気泳動し
ニトロセルロース膜にブロッティングした。この膜を、
０．０５％非イオン系界面活性剤ツイーン２０を含む燐
酸緩衝液にてよく洗浄後、ＥＬＩＳＡの系で用いたブロ
ッキング用溶液にて一晩処理した。洗浄後、Ｙ１１９１
モノクロナル抗体と２時間、アルカリフォスファターゼ
標識抗マウスＩｇＧ抗体と１時間反応させた９反応後、
０．２％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ
ン酸パラトルイジン塩を含む０．７５Ｍトリス−塩ａ緩
衝液（９８８，８）の溶液に膜を浸し、室温にて一晩放
置し免疫染色した。その結果、Ｙ１１９１モノクロナル
抗体の認識するヒト血清動脈硬化症関連抗原物質の分子
量は６０．０００ｔｈ６　、Ｃｏ。

と推定される。

また、Ｙ１１９１抗体が認識する抗原物質は、動脈硬化
症と密接な関係にあると言われているリボ蛋白の構成成
分ＡｐｏＡ　　Ｉ　、Ａ　　Ｉｔ／、Ｂ　　１００゜Ｂ
−４８，Ｅ、Ｄなどとは異なる高脂血症特異抗原物質で
ある（第２図参照）、またアンフオラインを用いた等電
点電気泳動により本抗原物質の等電点はｐＨ５，６〜７
であった。

またＳＤＳを含まない条件での本抗原物質の分子量はＳ
　　３００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ　　３００）ゲ
ルカラム［１０請Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
、０．５ＭＫＣｌ’コにより約２９０，０００出５０．
０００と推定された。

さらにアガロース電気泳動により、このＹ１１９１モノ
クロナル抗体の認識する抗原物質はＬＤＬのアポ蛋白は
認識しないことが確認された。

（１）モノクロナル抗体の作製 心筋梗塞患者血清の２名分を混合しこの２５μ！に２５
μｌの生理食塩水および５０μｒのフロイント完全アジ
ュバントを加えてよく混和した。

得られたエマルジョンをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス
の腹腔に投与した。約七週間後にフロイント不完全アジ
ュバントな用い同様の投与を行い、さらに約七週間後に
４倍稀釈した血清のみを１００μｌ最終免疫として腹腔
内に投与後、３日日に肺臓を取り出した。牌細胞はＨＥ
ＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ＨａｎｋｓＢ　ａｌａｎｃ
ｅｃｌｓａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎにてよく洗浄し、同
様に洗浄したマウスミエローマ細胞株Ｐ３／［Ｊｌと９
．５：１の割合で混合し、１１０００ｒｐで５分間遠心
した。

得られた沈渣を５０％ポリエチレングリコール４０００
を含むＤ’ＭＥＭ（−）培地１１Ｎに浮遊させ、３７°
Ｃで２分間時々振りまぜながら放置した。

次いでＤ’ＭＥＭ（−）培地９ｘ１を徐々に静かに加え
て稀釈した後、８００　ｒｐｍにて５分間遠心した。

次いで得られた細胞を２０％の牛胎児血清を含むＨＡ　
Ｔ培地７８ｚｌに懸濁し、０．１ｘｌｌづつを９６ウエ
ルの組織培養プレートに分注した。

２〜４日毎に培地を５０μｌ添加し、１０〜１４日後の
培養上清について抗体価を調べたところ、７６８ウエル
中５ウエルで強い抗体活性が見られた０次いで限界稀釈
法によりクローニングを行い１株の融合細胞が単離され
た。この株の培養上清より５１１２Ａモノクロナル抗体
を得た。５１１２Ａ細胞株から得られた５１１２Ａモノ
クロナル抗体はオフタロニー法による免疫グロブリンク
ラスはＩｇＭに分類されるもので、ヒト血清中の動脈硬
化症関連抗原を特異的に認識するモノクロナル抗体であ
る。

（２）　　５１１２Ａモノクロナル抗体による患者血清
の測定 １０００倍稀釈した被検血清（Ｆ　Ｈ：家族性高コレス
テロール患者血清、ＭＩ；心筋梗塞患者血清、ＡＰＯ；
脳梗塞患者血清、Ｎ；正常者血清）５０μｌを、ＥＬＩ
ＳＡ用マイクロプレート（住友ベークライト社製）に加
え、４℃にて一晩放置し吸着させた。１％ＢＳＡを含む
溶液でマイクロプレートを処理後、５１１２Ａモノクロ
ナル抗体溶液を５０μ！添加し、３７°Ｃにて１時間反
応さぜな。

次いで洗浄後、１０，０００倍稀釈したアルカリフォス
ファターゼ標識抗マウスＩｇＧ＋−ＩｇＭ抗体（ｔａｇ
ｏ社製）を１００μＺ添加して３７℃で１時間反応させ
、洗浄後、ｌＩＩＩｇ／ｘｉパラニトロフェニルリン酸
２ナトリウム塩、０．０１１ＭｇＣＩ□を含む１ｍＭジ
ェタノールアミン緩衝液（ｐＨ９，８）を１５０μｌ加
え、３７℃にて０．５時間反応させた。マイクロプレー
ト用比色計（バイオ・ラッド社製）を用い吸光度（ＯＤ
、。、ｎ〜）を測定し動脈硬化症関連抗原活性値として
その結果を、第３表に患者血清および第４表に正常者血
清の結果として示す９本発明の８１１２Ａモノクロナル
抗体は、家族性高コレステロール患者血清（ＦＨ）、心
筋梗塞患者血清（Ｍ　Ｉ　）、脳梗塞患者血清（ＡＰＯ
）のヒト動脈硬化症を強く認識し高い値を示した。しか
も正常者血清（Ｎ）に対する値は小さいことが明らかで
あり、このモノクロナル抗体はヒト血清中の動脈硬化症
関連抗原を特異的にｘｘ′３シたものであると判断でき
る。

第３表　３１１２Ａモノクロナル抗体による患者血清中
の動脈硬化症関連抗原活性の測定疾患名・・・ＦＨ：家
族性高脂血症 Ｍ　Ｉ　：心筋梗塞 ＡＰＯ：脳梗塞 判定基準・・・ＥＬＩＳＡ（ＯＤ、。、）の値による０
、５以上：４＋ ０．４〜０．５：３＋ ０．３〜０．４：２＋ ０．２〜０．３：＋ ０．１〜０．２：± ０．１以下ニー 第４表　５１１２Ａモノクロナル坑億に上Ａ健常０．５
以上：４＋ ０．４〜０．５：３＋ ０．３〜０．４：２＋ ０．２〜０．３＋＋ ０．１〜０．２：土 ０．１以下ニー この結果を第３図にまとめた。第３図から明らかなよう
に、高コレステロール血症患者、心筋梗塞患者および脳
梗塞患者血清はいずれも正常者血清よりも高い値を示し
た。

（３）　　５１１２Ａモノクロナル抗体と反応するヒト
血清動脈硬化症関連抗原 脳梗塞患者の血清５μｌをゲル濾過法［Ｂｌｏ−Ｇｅ１
■Ａ　１．５ｍ、５０ａ＋Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，８）コで分離したところ、’５１１２Ａモノクロ
ナル抗体の認識するヒト血清動脈硬化症関連抗原物質の
分子量は３５５，０００上１００，０００と推定された
。またアンフオラインを支持体とする等電点電気泳動に
より本抗原物質の等電点はｐＨ５，９〜９．９であった
。

（１）抗原の調製方法 ヒト胸部及び腹部大動脈硬化壁を摘出し、冷所にて血管
を切開したのちビンセットにて内膜肥厚部（動脈硬化病
巣）を剥離し、ハサミにて１■角に細切後、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、０．１％エタノールを含む水溶Ｒ（ｐＨ７，
４）を湿重ｉ１ｇ当つ５〜１゜ｘｌの割合で加え、ポリ
トロンホモゲナイザー（ｐｏｌｙｔｒｏｎ　　ｈｏｍｏ
ｇｅｎｉｚｅｒ）にてホモゲネート（ｈｏｍｏｇｅｎａ
Ｌｅ）を調製した。

このホモタネ−５４名（８検体）分の混合物！−４重の
ガーゼで濾過し、ｒ液を抗原液とした。

（２）モノクロナル抗体の作製 ホモゲネート１　ａ＋ｙ（２８０μｎ）に２８０μＮの
フロイント完全アジュバントを加えてよく混和した。

得られたエマルジョンをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス
の皮下に投与した。二および四週間後に同様の投与を行
い、さらにへ週間後に最終免疫として１１（２８０μり
のホモゲネートに燐酸榎街液１２０μｌを加えたものを
腹腔的投与し、３日日に稗臓を取り出した。これをＨＨ
ＢＳ（ＨＥＰＥＳＢｕ４ｆｕｒｅｄ　　Ｈａｎｋｓ　　
Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　　５ｏｌｎ、）にてよく
洗浄し、同様に洗浄したマウスミエローマ細胞株Ｐ３／
Ｕｌと５：１の割合で混合し、１０００ｒｐｓ＋で５分
間遠心した。

得られた沈渣ｔ！−５０！≦のポリエチレングリコール
４０００を含むＤ’ＭＥＭ（−）培地１ｖｌに浮遊させ
２分間放置した０次いで、Ｄ　”ｖＩ　Ｅ　Ｍ　（）培
地９ｘｉを徐々に静かに加えて稀釈後、８００　ｒｐｍ
にて５分間遠心した０次いで得られた細胞を２０％の牛
脂児血清含含むＨＡＴ培地３１．４ｚｆに懸濁し、０．
１ｄづつを９６ウエルの組！３培養プレートに分注した
。

２〜１１日毎に５０μｌづつ培地を加え、９．１１日後
の培養上清について抗体価を調べたところ、３１０ウエ
ル中２０ウエルで強い抗体活性が見られた０次いで限界
稀釈法によりクローニングを行った結果、計９株の融き
細胞が単離された。これらをブリスタンで処理されたＢ
　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に注入し、８〜２
３日後にその腹水を採取してモノクロナル抗体を得た。

この９株の融合細胞の内、Ｔ２５５Ａ細胞株から得られ
Ｔ２５５Ａモノクロナル抗体は、オフタロニー法による
免疫グロブリンクラスはＩｇＧ２ａに分類されるもので
、動脈硬化壁ホモゲネートを特異的に認識するモノクロ
ナル抗体である。

（３）Ｔ２５５Ａモノクロナル抗体の特異性蛋白量１０
μｇ／ｘｌに調製した病巣内膜肥厚部および正常動脈内
膜のホモゲネート（ＦＰ：ファイブラスプラーク、Ｙ：
イエロープラーク１ｗ：ホワイトブラーク、ＦＳ：ファ
ッティストリークス、ｃ：石灰化、Ｎ：正常者）１００
μｍをＥＬＩ　ＳＡ用マイクロプレート（ファルコン社
製）に加え、４℃にて一晩放置して吸着させた。１％Ｂ
ＳＡ溶液でマイクロプレートを処理後、Ｔ２５５Ａモノ
クロナル抗体溶液を１００μ！添加して室温にて２時間
反応させた０次いで洗浄後、６，０００倍稀釈しなアル
カリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ十ＩｇＭ抗体
（ｔａｇｏ社製）を１００Ａ１ｉ’添加して室温で２時
間反応させ、洗浄後、１論３／１１パラニトロフエニル
リン酸２ナトリウム塩、０．０１％ＭｇＣｌ２を含む１
＋＋Ｍジェタノールアミン！！街液（ｐＨ９，８＞を１
００μ！加え、室温にて１時間反応させた。

マイクロプレート用比色計（バイオ・ラッド社製）を用
い吸光度（ＯＤ、。５ｄｍ）を測定し、動脈硬化壁ホモ
ゲネートを認識する抗原活性値とした。その結果を第５
表に示すが、本発明のＴ２５５Ａモノクロナル抗体は、
ファイブラスプラーク（ＦＰ）。

イエロープラーク（Ｙ）、ホワイトプラーク（Ｗ）、石
灰化（Ｃ）に対し高い値を示し、ファッテイーストリー
クス（ＦＳ）および正常（Ｎ）で低い値を示した。

従ってこのモノクロナル抗体はヒト動脈硬化症の進展し
つつある病巣により強い反応性を示すことが確認できた
。

なお、総コレステロール（Ｔ　Ｃ）値の測定は、コレス
テロール測定キット（■−コレスターゼ「ニツスイ」二
日水製薬社製）を用いた。

またヒト動脈硬化病′巣切片を用い間接蛍光抗体法にて
病変部に免疫染ζ色を行ったところ、この抗体は内膜肥
厚部を特異的に認識していることが確認された。

第５表 病変名・・・ＦＰ：ファイブラスブラークイ；イエロー
プラーク Ｗ：ホワイトプラーク ＦＳ：ファ・ｋティストリークス Ｃ：石灰化 Ｎ：正常 判定基準・・・ＥＬＩＳＡ（ＯＤ４゜５〉の値による０
、６５以上＝４＋ ０．５５〜０．６５：３＋ ０．４５〜０．５５：２＋ ０．３５〜０．４５：＋ ０．２５〜０．３５：± ０．２５以下ニー Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／　ｐ、（コレステロール／タ
ンパク質）＝　（＋ａｇ／　ｄｉ＞／　（＋＋ｇ／　ｍ
ｌ＞以上の結果を第４図にまとめた。第４図からＴ２５
５Ａモノクロナル抗体は明らかに動脈硬化病巣部を特異
的に認識していることがわかる。

（４）Ｔ２５５Ａモノクロナル抗体と反応する動脈硬化
壁抗原物質 病巣肥厚内膜および正常動脈壁のホモゲネートをＳＤＳ
添加ポリアクリ）レアマイトゲルにて４０■、１６時間
電気泳動し、さらにニトロセルロース膜に電気的にブロ
ッティングした。この膜を、０．０５％非イオン系界面
活性剤ツイーン２０を含む燐酸緩衝液にてよく洗浄後、
ＥＬＩＳＡの系で用いたブロッキング用溶液にて一晩処
理した。

洗浄後、Ｔ２５５Ａモノクロナル抗体と２時間、アルカ
リフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体と
２時間反応させた０反応後、０．２％の５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリルリン酸パラトルイジン塩を含
む０．７５Ｍ）リスー塩酸ｖＩ街液（ｐＨ８，８）の溶
液に膜を浸し、室温にて一晩放置した。その結果、Ｔ２
５５Ａモノクロナル抗体が認識する抗原物質の分子量は
約ｓｏ、ｏｏｏであることが確認された。

また、Ｔ２５５Ａ抗体が認識する抗原物質は、動脈硬化
症と密接な関係にあると言われているリボ蛋白の構成成
分ＡｐｏＡ−１，Ａ−ＩＩ／、Ｂ−１００Ｂ−４Ｒ，Ｒ
，！”）”、−どとけ界なＡ動謔硬イに単特ｍ柁原物質
である（第５図参照）。

（１）抗原の調製方法 ヒト胸部及び腹部大動脈硬化壁を摘出し、冷所にて血管
を切開したのちビンセットにて内膜肥厚部（動脈硬化症
病巣）を剥離し、ハサミにて１鴇論角に細切後、１＋６
Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．１％エタノールを含む水溶液（ｐ
Ｈ７，４）を湿重量１ｇ当り５〜１０Ｍ１の割合で加え
、ポリトロンホモゲナイザー（ｐｏｌｙｔｒｏｎ　　ｈ
ｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）にてホモゲネート（ｈｏｍｏｇ
ｅｎａｔｅ）を調製した。

このホモゲネート６名（１０検体）分の混合物を４重の
ガーゼで濾過し、ｒ液を抗原液とした。

（２）モノクロナル抗体の作製 ホモゲネー）１ｍｇＤ５０μりに３５０ｕｊ！のフロイ
ント完全アジュバントを加えてよく混和した。

得られたエマルジョンをＢａ１ｂ／ｃマウスの皮下に、
　　投与した。二および五週間後に同様の投与を行ｂ１
、さらに、十三週間後に最終免疫としてｌ　ｍｇ（３５
０μｍ）のホモゲネートに燐酸緩衝液５０μ！を加えた
ものを腹腔的投与し、３日目に牌臓を取り出した。

これをＨＨＢ　Ｓ　（ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　　Ｂｕｆｆｕ
ｒｅｄ　　ＨａｎｋｓＢ　ａｌａｎｃｅｄ　　Ｓ　ａｆ
ｔ　　Ｓ　ｏｌｎ、　）にてよ（洗浄し、同様に洗浄し
たマウスミエローマ細胞株Ｐ３／Ｕｌと８．５：１の割
合で混合し、１０００ｒｐ鴫で５分間遠心した。

得られた沈渣を５０％のポリエチレングリコール４００
０を含むＤ″ＭＥＭ（−）培地１ｍｌに浮遊させ２分間
放置した０次いで、Ｄ’ＭＥＭ（−）培地１０１１を徐
々に静かに加えて稀釈後、８００ｒｐｍにて５分間遠心
した０次いで得られた細胞を２０％の牛胎児血清を含む
ＨＡＴ培地３５ｚＮに懸濁し、０．１ｍｌづつを９６ウ
エルの組織培養プレートに分注した。

２〜４日毎に５０μｌづつ培地を加え、１３日後の培養
上清について抗体価を調べたところ、３４４ウエル中４
ウエルで強い抗体活性が見られた０次いで限界稀釈法に
よりクローニングを行った結果、３株の融合細胞が単離
された。これらをプリスタンで処理されたＢａ１ｂ／ｅ
マウスの腹腔内に注入し、８〜１３日後にその腹水を採
取してモノクロナル抗体を得た。この３株の融合細胞の
内、Ｔ２５６Ｃ！［［Ｉ胞株か−ら得られた７２５６Ｃ
モノクロナル抗体は、オフタロニー法による免疫グロブ
リンクラスはＩｇＭに分類され、動脈硬化壁内膜肥厚部
の脂質蓄積部を特異的に認識するモノクロナル抗体であ
る。

（３）Ｔ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗性同位元素に
よる標識 Ｔ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗腹水を硫酸アンモニ
ウムで塩析後、ｐＨ８，１の５０ｍＭ）リスバッファー
に対し透析した。抗体に対し、２％相当のトリプシンを
加え、３７℃、４時間前ｍｆ＆、セファクリルＳ−２０
０カラムでゲル濾過し、Ｆ　ａｂ’画分を得た。リン酸
バッファーに対し透析し得られたＦ　ａｂ’約１００μ
ｙに対しＮａ”ゝＩ約１＋＊Ｃｉを加え、更に２０μｓ
のクロラミンＴを３０秒室温で反応させた。ヨード化反
応は４０μ９のメタ重亜硫酸ナトリウムで停止させセフ
ァクリルＳ−３００カラムで精製し、ヨード標識Ｔ２５
６Ｃモノクロナル抗体を得た。

（４）Ｔ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗性蛋白量１０
μｇ／ｘｉの調製した病巣内膜肥厚部および正常動脈内
膜のホモゲネート１００μ！をＥＬＩＳＡ用マイクロプ
レート（ファルコン社製）に加え、４℃にて一晩放置し
て吸着させた。１％ＢＳＡ溶液でマイクロプレートを処
理後、Ｔ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗１００μｌ添
加して室温にて２時間反応させた０次いで洗浄後、６．
０００倍稀釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウ
スＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（ｔａｇｏ社製）を１００μ！添
加して室温で２時間反応させ、洗浄後、１ａｇｌｘｉバ
ラニトロフェニルリン酸２ナトリウム塩、０．０１％Ｍ
ｇＣｌ□を含む１ｓ＊Ｍジェタノールアミン榎衝液（ｐ
Ｈ９，８）を１００μ！加え、室温にて１時間反応させ
た。マイクロプレート用比色計（バイオ・ラット社製）
を用い吸光度（ＯＤ　、。５ｎ＊）を測定した。その結
果、本発明の７２５６Ｃモノクロナル抗体は病巣内膜肥
厚部ホモゲネートに対する測定値は０．０７２と小さい
が、動脈硬化病巣切片を用い間接蛍光抗体法にて病変部
の免疫染色を行い、また同時にオイルレッドＯによる染
色ヲ行ったところ、動脈硬化内膜肥厚部の脂質蓄積部を
極めて特異的に認識していることが確認された（第６図
および第７図参照）。

また、このＴ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗ギの動脈
硬化内膜肥厚部とも交差することが明らかとなった。動
脈硬化症モデルウサギの動脈硬化病巣切片を用いた間接
蛍光抗体法による免疫染色およびオイルレッドＯによる
染色の様子をそれぞれ第８図および第９図に示す９図か
ら明らかなようにＴ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗ギ
動脈硬化内膜肥厚部の脂質蓄積部を特異的に認識した。

従って、本Ｔ２５６Ｃモノクロナル抗体はヒト動脈硬化
症診断のための画像解析用試薬を調製し、ヒトに応用す
るに際し、ウサギを用いて投与旦、安全試験等の予備試
験を十分に行うことができるものであり、ヒト動脈硬化
巣の部位特定や広がりを調べるための画像解析等への応
用が期待される。

北」！襄Ｕル 以上詳しく説明したように、本発明によりヒト動脈硬化
症関連抗原す極めて特異的に認詣することのできるモノ
クロナル抗体を得ることができた。

従って本発明のモノクロナル抗体を、動脈硬化症”詮所
するための直接的な血中指標物資ならびに動脈硬化病巣
を直接認識する指標物資として応用することが可能とな
った。

【図面の簡単な説明】

第１図はＹ１１９１モノクロナル抗体による血清中の動
脈硬化症関連抗原の判定を示す図であり、第２図はＹ１
１９１モノクロナル抗体が認識する抗原物質をタンパク
染色および免疫染色によって示す図であり、 第３図は５１１２Ａモノクロナル抗体による血清中の動
脈硬化症関連抗原の判定を示す図であり、第４図はＴ２
５５Ａ２５５Ａモノクロナル抗る動脈硬化病巣内膜肥厚
部ホモゲネートの判定を示す図であり、 第５図はＴ２５５Ａ２５５Ａモノクロナル抗する抗原物
質をタンパク染色および免疫染色によって示す図であり
、 第６図はＴ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗させたヒト
動脈硬化病巣切片を間接蛍光抗体法にて免疫染色した顕
微鏡写真であり、 第７図はＴ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗された第６
図と同じヒト動脈硬化病巣切片をオイルレッド０で染色
したｉｌｍ）ｉ？を鏡写真であり、第８図は７２５６Ｃ
モノクロナル抗体と反応させたウサギ動脈硬化病巣切片
を間接蛍光抗体法にて免疫染色した顕微鏡写真であり、 第９図はＴ２５６Ｃ２５６Ｃモノクロナル抗された第８
図と同じウサギ動脈硬化病巣切片をオイルレッド０で染
色した顕微鏡写真である。 （外５名） 尾／図 も３凹 第４７ 第６図 、ｌ 第７図

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト動脈硬化症関連抗原を特異的に認識するヒト
   動脈硬化症認識モノクロナル抗体。
2. （２）モノクロナル抗体が抗ヒト動脈硬化症抗体産生細
   胞とミエローマ細胞との融合細胞からのモノクロナル抗
   体である特許請求の範囲第１項記載のヒト動脈硬化症認
   識モノクロナル抗体。
3. （３）ヒト動脈硬化症抗原が家族性高コレステロール患
   者血清における抗原である特許請求の範囲第２項記載の
   ヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体。
4. （４）ヒト動脈硬化症抗原が脳梗塞、心筋梗塞患者血清
   における抗原である特許請求の範囲第２項記載のヒト動
   脈硬化症認識モノクロナル抗体。
5. （５）ヒト動脈硬化症抗原が動脈硬化病巣からの抗原で
   ある特許請求の範囲第２項記載のヒト動脈硬化症認識モ
   ノクロナル抗体。
6. （６）動脈硬化病巣が内膜肥厚部分である特許請求の範
   囲第５項に記載のヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体
   。
7. （７）モノクロナル抗体が免疫グロブリンクラスＩｇＧ
   である特許請求の範囲第１項記載のヒト動脈硬化症認識
   モノクロナル抗体。
8. （８）モノクロナル抗体が免疫グロブリンクラスＩｇＭ
   である特許請求の範囲第１項記載のヒト動脈硬化症認識
   モノクロナル抗体。
9. （９）ヒト動脈硬化症関連抗原を含有する溶液で、ヒト
   を除く哺乳動物を免疫し、該動物の抗体産生リンパ球と
   ミエローマ細胞とを細胞融合させて抗ヒト動脈硬化症抗
   体産生融合細胞を単離し、次いで抗ヒト動脈硬化症抗体
   産生融合細胞を培養することを特徴とするヒト動脈硬化
   症認識モノクロナル抗体の製造法。
10. （１０）ヒト動脈硬化症関連抗原を含有する溶液が家族
    性高コレステロール患者血清である特許請求の範囲第９
    項記載のヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体の製造法
    。
11. （１１）ヒト動脈硬化症関連抗原を含有する溶液が脳梗
    塞、心筋梗塞患者血清である特許請求の範囲第９項記載
    のヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体の製造法。
12. （１２）ヒト動脈硬化症関連抗原を含有する溶液が動脈
    硬化病巣のホモゲネートである特許請求の範囲第９項記
    載のヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体の製造法。
13. （１３）動脈硬化病巣が内膜肥厚部分である特許請求の
    範囲第１２項記載のヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗
    体の製造法。
14. （１４）モノクロナル抗体が免疫グロブリンクラスＩｇ
    Ｇである特許請求の範囲第９項記載のヒト動脈硬化症認
    識モノクロナル抗体の製造法。
15. （１５）モノクロナル抗体が免疫グロブリンクラスＩｇ
    Ｍである特許請求の範囲第９項記載のヒト動脈硬化症認
    識モノクロナル抗体の製造法。
16. （１６）酵素または放射性同位元素で標識されたヒト動
    脈硬化症認識モノクロナル抗体。
17. （１７）放射性同位元素が＾１＾２＾５Ｉである特許請
    求の範囲第１６項の標識モノクロナル抗体。
18. （１８）酵素または放射性同位元素で標識されたヒト動
    脈硬化症認識モノクロナル抗体からなるヒト動脈硬化症
    診断用試薬。
19. （１９）放射性同位元素で標識されたヒト動脈硬化症認
    識モノクロナル抗体からなるヒト動脈硬化症画像診断用
    試薬。
20. （２０）ヒト動脈硬化症が心筋梗塞または脳梗塞である
    特許請求の範囲第１８項または１９項の診断用試薬。
21. （２１）放射性同位元素が＾１＾２＾３Ｉ、＾１＾２＾
    ５Ｉ又は＾１＾３＾１Ｉである特許請求の範囲第２０項
    の診断試薬。
22. （２２）放射性同位元素が＾１＾１＾１Ｉｎである特許
    請求の範囲第２０項の診断用試薬。
23. （２３）放射性同位元素が＾９＾９＾ｍＴｃである特許
    請求の範囲第２０項の診断用試薬。