JPS63503274A

JPS63503274A - ポリペプチドの製造方法

Info

Publication number: JPS63503274A
Application number: JP62502947A
Authority: JP
Inventors: ホランド，イアン・バリイ; マックマン，ナイジェル; ニコド，ジャン‐マルク
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-05-15
Filing date: 1987-05-14
Publication date: 1988-12-02
Also published as: US5143830A; GB8800141D0; GB2197324B; DK13788A; WO1987006953A1; DE3781765T2; AU7392387A; AU600949B2; GB2197324A; GB8611832D0; DE3781765D1; EP0267224A1; EP0267224B1; ATE80660T1; DK13788D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ボ冨ぺブチ゛のＬｊ告主皿■分互本発明は、組換えＤＮＡバイオテクノロジーに関し、特に形質転換された宿主細胞中でポリペプチド産物を製造する方法に関し、ポリペプチド産物は該宿主細胞から分泌される。

光凱■宜景近年、組換えＤＮＡバイオテクノロジーの発展により、ポリペプチド産物の生産をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は、トランスフェクションされた宿主細胞内で、広範囲の種々の有用ポリペプチドの製造が可能になった。即ち、インスリンや成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモンのごときホルモン、及び産業上あるいは治療上有用な酵素、例えばキモシン組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）が形質転換宿主細胞で生産されている。

細菌細胞、特に大腸菌が、組換えポリペプチド産物の製造に宿主細胞として使用されてきた。このような細菌細胞の遺伝システムは現在比較的良（理解されており、またこのような細胞は良好な増殖特性を示す。しかし、このような細菌細胞が使用され異種タンパクを過剰生産すると、異種産物が通常宿主細胞内に蓄積し、その産物を回収するためには通常細胞を破壊する必要がある。また、組換え産物は細菌細胞内に不溶性凝集体として生産されることが多（、該凝集体は、ポリペプチド本来の生物学的機能性を有する状態にはない。したがって、可溶性で本来の生物学的機能性を有する形の有用産物を得るためには、不溶性ポリペプチド産物を可溶化し、変性する／性質を回復させる（ｄｅｎａｔｕｒｅ／　ｒｅｎａｔｕｒｅ）必要がある。例えば、英国特許ＮａＧＢ２１００？３２Ｂには、中でも、大腸菌内でのメチオニン−プロキモシンの製造方法において、宿主細菌細胞の破壊及び尿素とグアニジンＨ１による処理で生産物である非自然プロキモシン含有凝集体を可溶化することを含む方法が記載されている。しかし、細胞破壊と、変性／本性回復のプロセスは、組換えポリペプチド産物の製造コストをかなり高めてしまう。

そこで、組換え産物を細胞外培地中へ分泌する細菌発現システムを開発する試みがなされてきた。例えば、組換え異種ポリペプチドは細菌内で融合タンパクとして発現され、該融合タンパクにおいては異種ポリペプチド配列はＮ末端シグナル配列と結合している。融合タンパクは、グラム陰性菌の内股を通過して輸送され、シグナル配列も付随的に除去されるが、外膜を通過できず周辺質（ベリプラムス）中に残ってしまう。したがって、異種組換え産物を回収するには宿主細胞の破壊がなお必要であり、変性／本性回復の処理をして産物を本来の、生物学的に機能する形で生成させる必要もある。

また、宿主細胞として大腸菌のようなグラム陰性菌の“漏れる（　１ｅａｋｙ） ”ミュータントを生産に使用し、産物を細胞外の培地へ分泌させることが提案されている。しかし、このようなミュータント細胞は異種タンパク産物の大規模生産には不適であることが多い。というのは、産物収率が一般に低いし、細胞が脆弱なため大規模の増殖に適しないからである。

ヘモリジン（Ｈｌｙ）はある種の大腸菌により生産される細胞外タンパク毒素であり、それ自体グラム陰性菌により生産され、細胞膜も外膜も通過して輸送される数少ないタンパクの１つである。しかし、これまで、ヘモリジンが細胞外培地へ分泌されるプロセスは十分に説明されていない。諸研究によると、すｌ遺伝子の２つにより決定される特定の輸送システムがヘモリジンの外膜を通過する輸送を荷なうこと（匈ａｇｎｅｒ外、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

凡２００．１９８３）　、少なくとも４つの遺伝子」ｈ人、坦り比。

坦ｆｆｉ及び］旦旦遺伝子が、細胞から遊離した（（ｅｌｌ−ｆｒｅｅ）溶血表現型を引き出すのに必要であることが示されている。」ｈｌ遺伝子産物が、溶血性活性種を提供する」ｎ人遺伝子産物の活性化に必要な模様であるが、一方」ｎ旦及び」旦旦遺伝子産物（先に、垣αヱ」−及び−刷ｌ」］−と称された）は、溶血活性を細胞外媒体へ輸送するのに不可欠である。

加工入遺伝子の１次産物は、Ｎ−末端シグナル配列を含んでいない（Ｆｅ１ｍｌｅｅ外、　（１９８５）、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｌｉｉ、Ｐ　８　Ｂ　− ９３）。そこで、ｌ遺伝子産物の分泌がいかにしてなされるかを説明する試みとして、Ｇｏｅｂｅｌとその共同研究者ら（Ｈａｒｔｌｅｉｎ＋　Ｍ、外、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、■、　８７〜９７　、　（１９８３））はモデルを作った。それによると、坦りへ遺伝子（１０７ｋｄ）の産物は一％遺伝子産物そのものによって活性化され、多分、形ＬＮクンバクのＣ−末端近くに位置する自己タンパク分解活性によってプロセシングされてより小さな（５８ｋｄ）溶血活性ペプチドを生じ、これが細胞膜を通過して周辺質へ輸送される。

彼らはさらに、５８ｋｄの溶血活性ペプチドの外膜へ移送、及びそこから細胞外媒体への解放が、それぞれ担ｌＪ−遺伝子（４６ｋｄ）の産物及び垣ヱＵ遺伝子（６２ｋｄ）の産物によって促進されることを提案している。Ｈａｒｌｅｉｎ外も、５８ｋｄのフラグメントのＮ−末端にあって、該フラグメントを通常のごとく細胞膜を通過せしめるシグナルペプチドとして働くものの発生（タンパク分解的切断による）を提案している。

しかし、坦ｍ遺伝子産物分泌メカニズムについてのこの説明には議論がある。最近、私達の実験室及び他の所での研究によって、初期の坦りへ遺伝子産物の大きさに相当する、大きな溶血活性ペプチドが溶血性大腸菌の培養から得られる上清に存在することが実証された。この研究は、活性な細胞外ヘモリジンの生産には旧ｙＡタンパクの切断は不要であることを示唆している。

しかし、今、までのところ、ヘモリジンが細胞外媒体に分泌されるメカニズムについて満足し得る説明はなされていない。

本発明者らはへモリジン分泌システムをさらに研究し、旧ｙＡタンパクのＣ−末端から２７個のアミノ酸を取去ると、この短くなった（　ｔｒｕｎｃａ　Ｌｅｄ）分子は」ｈｌ遺伝子産物によって活性化され得るにもかかわらず、大腸菌からのヘモリジン分泌が阻害されることを示した。さらに、本発明者らは、旧ｙＡのＣ−末端からの２３ｋｄペプチドがそれ自身の分泌に必要な情報を全て含んでいることを示した。それで、本発明者らは、ｕＬｌ遺伝子産物及び」ｈｌ遺伝子産物（これらは細胞エンベロープ内に存在する模様である）存在下でヘモリジンの認識及び輸出（ｅｘｐｏｒｔ）に必要な全情報は、月りへ遺伝子産物の２３ｋｄのＣ−末端フラグメント中に含まれていると結論した。本発明者らの仕事はＣ− 末端分泌配列の最初の発見である。このようなＣ−末端分泌配列は、宿主細胞から発現され分泌される組換え融合タンパクの製造に使用することができる。

）１１ｙＢタンパクは多くの薬剤耐性は乳動物腫瘍細胞の表面に見出される広範囲な相同性を示す（Ｃ末端域にある一連の２２８個のアミノ酸のうち１７０個のアミノ酸又はその置換により保護された配列（Ｇｅｖｌａｃｈ、外、　Ｎａｔｕｒｅ　３２４　４８５−４８９）がＰ−糖タンパクＭａｒ　（マルチ薬剤耐性タンパクと同一）。このＭａｒタンパクは、薬剤耐性を直接にない、輸出ポンプとして機能する模様である。したがって、Ｐ−糖タンパクのシステムとヘモリジンのシステムは、他の輸出プロセスとは異なる新しい表面輸出メカニズムの群（ｆａｍｉｌｙ）に属する可能性がある。

光所勿翌豆そこで本発明は、第１の様相において、ポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドと、Ｃ−末端分泌配列を含む別のペプチドとを含有してなる融合タンパクをコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞を培養し、該細胞がら前記融合タンパクを発現、分泌させる方法を蝉供するものである。

本明細書の記載において、「Ｃ−末端分泌配列」とは、分泌されるポリペプチドのＣ−末端に存在するアミノ酸配列であって、その分泌径路を通って分泌されるポリペプチドを認識し分泌するのに必要な不可欠の情報を有しているアミノ酸配列を意味する。好ましくは、Ｃ−末端分泌配列はヘモリジンＣ−末端分泌配列である。

即ち、第１様相の好ましい実施態様として、本発明は、ポリペプチドの製造方法であって、前記ポリペプチドとヘモリジンＣ末端分泌配列を含む別のペプチドとを含有する融合タンパクをコートするＤＮＡで形質転換された宿主細胞を培養し、前記融合タンパクを発現、分泌させることからなる方法を提供する。

「ヘモリジンＣ−末端分泌配列ノの語句は、認識及びヘモリジン分泌径路を介しての輸出に必要な不可欠の情報を有するアミノ酸配列を意味する。この配列は、特徴的に、真性の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）大腸菌へモリジン毒素のＣ末端配列の少な（とも一部分、又はそれの置換もしくは修飾された同等物を含むものである、それがＣ末端分泌配列として機能するものであるならば。この分泌配列は、真性大腸菌」ｎ人遺伝子産物のＣ末端配列の少な（とも一部分と同じ配列を含んでいることが好ましい。

この大腸菌」ｈ人遺伝子産物のＣ末端は、Ｃ末端分泌配列として機能する１又は２以上の配列を含んでもよい。例えば、分泌配列は、図３に示すように、ＨｌｙＡの２１８個のアミノ酸Ｃ末端配列の１又は２以上のサブ配列と同じでもよい、公平にみて、本発明者らは、少なくとも１つのヘモリジンＣ末端分泌配列が、Ｈｌｙ　ＡのＣ末端の最後の２１８個のアミノ酸残基中に、特に最後の１５０個のアミノ酸残基中に、さらに具体的には最後の１１３個のアミノ酸残基中に、そして最も具体的には最後の３２個のアミノ酸残基中に存在すると考えている。

しかし、融合タンパクの前記別のペプチドがヘモリジンＣ末端分泌配列を含んでいる限り、それは融合タンパクの分泌を促進する働きをするであろう。したがって、この別のペプチドは分泌配列のほかに別のアミノ酸を含有していてもよい。

例えば、別のアミノ酸は、分泌配列をポリペプチドから分離して、分泌プロセスを促進する望ましい立体配座を融合タンパク中に有利にもたらす上で必要であるかもしれない。

本明細書の一般的記述を公平にみて、本発明者らは、ポリペプチドから分泌配列を６０個以下のアミノ酸として分離するのが有利であると考える。

本発明の方法は、ポリペプチドの製造に一般的に用いることができ、例えば、天然及び合成のポリペプチドや細閉山来のポリペプチドがあげられる。好ましいことにこの方法は、異種ポリペプチド、即ち、宿主細胞にとり異種であるペプチド、特に真核生物のポリペプチドの製造に使用できる。例えば、該ポリペプチドは、ホルモン、酵素、インターロイキンのような有用つまり治療に役立つ真核生物のポリペプチドである。

第２の様相において、本発明は、第１のポリペプチドと別のペプチドとを含有する融合タンパクであって、該別のペプチドがＣ末端分泌配列、好ましくはヘモリジンＣ末端分泌配列を含有するものである融合タンパクを提供するものである。

該融合タンパクは、内部融合タンパク、即ちＮ末端融合タンパク、つまり、ヘモリジンＣ−末端分泌配列を含有する前記別のペプチドがポリペプチドのＮ末端に結合している融合タンパクを含んでなるものでもよい。しかし、好ましくは、該融合タンパクはＣ末端融合タンパク、即ち、ヘモリジンＣ末端分泌配列を含む前記別のペプチドがポリペプチドのＣ末端に結合している融合タンパクである。典型的には、融合タンパクは、ポリペプチドのアミノ酸配列と該別のペプチドのアミノ酸配列との間にある１又は２以上の結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ　）に、選択的切断部位を有している。このような選択的切断部位は、１又は２以上のアミノ酸残基からなり、これらは選択的な酵素的、化学的あるいは他の切断に対し感応する部位を提供するものである。例えば、付加されているアミノ酸残基のない形で該ポリペプチドが必要である場合には、融合タンパクはさらに処理されてポリペプチドが切り離されてもよい。即ち、本発明の第１様相の方法の１つとしては、分泌の後に融合タンパクを切断してポリペプチドを生成させる方法もある。

第３の様相において、本発明は、本発明の第２の様相による融合タンパクをコードするＤＮＡ配列を提供するものである。

本発明の第３様相によるＤＮＡ配列は、前記ポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列と、前記別のペプチドをコードする第２のＩＩＮＡ配列を有するものであり、さらに第１及び第２のＤＮＡ配列の間の１又は２以上の結合にある１以上の選択的切断部位をコードする追加的なりＮＡ配列１以上を含んでもよい。このようなりＮＡ配列（複数）を得、結合させて本発明の第３様相のＤＮＡ配列をつくる方法は、組換えＤＮＡ技術の分野でよく知られている。即ち、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、該ポリペプチドを生産する親細胞から、例えば、親細胞から得られるｍＲＮＡの逆転写によって作られるｃＤＮＡ配列の形で得られる。別のペプチド、つまりヘモリジンＣ末端分泌配列を含有するものをコードするＤＮＡも、適当な制限酵素による消化により」ｈ人遺伝子の３′−末端域から得ることができる。

本明細書の一般性を公平にみて、本発明者らは、少なくとも１つのヘモリジンＣ −末端分泌配列が旧ｙＡタンパクのＣ−末端の最後の２１８個の、特に最後の１５０個の、より具体的には最後の１００個のアミノ酸残基中に存在している可能性があると考えている。即ち、別のペプチドをコードするＤＮＡは、坦ヱへコード配列の３′末端の最後の６５４個の、特に最後の４５０個の、さらに具体的には最後の３３９個の、そして最も具体的には最後の９６個のヌクレオチド残基中に存在する配列を含む可能性がある。例えば、このＤＮＡは、図３に示す６５４個のヌクレオチド中に、好ましくはその３′−末端の最後の４５０個中に、特に最後の３３９個中に、最も具体的には最後の９６個中に存在する配列を有する可能性がある。しかし、それは、分泌に関与するこのＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列なのであり、したがって遺伝子コードの冗長性を考慮すると、関連するアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も使用できることは、理解できよう。さらに、真性ヘモリジンＣ−末端分泌配列の置換もしくは修飾された類似配列（ａｎａｌｏｇｕｅ）を使用でき、したがって別のペプチドをコードするＤＮＡ配列にはこのような類似アミノ酸配列をコードする　ＤＮＡ配列が含まれていてもよい。通常、このような類位体は、対応する真性へモリジンＣ末端分泌配列と、少な（とも８０％、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する。

さらに、必要なりＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術及び当業者によく知られた方法を使用してリガーゼで結合された配列により、全体を又は部分的に合成することができる。

好ましくは、本発明の第３様相のＤＮＡ配列は、ポリペプチドをコードする第１の５’ＤＮＡ配列と、別のペプチドをコードする第２の３’ＤＮ＾配列を有し、さらには１．第１のＤＮＡ配列の３′末端と第２のＤＮＡ配列の５′末端を結合する選択的切断部位をコードする追加的なりＮＡ配列をも有している。

本発明の第３様相のＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞の形質転換やトランスフェクション用のベクター、特に発現ベクターの調製に用いることができる。

よって、第４の様相として、本発明は、本発明の第３様相によるＤＮＡ配列を有するベクターを提供するものである。

このようなベクターの代表的なものとしてプラスミドがあげられ、このベクターは選択マーカー、プロモーター、必要により適当な複製配列、及び他の制御域を適切に備わしめることにより、一定の細胞型中での使用に特に適合させられる。

このようなベクターとしては、細菌例えば大腸菌の発現ベクター、例えばｐＢＲ３２２やｐＡＴ１５３から誘導されるプラスミドのようなベクターがあげられる。適当な選択マーカー、プロモーターは当業者には良く知られており、抗生物質耐性マーカー、及び里プロモーターもしくはトリプトファンオペロンプロモーター、例えばｔｒｐ　Ｅプロモーターのようなプロモーターがあげられる。

は乳動物のトランスフェクションのためのベクターは、例えば、１又は２以上の適当なプロモーター／エンハンサ−１選択マーカー、プロモーター、真核生物の複製起点、及び場合によってはポリアデニル化部位（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ　５ｔｔｅ）が導入されたｐＢＲ３２２のごとき細菌プラスミドに基づくものでもよい。

第５の様相において、本発明は、ヘモリジンＣ末端分泌配列を有するペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列とそれに関して配置された唯一の制限部位とを、前記ペプチドと別のポリペプチドとを含んでなる融合タンパクの発現が、該ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列が前記唯一の制限部位に挿入されると得られるように、含んでなる発現ベクターをも提供するものである。

好ましくは、本発明の第５の様相による分離（ｓｅｐａｒａ　ｔｅ）ベクターは、第１のＤＮＡ配列のリーディングフレームに関し、３種のリーディングフレームのいずれかの中に第２のＤＮＡ配列を収容するように提供される。このような３種のベクター構造は実施例で後述する。このようなベクターを使用すると、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを、ただ１つの制限部位に挿入して、本発明の第４の様相に係る発現ベクターを提供することができる。本発明の第４の様相に係るベクターは適当な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするのに使用でき、形質転換された宿主細胞を培養して本発明の第２の様相に係る融合タンパクを発現させることができる。

こうして、第６の様相において、本発明はさらに本発明の第４の様相に係るベクターで形質転換された宿主細胞を提供するものである。

適当な宿主細胞としては、真核生物の宿主細胞、例えば酵母、は乳動物の細胞、及び原核生物の細胞、代表的なものとして細菌、好ましくは大腸菌のごときグラム陰性苫があげられる。適当なは乳動物宿主としては、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣細胞、げっ歯頚のミエローマ細胞があげられる。しかし、ヘモリジン分泌径路が融合タンパクを分泌するように働くためには、宿主細胞も機能的な＋（１ｙＢタンパク及びＤタンパクを発現する必要があることは理解されよう。機能的＋１１ｙＢ及びＤタンパクは、宿主細胞中に、多量に存在するか、あるいは生産されることが好ましい。これらのタンパクは宿主細胞自身により供給されてもよく、例えば、Ｈ１ｙ＋宿主細胞、例えば大腸菌Ｓ　Ｅ５０００．　（ｐＬＧ５７０）を使用できる。あるいは、旧ｙＢ、Ｄタンパクは、宿主細胞を」江且及び」ｈ旦遺伝子を含有する適当なベクター（単数又は複数）で共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）又は共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することにより供給されてもよい。このような共形質転換もしくは共トランスフェクションされる」ｎ１及び」旦且は、融合タンパクをコードするＤＮＡ配列と同じベクターに存在してもよいし、１又は２以上の別のベクター中に共形質転換又は共トランスフェクションされていてもよい。宿主細胞が−ｕヱヱー及び」打旦遺伝子で共形質転換される時、宿主細胞はＲｅｃ　Ａ−宿主細胞であることが好ましい。

宿主細胞の形質転換及びトランスフェクション、並びに形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞の培養の方法は、ｒｅｃＤＮＡ技術の分野で良く知られている。目的のポリペプチドを含む融合タンパクは宿主細胞から分泌され、したがって宿主細胞を破壊する必要なしに有利に培地から回収できる。さらに変性／本性回復の処理を行なわないでポリペプチド産物が可溶性で天然の生物学的に機能する状態で得られることが好ましい。

融合タンパクは必要に応じさらに処理してもよく、例えば切断して該ポリペプチド産物を生成させてもよい。

図Ｕ引直肌添付図面を参照して、次の非限定的な実施例の説明により本発明をさらに説明する。添付図面において、図１　：　ｐｔ、ｃ　５７０の制限部位地図、及びプラスミドｐＬＧ　６０９の構造モードを示すプラスミド図を示す；図２：Ａ、プラスミドｐＬＧ　６０９のみで形質転換した大腸菌ＳＥ　５０００（ム）、及びプラスミド、）ＬＧ　５７５　（・）とともに共形質転換した同菌についての増殖一時間のグラフを示す。

８０次の５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。

パネルＢ・・・一定時間にわたってとった大腸菌ＳＥ　５０００（ｐＬＧ　６０９）サンプルの全細胞タンパク。

パネルＣ・・・同様の時間にわたってとった大腸菌ＳＥ　５０００　（ｐＬＧ　６０９／ｐＬＧ　５７５）　からの培養上清画分のサンプル。Ａｃは、２３ｋｄ　ＨｌｙＡ−Ｃ末端ペプチドを示す。

図３　：　Ａ、ｐＳＦ　４０００とｐＬＧ　５７０における、■Ｌへの制限地図の比較を示す。

Ｂ、ｊ３ｊｙ、人遺伝子（ｐＬＧ　５７０）の３′末端のコード配列における６５７個のヌクレオチド（下の列）と、Ｂｕｙ　ＡタンパクのＣ末端における２１８個のアミノ酸配列（上の列）を示す。

図４二図３におけるＣ末端の最後の８２個のアミノ酸のバイトロバシック指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　１ｎｄｅｘ）のグラフを示す。

図５　：　Ａ、　ｐＬＧ　５７０上の溶血因子の制限地図、及びＴｎ５挿入の位置を示す。

Ｂ、ｐＬＧ５７０：Ｔｎ５−１〜２５をｐＬＧ　５７５で相補して輸出機能を与えた後、ウェスタンブロッティングを行ない、」ｈ人によりコードされる遺伝子産物を抗旧ｙＡ抗血清で同定した際に得られた、全細胞タンパクの５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

図６　：　ｐＬＧ　５？３及びｐＬＧ　５７４により指示されたタンパクの分析を示す。

図７：ベクター構造ｐＬＧ　６０９−１．　ｐＬＧ　６０９−２及びｐｔ、ｃ　６０９−３の挿入された唯一のＳａｇａ　Ｉ部位域におけるヌクレオチド配列を示す。

図８：」匹Ｚ　−エＦ　−皿Ａ遺伝子融合の調製を示す。

図９ａ：Ｈ１ｙＡの３′末端をコードするｐｔ、ｃ　６０９と、ｎｔｙ　Ｂ及び旧ｙＤをコードするｐｔ、ｃ　５７５を含有する大腸菌ＳＥ　５０００からの旧ｙＡの２３ｋｄ　Ｃ末端フラグメント分泌の５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

図９ｂ：大腸菌ＪＭ　１０１　（ｐＬＧ　６３２／ｐＬＧ　５７５）からとった細胞及び培養上清サンプルの５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析を示す。

図９ｃ：大腸菌ＪＭ　１０１　（ｐＬＧ　６３２／ｐＬＧ　５７５）由来の５６ｋｄキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）タンパク分泌の経時による５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析を示す。

図１０：ＨｌｙＡのＣ末端の種々のセグメントをコードするプラスミドの構成、及び」匹１」二ヱ」ｎ人遺伝子融合体（ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ）内からの」ｎ人配列の欠失を示す。

図１１　：　’１ｐＬＧ　６０９．　”）ｐＬＧ　６２０又は”　ｐＬＧ　６２１を含む大腸菌ＪＭ　１０１　（ｐＬＧ　５７５）により、媒体中に分泌されたペプチドの５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析を示す。

図１２：ＨｌｙＡのＣ末端における最後の２００個のアミノ酸の配列を示す。

図１３：大腸菌ＪＭ　１０１　（ｐＬＧ　６３２／ｐＬＧ　５７５）、大腸菌ＪＭ　１０１（ｐＬＧ　６３３／ｐＬＧ　５７５）及び大腸菌ＪＭ　１０１　（ｐＬＧ　６３４／ｐＬＧ　５７５）の上清及び細胞サンプルの５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析を示す。

図１４＝プラスミドｐＴＴＱ１８の地図を示す。

図１５：ブロモキシン遺伝子をｈｌｙＡ−Ｃ末端に融合されたＣ末端（２３ｋｄ）コード域を有するプラスミドｐＰＨ−１の構造。

図１６　：　ｐＰｌ（−１によりコードされる４０にハイブリッドｐｒｏ−キモシンー旧ｙの一定時間にわたる生産の５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析を示（ｐＭＧ１６８）　Ｓｏ徂■から得られる大腸菌へモリジン２２３ｋｄ分泌シグナルを含むｐＰＨ−１、ｐＰＨ−２及びｐＰ）Ｉ−３を示す。

図１８＝プラスミドｐＡｐａ−２の構造を示す。

図１９　＝　ｐＡｐａ−２によりコードされる５０ｋｄハイブリツドの一定時間にわたる生産の５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

誼　の量　なｉゝＨ試五及旦方抜本項には、下記の実施例を通じて用いられる主要な方法が述べられている。その他の詳細は、本明細書中で引用する文献に見出される。

皿抹反び土殖条件大腸菌５Ｅ５０００　ｒＬＬ１皿１３９．　Δ血Ｆ−屁　μｍ６９．ユ匹Ａ５７゜ＭＣ４１００」匹り、　ａｒａ１３９．　Δ圃ＩＰＯＺＡ）　ｕ　１６９．　ｔｈｉ：　ＪＭ１０３Δ〕二Ｉａｃ−一」λエコλ）、−」ｉｙ」ジＥ、　ｔｈｉ、　ｓｔｒ八、　ｅｎｄＡ、　５ｂｃＢ１５．１２４８１１口Ｄ３６．　Ｊ匹ＡＢ、二Ｉ’、ＺΔ旧５゜大腸菌ＪＭＩＯＩ！Ｅ、　を肚Δ■赳−」匹ＡＢ）　（Ｆ“、に虹０３６゜」ｎＡＢ、１ａｃｌ’　、ＺΔ旧５）。

これらの菌株はＬブロス中通気下で培養した。プラスミド含有菌株には、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＡ）又はアンピシリン（１００μｇ／　ｒａｆ）を適切に加えた。

プラ≦ＬえヱーバタテリオファージＭ１３ｍｐ１８　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ外、　１９８５Ｃｅｎｅ　３３１０３−１１９）ベクタープラスミドｐＡｃＹｃ１８←ｃａｍ”　、　ｔｅｔ”（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ＋１９７８　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｉ、　Ｌ３Ｌ１１４１−１１５６）；　ｐＬＧ　３３９．　ｋａｎ’　。

ｔｅｔ”　Ｃ３ｔｏｋｅｒ外、　１９８２）；　ｐＵｃ１２」ｖ已　１ａｃＺ’ 　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ外、　１９８３　Ｃｅｎｅ　２６１０１−１０６）；　ｐＯＵ７１Ｊ並”、　Ｊ耗”　（Ｌａｒｓｅｎ外。

１９８４　Ｃｅｎｅ　２８４５−５４）。

異なるプラスミドが有する関連旧ｙマーカーを表１に示す。

ｐＬＧ　５７０は完全なヘモリジン決定因子（ｄｅｆｅｒｍｉｎａｎｔ）を含み、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅ　ｒｉａに全く便宜のために受託番号ＮＣＩＢ　１２４６６で寄託されており、自由に入手できる。ｐＬＧ　５７０は、大腸菌に１２５Ｅ５０００宿主中に保管されている。　ｐｔｃ　５７５は、輸出遺伝子−リｌ」−及び」旦且をコードするｐＬＧ　５７０由来のサブクローンである（Ｍａｃｌａ＋ａｎ外、（１９８５ａ）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０１．２８２〜２８８）、ｐＬＧ　６０９は、発現ベクターｐＴＴ　Ｑ　１８のｔａｃプロモーターの背後に１の３′末端を挿入して調製された（Ｎｉｃａｕｄ　外、　（１９８６）　ＦＥＢＳ、　Ｌｅｔｔ。

％１４．３３１〜３３５）。ｐＬＧ　３６１は、！；！！！ＪＬＦ遺伝子を含有する（Ｊａｃｋｓｏｎ外、　（１９８５）　ＥＭＢＯ，Ｊ、　４．２３７７−２３８３）。次の全プラスミドｐＬＧ６２０．　ｐＬＧ　６２１．　ｐＬＧ　６３１．　ｐＬＧ　６３２．　ｐＬＧ　６３３及びｐＬＧ　６３４は、本研究の過程で調製されたもので、図８９図１０に示す。プラスミドｐＬＧ　６０３はＧｒａｙ外（１９８６）（ＭＧＧ　２０５．１２７−１３３）に記載のようにプラスミドｐＬＧ　３３９　（Ｓｔｏｋｅｒ　外（１９８２）Ｇｅｎｅ　１８．３３５〜３４１）を使用して調製された。

＋　Ｓ　び！Ｌ！ＬＪｊ　コのＵ培養を冨培地（ｒｉｃｈ　ｍｅｄｉｕｍ）中でＡｎｓｏ　＝　０．４まで増殖させた後、ＩＰＴＧ　（Ｓｉｇｏ＋ａ）を最終濃度５０ｐｇ／ｍｉ！まで加え、旦り又は」匹プロモーターを脱抑制させた。細胞を回収し、５ＯＳ−試料緩衝液（ＬａｅｍＩｌｌｉ、　（１９７０）　ＮａｔｕｒｅＵ２１．、６８０−６８５）に直接再浮遊させて、細胞試料を調製した。まず細胞を遠心（Ｓｏｒｖａｌ　ｌ５Ｓ３４＋１６０Ｏｒｐｍ、　１５分）で除き、次にＴＣＡを上清に最終濃度、１０％に加えて、培養上清試料を調製した。沈降したタンパクを遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＨＢ４．１０００ｒｐｎ＋、１０分）で回収し、ＴＣＡを飽和トリス溶液を用いて中和した後、タンパクをＳＯ３−試料緩衝液に溶解した。

…−素制限酵素と３１ヌクレアーゼは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓから得、Ｔ４リガーゼはＢｉｏｌａｂｓから得、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｉ＋）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒから得た。制限条件は、それら製造者の説明したとおりであった。

ＤＮＡフーグメン　の　Ｉ！ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼフラグメントは、Ｄｒｅｔｚｅｎ外（１９８１）　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、■２　、２９５〜２９８）が記載しているように、アガロースゲルで精製した。

ＳＯ３−ポｉアク１ルアミニ　”）Ｅｔ”””　５Ｏ３−ＰＡＧＥ基本方法は、１８％又は１１％（Ｗ／Ｖ）のアクリルアミド分解ゲルを７％重層ゲルとともに用いるＬａｅｍｍｌｉ　（１９７０）　（Ｎａｔｕｒｅ２２７　６８０〜６８５）の方法であった。アクリルアミド・モノマー：ダイマーの比４４：０．８゜ゲルは、１０％（Ｖ／Ｖ）氷酢酸と２５％（Ｖ／Ｖ）プロパン−２−オールを含有する溶液中でローマッシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ）（０，０５％−／ν）を用いて染色した。

ニス　ンブロー−ングタンパクをアクリルアミドゲルからニトロセルロース上に電気泳動により移し、次にウサギ抗旧３＋Ａもしくはウサギ抗ＱＵＩＰＦのいずれかとヒツジ抗ウサギＩｇＧに接合されたホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ（Ｎｏｒｄｉｃ　Ｉｍｍ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃａ１社）を用いるタンパクの免疫学的検出を、基質としてローシア・ニシジンの代りに０．５■／Ｉｌｊ！の３．４．３’　、　４　’ −テトラアミノフェニル塩酸塩を用いた以外は７（＋ｗｂｉｎ外（１９７９）（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　７６、４３５０−４３５４）が記載しているように行なった。

゛パ　ゝ　（Ｈａｅｍｏｌ　ｔｉｃ　Ａｓ５ａ溶血活性の大きさは、特定の旧ｙ因子、増殖培地（安定性に影響する）、宿主菌株及び細胞の所在位置によって広く変化する。擬似的な結果が赤血球の非特異的溶血においても得られることがある（下記参照）。さらに、孔形成ヘモリジンは反応で消費されるので、ヘモグロビンの遊離は酵素反応のプロセスではない（Ｂｈａｋｄｉ　外、１９８６．　Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｎ＋ｍｕｎ、５Ｊ、　６３−６９）。

このような理由により、溶血活性が異なる試料中に存在する毒素の濃度に正比例する条件を確立する際には、大いに注意する必要がある。そこで、必ず、各ヘモリジン試料に新鮮なヒツジ赤血球（Ｏｘｏｉｄ）を過剰に添加した。即ち、反応（ヘモグロビンの遊離）が選択した一定時間にわたって線型動力学（１ｉ　ｎｅａｒｋｉｎｅｔｉｃｓ）に従う条件とした。こうした最良の条件は、一定範囲の試料量について予備的な経時実験を行なって決めた。次いで、個々の生物学的測定を次のように行なった。２組の試料（５〜５０μりを、緩衝液中の洗浄赤血球（Ｍａｃｋｍａｎ外）１ｏ１１ａｎｄ、　１９８４ａ、　ＭＧＧ、　ｌｆ３．　３１２〜３１５）と混合して最終容量１ｍｆｆ１，１０％（ν／Ｖ）赤血球濃度にした。これら試料を、それぞれ１０分間又は２０分間インキュベートし、次いで残った完全な赤血球を遠心ですぐに除去した。各試料から上清７００μｌをとり、分光光度計でＡ、４．において遊離ヘモグロビンの測定に供した。１０分間と２０分間のインキュベーションの結果を生物学的測定の直線性を確認するために用い、またその平均値をとった。

１単位の溶血活性を、３７°Ｃにおいて、試料ｌｌ１１１当り１時間でヘモグロビン５０■を遊離するのに必要な毒素量と定義した。周辺質試料の場合（この場合、活性が通常非常に低く、検出不能である）、緩衝液に５１１ＩＭのＭｇＣｆｚが存在すると、細胞の遠心後、上清中のヘモグロビンを測定する前に赤血球の擬似溶血が引起されることがある。しかし、上清画分からペレット化した細胞を１５泣除去することでこれを回避した。一般に、溶血活性の変動を最小にするために、可能な場合にはこれらの研究は同質遺伝子の菌株背景に関して行ない、分析用試料は栄養ブロス（Ｏｘｏｉｄ）に１０ｍＭ　ＣａＣｌ１２添加のもので指数関数的に増殖する細胞（Ａ”’＝０．９）から得た。このような条件では、培地中の溶血値（ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ　ｖａｌｕｅ）は最大値に近づ＜　ＣＮ１ｃａｕｄ外、　１９８５ａ　ＭＧＧ、　１９９．１１１−１１６）。最後に、本発明者らは、細胞が定常期に近づくにつれて、周辺質の値がまだ非常に低いにも拘らず、ヘモリジンの分布は細胞内の蓄積が若干多くなるように変化することを認めた。

旧　Ａ　び旧　Ａの　の　−ン　−　ｔｒｕｎｃａ　ｔｅｓ　のＴｏｗｂｉｎ外（１９７９Ｊ、　Ｉｏｃ　ｅｆｔ）が記載しているようにして、タンパクを５Ｏ３−ＰＡＧＥで分離した後、ウェスタンブロッティング法によってニトロセルロースに移した。旧ｙＡ誘導体を抗ヘモリジン抗体（Ｍａｃｋｍａｎ外、　１９８５ａ　ＭＧＧ、　２０１．２８２−２８８）を使用して免疫学的に検出した後、ベルオキシクーゼ接合抗体で処理した。

フのゝ百　ｆｒａｃＨｏｎａｔｉｏｎ）細胞を１０＋ｉＭ　ＣａＣ１ｚ添加栄養ブロス中で増殖させた。周辺質両分を、Ｎａ５ｓａｌとＨｅｐｐｅｌ　（１９６６、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｍ、　２４１．３０５５〜３０６２）が記載しているようにして浸透圧ショックによって遊離させ、次にスフェロプラストの音波処理により細胞質画分を遊離させた。各百分の相対汚染を、細胞試料全体、個々の細胞画分全て、及びマレート−デヒドロゲナーゼ活性（ＭＤＩ−細胞質）と β−ラクタマーゼ活性（ＢＬＡ−周辺質）についての洗浄液を分析して監視した。ＭＤ）ｌはオキサロ酢酸とＮＡＤＨを添加して検定し、ＮＡＤＨｅＡ度の低下を追跡した。ＢＬＡは、Ｏ’Ｃａ１１ａｇｈａｎ外（１９７２Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａ　Ａｇｏｎｔｓ　ａｎｄ　ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙＬＬ　２８３−２８８）が記載しているようにして検定した。相互汚染が１０％未満である時にのみ、百分を次の分析に供した。いずれの場合でも、両分中の活性は、細胞試料全体の９５％より大きかった。

遠心で細胞質百分から膜を除去する試みを行なったところ、処理中に両両分から溶血活性が完全に、不可逆的に失われた。

したがって、示された全ての細胞質画分が細胞膜をまだ含有している。

用虹配死ｑ分捉バタテリオファージＭ１３　ｍｐｌＢにクローニングした制限フラグメントを、Ｓａｎｇｅｒ　外（１９７７Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４＋５４６３−５４６７）によって最初に説明されたジデオキシチェインターミネータ−法に、テンプレートとして使用した。生じるＤＮＡ配列をバイトロバシー（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）値について分析しくＫｙｔｅａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　１９８２．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　ＪｉＬ、１０５−１３２）　、予想される２次構造についてＧａｒｎｉｅｒ分析法（Ｇａｒｎｉｅｒ外１９７Ｂ、　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、■虹９７−１２０）によって、Ｍ、　５ｔａｒｋ　（ＬｅｉｃｅｓｔｅｒＢｉｏｃａｎｔｒｅ）から入手のプログラムを使用して分析した。

災旌阻土Ｈｌ　２００１　（７）Ｃｒ　２３ｋｄへ７’チＦハ、旧　６　による　パ、に八　で　る　している大腸菌のある種の病原性菌株によるヘモリジンの生産は、プラスミド上に存在するか、又は染色体に組込まれた約７．５　ｋｂ配列によってコードされている　（Ｗｅｌｃｈ外（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９４゜６６５−６６７ｓ　Ｍｕｌｌｅｒ外（１９８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１５３．８４６−８５１）。旧ｙ決定因子は少なくとも４遺伝子で構成されている。」ｎ人、該毒素の構造遺伝子１が上皇、　Ｈｌｙ　Ａの翻訳後修飾に必要であるが、分泌には不要；」ｈ旦と」ｈ旦、該毒素をエンベロープを通して媒体中へ輸出するのに不可欠（Ｍａｃｋｍａｎ外（１９８５ａ）　ＭＧＧ　２０１゜２８２−２８８　ＨＮ１ｃａｕｄ外（１９８５ｂ）　Ｆ）ｉＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１８７３３９−３４４）。

先の研究によって、」ｎ人は、Ｎ末端のタンパク加水分解プロセシングなしに媒体中へ輸出される１０７にダルトンポリペプチド（Ｆｅ１ｍｌｅｅ外（１９８５ａ）　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　ｌｉ３．８８−８３）をコードするものであることが実証されている（Ｎｉｃａｕｄ外（１９８５ａ）　ＭＧＧ」則、　１１１−１１６　；　Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｒｒｅｒｏ外（１９８５）　ＭＧＧ　９９．１０６−１１０）。

さらに、ｈｌｙＡについてのＤＮＡ配列データは、Ｎ末端シグナル配列が全く存在しないことを示している（ＦｅｌＩＩｌｌｅｅ外（１９８５ｂ）　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１６３　９４−１０５）。この事実及びヘモリジン分泌物中に周辺質中間体が存在しないことが明らかであることを鑑み、本発明者らはヘモリジン輸出のモデルを提案した（Ｍａｃｋｎａｎ外（１９８６）　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏ、　Ｉｍｎ＋ｕｎ、　１２５　ｐ１５９−１８１．　ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ）。その中で、本発明者らは、内膜内に位置する輸出機構による細胞質旧ｙＡの認識を伴なう第１ステツプと、それに続く、該毒素の媒体への直接的な押出しをもたらす第２ステツプを想像した。

最近、本発明者らは、大腸菌のヘモリジン分泌は、旧ｙＡのＣ末端から約２７個のアミノ酸を欠失させることによって阻害でき、それにもかかわらずこの短かくなった分子はなお溶血活性を有することを示した。この実施例において本発明者らは、分泌シグナルは旧ｙＡのＣ末端にまさしく位置している別の証拠を説明する。

旧　ＡのＣｒフーグメン　シー゛　るブースミ゛　ＬＧ　６０９旦皿製ｐｔ、ｃ　５７０由来の」ｎへの３′末端をコードする１、　６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントを、高コピー発現ベクターｐＴＴ０１８に翻訳されるように正しいリーディングフレームにサブクローニングすることにより行なった（図１参照）。このプラスミドは、マルチクローニング発現部位の上流に虱プロモーターを有１７、さらにクローン化遺伝子による発現が誘導剤ＩＰＴＧの不存在下では完全に抑制されるようにするためにＩａｃ　Ｉ’遺伝子をも有している。Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｌ’１．　Ｍ、外（Ｇｅｎｅ　２６．２７３ −２８２　（１９８３））がｐＴＴｏｌＢに類似したベクターで、」ｈへの３′ 末端のサブクローニングに使用できるベクターを説明している。得られる組換えプラスミドｐＬＧ　６０９は、ハイブリッド遺伝子をｈｌｙＡの３′末端に融合されたｔａｃプロモーターとともに含むはずであり、ｈｌｙＡの３′末端は旧ｙＡのＣ末端に対応する２３キロダルトンのポリペプチド（Ａｃ）合成を指示するはずである。

ＬＧ７５旧　ＢＤ　の　びＡ　に１゛番る５Ｅ５０００　（ＬＧ　６０９のプラスミドベクター内のＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｍｄ　ｍフラグメントの存在と方向を、制限酵素分析で確認した。

ｐＬＧ　５７５　（Ｍａｃｋｍａｎ外（１９８５ａ）　ＭＧＧ　２０１．２８２ −２８８）、　止ユ及び１Ｌ旦を有するプラスミド、の存在下又は不存在下で、虱プロモーターから胱合成を誘導するためのＩＰＴＧを添加して、菌株５Ｅ５０００　（ｐＬＧ　６０９）の増殖特性を研究した。図２ａから、１輸出機能をもたないｐｔ、ｃ　６０９を有する菌株にＩＰＴＧを添加すると、増殖が急速に停止したことがわかる。これに対し、輸出機能も存在すると、ＩＰＴＧを添加しても増殖に少ししが影響しなかった。

この結果から、旧ｙｔａ出タンパクの不存在下ではポリペプチド（かなりの確度でＡｃ）の細胞内蓄積は、細胞にとって有毒であること、この効果はＡｃタンパクを媒体へ輸出することにより緩和され得ることが示された。

ＨＩ　Ａの２３ｋｄＣｒ−グメーン（゛、る図２に示された実験から得られた細胞及び培地のタンパク含有量を５Ｏ３−ＰＡＧＥで分析した。まず、図２ｂにｐｉ、ｃ　６０９のみを有する菌株５Ｅ５０００の全細胞リゼイト（溶菌液）において少量の２３ｋｄポリペプチドの合成の誘発が示される一方、培養上清には２３ｋｄタンパクは全く検出されなかった（データ示さず）。

しかし、これに対し、図２０に示されるように、輸出機能の存右下では、ＩＰＴＧ添加後、かなりの量の２３ｋｄポリペプチドが培地中に蓄積した。２３ｋｄタンパクの旧ｙＡのフラグメントと同一性は、精製ヘモリジンに対する抗血清を用いて確認した（Ｎｉｃａｕｄ外（１９８５ｂ）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１８７．３３９−３４４）　（データ図示せず）。

これらの結果は、まさしく、旧ｙＡのＣ末端、２３．０００ダルトンのペプチドがそれ自身の分泌に必要である全情報を含んでいることを明確に実証するものである。予想したように、分泌は、特定のヘモリジン輸出タンパク、旧ｙＢと旧ｙＤの存在下においてのみ認められ、旧ｙＣを必要としない（Ｎｉｃａｎｄ外（１９８５ｂ）ＦＥＢＳ、　Ｌｅｔｔ、　１８７　３３９−３４４）　、これらの結果を実施例２における、旧ｙＡのＣ末端にある小区域の欠失により分泌が阻害されるというデータと勘案すると（Ｇｒａｙ外、１９８６．　ＭＧＧ　２０５．１２７−１３３も参照されたい）、Ｃ末端に近い小区域が完全なヘモリジンの分泌に必要なすべての情報を含んでいることが、強く示唆されている。したがって、本発明者らの結果は、旧ｙＡのＣ末端域が旧ｙＢ及び／又は旧ｙＤと特異的に相互作用して分泌を助長するというメカニズムと合致している。予備的な研究により、有意濃度の旧ｙＤが外膜によっても分けられている（Ｍａｃｋ−ｍａｎ外（１９８５ｂ）　ＭＧＧ　２０１．５２９−５３６）が、これら後者のタンパクは主に内膜内に所在していることが示された。旧ｙＢ及びＤが存在しないと、１０７．０００ダルトンのタンパクは細胞内に蓄積する（Ｇｒａｙ　外、　ＭＧＧ　２０５　１２７−１３３　（１９８６））。

実施ｍｕｉｙ　ＡのＣ末端の欠失によって分泌が阻害されるが、溶血活性は阻害されない。

１、″””　ｈｌＢ　ｈｌＤの　は１　におしるヘモ１ジンの　１置゛この研究では、旧ｙ決定囚子２００１の種々のサブクローン（表１　、　Ｍａｃｋｒｎａｎ外、１９８５ａ　ＭＧＧ　２０１．２８２−２８８）を好都合にも入手することができ、それらには輸出遺伝子の１方又は両方を有するものも含まれており、分子内ヘモリジンの生産及び位置決定に関する相補性テストでこれらの遺伝子の存在の効果を測定した。この分析のために、各遺伝子は必ず同じベクターによって供給された。即ち、ｌの供給源はｐＵｃ１２　（約６０コピー）；４、Ｄ−は、ｐＡｃＹｃ１８４　（約２０コピー）；」ｈ人はｐＬＧ３３９（約６コピー）であった。これによって確実に、得られる結果は比較可能であり、旧ｙ　Ｃ，Ｂ、、Ｄタンパクは過剰に存在した。これらの分析の結果を、完全な再構成系（例えば、ｐＬＧ　５８３に人、　５７７　」ｎ旦、　５９１　■Ｌ且、旦）を表２に示す。

Ｈｔｙ　Ａが培地へ分泌される条件下では、通常、最高２％の溶血活性が、指数的に成長する培養の細胞内に見出された。さらに、浸透圧ショックによる検出で、かかる低レベル活性の実質的に１００％が細胞質内に見出され、周辺質には極低レベル見出された。いずれか一方の輸出機能が存在しない場合には、ヘモリジンの全生産量が５〜１０倍減少し、このことは、細胞内ヘモリジンの合成又は分解に対する何らかの形のフィードバック調節を示唆している。指数成長期において、１方又は両方の輸出機能が存在しない場合の、異なる細胞内空間内の溶血活性を分析したところ、残る活性の９０％をこえる範囲が常に細胞質に存在することがわかった（表２）。

−遣二一　１− えブースミ゛と旧　マーカーヱ乞盆上謎性　１区玉　文−歓ｐｔ、ｃ　５７０　ａｌｌｐ　完全な皿決定因子　Ｍａｃｋｍａｎ及びＨｏｌ　１ａｎｄ　（１９８４ｂ）＃　５７ｑ　ｔｅｔ　上ｄＭａｃｋｍａｎ外（１９８５ａ）〃５７５　ｃａＩｌｈ旦且」ｎ旦　〃〃〃＃５７７ｔｅｔ」ｎ旦」ｎ人＋　１　＋　＃　ｔｔ　〃〃５７３ＣａＩ」ｄＬＮｌ＃〃〃＃５７４　ｃａｎ　」ｎ人”　ＩＩ　＃　ＩＩ＃５８３　ｋａｎ　」佳ＬＮ＃　ｓ〃〃６０３　ｋａｎ　Ｉ法’　Ｇｒａｙ外（１９８６）ｎ　５９４　ｃａｗ　上注Ｍａｃｋ＋ａａｎ外（１９８５ｂ）ｔｙ　５９１　ａｍｐ　％　Ｎ１ｃａｕｄ外（１９８５ｂ）ｈｌｙＡ’　・　１０７ｋｄポリペプチドを生ずる」旦人／旦［融合体ｈｌｙＡ１′・　１０４ｋｄポリペプチド　〃〃〃ｈｔｙＡ”・該遺伝子のＥｃｏＲＩ部位における終止により生ずる」ｈ人知縮体（ｔｒ−ｕｎｃａ　ｔｅ）。

−表一一」− ゛内膜のプラ≦（ＬＬ　」ヱ」ｌ脂　相二」世　周ｊｒ１　ＪａＭＪＬｌ、なし　なし　＜０．０１　＜０．０１　＜０．０１２、ｐＬＧ５９１，５８３，５７５　ＣＡＢＤ　１５．４　＜０．０１　０．３３、ｐＬＧ５９１，５８３　ＣＡ−＜０．０１　０．２”　２．４４、　ｐＬＧ５９１，５８３，５７９　ＣＡＢ−＜０．０１　０．１’　１．５５、　ｐＬＧ５９１，５８３．５９４　ＣＡ−Ｄ　＜０．０１　０．１”　１．５６、ｐＬＧ５７０．Ｔｎ５−２，５７３．５７９　ＣＡ’ＢＤ”　０．８　３．１’７．１）ＬＧ５７０．Ｔｎ５−２．５７４．５７９　ＣＡ″ＢＤ　Ｏ，２２，５’８、ｐＬＧ５７７．６０３．５７５　ＣＡ’ＢＤ　Ｏ，８４０，０１１，３７＊、記号Ａ’　、Ａ”・・・表１に示すとおり。

ａ９周辺質両分の細胞質マレート・デヒドロゲナーゼによる汚染が１０％に達した場合。

ｂ、細胞内活性。

２．１０７ｋｄ　ンパク＼゛へに・　るｈＩ　ＡへのＴｎ５　のりＨｌｙ　ＡのＣ末端の一群の欠失変異体を、先に説明されたようにして（Ｍａｃｋｍａｎ及びＨｏ１ｌａｎｄ　、　１９８４ｂ　ＭＧＧ　１９６．１２９−１３４　）、Ｔｎ５による挿入突然変異誘発によって単離した。Ｔｎ５挿入の位置を、図５８に示した。試験したすべての場合において、ｈｌｙ　ＡへのＴｎ５挿入によって、細胞外においても細胞内においても溶血活性なしの結果が得られた（データネ記）。しかし、全細胞タンパクを５Ｏ５−ＰＡＧＥで分析した後、ウェスタンブロッティング及びｈｔｙ　Ａでコードされた遺伝子産物の抗旧ｙＡ抗血清を用いる同定を行なったところ、Ｈｌｙ　Ａの短縮（ｔｒｕｎｃａ　ｔｅｄ）誘導体が検出された。これに対し培地中には相互反応物質は全く検出されなかった（図５ｂ）。図５ｂに示した、ゲルの列（ｔｒａｃｋｓ）は次のとおりである。

列１−５全細胞リゼイト；列ＩＴｎ５−１２　；列２　ｉｎ５−１４　：列３Ｔｎ５−１６Ｈ列４　ｉｎ５−１８；列５　ｉｎ５−２０　；列６−１２培養上清；列６Ｔｎ５−１２　；列７　ｉｎ５−１４　；列８　ｉｎ５−１６　ｉ列９　ｉｎ５−１８；列１０　ｉｎ５−２０：列１１　ｉｎ５−２１；列１２　ｉｎ５ −２５；列１３と１４それぞれ、ｐＬＧ　５７３とｐｉ、ｃ　５７４によりプログラムされたｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写、翻訳の生成物。

これらの結果は、旧ｙｔのＣ末端の大きな部分を除去すると、常に、活性喪失がもたらされるばかりでなく、分子の残余部分の分泌能が得られたことを示している。

図５のデータは、ｈｔｙ　Ａの３′末端近くでのいくつかの挿入によって、分子量がいずれも約８０ｋｄである短くなったポリペプチドを生成したことも示している。このことは、このような挿入によって、約８０ｋｄのプロテアーゼ耐性ドメインにタンパク加水分解的に縮小される異常ポリペプチドが生成されることを示唆する。この現象に鑑み、旧ｙＡの特異的Ｃ末端欠失を行なう代替源がめられた。

３、ｈｌ　Ａ（７）３’　ｒ　ｔ７”りｔ）−７（Ｄ先に（Ｍａｃｋｍａｎ外、１９８５ａ　ＭＧＧ　％珪、　２８２−２８８　）　、本発明者らは、旧ＹＡの若干短縮された状態をコードすると思われる３ｋｂのＢａｎ　［−Ｂｇｌｌｆフラグメントを有するプラスミドｐｌ、Ｇ　５７４の旦ｖｉｔｒｏにおける調製を説明した。すなわち、上述の旧ｙＡ欠失変異体（ｄｅｌｅｔｔｏｎｓ）とは異なり、このプラスミドは正常サイズに近いポリペプチドであるが、それにも拘らず安定であるものをコードするものであった。本発明者らは、ｐＬＧ　５９４により生産される毒素の短縮体の大きさを調べた。別のサブクローンｐＬＧ５７３、反対方向に３ｋｂのＢａｏ＋　ＩＩ　−Ｂａｆ　ＩＩフラグメントを有図５ｂ（列１４）に示されるように、ｐｔｃ　５７４は、約１０４　ｋｄのポリペプチドのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの合成をコードする。　ｐＬＧ　５７３は、５Ｏ３−ＰＡＧＥの移動度では、ｐｔ、ｃ　５７０中の完全な決定因子によってコードされる旧ｙ／ｌタンパク（１０７ｋｄ）と−見したところでは区別できないポリペプチドの合成を指示した。実際、ｔｅｔ遺伝子内の下流の配列を検査すると（Ｐｅｄｅｖ　、　１９８３　Ｇｅｎｅ、Ｉｇ。

２７７−２８０　”）　、どちらの方向でも、ｐｉ、ｃ　５７３及びｐｔ、ｃ　５７４によりそれぞれコードされる３７個のアミノ酸及び１７個のアミノ酸を旧ｙａタンパクに付加するであろうフレーム内での融合が予想される（図４参照）。これにより、図５で認められたタンパクに類（以した分子量をもつタンパクが合成されるであろう。もとのｈｉｙ　Ａ配列が３′末端の近くに２つの近接して結合されたＢａｌＵ部位を含むという別の可能性は、ＤＮＡのこの域を配列することによって除かれた（図３）。

４、ＬＧ５７３　びＬＧ　５７４にょ　コード　れた　ンバ　のｐＬＧ　５７３又はｐＬＧ　５７４を別のプラスミドｐＬＧ　５７０：：ｉｎ５−２及び、）ＬＧ５７９（それぞれ…匹、旦及び社用を与える）とともに有している苗株ＭＣ４１００の指数成長培養を、溶血活性の有無について分析した。代りに、プラスミドｐＬＧ　５７？及びｐＬＧ　５９４を、それぞれ皿及び皿の供給源として使用することができる。

表２の結果（第６．７行）は、ｐｔ、ｃ　５７３又はｐｔ、ｃ　５７４の一方を有する菌株は低レベルの細胞外活性しか生じないことを、明確に実証している。

さらに、どちらの場合でも、培地中に比較して細胞内には数倍高い溶血活性が存在した。さらに、ヒツジ血液平板（本発明らはこれが分泌に対して大変感度の高い試験となることを見出した）上で、細菌のコロニーにｐｉ、ｃ　５７４が存在しても検出可能なほどにはヘモリジンの遊離を促進できず、またｐＬＧ　５７３は極く小さなハロー（ｈａｌｏｅｓ）を形成しただけであった（データ示さない）。これらの結果は、ｐｔ、ｃ　５７３とｐｔ、ｃ　５７４から生産される旧３１Ａの短縮体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｕｍｓ）は分泌上欠陥を有することを強く示唆した。この効果を、上述の第１項で説明した条件と同等の条件でｌｉ！認するために、ｐＬＧ　５７３中で４をコードする）ｌａｗ旧−ＩＩＩフラグメントを低コピー数（１ｏ−ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ）ベクターｐＬＧ　３３９に移入し、組換えプラスミドｐＬＧ６０３を発生させた（図５８参照）。このプラスミドにより指示される溶血活性の創出を測定したところ、本発明者らは、ヘモリジンの細胞外濃度が、完全な旧ｙＡをコードする構造体に比較して１０〜２０倍低いことを認めた（表２、第８行）。

輸出機能の存在下でｐＬＧ　５７３及びｐＬＧ　５７４によって指示される、旧ｙ＾タンパクの濃度と局在位置も、旧ｙａに対する抗体を用いるイムノブロッティングによって分析した。

図６は、５Ｏ３−ＰＡＧＥで分離され、ウェスタンブロッティングによりニトロセルロースに移され、抗ヘモリジン抗体を用いて可視化された後、ペリオキシダーゼ接合抗体で染色されたタンパクを示す、　ｐＬＧ　５７３とｐＬＧ　５７４は、ｈｌｙＢ及び皿、旦をそれぞれ供給するｐｔ、ｃ　５７９とｐＬＧ　５７０：ｉｎ５−２で途中で相補された。

列１−２、全細胞リゼイト。列１　、　ｐＬＧ　５７４　；列２．ｐＬＧ５７３、列３−６、培養上清。列３　、　ｐｔ、ｃ　５７４　；列４．ｐＬＧ５７３；列５．大腸菌培養上清、プラスミドなし；列６．ｐＬＧ５７０由来の真性旧３＋　Ａ（１０７Ｋ）。

図６に示すように、ｐＬｃ５７４（列３）又はｐｔ、ｃ５７３（列４）のいずれにおいても有意量のＨｌｙ　Ａは培地中に検出されなかった。しかし、どちらの場合も、細胞内濃度の１０７ｋｄポリペプチドが容易に検出された（図６１列１．２）。

５、ｈＩＡ２００１の３′　姓の１ｕｏｔｙ　ＡのＣ末端域は明らかに分泌プロセスに関与しているので、ｈｌｙ　Ａの対応城のＤＮＡ配列を得る必要があった。ＤＮＡ配列分析の結果及びＦｅｌ＋ａｅｅ外１９８５ｂ　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、　■Ｌ、　９４−１０５）によって述べられた旧ｙ　ｐｓＦ４０００のそれと比較される最後の２１８残基について予想されるアミノ酸配列を、図３ｂに示す。

この域の全体の配列は高度に保存され、ＤＮＡレベルで９５％の相同性、アミノ酸レベルで９４％の相同性である。配列データと制限酵素分析によっても、旧ｙ　２００１とＦｅ１ｍ１ｅｅ外の配列との間の制限酵素部位の相違が確認された。これは、後者の配列中のＢａｌ■部位が全く異なるＢａｆＩ［部位によって置き換えられているという驚くべき発見を伴なうものであった（図３ａ）。

この、旧ｙＡ　２００１配列中のＢａｆ１１部位は末端に極めて近く、上述のように旧ｙａの２７個のアミノ酸欠失を発生させることができた。

Ｈｌｙ　Ａ　２００１配列データ及びクローニング部位接合における下流配列の知識から、旧ｙＡの末端８２アミノ酸についてと、Ｂａｆ１１部位での切断により生じたｐＬＧ　５７４　、　ｐＬＧ　５７３の欠失についてのバイトロバシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　１ｎｄｅｘ）のプロフィールを得た（図４）。ｐｔｃ　５７３とｐｔ、ｃ　５７４で形成されていると思われる末端域の構造のほかに、この図はＢａｌｌｎ部位の位置を示し、それは、旧ｙＡの予想２次構造中のめったにない特徴即ち短かいα−ヘリックス域と一致している。この特徴は、旧ｙＳＦ４０００中で、残基１８５−１９６間の予想されるα−へワックスにオーバーラツプする１３個の比較的疏水性のアミノ酸（残基１９１−２０３）の連なりとして、保存されている。

災旌開主旧　２３ｋｄ＼゛・ジグ　ル　に　なる１−一゛イングフレームｔ　せしめるための　ＥｃｏＲｌ　’フカ−ＤＮＡ　るＬＧ　６０９のサブクローン実施例１で説明したようにして誘導されたプラスミドｐＬＧ６０９を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１で消化した。Ｓｅａ　１認識部位を含む３種の合成オリゴヌクレオチド：１）　ＧＡＡＴＴＴＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡ２）　ＧＡＡＴＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡ３）　ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡを、当業者には良く知られた方法を用いて合成し、消化されたｐｔ、ｃ　６０９とリガーゼで結合し、図７に示したようにそれぞれ新規ベクターｐＬＧ　６０９ −１　、　ｐＬＧ　６０９−２及びｐＬＧ　６０９−３を生成させた。これらは、各々、旧Ｖ　Ａ　２３ｋｄ分泌シグナル域に対する異なったリーディングフレームを含んでいる。

ベクターｐＬＧ　６０９−１　、　ｐＬＧ　６０９−２及びｐｉ、ｃ　６０９− ３は、したがって、ｔ＋ｌｙ　Ａの３′末端に関しかつその上流にある３種のリーディングフレームのいずれかの中に第２のＤＮＡ配列の挿入を含んでいる。

皇旌■土旧　ＡＣＰ′、に１人した　ンパクの＼″・Ａ、ＩａｃＺ　−ｏｍ　Ｆ　−ｈｌ　Ａキメ−゛　−の晋Ｎ末端にβ−ガラクシダーゼ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の１０個のアミノ酸をその翻訳開始シグナルとともに含んでいるキメラタンパク、外膜ポーリン（ｌｎｐＦの大部分を含有する中央部分、及びＣ末端である旧ｙａの分泌シグナルを含んでいるキメラタンパクを調製した。この調製の第１段階として、１ａｃＺユ姐ｉハイブリツド遺伝子をｐＵＣ１２の中につくった（図８）。匹ＬＬ遺伝子の核、成熟０＋ａｐＦのＮ末端にある初めの１１アミノ酸をコードするＤＮＡ配列とＣ末端にある最後の３０アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を欠くもの、を０．９　ｋｂ　ＢＬＬｍ　−１（ｉｎｃ　ｍフラグメントの上で、ｐｔ、ｃ　３６１から除去した（　Ｊａｃｋｓｏｎ外、１９８５　ＥＭＢＯＪ、　４　、２３７７−２３８３　）。これを、予めシリ−旧とＨｉｎｃｎで消化されたｐＵＣ１２のｌａｃプロモーターの下流に挿入した。中間体プラスミドｐＬＧ　６３１は、Ｎ末端に、０ＩａｐＦの中央の３００個のアミノ酸に融合されたβ− ガラクトシダーゼ部分の最初の１０個のアミノ酸を含有するキメラタンパクをコードするものであった。第２に、ｐＬＧ　６０９をＥｃｏＲＩで消化し、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）を用いて平滑末端を作る際に詰めた後、さらにＨｉｎｄＩ［［で消化して１．６ｋｂフラグメントを生成させた。これはｂｔｙ　Ａの３′末端を含み、ｐＬＧ　６３１に挿入した。ｐＬＧ　６３１は予めＨｉｎｃ　ＩＩとｌ１ｉｎｄＩ［ｌで消化しておいた。得られたプラスミドｐＬＧ　６３２は制限分析で確認した。これは、ｌａｃプロモーターの支配下にあるＩａｃＺ一部１− ｕＬ虹遺伝子融合体を含んでいた。したがって、ｐｔ、ｃ　６３２は、旧ｙｎの最後の２１８個のアミノ酸を含む５６ｋｄキメラタンパクをコードするものと予測された。この遺伝子融合体の転写はｌａｃプロモーターに制御され、翻訳はβ −ガラクトシダーゼの開始シグナルによって制御されるものであった。

８．５６ｋｄキメ−ンパクの１立１への　゛、は　ＨＩ　Ｂ　び旧　Ｄの　に　るＨｌｙ　Ａの２３ＫｄのＣ末端ペプチドは、ｐＬＧ　５７５　（Ｍａｃｋｍａｎ外、Ｊ、　Ｌｏｃ、　Ｃｉｔ、　１９８５ａ）によってコードされる輸出機能旧ＶＢ及び旧ｙ　Ｄ　（Ｎｉｃａｎｄ外、１９８６ｂ　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、」財、　３３１−３３５　）を含有する大腸菌５Ｅ５０００から培地へ特異的に分泌される。そこで、本発明者らは、旧ｙｔの当該２３ｋｄペプチドを含んでいる５６ｋｄのキメラタンパクが認識され、このシステムを用いて培地へ特異的に遊離されるか否かを試験するために同じ条件を使用した。比較のために、図９ａに、ｐＬＧ　６０９のｔａｃプロモーターをＩＰＴＧで脱抑制させた後の、２３ｋｄペプチドの菌種５Ｅ５０００　（ｐＬＧ５７５）の培地中での急速な蓄積を示す。

タンパクを５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブリリアントブルーによって（上側の半回）又はウェスタンプロットでＨｌｙ　Ａに対するポリクローナル抗体を用いることによって（下側の半回）可視化した。ＩＰＴＱは、ｔ＝ｏｈで加えた。

細胞：列１．ｔ＝ｏｈ；列２．ｔ＝２ｈ；列３．ｔ＝３ｈ；列４．　ｔ＝４ｈ。

上清：列１．ｔ＝ｏｈｉ列２．ｔ＝２ｈ、列３．ｔ＝３ｈ；列４．　ｔ＝４ｈ。

ウェスタンプロット（下の半回）は、さらに、２３ｋｄタンパクの大々部分がまさしく培養中にあり、細胞内には有意なほど蓄積していないことを示している。

ｐｔ、ｃ　６３２を菌株ＪＭＩＯＩ　Ｆ　’Ｌ匹ｄ−皿ハイブリッド遺伝子の上流にある）をＩ　ＰＴＧを用いて脱抑制した。図９ｂは、ヘモリジン輸出遺伝子の存在下及び不存在下における５６Ｋｄキメラタンパク（ＨｌｙＡに対するポリクローナル抗体を用いるウェスタンプロットで同定）の誘導を示す。

細胞試料及び培養上清（ＳＮ）試料を、大腸菌ＪＭＩＯＩ　（ｐＬＧ６３２）と大腸菌ＪＭＩＯＩ　（ｐＬＧ　６３２／ｐＬＧ　５７５　）　（それぞれ、−輸出及び十輸出という）の培養から、ＩＰＴＧによる誘発時と誘発から２時間後に採取した。タンパクをＳＯ３ＰＡＧＥで分析し、Ｈｌｙ　Ａに対するポリクローナル抗体を用いて可視化した、矢印は、５６ｋｄのｏｎ＋ｐＦ−ｈｌｙＡｃハイブリッドの位置を示す。

−輸出：列１．　ｔ＝ｏｈ　（細胞）；列２．　ｔ＝ｏｈ　（ｓＮ）　；列３．ｔ＝２ｈ　（細胞）；列４．　ｔ＝２ｈ　（ＳＮ）　；十輸出二列５．　ｔ＝ｏｈ　（細胞）；列６．　ｔ＝ｏｈ　（ＳＮ）　；列７．ｔ＝２ｈ　（細胞）；列８．　ｔ＝２ｈ　（ＳＮ）。

１（１ｙ　Ｂ及び旧ｙＤの不存在下では、５６＋ｄタンパクは細胞に会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ままであった。しかし一方、ヘモリジン輸出遺伝子をｐｔ、ｃ　ｓ’ｙｓで与えると、キメラタンパクの大々部分が培地中で検出され、細胞内には検出不能な量しかなかった。

明らかに、Ｈｌｙ　Ａの２３ｋｄペプチドも５６ｋｄのキメラタンパクも、ヘモリジン輸出経路によって特異的に認識され、培地へ分泌されるのである。図９０は、誘発後の、５６ｋｄキメラタンパクの培養上清中における蓄積の時間経過を示す。染色したプロフィールは、このタンパクが培地中へ特異的に遊離されることを示した。

ＪＭＩＯＩ　（ｐＬＧ　６３２及びｐＬＧ　５７５　）のＬブロス中での培養をＩＰＴＧで誘発してｌａｃプロモーターを脱抑制した。細胞試料と培養上清試料を、誘発時及びその後時間間隔をおいて採取した。タンパクをＳＯ３ＰＡＧＥで分析し、クーマシーブルー染色で可視化した。分子量はキロダルトンで示す。

細胞試料：列１．ｔ＝Ｑｈ；列２．ｔ＝６０分；列３゜ｔ＝１２０分、列４．ｔ＝１８０分；上清：列５．ｔ＝ｏｈ；列６．ｔ＝６０分；列７゜ｔ＝１２０分；列８．ｔ＝１８０分。

タンパクの全量は２３ｋｄのＣ末端ペプチドのみよりも少なかった（図９ａ）が、これは単に、誘発後のｐＬＧ　６０９のお匹エプロモーターからの転写レベルが、ｐｔ、ｃ；　６３２上の１ａｃＺ−望■Ｆ　−皿遺伝子融合体の上流に存在するｌａｃプロモーターの転写レベルに比して高いことを反映しているだけかもしれない。

実施拠ｉ旧　Ａ３Ｕ、ジグ　ルはＣｒの一部の１１３　のアミノ　に拉１ツ一り− Ｈｉｙ　Ａの２３ｋｄのＣ末端のペプチドの遊離は、分泌シグナルが最後の２１８個の残基内に位置することを示した。さらに、最後の２７個のアミノ酸の欠失によりこのシグナルは混乱され、生じるポリペプチドの分泌は阻害された（Ｇｒａｙ外（１９８６）　ｌ’ｌｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０５　、１２７−１３３）。そこで、分泌に必要である域をもっと明確に位置決めするために、旧ｙＡのより小さいＣ末端フラグメントを発現する２つのプラスミドを調製した（図１０）。第１に、４６個のアミノ酸をコードする１３８ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ｐＬＧ　６０９によりコードされるｈＵＬＡ内から切取った。生成したプラスミドｐｔ、ｃ　６２０は」匹プロモーターの制御下にあ４辻ＬＬの３′末端の一部を含み、旧３１Ａの１８ｋｄのＣ末端フラグメントを発現した。第２に、ｐＬＧ　６２０由来の３５３　ｂｐのシ１１ＤＮＡフラグメントをベクターｐＵｃ１２に挿入してｐＬＧ　６２１をつくった（図１０参照）。これは、旧３１Ａの最後の１１３個のアミノ酸に融合した、β−ガラクトシダーゼ部分の最初の９残基からなるハイブリッドタンパクを生成した。この遺伝子融合体はｌａｃプロモーターの制御下にあった。

ｐＬＧ　６２０及びｐＬＧ　６２１によりコードされるＣ末端ペプチドがヘモリジン輸出経路によって分泌されるかどうかを試験するために、これらのプラスミドをｐｔ、ｃ　５７５を含むＪＭ　１０１の中に移入した０図１１は、次のことを示している。

ヘモリジン輸出経路を利用する、旧３＋Ａの種々のＣ末端フラグメントの分泌。

培養上清（ＳＮ）試料からのタンパクを５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分析したのち、クーマシーブリリアントブルーで染色した。

列１．ＳＮ　大腸直針１０１（ｐＬＧ　６０９／ｐＬＧ　５７５）。

列２．ＳＮ　大腸菌ＪＭＩＯＨｐＬＧ　６２０／ｐＬＧ　５７５）。

列３．ＳＮ　大腸菌ＪＭＩＯＩ（ｐＬＧ　６２１／ｐＬＧ　５７５）。

１４、３　ｋｄ分子量の標準も示す。

得られた結果から、誘発と同時に、ｐＬＧ　６２０及びｐＬＧ　６２１によりそれぞれコードされた１８ｋｄのペプチド及び１２ｋｄのペプチドが培地中へ分泌されたことがわかる。このことは、）ｆｌｙ　Ａタンパクの分泌シグナルがＣ末端の最後の１１３個のアミノ酸の中に含まれていることを、強く示唆した。培地中へ分泌された１２ｋｄペプチドの量は、２３ｋｄ及び１８ｋｄタンパクのいずれの量よりも少なかったが、これもｌａｃプロモーターからの転写が低レベルであることを反映している可能性がある。

災旌皿ｌヘモ１ジンの　′の２７　のアミノ　くキメーー乙ぺｊｊす韻［ユの　＼′Ｉ゛、口　に　るｔ＋ｔｙ　Ａ分泌シグナルを含む最小配列に関する別の情報が、キメラタンパク遊離の研究から得られた。本発明者らは、旧ｙＡの最後の２１８個のアミノ酸が、ＯｍｐＦと旧ｙＡのＣ末端部分とからなる５６ｋｄキメラタンパクの培地への分泌を指示する能力を有することを明らかにした。本発明者らは、下に、分泌シグナルは最後の１１３個のアミノ酸内に位置することを明らかにする。

即ち、ＩａｃＺ　−匹柱Ｌ−紅ＬＬハイブリッド遺伝子の中から、ＬａｃＺ配列もｇｇ２ｇ配列も変えないまま、ｈｉｙ　Ａ配列を欠失させて、２種のハイブリッドタンパクを生成した。これらは、そのＣ末端に旧ｙＡの最後の２７アミノ酸からなる乱れのないブロックのみを含むものであった。

ｐＬＧ５７０の一部についての部分的制限地図を図１０に示す。ｐＬＧ６０９はｕ４と且ＬＬの３′末端との間に遺伝子融合体を含む。

１の３′末端は、β−ガラクトシダーゼの５残基であって、そのＮ末端において旧３１Ａの最後の２１８アミノ酸のＣ末端に融合されたものからなる２３ｋｄのキメラタンパクをコードするものである（Ｎｉｃａｕｄ外、（１９８６ｂ）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　皿り、　３３１−３３５）。この旦媛−担ｌ」ユバイブリッド遺伝子の転写は、ｔａｃプロモーターによって制御される。ｐＬＧ６２０は、ｐＬＧ６０９がら…ＩＬの３′末端内の１３８ｂｐのＢａｌ　Ｉフラグメントを欠失させてっ（った。ｐＬＧ６２０ハ、旧ｙＡの１７２個の残基を含む１８ｋｄキメラタンパクをコードする１ａｃＺ−、！ＩＬＩＬＬハイブリッド遺伝子（雇プロモーターの制御下にある）を含んでいる。ｐＬＧ６２１は、ｐＬＧ６２０から分離した３５３ｂｐのＤｒａ　Ｉフラグメントを、ベクターｐＵｃ１２のＳｍａ　Ｉ　ｓ位に挿入して構成した。組換え体はＸ−ｇａ　１　／　Ｉ　ＰＴＧを含有する培地で増殖させ、白色コロニーとして確認し、挿入の方向は制限分析によって確認した。ＰＬＧ６２１は、ｌａｃプロモーターの制御下にある１ａｃＺ −ｕＬＬ遺伝子融合体を含んでおり、β−ガラクトシダーゼ部位の９残基であって旧ｙＡの最後の１１３のアミノ酸に融合されたものからなる１２ｋｄキメラタンパクをコードする。

図１０は、ｐＬＧ３６１の一部の部分的制限地図を示す（Ｊａｃｋｓｏｎ外、１９８５、Ｅｍｂｏ　Ｊ、互、２３７７−２３８３）、　ｐＬＧ６３２は図８で先に述べたようにして構成したもので、５６ｋｄキメラタンパクをコードする。

ｐＬＧ６３３とｐＬＧ６３４はいずれも、第１にＢａ１ｍで完全に消化し、ｓ１ヌクレアーゼを使用して付着末端を除去することによりつくった。第２に、該ＤＮＡをＢａｔ　Ｉで部分的に消化し、大きなりＮＡフラグメントを分離した。リガーゼで結合後、そのＤＮＡを菌株ＪＭＩＯＩ　Ｆ’ｌａｃ　Ｉ’に移入し、適当な欠失を含むプラスミドを制限分析で確認した。

制限酵素は次のとおりである。Ｂ−Ｂａｌ　ｎ　、Ｂｇ−Ｂａｌ　ＩＩ　、Ｄ　 −Ｄｒａｌ、Ｅ−ｈ皿１゜発生した２つのプラスミド、ｐＬＧ６３３及びｐＬＧ６３４　（図１０）は、それぞれ４５ｋｄ、４０ｋｄのキメラタンパクをコードする。これらのキメラタンパクはどちらもそのＣ末端の最末端から同じ２７個のアミノ酸域を含んでいた（この域でのアミノ酸残基について図１２を参照されたい）。しかし、４５ｋｄタンパクでは、この小さなＣ末端域は、旧ｙＡの９８残基によって該分子の０ｃａｐＦ部分を有する融合部位から分離されていた。一方、４０ｋｄタンパクでは、ｏｔｙ　Ａの５２残基だけがこの域を、Ｏｎ＋ｐＦを有する融合部位から分離していた。

４５ｋｄ及び４０ｋｄのキメラタンパクの分泌を、ｐＬＧ５７５を含有するＪＭＩＯＩを用いて試験した。細胞画分及び上清画分を、ＯｍｐＦに対するポリクローナル抗体に対してウェスタンプロットした。というのは、旧ｙａに対する抗体はどちらのタンパクも検出しないからである。図１３は、４５ｋｄキメラタンパクが全蓄積量では５６ｋｄキメラタンパクより少なく、少量の４５ｋｄタンパクは細胞に会合していることがわかったにもかかわらず、誘発と同時に培地へ分泌されたことを示す。この結果は、旧ｙＡの少なくとも２７の残基は分泌シグナルの大部分を実際含んでおり、ヘモリジン輸出経路から多少の特異的な分泌を行わしめるのに十分なものである可能性を示唆した。

図１３に示すように、菌株大腸菌ＪＭＩＯＩ　（ｐＬＧ６３２／　ｐＬＧ５７５）　、大腸菌（ｐＬＧ６３３／　ｐＬＧ５７５）及び大腸菌ＪＭＩＯ１，（ｐｔ、ｃ６３４／　ｐＬＧ５７５）をＩＰＴＧで誘発し、２時間後に誘発細胞試料と上清（ＳＮ）試料とを５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析し、タンパクを０ｃａｐＦに対するポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティングで検出した。真のＯｎ＋ｐＦは３６ｋｄで示される。列１　、　ＪＭＩＯＩ細胞；列２、ＪＭＩＯＩ　（ｐＬＧ６７４／　ｐＬＧ５７５）細胞；列３、ＪＭＩＯＩ　（ｐＬＧ６３３／　ｐＬＧ５７５）細胞；列４、ＪＭＩＯＩ（ｐＬＧ６３２／　ｐＬＧ５７５）細胞；列５、ＪＭＩＱＩ（ｐＬＧ６３４／ｐＬＧ５７５）　ＳＮ　；列６、ＪＭｌｏｌ（ｐＬＧ６３３／ｐＬＧ５７５）　ＳＮ　；列７、ＪＭＩＯＩ　（ｐＬＧ６３２／ｐＬＧ５７５）　ＳＮ。

本発明者らは、旧ｙｘの最後の２００個のＣ末端アミノ酸、及びそれらの予想される２次構造を調べた（図１２）。

ｐＬ０５７０由来の、加工」−の３′末端によりコードされた最後の２００個のアミノ酸（Ｇｒａｙ外、（１９８６）Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　−臣、１２７−１３３）。開いた（白い）、あるいは閉じた（黒い）箱の域は、それぞれ弱いあるいはより強いα−ヘリックス域を示す。

興味深いことに、潜在的なα−ヘリックスが残基１６７と１７７との間に見出された。ｐＬＧ６３３及びｐＬＧ６３４の構成に用いられたＢａｌ■部位にまたがる域である。この域は、提案した２７個のアミノ酸分泌シグナルを分子の残余の部分から分離するのに役立ち得る。

重要なことに、ｐＬＧ６３４の坦１ｊ工配列内の融合部位を調べることによって、本発明者らは、この潜在的なα−ヘリックスは、４５ｋｄキメラタンパク中では部分的に再生されるが、４０ｋｄキメラタンパクでは再生されないことを見ることができる。これによって、なぜ有意量の４５ｋｄタンパクが培地中へ分泌されるかを説明することができた。

正常な旧ｙ分泌メカニズムは翻訳後でなければならないので：分泌シグナルが輸送されるポリペプチドの３次構造の中に埋もれないことが重要である。正常な旧ｙ＋へ分子の予想される２次構造、分泌される旧ｙ＾のより小さな短縮体、並びにＯｎ＋ｐＦ及びプロキモシン　ハイブリッドをしらべると、シグナル配列域は常に分子のバルクから離れた別個の２次構造ドメインを形成している模様であることが示される。したがって、旧ｙｔのＣ末端域にある離れたシグナルは旧ｙＢ、０１６出システムを認識するのには十分であるけれども、特定ハイブリッドの効率的な分泌には、シグナル配列が旧ＶＢ、Ｄ分泌機構に確実に接近できるのに十分なだけスペーサーとしてのアミノ酸の挿入が必要かもしれないことは、理解できよう。

０ＩＩｌｐＦに対する抗体を使用したところ、成熟した０ＩｌｌｐＦ　（３６ｋｄ）が培地中に少量存在することが図１３に示された。

Ｍｕｇ−Ｏｐｓｔｅｌｔｅｎ　と−１ｔｈｏｌｔ（１９７８Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　・５０８５２８７−２９１）は、先に、成熟ＯｍｐＦタンパクが通常野性型大腸菌から培地中へ小胞が会合した状態で遊離されることを示した。

５６ｋｄキメラタンパクが小胞の形で遊離されるかどうかをためすために、培養上清試料をプロテアーゼで処理した。５６ｋｄのハイブリッドタンパクはプロテアーゼで完全に分解されることがわかったが、成ＰＯＬＩｌｐＦタンパク　（小胞の膜に埋まっている）は完全に抵抗した（未公表データ）。さらに、培養上清を沈降させると（４０ｒｐｍ　、　４時間、５０Ｔｉローター）、得られた結果は明確に、野性型のＯｎ＋ｐＦタンパクはすべてペレット中にあったが、キメラタンパクはすべて上清中に残っている（未公表データ）ことを示した。したがって、キメラタンパクの分泌は特異的であるようで、外膜による差別的遊離を伴うものではない。

実施■エプロキモシンー旧　Ａバイブ１ツドの　と＼゛′、２３ｋｄタンパクをコードする旧ｙＡの３′末端を有するＥｃｏＲ１−旧ｎｄ　ｍフラグメント（図１）をｐＴＴＱ１８　（図１４）にクローニングして、プラスミドｐＬＧ６０９　（図１）を生成させた。種々のオリゴヌクレオチドをｐＬＧ６０９の唯一のＥｃｏＲ１部位に挿入して３’Ｈ１ｙＡ遺伝子のための種々のり−デングフレームを作り出すことにより、一連のサブクローンを調製した（図７）。

第１のプロキモシン−ｔ＋ｉｙ　Ａハイブリッド（Ｘｍａ１部位へ）を、図１５に示すように、二重起源（ｄｕａｌ　ｏｒｉｇｉｎ）ベクターｐＭＧ１６８（イギリス国特許ｋＧ８２１３６８１４Ｂ）及びｐＬＧ６０９−１からｐＰＨ−１を形成して調製した。４０ｋｄの産物（Ｈｌｙ　Ａに対する抗体で確認）が、細胞が輸出遺伝子旧ｙＢ及びｔ＋ｔｙ　Ｄを有するｐＬＧ５７５を含んでいる場合には、培地へ分泌された。図１６は、ｐＰＨ−１でコードされる４０にハイブリッドプロキモシン−Ｈｌｙの生産の時間経過を示す。ｔｒｐプロモーターから高レベルの発現を誘発してハイブリッド遺伝子を転写させるために、培養を３７°Ｃに移した。これにヨリλリプレッサーＣｌ８５７が不活化され、λブロモ−タールＲの広範な転写が始まり、次いでこれによりベクターのコピー数の下流制御が乱される。プラスミド数の増加はにリプレッサーを滴定しくｔｔｔｒａｔｅ　ｏｕｔ）　、次にｋとから高レベルの発現を可能にする。

図１６において− 列１−０分、列２−３０分誘発１列３−６０分誘発１列４−９０分誘発１列５− １２０分誘発。

ｌ１ｙ　Ａ分泌シグナルに融合されるプロキモシンの大きな部分をつ（るために（Ａｐａ１部位へ）　、ｐｐｎプラスミドシリーズ（図１７）に設けられた３種のリーディングフレームすべてに旧３１Ａ分泌シグナルを都合よく利用した。次に、大きいプロキモシンハイブリッドを二重起源ベクター（９ＭＧ１６Ｂ）とｐＰＨ−２からつくった。得られたプラスミドは、５０ｋｄバインブリツドタンパクをコードするものであって、２３ｋｄタンパクをコードするｈｉｙ　Ａ　−Ｃ末端ＤＮＡに融合されるプロキモシン遺伝子の大フラグメントをコードするｐＡｐａ−２である　（図１８）。

図１９は、ｐＡｐａ−２でコードされる５０にのハイブリッドプロキモシン−Ｈ１ｙ生産の時間経過を示す。詳細は図１６について上述したとおりである。

これらの結果は、このハイブリッドは、輸出プラスミドｐＬＧ５７５も存在するならば、分泌されることを示している。このハイブリッドの同一性は、プロキモシンと旧ｙＡの両方に対する抗血清を用いて確認した。

ｐＬＧｓ７０　＝’ｌ、エエエヨエ、工８ヨエ」ヨＵ−ＥｃｏＲ１リンカ−ＤＮ＾を使用し、ヘモリジン２３ＫＯ分泌シグナルに対する異なるリープ・イングフレームを発生する、ｌ”ＬＧ６０９のサブクローンＭＡ　ＩＰＬＧ６０９−Ｉ　Ｇ　ＡＡＴ　ＴＩＴ　ＣＣＣＣＩＧＧＧ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＴＣＩ　Ｃ１１ＰＬＧ６０９−２　Ｇ　ＡＡ、ＴＴＴ　ｃｃｃ”ＴＡＡｃ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＣＴ、ＭＡ　ＩＰＬＧ６０９−３　Ｇ　ＡＡＴ　ＴＴＣＣＣＩＧ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＴＣＩ　ＣＨ１１ｉｎｄｌｌ＋ −輸　出　十　幀　自相　胞　上　清ＨＱＩＥＯＩＦＤＫＤ　ＧＲＶＩＴＰＤＳＬＫ　ＫＡＦＥＹＱＯ５ＮＮ　ＫＶＳＹＶＹＧＨＤＡ　５ＴＹＧＳＯＤＮＬＮ細　胞　上　清プロキモシン（ＰＭＧ１６８）　ＳＭ＾！部位から得られる大腸菌ヘモリジン２３ＫＯ分泌シダナノしの３種のリーディングフレーム εｃｏＲＩ　Ｘｍａ　１３方法のりガーゼによる結合本輸　出　二輪　出Ｆｉｇ、１６リガーゼで結合上　消時間−時間− 国際調査報告 −１″＋′ｌ＾−ｅｋ＃ｌ−Ｎ・　Ｐσ／ＧＢ　８７１００３３１

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリペプチドの製造方法であって、前記ポリペプチドと、Ｃ−末端分泌配列を有する別のペプチドとを含有してなる融合タンパクをコードするＤＮＡで形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を培養して、該宿主細胞から前記融合タンパクを発現させ、分泌させる方法。
２．請求の範囲第１項記載の方法であって、分泌後、融合タンパクが切断されて前記ポリペプチドを生成する方法。
３．請求の範囲第１項又は第２項記載の方法であって、前記Ｃ末端分泌配列がヘモリジソＣ末端分泌配列である方法。
４．第１のポリペプチドと別のペプチドとを含有してなる融合タンパクであって、前記の別のペプチドがＣ末端分泌配列を有するものであるタンパク。
５．請求の範囲第４項に記載の融合タンパクであって、Ｃ末端融合タンパクであるもの。
６．請求の範囲第４項又は第５項に記載の融合タンパクであって、前記別のペプチドがヘモリジンＣ末端分泌配列を有しているもの。
７．請求の範囲第４項、第５項又は第６項に記載の融合タンパクをコードするＤＮＡ配列。
８．請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
９．ヘモリジンＣ末端分泌配列を有するペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列と、それに関して配置された唯一の制限部位とを、前記ペプチドと別のペプチドとを含んでなる融合タンパクの発現が、該ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列が前記唯一の制限部位に挿入されると得られるように、含んでなる発現ベクター。
１０．請求の範囲第８項記載のベクターで形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞。