ES2444840T3 - Exportación y modificación de poli(péptidos) de tipo lantibiótico - Google Patents

Abstract

Un método para producir, en una célula hospedadora, un polipéptido que contiene un puente tioéter, cuyo origenno es una bacteria Gram-positiva, comprendiendo el procedimiento; a) seleccionar una célula hospedadora que tenga una molécula de ácido nucleico que comprenda un primer y unsegundo fragmento de ácido nucleico que estén en la misma fase de lectura abierta, en la que - el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmenteequivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico, y en el que estepéptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal maneraque pueda producirse la formación de un puente tioéter; - el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia amodificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias constituido por Ser-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es un cualquier aminoácido y donde n es 1-13, y donde el polipéptidono tiene como origen una célula bacteriana Gram-positiva; b) seleccionar la célula hospedadora para detectar la presencia de la proteína transportadora LanT; c) traducir la molécula de ácido nucleico, produciendo de este modo un péptido de fusión del péptido líder delantibiótico y el polipéptido que comprende la secuencia seleccionada del grupo de secuencias constituido porSer-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; y d) recoger el polipéptido que contiene el puente tioéter de un medio de la célula hospedadora.

Description

Exportación y modificación de poli(péptidos) de tipo lantibiótico

5 La invención se refiere al campo de los lantibióticos y al campo de las modificaciones post-traduccionales de (poli) péptidos.

Los lantibióticos forman un grupo de péptidos antibióticos únicos modificados post-traduccionalmente y sintetizados ribosomalmente producidos por, y que actúan principalmente sobre, bacterias Gram-positivas (para una revisión véase McAuliffe et al., FEMS Microbiol. Rev. 25: 285-308 (2001). Dado que, por definición, contienen puentes tioéter intramoleculares o anillos formados por los aminoácidos con grupos tioéter, lantionina (Lan) y 3-metil lantionina (MeLan) y dado que todos son antibióticos peptídicos con actividad bactericida de moderada a fuerte, estos toman su nombre de estas propiedades más llamativas.

15 Los anillos tioéter protegen a los péptidos contra la degradación proteolítica. Por ejemplo, el lantibiótico nisina permanece activo después de tratamiento con tripsina. Los anillos tioéter son esenciales para algunas actividades de los lantibióticos. Por ejemplo, la apertura del anillo A o C en la nisina suprime la capacidad de permeabilización de la membrana. El anillo A de la nisina es necesario con respecto a su capacidad para autoinducir su propia síntesis y con respecto a la capacidad de la nisina para bloquear la síntesis del peptidoglucano interaccionando con el lípido II. Es esencial tener anillos tioéter y no puentes disulfuro dado que el reemplazo de anillos tioéter por puentes disulfuro conduce a la pérdida de actividad microbiana.

No deterioran el ambiente y no son tóxicos para los animales o el hombre y encuentran, o pueden encontrar, aplicaciones como bioconservantes en la preparación de alimentos y bebidas, pero también como agente bactericida 25 en productos cosméticos, veterinarios y médicos. Dado que el creciente número de microorganismos patógenos resistentes a fármacos múltiples ha creado la amenaza de otra “era preantibiótica” para muchas enfermedades bacterianas, se espera que los lantibióticos también puedan servir como un nuevo compuesto principal para remediar este problema alarmante. Principalmente por estas razones, en la década anterior, los lantibióticos han experimentado un notable aumento en actividades de investigación aplicada y básica, lo que conduce a un aumento extraordinario en cuanto al conocimiento acerca de sus propiedades estructurales y funcionales, sus mecanismos de acción y de los genes y componentes proteicos implicados en su biosíntesis y secreción. Por ejemplo, los lantibióticos se han convertido actualmente en objeto de proyectos de “modificación por ingeniería genética de proteínas”, con el objetivo de alterar, mediante mutagénesis dirigida a sitio, su actividad, estabilidad y espectro de células diana susceptibles. En la presente descripción se realiza un enfoque sobre los lantibióticos lineales (tipo A)

35 ya que hasta el momento se dispone de muy poca información específica acerca de los lantibióticos circulares (tipo B).

Los lantibióticos subtilina y nisina pertenecen a, y son representativos de, antibióticos peptídicos o lantibióticos de tipo A. Contienen los aminoácidos poco frecuentes deshidroalanina (Dha), deshidrobutirina (Dhb), meso-lantionina y 3-metillantionina, y los puentes tioéter característicos. La nisina es el lantibiótico más destacado y se usa como un conservante alimenticio debido a su alta fuerza contra determinadas bacterias Gram-positivas. Las cepas de Lactococcus lactis que pertenecen al grupo serológico N producen nisina. Las fuertes actividades bactericidas de la nisina, y de muchos otros lantibióticos, se basan en su capacidad para permeabilizar la membrana citoplasmática de bacterias diana. La degradación del potencial de membrana comienza por la formación de poros a través de los

45 cuales se liberan moléculas de bajo peso molecular. Además, la nisina inhibe la síntesis de la pared celular uniéndose al lípido II, un precursor de la síntesis del péptidoglucano, modula la actividad de enzimas autolíticas e inhibe el desarrollo de esporas (véase también Breukink y de Kruijf, Biochem. Biophys. Acta 1462:223-234, 1999).

En muchos países la nisina se usa para impedir el desarrollo de clostridia en queso y en alimentos en conserva. La estructura peptídica de la nisina la describieron primera vez Gross y Morell (J. Am. Chem. Soc. 93:4634-4635, 1971), y su gen estructural se aisló en 1988 (Buchmann et al., J. Biol. Chem. 263:16260-16266, 1988). La nisina tiene dos variantes naturales, la nisina A y la nisina Z, que solo se diferencian en un resto de aminoácido en la posición 27 (la histidina en la nisina A se reemplaza por asparagina en la nisina Z).

55 La subtilina la produce Bacillus subtilis ATCC 6633. Groos y Kiltz (Biochem. Biophys Res Commun 50: 559-565, 1973) desenmarañaron por primera vez su estructura y en 1988 se aisló su gen structural (Banerjee & Hansen, J. Biol. Chem. 263:9508-9514, 1988). La subtilina comparte fuertes similitudes con la nisina con una idéntica organización de las estructuras en anillo de la lantionina (Fig. 1), y ambos lantibióticos poseen similares actividades antibióticas.

Debido a su fácil análisis genético B. subtilis se convierte en un organismo modelo muy adecuado para la identificación y caracterización de genes y proteínas implicados en la biosíntesis de lantibióticos. La ruta mediante la cual se produce la nisina es muy similar a la de la subtilina, y las proteínas implicadas comparten homologías significativas sobre las proteínas completas (para una revisión véase también De Vos et al., Mol. Microbiol. 17:427

65 437, 1995).

Otro lantibiótico bien conocido y estudiado, producido por Staphylococcus epidermis 5, es Pep 5, que contiene tres estructuras en anillo (una MeLan y dos Lan), un resto oxobutirilo N-terminal, y dos restos Dhb (Kellner et al., Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 28:616-619, 1989).

5 Los genes respectivos que actúan postraduccionalmente se han identificado adyacentes a genes los estructurales, y juntos se organizan en estructuras de tipo operón (Fig. 2). Se piensa que estos genes son responsables de la modificación postraduccional, del transporte del prepéptido modificado, de la escisión proteolítica y de la inmunidad que impide efectos tóxicos sobre la bacteria productora. Además de esto, la biosíntesis de la subtilina y de la nisina está fuertemente regulada por un sistema regulador de dos componentes que consiste en una histidina quinasa y una proteína reguladora de respuestas.

De acuerdo con un modelo presente (Fig. 3) se supone que una señal dependiente de la fase de crecimiento extracelular puede activar la histidina quinasa localizada en la membrana. La naturaleza de esta señal puede ser diferente para la biosíntesis de la subtilina y de la nisina. Mientras que en la biosíntesis de la nisina, la propia nisina

15 tiene una función inductora, en la biosíntesis de la subtilina se mostró que esta biosíntesis era dependiente de esporulación.

De acuerdo con el modelo, después de su auto-fosforilación, la histidina quinasa Spak y Nnisk transfiere el resto fosfato al regulador de respuestas que a su vez activa los genes necesarios para la biosíntesis de la subtilina y de la nisina. Por lo tanto, el prepéptido se modifica en un complejo de modificación localizado en la membrana (lantionina sintetasa) que consiste en las proteínas SpaB/SpaC y NisB/NisC intracelulares, respectivamente. De acuerdo con el modelo, estas proteínas también están asociadas con el transportador SpaT y NisT, respectivamente.

Como en cualquier lantibiótico, la molécula de presubtilina o prenisina consta de un segmento líder y un segmento

25 maduro, y se piensa que el segmento líder desempeña diversas funciones en la ruta biosintética. Se piensa que no es sólo una secuencia señal de translocación, sino que proporciona señales de reconocimiento para las enzimas de modificación y para suprimir la actividad antimicrobiana hasta que el péptido maduro se libere de la célula. Como también suponen Qiao y Saris, (Fems Microbiol. Let. 144:89-93 (1996), el prepéptido modificado es, en el caso de algunos lantibióticos, escindido proteolíticamente después de su transporte a través de la membrana celular, pero en el caso de otros lantibióticos la escisión del líder a partir del péptido modificado se produce dentro de la célula antes de la secreción. En el caso de la nisina, la escisión la realiza NisP, mientras que en el caso de la subtilina no se ha encontrado ninguna proteasa específica dentro de la estructura de tipo operón. Sin embargo, B. subtilis es rica en proteasas extracelulares y posiblemente la subtilisina, que también reconoce la prolina en la posición-2, escindiría la presubtilina modificada.

35 Recientemente se han caracterizado los grupos génicos que flanquean los genes estructurales de diversos lantibióticos lineales (tipo A), (para una revisión véase Siezen et al., Antonie van Leeuwenhoek 69:171-184, 1996). Los representantes mejor estudiados son los de la nisina (nis), subtilina (spa), epidermina (epi), Pep5 (pep), citolisina (cyl), lactocina S (las) y lacticina 481 (lct). La comparación de los grupos génicos de lantibióticos demuestra que contienen genes conservados que probablemente codifican funciones similares.

Los grupos nis, spa, epi y pep contienen genes lanB y lanC que se supone que codifican dos tipos de enzimas que se han implicado en las reacciones de modificación características de todos los lantibióticos, es decir, deshidratación y formación de anillos tio-éter. Los grupos génicos cyl, las e Ict no tienen homología con el gen lanB, pero contienen

45 un gen lanM mucho más grande que es el homólogo del gen lanC. La mayoría de los grupos génicos de lantibióticos contienen un gen lanP que codifica una serina proteasa que está supuestamente implicada en el procesamiento proteolítico de los prelantibióticos. Todos los grupos contienen un gen lanT que codifica un transportador de tipo casete de unión a ATP (ABC, ATP Binding Cassette) que abarca la membrana plasmática de una célula y que probablemente está implicado en la exportación de (precursores de) los lantibióticos de la célula. Los genes lanE, lanF y lanG en los grupos nis, spa y epi codifican otro sistema de transporte que está posiblemente implicado en la auto-protección. En los grupos génicos de nisina y subtilina se han localizado dos genes en tándem, lanR y lanK, que codifican un sistema regulador de dos componentes.

Finalmente, se han encontrado genes no homólogos en algunos grupos génicos de lantibióticos. Los genes

55 nisL y spaI codifican lipoproteínas que están implicadas en inmunidad, el gen pepL codifica una proteína de inmunidad localizada en la membrana y epiD codifica una enzima implicada en una modificación postraduccional encontrada solamente en el extremo C de epidermina. Diversos genes de función desconocida también se encuentran en el grupo génico lan. Comúnmente, un organismo hospedador o una célula hospedadora que lleva uno

o más de dichos genes (en este caso, por ejemplo, lanT, lanI, lanA, lanP, lanB y lanC) en dicho grupo se identifican con una anotación abreviada tal como lanTIAPBC. Los genes anteriormente identificados son claramente diferentes de los genes que codifican los aparatos de secreción de las lactococinas no lantibióticas que están compuestas por dos proteínas de membrana LcnC y LcnD, como se describe, por ejemplo, en Franke et al., J. Biol. Chem. 274:84848490, (1999).

65 Se ha configurado una base de datos para todos los supuestos productos génicos de los grupos génicos de lantibióticos de tipo A. La base de datos busca alineamientos de secuencias múltiples y predicción de estructuras secundarias que se han usado para identificar elementos de secuencias conservados en los productos génicos LanB, LanC, LanE, LanF, LanG, LanK, LanP, LanM, LanR y LanT que pueden ser esenciales para la estructura y función (Siezen et al., citado anteriormente). Esta base de datos permite realizar una exploración rápida de secuencias recientemente determinadas en grupos génicos de lantibióticos.

5 Sin embargo, a pesar de todo el conocimiento reciente citado anteriormente, obtenido en el campo, han sido escasos, sino más bien infructuosos, los intentos para diseñar nuevos péptidos similares a lantibióticos que comprendan puentes tioéter sintetizados de origen no natural. En el documento US 5.861.275, se han producido quimeras de nisina-subtilina en la bacteria Bacillus subtilis Gram-positiva, que sin embargo, no comprenden puentes tioéter distintos de los que se producen naturalmente en nisina o subtilina. En una solicitud diferente (US 2002/0019518) se usó Bacillus subtilis para producir un polipéptido quimérico que comprendía un péptido lantibiótico y un segmento líder de subtilina, un lanticuerpo, que permanecía asociado dentro de la pared celular.

Bierbaum et al. Appl. Env. Microbiol. 62:385-392, 1996, han modificado por ingeniería genética un nuevo puente

15 tioéter en el lantibiótico Pep5 modificando la bacteria Gram-positiva Staphylococcus epidermis 5 empobreciendo al organismo huésped del grupo génico pepTIAPBC y reemplazándolo con un grupo génico pepIAPBC, en el que pepA se reemplazaba o no con genes estructurales mutados que codificaban un péptido Pep 5 en el que se sustituyeron los aminoácidos; se generaron genes que codificaban péptidos con sustituciones C27A (cisteína por alanina en la posición 27), C33A, A19C, Dhb16A, Dhb20A, K18Dha. Solamente la sustitución A19C dio como resultado la nueva formación de un nuevo anillo tioéter. El clon correspondiente a la sustitución A19C produjo una cantidad bastante pequeña de un péptido que solo mostró poca actividad. Se pensó que una exposición prolongada del péptido a proteasa intracelular de la célula transformada productora fue la causa de este resultado decepcionante.

25 La sustitución K18Dha en Pep 5 dio como resultado un clon que produjo serina incompletamente deshidratada en la posición 18. Kuipers et al., (J. Biol. Chem. 267:24340-24346, 1992) modificaron por ingeniería genética un nuevo resto Dhb en nisina Z sustituyendo M17Q/G18T en dicho lantibiótico, pero también se obtuvo sólo deshidratación incompleta de la treonina resultante y ninguna formación de anillo adicional. La deshidratación incompleta se piensa generalmente que es un resultado de la especificidad del sustrato cuestionable de la enzima deshidratante LanB en la célula transformada.

En resumidas cuentas, en gran medida aún no se ha conseguido ningún éxito proporcionando nuevos puentes tioéter para lantibióticos en organismos Gram-positivos, conduciendo sólo a la formación de puentes tioéter modificados genéticamente que se ha proporcionado para polipéptidos de descendientes no lantibióticos o por

35 organismos distintos de bacterias Gram-positivas.

Paul, Leena K et al (FEMS Microbiol. Lett 176 :45-50, 1999) estudiaron recientemente el péptido líder subtilina como una señal de translocación en la bacteria E. coli Gram-negativa, por defecto desprovista de un sistema transportador de lantibiótico específico, y proporcionaron una proteína de fusión que comprendía el péptido líder subtilina y parte de la subtilina madura unida a la fosfatasa alcalina (AP, Alkaline Phosphatase) de E. coli para estudiar dicha translocación posible. Aunque la proteína de fusión se translocó al lado periplásmico de la membrana citoplasmática, permaneció asociada a la membrana. En un trabajo anterior, (Izaguirre & Hansen, Appl. Environ. Microbiol 63:39653971, 1997) se expresó la misma proteína de fusión en la bacteria Bacillus subtilis Gram-positiva, donde se escindió de dicha membrana después de la translocación satisfactoria, pero no hubo deshidratación de serinas o treoninas en 45 el polipéptido AP, y mucho menos se observó la formación de puentes tioéter. Novak J et al., ASM general meeting

96:217 (1999), proporcionaron recientemente una célula hospedadora de E. coli con una ORF (ORF1) que codificaba un transportador ABC de 341 aminoácidos, que se pensaba que estaba implicado en la translocación del lantibiótico mutacina II en Streptococcus mutans. Sin embargo, en E. coli no se produjo ningún producto génico intacto de dicha ORF1, mientras que se observó una proteína truncada de identidad o funcionalidad desconocida.

Con objeto de modificar genéticamente proteínas de lantibióticos (para una amplia revisión, véase Kuipers et al., Antonie van Leeuwenhoek 69:161-170, 1996) o con objeto de modificar genéticamente nuevos (poli)péptidos recién diseñados con modificaciones postraduccionales de tipo lantibiótico, por ejemplo para uso farmacéutico, recientemente se ha prestado mucha atención (véase, por ejemplo Entian & de Vos, Antoni van Leeuwenhoek

55 69:109-117, 1996; Siegers et al., J. Biol. Chem. 271:1294-12301, 1996; Kiesau et al., J. Bacter. 179:1475-1481, 1997) a entender la función del complejo LanB, LanC (o LanM) y LanT, las enzimas que se piensa que están implicadas (en ese orden) en la deshidratación, formación de anillos tioéter y transporte del lantibiótico fuera de la célula.

La presente invención muestra que el péptido no modificado, que se acopla a su péptido líder, puede transportarse fuera de la célula sin modificación anterior, y que cuando LanB y LanC (o LanM), actúan del todo, pueden actuar no dentro, sino también fuera de la célula (véase también Fig. 4).

Donde anteriormente se pensaba normalmente que LanB y LanC actuaban en concierto para modificar el péptido

65 sólo antes de que se translocase, en el presente documento se proporciona adicionalmente que después del transporte, el péptido no modificado extracelularmente como tal puede experimentar su modificación postraduccional específica conduciendo a la deshidratación y a la formación de puentes tioéter, llevando la función de la proteína transportadora a la fase central para modificar un (poli)péptido de tipo lantibiótico, siendo esto un requisito previo para presentar el péptido no modificado a la maquinaria de modificación.

5 Por tanto, la invención proporciona la comprensión de que la deshidratación de una serina o una treonina de un (poli)péptido y la posterior formación de puentes tioéter puede producirse satisfactoriamente cuando un pre(poli)péptido se ha transportado fuera de la célula hospedadora donde se ha producido por traducción, preferentemente por una proteína transportadora, tal como un transportador ABC, preferentemente correspondiendo, al menos funcionalmente, a un transportador comúnmente identificable como LanT. Después, la deshidratación (y opcionalmente la formación de puentes tioéter) se cataliza solo enzimáticamente por una enzima o enzimas que corresponden al menos funcionalmente a LanB y/o LanC. Dicho transporte transporta el (poli)péptido a modificar través de la membrana de la célula hospedadora cuando, durante su funcionamiento, se coloca cerca de LanB localizado extracelularmente para la deshidratación.

15 La invención proporciona un método para producir, en una célula hospedadora, un polipéptido de origen bacteriano no Gram-positivo, que contiene un puente tioéter, comprendiendo dicho método:

a) seleccionar una célula hospedadora que tenga una molécula de ácido nucleico que comprenda:

-

un primer fragmento de ácido nucleico que codifique un péptido líder;

-

un segundo fragmento de ácido nucleico que codifique un polipéptido deseado que comprenda una secuencia seleccionada del grupo de secuencias que consiste en Ser-Xaan-Cys y Thr-Xaan-Cys, en la que Xaa es cualquier aminoácido y en la que n es 1-13, y donde el polipéptido es de origen bacteriano no Gram-positivo;

-

en la que el primer y segundo fragmento de ácido nucleico estén dentro de la misma fase de lectura abierta 25 que la molécula de ácido nucleico; y -en la que el péptido líder sea funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico;

b) seleccionar la célula hospedadora para detectar la presencia de la proteína transportadora LanT o un equivalente funcional de la misma que tenga la actividad LanT; c) traducir la molécula de ácido nucleico, produciendo de este modo el péptido líder y el polipéptido que comprende la secuencia seleccionada del grupo de secuencias que consisten en Ser-Xaan-Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; y d) recoger el polipéptido que contiene el puente tioéter de un medio de la célula hospedadora.

35 En una realización adicional preferida, la invención proporciona un método de acuerdo con la invención que comprende adicionalmente recoger dicho (poli)péptido deseado después de detectar la presencia de dicho péptido líder en el medio de cultivo o sobrenadante de dicha célula (véase también Fig. 5). Para detectar dicha presencia, se prefiere que dicho medio solo contenga escasos nutrientes, es decir, un medio denominado mínimo. Además, se prefiere que dicha presencia se detecte recogiendo el sobrenadante aspirando y dispensando el sobrenadante dentro y fuera de una punta de pipeta (u otro dispositivo de recogida) que contenga un lecho microvolumétrico de medios de cromatografía por afinidad fijado en el extremo de la punta que está preferentemente sin volumen muerto. En el presente documento a este procedimiento se le denomina “ziptipping” (pipeteado con ziptip) y permite, tras elución posterior, la presentación relativamente pura del (poli)péptido deseado para análisis posterior.

45 Preferentemente usando la combinación de cultivo en medio mínimo y ziptipping el sobrenadante de este cultivo, pueden obtenerse muestras de suficiente pureza que son muy adecuadas para la detección o análisis por MALDI-TOFMS de alta resolución. Esto permite medir más significativamente el péptido líder y por tanto la predicción del contenido del (poli)péptido deseado. Por tanto, la detección de dicho péptido líder puede usarse para averiguar la exportación del (poli)péptido acoplado a este líder lantibiótico, especialmente en aquellos casos en las que la peptidasa líder actúa extracelularmente.

En una realización adicional preferida, la invención proporciona un método en el que la célula hospedadora productora del (poli)péptido deseado está esencialmente desprovista de actividad peptidasa líder (LanP),

55 permitiendo por tanto la producción y el recogida extracelular -usando antibióticos anti-líder -del (poli)péptido deseado que está aún esencialmente acoplado a su péptido líder. Además, de esta manera, se reducen posibles efectos tóxicos intracelulares del (poli)péptido deseado provisto de puentes tioéter. Por supuesto también es suficiente diseñar un péptido líder que no pueda escindir la peptidasa líder de la célula hospedadora usada. En ambos casos, el (poli)péptido deseado puede obtenerse posteriormente libre del péptido líder, por ejemplo, por escisión proteolítica específica, usando LanP añadida, o mediante cualquier proteasa adecuada capaz de escindir el péptido líder del (poli)péptido deseado. Además, en el presente documento se ha previsto que en un (poli)péptido deseado, un serina o más serinas, que están localizadas en el extremo N de cisteínas se deshidraten y acoplen a más cisteínas localizadas en el extremo C. Como también se ilustra en el presente documento en la descripción detallada, una secuencia (poli)peptídica con una serina y una cisteína “S – C” contiene (preferentemente después de

65 la formación de puentes tioéter) alaninas en dichas posiciones de la serina y cisteína: “A – A”. Estas alaninas están acopladas por -además de la estructura peptídica –un puente tioéter.

Generalmente, en el presente documento se proporciona un método que permite un alto nivel de detección para medir niveles de (poli)péptidos (lantibióticos) directamente del sobrenadante de cultivo, considerando que la proporción deseada del péptido líder frente al (poli)péptido es esencialmente de 1:1. Dicha orientación permite métodos de cultivo eficaces para producir el polipéptido deseado y permite determinar momentos óptimos o

5 apropiados a los que puede recogerse dicho cultivo.

En una realización preferida, la invención proporciona un método de acuerdo con la invención, y un (poli)péptido de acuerdo con la invención en el que dicho (poli)péptido deseado se selecciona en el grupo de hormonas peptídicas o fragmentos de estas hormonas o análogos de estas hormonas que se originan de hormonas hipofisiarias y/o peptídicas con acciones similares, tales como, vasopresina, terlipresina, desmopresina, cispresina, oxitocina, hormona adrenocorticotrópica y hormona de crecimiento humano.

En otra forma realización preferida, la invención proporciona un método de acuerdo con la invención, y un (poli)péptido de acuerdo con la invención en el que dicho (poli)péptido deseado se selecciona del grupo de

15 hormonas peptídicas o fragmentos de estas hormonas o análogos de estas hormonas que se originan de hormonas hipotalámicas y/o peptídicas con acciones similares tales como gonadoliberina II, hormona liberadora de hormona luteinizante, leuprolida y otros análogos sintéticos de LHRH tales como gonadorelina, goserelina, buserelina, leuprorelina, nafarelina, triptorelina y cetrorelix, somatostatina, análogos de somatostatina, tales como octreótido, somatostatina, péptido inhibidor de corticotropina, factor liberador de corticotropina, urocortina, urotensina II y factor liberador de hormona de crecimiento.

En otra realización preferida, la invención proporciona un método de acuerdo con la invención, y un (poli)péptido de acuerdo con la invención en el que dicho (poli)péptido deseado se selecciona en el grupo de hormonas peptídicas o fragmentos de estas hormonas o análogos de estas hormonas que se originan de hormonas peptídicas

25 adrenocorticales, méduloadrenales, renales y cardiacas y/o peptídicas con acciones similares tales como adrenomedulina, angiotensina I, factor natriurético auricular, bradiquinina, péptido natriurético cerebral, péptido natriurético de tipo C y péptido vasonatrina.

En otra realización preferida, la invención proporciona un método de acuerdo con la invención, y un (poli)péptido de acuerdo con la invención en el que dicho (poli)péptido deseado se selecciona del grupo de hormonas peptídicas o fragmentos de estas hormonas o análogos de estas hormonas que se originan de otros órganos endocrinos/ exocrinos tales como el páncreas, hormona tiroidea y paratiroidea y/o peptídicas con acciones similares tales como calcitonina, osteocalcina, glucagón, insulina, factor de crecimiento I o II similar a insulina, parathormona y colecistoquinina.

35 En otra realización preferida, la invención proporciona un método de acuerdo con la invención, y un (poli)péptido de acuerdo con la invención en el que dicho (poli)péptido deseado se selecciona del grupo de hormonas peptídicas o fragmentos de estas hormonas o análogos (sintéticos) de estas hormonas con actividad (de tipo) antibiótica y/u hormonas peptídicas con acciones similares, tales como dermaseptina, defensina I, péptido similar a bombinina, histatina-5, indolicidina, magainina-1 y ceratotoxina A.

En otra realización preferida, la invención proporciona un método de acuerdo con la invención y un (poli)péptido de acuerdo con la invención en el que dicho (poli)péptido deseado se selecciona del grupo de péptidos o fragmentos biológicos activos de estos péptidos y/u hormonas o análogos de estos péptidos y/o péptidos con acciones similares

45 tales como exendina-3, secretina, polipéptido pancreático humano, péptido YY, polipéptido inhibidor gástrico, gastrina I grande, pentagastrina, péptido liberador de gastrina, motilina, neuropéptido Y, galanina, alfa-neuroquinina, deltorfina, alfa-endorfina, beta-endorfina, leu-encefalina, met-encefalina, alatostatina I, anthopleurina-A, péptido antiinflamatorio 1, péptido inductor del sueño delta, alfa-dendrotoxina, eledoisina, equistatina, péptido cardioactivo pequeño A o B, cerebelina, caribdotoxina, conopresina G, conotoxina El, corazonina, péptido encefalitogénico alérgico experimental, péptido complementario de la encefalomielitis autoinmune experimental, ácido tocinoico/ácido presinoico, factor ácido de crecimiento de fibroblastos derivado de cerebro (1-11), factor ácido de crecimiento de fibroblastos derivado de cerebro (102-111), factor básico de crecimiento de fibroblastos derivado del cerebro (1-24), péptido inhibidor de unión a fibrinógeno, péptido inhibidor del factor de crecimiento de fibroblastos y factor alfa de crecimiento transformante.

55 En otra realización preferida, la invención proporciona un método de acuerdo con la invención, y un (poli)péptido de acuerdo con la invención en el que dicho (poli)péptido deseado se selecciona del grupo de péptidos o fragmentos biológicos activos de estos péptidos y/u hormonas o análogos de estos péptidos y/o péptidos con acciones similares tales como guanilina, helospectina I, fragmento antigénico de la superficie del virus de la hepatitis B, molécula de adhesión intercelular, taquiplesina I, fragmento peptídico antigénico (gp120), fragmento I peptídico antigénico (gp 41) del VIH, péptido antigénico 5 del VIH, inhibidores de proteasa del VIH, IGF II 69-84, fragmento 8 de interleucina, fragmento 2 de interleucina (60-70), leucoquinina I, leucopiroquinina, mastoparán, hormona concentradora de melanina, melitina y péptidos relacionados con el oncogén ras.

65 Considerando que la formación de lantionina entre, por ejemplo, deshidrobutirina y cisteína es energéticamente posible a temperatura ambiente y que también puede producirse espontáneamente, el (poli)péptido transportado puede formar puentes tioéter espontáneamente o cuando se coloca en proximidad funcional a LanC localizado extracelular para la formación de puentes tioéter inducida enzimáticamente. Como alternativa, dicho transportador transporta el polipéptido a modificar a través de la membrana de la célula huésped cuando se coloca en proximidad funcional a LanM localizado extracelular para la deshidratación de LanM y posterior formación de puentes tioéter.

5 Con este conocimiento, la invención proporciona un método mediante el cual pueden beneficiarse varios campos. En resumen, la invención proporciona el uso de exportadores lantibióticos (LanT) para exportar péptidos o proteínas que opcionalmente pueden haberse transformado por la enzima (o enzimas) lantibiótica, en particular permitiendo la formación extracelular de lantioninas y otros anillos. Los aminoácidos pueden formar secuencias cortas (péptidos) y secuencias largas (proteínas). Los péptidos y proteínas [en el presente documento denominados también (poli)péptidos] son clases importantes de biomoléculas, por ejemplo, tanto para la nutrición, como para el control de plagas y para luchar contra enfermedades. Su importancia se ilustra mediante la cantidad y serie de terapias basadas en los recientemente creados por las industrias bioquímicas y farmacéuticas. También hay una gran cantidad de productos farmacéuticos basados en proteínas y péptidos y también debe entenderse que el uso de

15 compuestos farmacéuticos terapéuticos no está limitado a seres humanos sino que también se amplia a animales, plantas u otros biosistemas. Sin embargo, la fabricación de muchos actuales y posibles compuestos farmacéuticos proteicos o péptidos tiene limitaciones: en particular muchos se preparan en células vivas (in vivo), pero estas células deben romperse o someterse a lisis (destruirse), y su contenido debe extraerse, separarse y purificarse, para proporcionar una cantidad determinada de péptido o de proteína. Este es un proceso complejo, y además la cantidad de cualquier péptido o proteína deseado en cualquier célula en cualquier momento está limitada.

La presente invención evita este problema introduciendo en las células vivas un factor que permite a las células transportar continuamente proteínas o péptidos y exportarlos a través de la pared celular, de tal manera que el producto producido intercelularmente pueda recogerse extracelularmente y las células puedan seguir viviendo y 25 produciendo materiales. Es obvio que esto permite una producción a una velocidad más alta y sustancialmente más fácil de los productos deseados. Lo que ahora se sabe es que dicho transportador LanT o equivalente funcional del mismo actúa sobre el (poli)péptido no modificado al cual está aún unido el líder, un campo de este tipo se refiere a la expresión y producción de (poli)péptidos recombinantes de origen no bacteriano y se refiere a la expresión y/o producción de un (poli)péptido de origen eucariota (de origen vegetal, animal o fúngico) o también viral. Actualmente dichos péptidos se producen ampliamente por medios recombinantes para su uso en la producción de productos farmacéuticos, por ejemplo, como compuestos activos tales como una hormona (poli)peptídica, o una citocina, o un fragmento de anticuerpo, o un agente biopesticida, o como un antígeno para una vacuna o composición inmunogénica. Sorprendentemente, ahora es posible el uso de un sistema transportador de tipo lantibiótico para exportar péptidos de origen eucariota o viral y no sólo de origen bacteriano (procariota). En una primera realización, 35 la invención proporciona un método que permite la recogida extracelular de un (poli)péptido deseado -que puede estar fuera del campo de los lantibióticos bacterianos incluso ser de origen eucariota o viral -producido por una célula hospedadora recombinante, comprendiendo dicho método las etapas de: a) seleccionar una célula hospedadora recombinante que comprenda, o este dotada de, un primer ácido nucleico recombinante que tiene un primer fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido líder y un segundo fragmento de ácido nucleico que codifique dicho (poli)péptido deseado (en la Tabla 1 se proporcionan ejemplos útiles de los mismos), mediante el cual dicho primer y segundo fragmento se encuentran dentro de la misma fase de lectura abierta de dicho primer ácido nucleico y dicho péptido líder es al menos funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado con el péptido de un lantibiótico (en la Tabla 2 se proporcionan ejemplos útiles de dicho péptido líder) y seleccionar dicha célula hospedadora con respecto a la presencia de una proteína transportadora de lantibiótico normalmente

45 conocida como LanT (pudiendo ser dicha célula hospedadora un procariota Gram-positivo o Gram-negativo o un eucariota dotado con dicho transportador) y permitir la traducción de dicho primer ácido nucleico. Como se dice, se prefiere que dicha célula esté esencialmente desprovista de actividad peptidasa líder, o comprenda peptidasa líder que no pueda escindir el péptido líder específico usado. Dicha célula hospedadora se obtiene, por ejemplo, al menos funcionalmente, delecionando el gen lan P.

En una realización preferida, la invención proporciona un método que permite la recogida extracelular de un (poli)péptido deseado que no ha sufrido modificación postraduccional intracelular que comprende la deshidratación de una serina o una treonina y/o la formación de puentes tioéter. En la descripción detallada del presente documento, se demuestra, por ejemplo, cómo obtener extracelularmente el prepéptido de nisina (es decir, el líder de

55 nisina y nisina no modificada). El prepéptido de nisina se obtuvo usando una célula hospedadora seleccionada con respecto a la presencia de dos plásmidos, uno que codifica el prepéptido de nisina y uno que codifica NisT, mediante la cual dicha célula hospedadora se caracterizó adicionalmente por al menos la ausencia funcional de al menos uno de los otros productos génicos derivados del grupo génico Nis, tales como NisB, NisC o NisP.

Por tanto la invención proporciona un (poli)péptido que puede recogerse después de que el (poli)péptido se haya transportado desde la célula hospedadora productora, obviando la necesidad de someter a lisis o alterar las células hospedadoras para proceder a la recogida. Sin embargo, si se desea hacer eso, el polipéptido deseado puede por supuesto recogerse del interior de la célula también. Los cultivos de células dotados con dicha proteína transportadora ahora pueden mantenerse vivos y en uso, por lo cual el (poli)péptido deseado puede recogerse, por 65 ejemplo, del sobrenadante de células hospedadoras centrifugadas. No es necesario que de por sí estas células hospedadoras sean de origen Gram-positivo, pudiendo ahora proporcionarse procariotas Gram-negativos o incluso

eucariotas con dicho transportador colocado adecuadamente que potencie enormemente la gama de sistemas de expresión que puede usarse para expresar y producir un (poli)péptido deseado.

Adicionalmente la invención proporciona un método que permite la modificación extracelular de un (poli)péptido

5 deseado producido por una célula hospedadora recombinante, comprendiendo dicho método las etapas de: a) seleccionar una célula hospedadora recombinante que comprenda un primer ácido nucleico que comprenda un primer fragmento de ácido nucleico que codifique un péptido líder y un segundo fragmento de ácido nucleico que codifique dicho (poli)péptido deseado, mediante lo cual dicho primer y segundo fragmento están dentro de la misma fase de lectura abierta de dicho primer ácido nucleico y dicho péptido líder es al menos funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado con el prepéptido de un lantibiótico de tipo silvestre, y b) seleccionar dicha células hospedadora con respecto a la presencia de una proteína transportadora normalmente conocida como LanT

o un equivalente funcional de la misma y c) seleccionar dicha célula hospedadora con respecto a la presencia de una proteína esencialmente extracelular (tal como LanB, LanC o LanM) capaz de proporcionar modificación postraduccional, y d) permitir la traducción de dicho primer ácido nucleico. En una realización preferida, la invención

15 proporciona un método que permite la modificación extracelular de un (poli)péptido deseado que no ha sufrido modificación postraduccional intracelular que comprende la deshidratación de una serina o de una treonina y/o la formación de puentes tioéter. Se prefiere que dicha enzima esencialmente extracelular sea capaz de deshidratar una serina o una treonina, o sea capaz de proporcionar la formación de puentes tioéter. En el presente documento con la invención se proporciona un método para la modificación de (poli)péptidos no lantibióticos de tipo lantibiótico, sorprendentemente incluso cuando dicho (poli)péptido es de origen esencialmente eucariota o viral. Esto resulta ser muy útil para alterar diversas características de dichos productos, especialmente relacionadas, por ejemplo, con la estabilidad o perfiles farmacológicos de (poli)péptidos útiles, tales como los que pueden seleccionarse de la Tabla 1. Por supuesto es útil usar un péptido como el seleccionado de la Tabla 2 o equivalentes funcionales de los mismos.

25 Adicionalmente, la invención proporciona un método que permite la modificación extracelular de un (poli)péptido deseado producido por una célula hospedadora recombinante, en el que dicha modificación comprende la formación de puentes tioéter. Preferentemente, la localización de serinas, treoninas o cisteínas en el (poli)péptido deseado se selecciona de tal manera que la formación del anillo tioéter por el sistema enzimático seleccionado se realiza naturalmente. Por ejemplo, la deshidratación de serina y treonina seguido de la formación de anillos tioéter por acoplamiento a cisteína se realiza preferentemente de la siguiente manera. En el caso de enzimas lantibióticas que pertenecen a los lantibióticos denominados de tipo B, la formación de anillos se produce a partir de serinas/treoninas deshidratadas a más cisteínas localizadas en el extremo C o en el extremo N. En el caso de enzimas lantibióticas que pertenecen a los lantibióticos denominados de tipo A la formación de anillos solo se produce a partir de serinas/treoninas deshidratadas a más cisteínas localizadas en el extremo C terminal. La conversión por enzimas

35 que pertenecen a lantibióticos de tipo A se produce a tiempo de dirección N a C terminal de serinas/treoninas deshidratadas a la cisteína más cercana localizada en el extremo C. En el caso de enzimas pertenecientes a lantibióticos de tipo A, las lantioninas se forman a una distancia preferencial de uno a cuatro aminoácidos a cisteínas disponibles. Se prefiere más que haya de 2 a 3 aminoácidos entre una serina/treonina deshidratada en un lado y una cisteína en el otro lado. La distancia óptima es de dos aminoácidos. A partir de la Tabla 1 pueden seleccionarse péptidos con las distancias preferidas anteriores para la formación óptima de puentes tioéter. A distancias entre cuatro y trece aminoácidos la formación de lantionina puede producirse pero resulta ser menos eficaz. A estas distancias también se produce la deshidratación de serinas y treoninas sin formación posterior de lantionina después de la ausencia de deshidratación de serina/treonina. Se prefiere tener regiones flanqueantes de serinas y treoninas que permitan la actividad de la enzima deshidratante. Para ayudar a conseguir esto, se prefiere que al menos los

45 seis a ocho aminoácidos (tres a cuatro a cada lado) que rodean las serinas/treoninas deshidratadas sean principalmente hidrófobos. En cada una de estas posiciones en el 40-80 % de los casos el aminoácido es preferentemente hidrófobo, en el 20-40 % hidrófilo, de los cuales en el 5-15 % están cargados positivamente. Se prefiere que apenas se produzcan aminoácidos cargados negativamente. La composición de las regiones flanqueantes en el (poli)péptido deseado preferentemente difiere de la de la serina y treonina en los péptidos líder de tipo lantibiótico. En los péptidos líder las serinas y treoninas se producen pero nunca están deshidratadas, mientras que no se producen cisteínas. Las seis a ocho posiciones más próximas a las serinas/treoninas líder contienen menos aminoácidos hidrófobos y tienen aminoácidos más negativamente cargados que en las posiciones alrededor del propéptido de serina/treonina; por posición en solo el 20-40 % de los casos, el aminoácido es hidrófobo y en aproximadamente el 20 % de los casos se prefiere un aminoácido cargado negativamente.

55 Con respecto al sitio de escisión peptidasa existen al menos dos tipos de péptidos líder a partir de los cuales puede obtenerse orientación para diseñar mejor péptidos o proteínas escindibles. Una clase necesita la serina proteasa de tipo subtilina LanP para la escisión, que se produce después de Pro-Gln, Pro-Arg, Ala-Asp, Ala-Glu. En el caso de nisina, parece ser necesario un resto cargado positivamente en la posición -1 y un resto hidrófobo en la posición -4 para la interacción con NisP. Esta serina proteasa de tipo subtilina LanP actúa en los prepéptidos de, por ejemplo, Pep5, Epilancina K7, Nisina A, Nisina-Z, Epidermina, Gallidermina.

En las otras clases los péptidos líder se escinden después de las secuencias Gly-Gly, Gly-Ala o Gly-Ser. Lo último se mantiene para muchos otros péptidos líder de bacteriocina no lantibióticos. Las proteasas de tipo subtilina no son 65 conocidas por escindir estas secuencias, por tanto un tipo diferente de proteasa escinde estos péptidos líder. Se ha demostrado que en algunas bacteriocinas, tanto lantibióticos como no lantibióticos, esta segunda proteasa es un

dominio del sistema de transporte LanT. Este tipo de peptidasa líder actúa, por ejemplo, en prepéptidos de Lacticina481, Variacina, Mutacina-II, Estreptococina-A-FF22, Salivaricina-A y Sublancina.

Además existe un lantibiótico de dos componentes, Citolisina-LL / Citolisina LS, del cual se escinde cada 5 componente dos veces, una vez por la peptidasa de “tipo doble de glicina” y después de esto por la peptidasa de tipo subtilisina.

La invención proporciona adicionalmente un método para la modificación de un polipéptido deseado de acuerdo con la invención en el que dicha célula hospedadora es una procariota Gram-negativa o una eucariota. Además, la

10 invención proporciona un (poli)péptido modificado con un método de acuerdo con la invención.

La invención también proporciona una célula hospedadora, tal como un procariota Gram-negativo o un eucariota, proporcionada con un ácido nucleico recombinante que comprende un primer fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido líder y un segundo fragmento de ácido nucleico que codifica un (poli)péptido deseado, mediante

15 el cual dicho primer y segundo fragmento se encuentra dentro de la misma fase de lectura abierta de dicho primer ácido nucleico y dicho péptido líder es al menos funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado con el prepéptido de un lantibiótico. En una realización preferida, se proporciona una célula hospedadora de acuerdo con la invención en la que dicho (poli)péptido deseado es de origen esencialmente eucariota o viral, por ejemplo seleccionado de la Tabla 1 y/o en el que dicho péptido líder se selecciona de la Tabla 2.

20 Adicionalmente, la invención proporciona una célula hospedadora de acuerdo con la invención, proporcionada, dicha célula hospedadora con, o seleccionada para, la presencia de al menos una proteína LanT o equivalente funcional de la misma en el que dicha célula hospedadora se caracteriza adicionalmente por al menos la ausencia funcional de al menos uno de los otros productos génicos derivados del grupo génico Lan, tal como LanB, LanC, (o una parte

25 funcional de LanM) o LanP. En una realización preferida, dicha célula hospedadora comprende un procariota Gramnegativo o un eucariota.

Dicha célula hospedadora, como se proporciona en el presente documento, encuentra un uso específico en un método de producción de un (poli)péptido para la recogida o modificación, como se proporciona en el presente 30 documento anteriormente. Para los fines de recogida se prefiere especialmente que LanT esté presente pero que LanB y/o Lan C (o LanM), aunque preferentemente ambos, estén ausentes, al menos funcionalmente ausentes ya que obstaculizan la unión con, o interfieren con, el polipéptido que va a recogerse. Para los fines de modificación, se prefiere especialmente que LanT y una proteína esencialmente extracelular que permita la modificación extracelular, tal como LanB, Lan C o LanM, o en lugar de LanB, un fragmento LanM (preferentemente N-terminal) tenga función

35 LanB o en lugar de LanC, un fragmento LanM (preferentemente C-terminal) tenga una función LanC presente, mientras que un grupo del producto génico lantibiótico adicionalmente extendido o incluso completo no esté preferentemente al menos funcionalmente presente.

Otra realización de la invención es una célula hospedadora que se proporciona con genes que codifican LanB, o la

40 parte N-terminal equivalente de LanB, con o sin un gen que codifique LanT, que puede exportar prepéptidos lantibióticos deshidratados, que tienen mutaciones de tal manera que los fragmentos que se proporcionan con la deshidroalanina y/o deshidrobutirina puedan liberarse química o proteolíticamente. Dichos fragmentos pueden inhibidor una enzima, especialmente una proteasa, tal como cisteína proteasa o aspartil proteasa.

45 Además, la invención proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un primer fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido líder y un segundo fragmento de ácido nucleico que codifica un (poli)péptido deseado, mediante lo cual dicho primer y segundo fragmento se encuentran dentro de la misma fase de lectura abierta de dicho ácido nucleico y dicho péptido líder es al menos funcionalmente equivalente a un péptido líder Nterminal encontrado con el prepéptido de un lantibiótico, y en el que dicho (poli)péptido deseado es de origen

50 esencialmente eucariota o viral. Además, la invención proporciona una sustancia proteínica que comprende un polipéptido codificado por un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Dicha sustancia proteínica puede recogerse, o modificarse de acuerdo con un procedimiento como se proporciona en el presente documento. En el presente documento también se proporciona el uso de una célula hospedadora o un ácido nucleico o sustancia proteica de acuerdo con la invención para la producción de un (poli)péptido deseado, y su uso en la producción de

55 una composición farmacéutica. En particular, la invención proporciona un (poli)péptido de origen procariota Gramnegativo o eucariota (en la Tabla 1 pueden encontrarse ejemplos) en el que una serina o una treonina se ha deshidratado o que se ha proporcionado con un puente tioéter. La ventaja de dicho polipéptido, subyace, por ejemplo, en la creación de variantes de fármacos conocidos, basados en péptidos o en proteínas, en el que, por ejemplo, la dosis o frecuencia de administración puede reducirse, disminuyendo de esta manera el coste del

60 tratamiento, el tiempo del tratamiento y la incomodidad para el paciente; la creación de variantes de nuevos fármacos basados en proteínas o en péptidos donde el fármaco puede no haber sido eficaz o haberse admitido para su uso en una forma no estabilizada y la creación de nuevas entidades de por sí terapéuticas.

La invención se explica adicionalmente en la descripción detallada. 65

Leyenda de las figuras

Figura 1 estructura peptídica de nisina y subtilina madura

5 Figura 2 organización genómica de genes implicados en la biosíntesis de subtilina y nisina

Figura 3 modelo para la biosíntesis de nisina en el que la modificación se produce intracelularmente

Figura 4 modelo para la biosíntesis de nisina en el que la modificación se produce extracelularmente

10 El prepéptido nisina se exporta por NisT (“T”), se deshidrata por NisB (B) extracelular y se somete a cierre de anillo tioéter por NisC (C) extracelular. La peptidasa líder extracelular, NisP (P) se escinde del péptido líder. La nisina interacciona con una histidina quinasa NisK (K) unida a membrana que fosforila un regulador de respuesta NisR (R), que en su giro activa la transcripción de los genes nis (+, +). Las células productoras se protegen contra nisina mediante la acción

15 concertada del lipopéptido Nisl y el sistema transportador NisEFG.

Figura 5 Detección del péptido líder lantibiótico directamente del medio de cultivo por MALDI-TOFMS. Usando la combinación de cultivo en medio mínimo y ziptipping el sobrenadante de este cultivo, se obtuvieron

20 muestras de suficiente pureza para MALD-TOFMS a alta resolución. Esto permitió medir más significativamente el péptido líder nisina. Según lo que se sabe, esto nunca se ha publicado. La detección del péptido líder lantibiótico puede usarse por tanto para averiguar la exploración del (poli)péptido acoplado a este líder lantibiótico, es decir, en aquellos casos en los que la peptidasa líder actúa extracelularmente. Generalmente este método permite un alto nivel de detección para medir (poli)péptidos (lantibióticos) directamente del sobrenadante

25 de cultivo.

Figura 6 Transporte de prepéptido nisina no modificado mediante el transportador de nisina NisT. (Ejemplo 1)

30 Figura 7 Transporte mediante NisT de una variante de angiotensina 1-7 fusionada al extremo C del líder de nisina. (Ejemplo 2)

Figura 8 35 Transporte mediante NisT de una variante de vasopresina fusionada con al extremo C del líder de nisina. (Ejemplo 3)

Figura 9 Transporte y deshidratación por NisBT del prepéptido de nisina. (Ejemplo 4)

40 Figura 10AB Transporte, deshidratación y formación de anillo en el prepéptido de nisina por células de Lactococcus lactis que tienen el plásmido pNGnis-ABTC.

45 Figura 10A: sin inducción, Figura 10B: con inducción (Ejemplo 6)

Figura 11 Transporte mediante NisT del prepéptido de nisina no modificado, extendido en el extremo C con una variante de encefalina. (Ejemplo 13).

50 Se diluyeron cultivos de una noche de la bacteria Lactococcus lactis NZ9700, productora de nisina, que crecía en caldo M17 complementado con glucosa al 0,5 % a 1/100. A una densidad óptica de 660 nm igual a 0,4, las células se centrifugaron y el medio se sustituyó por medio mínimo (Jensen y Hammer, 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59: 4363-4366) que contenía 1/1000 de sobrenadante de Lactococcus lactis NZ9700 de una noche filtrado con poros de

55 0,4 mm. Después de incubación durante una noche el medio se sometió a ziptipping usando ziptips de C18 (Millipore). Como una matriz para el análisis MALDI-TOFMS se utilizó ácido ciano cinamínico.

La figura muestra un pico a 2349,6 correspondiente al péptido líder nisina (valor teórico de 2351,2). Dos subpicos, de 2372,5 y de 2388, correspondientes a aductos de sodio y potasio respectivamente. Un pico de 2482,2

60 corresponde al péptido líder nisina con la primera metionina aún unida (el valor teórico es idéntico: 2482,2). A una mayor masa los picos 3352,5, 3372,6 y 3390,1 corresponden a nisina, a un aducto de sodio y a un aducto de potasio respectivamente.

Descripción detallada

Las enzimas de lantibióticos son especiales. No hay fuerte homología, o ninguna en absoluto, con otras enzimas. Se muestran secuencias de ADN o de aminoácidos de muchas enzimas de lantibióticos, pero sus estructuras no se han 5 determinado. Los genes implicados en la biosíntesis, procesamiento y exportación de lantibióticos están presentes en un grupo lanA B C / M (D) P R K T F E G I. No hay orden uniforme u orientación de los genes en los diferentes grupos lo que indica que los reordenamientos se han producido en la evolución. Las lantioninas son los restos más típicos formados postraduccionalmente en antibióticos. Se forman en dos etapas. En primer lugar las serinas y treoninas del propéptido se deshidratan dando lugar a deshidroalaninas y deshidrobutirinas respectivamente. Se ha propuesto que LanB desempeña una función en la deshidratación, dado que tiene una escasa homología con IIvA, una treonina deshidratasa de E.coli. Además, se ha observado que la sobreexpresión de NisB aumenta la aparición de la deshidratación de serina 33 en nisina A, del 10 % en la situación normal hasta el 50 % en el caso de NisB sobreexpresada. La proteína LanB consta de aproximadamente de 1000 restos. LanB son proteínas asociadas a membrana. Se piensa que LanC es responsable de la adición posterior de grupos SH cisteína a los deshidro

15 aminoácidos, que da como resultado los anillos tioéter. En el caso de PepC, datos experimentales apoyan esta idea. Las proteínas LanC actualmente conocidas se componen de aproximadamente 400 restos. En los lantibióticos de tipo A la parte N-terminal de los restos de lantionina y metillantionina se forman por los restos de deshidroalanina o deshidrobutirina, mientras que la mitad C-terminal se forma por los restos de cisteína.

Las deshidroalaninas y deshidrobutirinas son esenciales en diversos (poli)péptidos para la actividad del (poli)péptido específico. Los restos deshidro son, por ejemplo, esenciales para la inhibición mediada por nisina del crecimiento de esporas bacterianas (Liu y Hansen 1996. Appl Environ. Microbiol. 59: 648-651), para un antagonista del receptor de neuroquinina (Lombardi et al 1998. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 8: 1153-1156), para la fenilalanina amonio ligasa (Schuster y Rétey 1995 PNAS 92: 8433-8437) para un inhibidor de tripeptidilpeptidasa II (Tomkinson

25 et al., 1994. Archives of Biochemistry and Biophysics 314: 276-279), para un péptido inhibidor de proteasa del VIH-1 (Siddiqui et al. 2001. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 38: 90-95), para la actividad de péptidos contra bacterias Gram-negativas (Ferrari et al 1996 2: 4-Journal of Antibiotics) y para la actividad de péptidos antifúngicos (Kulanthaivel et al WO 2000063240). Los (poli)péptidos que contienen restos deshidro pueden producirse por células que tienen LanT y LanB o LanT en la parte N-terminal de lanM que es equivalente a LanB. Las actividades anteriormente mencionadas pueden ser de importancia económica significativa. Por ejemplo la inhibición de la tripeptidil peptidasa II es de relevancia en la lucha contra la obesidad. Esto es obvio por el hecho de que la tripeptidil peptidasa II degrada el octapéptido colcistoquinina-8, un agente saciante endógeno.

La formación de lantionina entre deshidrobutirina y cisteína es energéticamente posible a temperatura ambiente y 35 puede también producirse espontáneamente.

La maduración y secreción del lantibiótico se piensa que se produce en el complejo multimérico lantionina sintetasa asociado a membrana que consta de las proteínas LanB, LanC y las moléculas transportadoras ABC LanT. Al menos dos moléculas de LanC y dos moléculas de LanT forman parte del complejo de modificación y transporte. Algunos lantibióticos no tienen el gen lanB, pero tienen un gen lanM mucho más grande, cuyo producto tiene cierta homología en el extremo C con el producto génico lanC. Dado que ningún homólogo de lanB está presente en grupos productores de LanM la parte N-terminal de la proteína LanM podría realizar la reacción de deshidratación típicamente realizada por LanB. La síntesis química de los lantibióticos es posible pero es extremadamente costosa y requiere mucho tiempo. Muchos lantibióticos mutantes que contienen sustituciones de aminoácidos se han

45 obtenido por modificación con ingeniería genética. Sin embargo, a pesar de muchos estudios, hasta ahora solo se ha obtenido en el lantibiótico Pep5 un anillo de lantionina en una nueva posición.

Como se ha dicho, los sistemas exportadores de lantibióticos, LanT, (cuyas secuencias ya se conocen) se piensa en general que están dedicados al transporte del lantibiótico completamente modificado. De hecho se ha comunicado que las dos enzimas implicadas en la formación de lantionina en nisina (NisB y NisC) se localizan intracelularmente en un complejo asociado a membrana NisBCT (Siegers et al., 1996). Dicha localización intracelular sugiere que los prepéptidos están deshidratados por LanB después de lo cual, se forman los anillos por LanC seguido de la exportación por LanT. Además, si las enzimas formadoras de anillos tioéter, NisB (responsables de la deshidratación, que es la primera etapa en la formación de anillos) o NisC (responsable de la formación de anillos

55 entre restos deshidro y cisteína) están inactivadas por deleción en fase de 61 aa o por inserción plasmídica, respectivamente, ya no se exporta ningún péptido. Esto último sugiere que la ausencia de metil(lantioninas) impide la exportación.

Sin embargo, sorprendentemente ahora se ha medido que el prepéptido, tal como el prepéptido nisina, puede transportarse a través del transportador de nisina. Este resultado se obtuvo usando una cepa con dos plásmidos, uno que codificaba el prepéptido nisina y uno que codificaba el transportador de nisina. No se observó producción de prepéptido en un experimento de control en el que se utilizó una cepa solo con el plásmido que codificaba el prepéptido. Algunos lantibióticos contienen serinas/treoninas deshidratadas que no participan en la formación de anillos tioéter. A partir de lo anterior, en combinación con la observación de que el péptido no modificado se exporta, 65 puede formularse la teoría de que la translocación del prepéptido sin anillos tioéter también es posible pero con restos deshidro. Se sabe que la segunda etapa en la formación de anillos de lantionina es menos difícil de realizar

dado que también puede producirse espontáneamente a temperatura ambiente. Por lo tanto, después de la producción de prepéptidos con restos deshidro pueden formarse anillos de lantionina extracelularmente.

Para impedir incompatibilidades celulares con (poli)péptidos recién formados que contienen tioéter y/o restos 5 deshidro, puede realizarse síntesis in vitro de (poli)péptidos con tioéter. Al revés, vesículas de membrana con LanB

o LanBC o LanBT o LanBCT o LanMT, obtenidas por células sometidas a prensa francesa, pueden mezclarse con un extracto celular, obtenido sometiendo a ultrasonidos un sedimento celular y centrifugando, con ATP y un sistema generador de ATP, con inhibidores de proteasa y con una fusión (poli)péptido-líder con serinas/treoninas y cisteínas en posiciones adecuadas. En el caso de vesículas que contienen LanC o LanCT péptidos con restos deshidro pueden cerrarse por LanC para formar enlaces tioéter estereoespecíficamente. Después de someter a agitación vorticial con un volumen de cloroformo y centrifugación el sobrenadante contiene el péptido de fusión con anillos tioéter y/o restos deshidro como se muestra por análisis Maldi TOF del sobrenadante sometido a ziptipping. La formación de anillos se deduce de la masa observada después de peroxidación dado que la peroxidación hace que se produzca a una adición de tres oxígenos a cisteínas libres, mientras que solo 1 o 2 átomos de oxígeno forman

15 puentes tioéter.

Para las actividades in vitro de LanB, LanC y lanM, en lugar de usar vesículas de membrana obtenidas mediante prensado con prensa francesa, también pueden reconstituirse enzimas de lantibióticos aisladas producidas por organismos bacterianos o eucariotas en vesículas de membrana o liposomas.

También puede usarse LanC (o LanM C-terminal) (que contiene vesículas o proteoliposomas) en ensayos in vitro para la generación de lantioninas estereoespecíficas en procedimientos químicos de formación de lantionina, que en ausencia de lanC producen diastereómeros (Galande y Spatola 2002. Letters in Peptide Science 8: 247-251).

25 El presente hallazgo proporciona la posibilidad de fabricar nuevos lantibióticos y por tanto estabilizar péptidos / proteínas mediante anillos tioéter, D-alaninas u otros restos formados por enzimas de lantibióticos. Antes de la formación de (metil)lantionina, típicamente la distancia de los restos deshidro a cisteínas es de 2-5 restos pero también son posibles distancias mucho más largas. Las (metil)lantioninas pueden formarse a partir de restos deshidro localizados más N-terminalmente o localizados más C-terminalmente. Además el sistema transportador de lantibióticos puede usarse para la exportación de otras proteínas insertando la secuencia que codifica el péptido líder delante de la secuencia de ADN de proteína.

También pueden obtenerse (poli)péptidos cortos con restos deshidro y/o anillos tioéter incorporándoles una secuencia de ADN lantibiótico. Por ejemplo en un péptido eucariota específico de 10 aminoácidos un anillo tioéter

35 puede modificarse con ingeniería genética de la siguiente manera. Basándose en un lantibiótico de 20 aminoácidos con un anillo tioéter entre la posición 13 y 16 puede diseñarse una secuencia de ADN que codifique los 10 primeros aminoácidos del lantibiótico seguido de los 10 aminoácidos del péptido eucariota con una serina en la posición 13 y una cisteína en la posición 16. Introduciendo genéticamente un sitio de escisión (químico) el péptido híbrido resultante, exportado en el medio, puede escindirse y el péptido eucariota con anillo tioéter se libera.

Se ha descrito que un (poli)péptido puede agregarse genéticamente detrás de un lantibiótico y exportarse (Hansen, US2002019518: Construction of a strain of bacillus subtilis 168 that displays the sublancin lantibiotic on the surface of the cell). Sin embargo también es posible agregar (poli)péptidos genéticamente detrás de una secuencia de lantibiótico y tener el (poli)péptido de fusión resultante sin modificación exportada por LanT, o exportada por LanBT

45 solo con deshidratación de serinas y treoninas en el lantibiótico y en el (poli)péptido agregado sin la formación de anillo o exportado por LanBTC/LanMT con deshidratación y formación de anillo tanto en el lantibiótico como en el (poli)péptido agregado.

También es posible generar un (poli)péptido que contenga lantionina y/o restos deshidro omitiendo un fragmento Cterminal de una secuencia de lantibiótico y añadiendo un fragmento más largo a la secuencia de lantibiótico restante. Por ejemplo la secuencia del lantibiótico nisina de 34 aminoácidos puede reemplazarse por los 30 primeros aminoácidos N-terminales y extenderse en el extremo C en 6 aminoácidos: KYSGFC. Después de la deshidratación y formación de anillo tioéter por células con NisBTC, y tratamiento extracelular con tripsina, se produce una variante de encefalina lantionina. En este caso el resto Ser33 de nisina forma parte de la molécula de encefalina recién

55 formada después de la deshidratación y formación de lantionina. La tripsina libera la encefalina por escisión detrás del resto de lisina que reemplaza la histidina en nisina. Se conocen variantes de encefalina lationina activas (Svenssen et al 2003. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 304: 827-832).

Ya se han previsto diversos usos. Por ejemplo, fármacos basados en péptidos/proteínas que se degradan rápidamente en el plasma sanguíneo pueden protegerse contra la proteólisis mediante anillos tioéter. Además, los nuevos lantibióticos pueden usarse como antibióticos especialmente contra bacterias Gram-positivas. Esto es útil dado que hay una creciente y propagada resistencia contra antibióticos clásicos. Además, los nuevos lantibióticos pueden usarse como aditivos (alimentarios) para impedir el crecimiento bacteriano y aumentar la vida útil de los productos (alimentarios). El dominio de la síntesis enzimática de anillos tioéter proporciona adicionalmente la 65 posibilidad de sintetizar una amplia diversidad de nuevos péptidos antimicrobianos, que ofrecen muchas posibilidades para evadir la resistencia. Los lantibióticos tienen diversas actividades antimicrobianas:

permeabilización de membranas, inhibición de síntesis de paredes celulares, modulación de actividades enzimáticas, inhibición del crecimiento de esporas. Los nuevos péptidos o proteínas de tipo lantibiótico son más estables (es decir, menos propensos a escisión proteolítica) y pueden tener actividad modulada o un espectro de actividad diferente. En el presente documento se proporciona una selección de dichos péptidos o proteínas en los

5 ejemplos que continuación se ofrecen. Pueden modificarse genéticamente deshidropéptidos que pueden usarse para bloquear la actividad enzimática, especialmente actividad proteasa.

EJEMPLO 1

El transportador NisT puede transportar el prepéptido nisina no modificado

Este ejemplo implica una cepa de Lactococcus lactis que carece del grupo génico de nisina cromosómico completo, pero produce simultáneamente el prepéptido NisT codificado por plásmido y NisA. NisA no modificado puede encontrarse en el sobrenadante de cultivo, lo que demuestra que NisT es eficiente para el transporte de prepéptidos

15 no modificados al exterior de la célula.

Materiales y métodos:

Usar para la expresión inducible de nisina de nisT en Lactococcus lactis un plásmido derivado de pNZ8048 (Kuipers et al. 1997. Tibtech. 15: 135-140). Amplificar el gen nisT usando los cebadores NisT.fw (5’-CGG TCT CCC ATG GAT GAA GTG AAA GAA TTC ACA TCA AAA C) y NisT.rev (5’-CGG TCT CTC TAG ATT ATT CAT CAT TAT CCT CAT ATT GCT CTG) con ADN cromosómico de NZ9700 (una cepa de L. lactis productora de nisina; Kuipers et al. 1997. Tibtech. 15: 135-140) como molde.

25 Usar como condiciones PCR: 5 min 94 ºC, 30 veces [30 s 94 ºC, 30 s 50 ºC, 3 min 72 ºC], 10 min 72 ºC. Purificar el producto PCR con el kit de aislamiento PCR de Roche. Digerir el vector de expresión con Ncol/Xbal y el fragmento PCR con Eco31l (subrayado en los cebadores, los extremos adhesivos que esto genera se indican en cursiva y son compatibles con Ncoly Xbal) y ligar posteriormente los fragmentos usando T4 ligasa (Roche). Denominar al plásmido resultante pNG-nisT. Este plásmido contiene un gen de resistencia a cloranfenicol (Cm) como marcador de selección.

Usar para la producción inducible de nisina del prepéptido NisA en L. lactis una variante de pNZ8048 que contenga un marcador de selección de resistencia a eritromicina (Em) en lugar de un marcador Cm. Amplificar el gen nisA usando los cebadores NisA.fw (5’-CGG TCT CTC ATG AGT ACA AAA GAT TTT AAC TTG GAT TTG G) y NisA.rev

35 (5’-TAT ATG GAT CCT TTG CTT ACG TGA ATA CTA CAA TGA CAA G) y ADN cromosómico de la cepa NZ9700 como molde en las mismas condiciones a las descritas anteriormente. Purificar el producto PCR con el kit de aislamiento PCR de Roche. Digerir el vector de expresión con Ncol/BamHI y el fragmento PCR con Eco31l y BamHI (subrayado en los cebadores, los extremos adhesivos que esto genera se indican en cursiva y son compatibles con Ncoly BamHI) y ligar posteriormente los fragmentos usando T4 ligasa (Roche). Denominar al plásmido resultante pNG-nisA.

Cultivar las cepas de L. lactis NZ9000 o PA1001 (un derivado de NZ9000 que carece de actividad AcmA para anular la lisis celular (Buist et al. 1995. J. Bacteriol. 177: 1554-1563) y que carece de HtrA para disminuir la actividad proteolítica extracelular (Poquet et al. 2000. Mol. Microbiol. 35: 1042-1051) con pNG-nisT (Cm) y pNG-nisA (Em) en 45 medio basado en M17 (Terzaghi y Sandine. 1975. Appl. Microbiol. 29: 807-813) a una DO600 de 0,4. Recoger las células por centrifugación y resuspender en el mismo volumen de Medio Mínimo (Jensen y Hammer, 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59: 4363-4366) e inducir para la expresión del prepéptido NisT y NisA por adición de nisina como se ha descrito anteriormente (Kuipers et al. 1997. Tibtech. 15: 135-140). Después de inducción durante una noche y posterior centrifugación, pipetear los sobrenadantes de cultivo hacia arriba y abajo en ziptips C18 (Millipore): dos veces con 10 !l de acetonitrilo al 50%, seguido de dos veces con 10 !l de agua desmineralizada, seguido de ocho veces con 10 !l de sobrenadante, seguido de lavado 2 veces con 10 !l de agua desmineralizada, seguido de elución usando 2 veces 10 !l de acetonitrilo al 50 % que contiene TFA al 0,1 %. Secar al vacío el eluyente final y conservar a -20 ºC hasta análisis por espectrometría de masas. Antes del analisis resuspender el material seco en 2,5 !l de acetonitrilo al 50 % que contiene TFA al 0,1 % y aplicar 1 !l a la diana. Después de secar, aplicar 1 !l de matriz

55 (ácido alfa-ciano-4-hidroxicinnámico 10 mg/ml completamente disuelto (calentando suavemente y sometiendo a agitación vorticial) en acetonitrilo al 50 % que contiene TFA al 0,1 %) a la diana. Usar los siguientes ajustes laser (modo lineal) MALDI-TOFMS: energía ordinaria 100 %, fina 50 %, fuente 20 KV, extra 19800, fuerza 15000, supresión 500, tiempo de impulso 40, tensión de pulso 2200, velocidad de muestreo 500 MHz, sensibilidad 50 mV, disparos 15.

Resultados

Análisis de los sobrenadantes de cultivo de los siguientes cultivos inducidos y análisis por MALDI-TOFMS:

65 NZ9000 (o PA1001) NZ9000[pNG-nisA] (o PA1001)[pNG-nisA])

NZ9000[pNG-nisA + pNG-nisT] o (PA1001[pNG-nisA + pNG-nisT])

No se observan picos en las muestras derivadas de los cultivos A y B. La medición en la muestra C con dos picos

5 principales: Figura 6. El primero próximo a o idéntico a 5832.8 Da correspondiente al prepéptido de nisina no modificado: (5831.8 más 1 protón). El segundo con aproximadamente una masa mayor de 130 Da que el primero, que correspondería al prepéptido de nisina con dos átomos de cinc (Bierbaum, G. 1999. Ed. J. W. Kelly. Amino acids, Peptides, Porphyrins, Alkaloids 4, 275-301. Elsevier. Comprehensive Natural Products Chemistry. Eds. D. Barton, K. Nakanishi & O. Meth-Cohn) o -más probablemente-al prepéptido de nisina con la metionina en posición 1 aún presente. Este resultado es coherente con el prepéptido de nisina no modificado que transporta el transportador de nisina NisT. Este resultado demuestra inequívocamente que NisT es suficiente para el transporte del prepéptido de nisina y que la modificación previa al transporte no es necesaria.

EJEMPLO 2

15 Transporte mediante NisT de un péptido de fusión del líder de nisina y una variante de angiotensina

Este ejemplo describe el transporte fuera de Lactococcus lactis mediante el transportador de nisina NisT de una variante de angiotensina1-7 que está precedida por el líder de nisina. Se muestra una vez más que el transportador de nisina no es específico para la nisina, pero que pueden transportarse muchos (poli)péptidos siempre que estén fusionados con el líder de nisina.

Materiales y métodos.

25 Como en el ejemplo 3, se obtiene la fusión genética precisa de un péptido eucariota, en este ejemplo angiotensina 17, delante del líder de nisina.

La obtención del gen de la variante de angiotensina 1-7 se realiza hibridando dos oligonucleótidos fosforilados: ang1: 5’ ACGCAATCGT-TCTTATATTTGTCCTTAAG 3’ y ang2: 5’ GATCCTTAAGGACAAATATAAGAACGATT 3’

El fragmento hibridado incluye un codón de terminación y tiene en su extremo 5’ el saliente ACGC y en el extremo 3’ un extremo adhesivo compatible con BamHI. Ligar el fragmento génico hibridado en pLP1 digerido por Eco31I y BamHI y denominar al plásmido resultante pLP1ang.

35 Inducir la cepa PA1001 portadora de pNGnisT (ejemplo 1) y pLP1ang para la expresión como se describe en el ejemplo 1. Realizar purificación del péptido segregado y realizar análisis por MALDI-TOFMS (modo lineal) esencialmente como se describe en el ejemplo 1.

Resultado

Figura 7: las muestras derivadas del sobrenadante sometido a ziptipping de PA1001 + pNGnisT + pLP1ang muestran un pico Maldi TOF correspondiente al líder de nisina fusionado a la variante de angiotensina 1-7. Este pico no aparece en muestras derivadas de células solo con pNGnisT o solo con pLPang1. Estos datos demuestran que NisT puede transportar el péptido de fusión angiotensina-líder fuera de la célula.

45 EJEMPLO 3

Transporte mediante NisT de un péptido de fusión del líder de nisina y una variante de vasopresina

Este ejemplo muestra la exportación fuera de Lactococcus lactis PA1001 mediante NisT de una fusión del líder de nisina ampliado en el extremo C con una variante de vasopresina. La vasopresina es una hormona antidiurética peptídica de 9 aminoácidos (aa). Tiene cisteínas en la posición 1 y 6: CYFQNCPRG que forman un enlace disulfuro interno. Este ejemplo implica una variante de vasopresina C1S. Este ejemplo implica fusión precisa de vasopresina modificada con serina (SerVaso) en el péptido líder NisA de nuevo por modificación genética.

55 Materiales y métodos

Para obtener una fusión exacta y en marco de SerVaso con el péptido líder NisA, convertir primero un vector de expresión pNZ8048 derivado del plásmido pNG-nisl-SC3, que contiene SC3 detrás del líder de nisina en un vector de secreción líder-péptido NisA general. Introducir sitios de restricción adecuados y eliminar las secuencias c-myc-SC3 por amplificación PCR de todo el plásmido usando los cebadores: pLP.1 (5’-CGG TCT CAG CGT GGT GAT GCA CCT GAA TC) y pLP.2 (5’-CCA CGCTGA GAC CGC AGC TGG GAT CCG GCT TGA AAC GTT CAA TTG AAA TGG). Cortar el producto PCR con Eco31I (secuencias subrayadas en los cebadores) dando como resultado extremos adhesivos (en cursiva en las secuencias de cebadores) que son compatibles para el autoligamiento del 65 plásmido. Después del autoligamiento, el plásmido resultante, pLP1, puede usarse para la fusión precisa de péptidos y proteínas después de la secuencia de aa GASPR del péptido líder NisA usando el sitio de restricción Eco31I. Los

fragmentos de ADN a insertar en esta posición deben contener un extremo adhesivo 5’-ACGC para permitir el ligamiento. En el extremo 3’ el fragmento de ADN debe contener un extremo adhesivo que sea compatible con BamHI (el sitio introducido por el cebador pLP.2, se indica en negrita).

5 Obtener el gen SerVaso hibridando dos oligómeros: VP. 1: 5’-ACG CTC ATA TTT TCA AAA TTG TCC TCG TGG TTA AG y VP.2: 5’-GAT CCT TAA CCA CGA GGA CAA TTT TGA AAA TAT GA. El fragmento hibridado incluye un codón de terminación y tiene en su extremo 5’ el saliente ACGC y en el extremo 3’ un extremo adhesivo compatible con BamHI. Ligar el fragmento génico SerVaso en pLP1 digerido con Eco31I y BamHI y denominar al plásmido resultante pLPIvp.

Inducir la cepa PA1001 portadora de pNGnisT (ejemplo 1) y pLPvp para la expresión como se describe en el ejemplo 1. Realizar la purificación del péptido segregado y realizar análisis por MALDI-TOFMS (modo lineal) esencialmente como se describe en el ejemplo 1.

15 Resultado

Figura 8. Una masa MALDI-TOFMS coherente con la exportación del péptido de fusión del líder nisina ampliado en el extremo C por vasopresina C1S. Este resultado demuestra que un péptido eucariota puede fusionarse con un péptido líder de lantibiótico y, como tal, exportarse mediante un transportador de lantibiótico.

EJEMPLO 4

Exportación del prepéptido de nisina mediante el transportador de nisina NisT y modificación por la enzima deshidratante de nisina NisB sin formación enzimática posterior de puentes tioéter.

25 Materiales y métodos

Clonar NisBT como en el ejemplo 1 usando los cebadores nisB fw, (5’-CGG TCT CGC ATG ATA AAA AGT TCA TTT AAA GCT CAA CCG TTT TTA GTA AG) y nisT rev (5’-CGG TCT CTC TAG ATT ATT CAT CAT TAT CCT CAT ATT GCT CTG). Transformar NZ9000 + pNG-nisBT (Cm) con pNG-nisA (Em) (construido como en el ejemplo1). Cultivar en medio mínimo células NZ9000 + pNG-nisBT + pNG-nisA e inducir como en el ejemplo 1. Someter a ziptipping el sobrenadante y analizar por MALDI-TOFMS como en el ejemplo 1.

Resultados

35 Figura 9. Un pico MALDI-TOFMS de aproximadamente 5690 Da en la muestra derivada del sobrenadante de células NZ9000 + pNG-nisBT + pNG-nisA. Ausencia de este pico en muestras derivadas del sobrenadante de NZ9000 + pNG-nisT + pNG-nisA (ejemplo 1). Coherente con la deshidratación de la mayoría de las serinas (probablemente Ser33 permanece sin modificar como en la propia nisina) y todas las treoninas.

EJEMPLO 5

Exportación del prepéptido de nisina mediante el transportador de nisina NisT y modificación por la enzima deshidratante de nisina NisB sin formación enzimática posterior de puentes tioéter.

45 Materiales y métodos

Construir el plásmido pNG-nisABT similar a la organización de estos genes el productor de nisina de tipo silvestre NZ9700, que es con una repetición invertida entre los genes nisA y nisBT. En resumen: realizar PCR sobre ADN cromosómico con los cebadores nisAfw: 5’ CGG TCT CTC ATG AGT ACA AAA GAT TTT AAC TTG GAT TTG G 3’ y nisTrev: 5’ CGG TCT CTC TAG ATT ATT CAT CAT TAT CCT CAT ATT GCT CTG 3’. Clonar el producto PCR en pGEM-T (ligamiento A-T). Digerir pGEM-TnisABT con BsaI. Ligar nisABT (BSAI) con pNG8048E(ncoI/XbaI). Transformar este plásmido en NZ9000, cultivar e inducir. En este caso, después de la inducción nisBT se transcribe solo en baja cantidad por lectura limitada. Someter el sobrenadante a ziptipping y MALDI-TOFMS como en el

55 ejemplo 1.

Resultados

Un pico MALDI-TOFMS de aproximadamente 5690 coherente con la exportación del prepéptido de nisina y con la deshidratación de las serinas (la mayoría) y treoninas (todas) del propéptido.

EJEMPLO 6

Exportación del prepéptido de nisina mediante el transportador de nisina NisT y modificación por la enzima

65 deshidratante nisina NisB seguido de la formación de puentes tioéter mediada por NisC, que implica un plásmido pNG-nisABTC.

Materiales y métodos

Construir el plásmido pNG-nisABTC similar a la organización de estos genes en el productor de nisina de tipo silvestre NZ9700, que es con una repetición invertida entre los genes nisA y nisBTC. Esta construcción puede 5 realizarse de manera análoga a la construcción de pNGnisABT descrita en el ejemplo 5, usando -en lugar de nisT rev-nisC rev: 5’ CGG TCT CTC TAG ATC ATT TCC TCT TCC CTC CTT TCA AAA AAT C 3’.

Como alternativa, y esta es la construcción del plásmido que contiene nisABTC con el que se obtuvieron los datos presentados, clonar los genes nisABTC sobre un plásmido de entrada. Restringir pNG8048E con HindIII. Retirar el fragmento que contiene Em-r aislando el fragmento vectorial (3 kb) del gel. Autoligar el fragmento vectorial y denominar al vector resultante pBMDLI. Realizar PCR con pBMDLI para perder el Cm-r e introducir un sitio PstI y un sitio Xbal. Aislar este fragmento este fragmento aislado fuera del gel y estringir con PstI y Xbal. Cortar pNG8048E también con PstI y Xbal para obtener el fragmento Em-r. Aislar este fragmento de 1 kb fuera del gel y ligar con el producto PCR anterior. Nombrar al nuevo plásmido pBMDL2. Restringir pBMDL2 con SmaI para linealizarlo y

15 obtener extremos romos. Insertar un Casete de Conversión Vectorial de Entrada (RfA) (1,7 kb) por ligamiento en el extremo romo. Obtener así un vector denominado pBMDL3. Para preparar un vector que contenga los genes nisABTC, introducir sitios attB de entrada mediante PCR. El fragmento PCR de 6,4 kb se depuró sobre una columna del kit Zymoclean DNA Clean & Concentrator. Se realizó una reacción BP con este producto PCR y pDONR201 (Invitrogen) durante la incubación ON a 25 ºC. Obtener el vector de entrada pBMDL4 en células DH5alfa de E.coli mediante transformación química. Realizar, con este vector de entrada pBMDL4 y el ya creado pBMDL3, una reacción LR. Obtener el vector pBMDL5 (con nisABTC) en EC1000 de E.coli (que contiene RepA en el cromosoma) mediante electroporación. Aislar pBMDL5 (que contiene nisABTC) y transformar en PA1001 (electroporación).

Cultivar NZ9000 + pBMDL5 (o pNGnisABTC) y comparar muestras inducidas y no inducidas. Analizar el

25 sobrenadante como en el ejemplo 1. Después de esto, someter el sobrenadante tratado con tripsina a un ensayo de inhibición de crecimiento de Lactococus lactis resistente a eritromicina, sensible a nisina. Además, ensayar la capacidad del sobrenadante sometido a tripsina para inducir al promotor de nisina con el ensayo Gus (Kuipers et al. 1995. J. Biol. Chem. 270: 27299-27304)

Resultados

En la muestra no inducida se observa un pico pequeño del prepéptido modificado (deshidratación y formación de lantionina) y un pico más grande del prepéptido no modificado (Figura 10A). En la muestra inducida se observa un pico grande del prepéptido modificado (deshidratación y formación de anillo de lantionina) y un pico pequeño que

35 correspondería al prepéptido modificado con metionina 1 (Figura 10B). Las muestras sometidas a tripsina de ambos sobrenadantes, inducido y no inducido, fueron capaces de inducir al promotor de nisina, según medición realizada con el ensayo Gus. Los sobrenadantes sometidos a tripsina e inducidos tienen capacidad inhibidora de crecimiento comparable a la del sobrenadante del productor de nisina de tipo silvestre NZ9700. Aparentemente el promotor de nisina es permeable. Este resultado en la muestra no inducida confirma de nuevo el resultado del ejemplo 1 de que el prepéptido no modificado puede exportarse.

Estos resultados de las muestras inducidas son coherentes con la exportación del prepéptido de nisina que ha sufrido todas las formaciones de puentes de lantionina. La tripsina se escinde del líder liberando nisina activa con actividad antimicrobiana y capacidad inductora. Por lo tanto NisBTC es suficiente para la formación de lantionina.

45 EJEMPLO 7

Síntesis mediada por EpilancinaBC por Staphyloccus epidermis (procariota, Gram-positivo) del líder de epilancina (tabla 2) acoplado a glucagón (tabla 1) con anillos tioéter.

La secuencia [C5, S24, C29] de glucagón es HSQGCFTSDYSKYLDSRRAQDFVSWLMNC (tabla 1). Esta secuencia permite que las enzimas epilancina K7 formen anillos tioéter entre S2-C5 y S24-C29.

Materiales y métodos

55 Clonar una construcción líder-epilancina K7 después de una fase de lectura abierta por glucagón mutante, seguido por epilancina BTC. Transformar el plásmido anterior a Staphylococcus epidermis. Inducir la transcripción. Continuar el cultivo celular durante una noche en medio mínimo, centrifugar, realizar ziptipping del sobrenadante y análisis MALDI-TOFMS (modo lineal).

Resultado

Como se indica en la Tabla 1, se observa un pico MALDI-TOFMS coherente con la producción de glucagón con serinas y treoninas deshidratadas y anillos tioéter. El análisis Maldi TOF de las muestras peroxidadas indica la

65 formación de puentes tioéter, ya que pueden añadirse 3 oxígenos a las cisteínas mientras que a los puentes tioéter pueden añadirse uno o dos oxígenos.

EJEMPLO 8

Producción por Streptococcus salivarius (procariota Gram positivo) de taquilepsina I [S3, S12] I (tabla 1) después de exportación mediante SalT. 5 Materiales y métodos

Clonar una construcción líder-salivaricina (tabla 2) después de una fase de lectura abierta por taquiplesina mutante (tabla 1). Clonar la salivaricina T en un segundo plásmido con un marcador antibiótico diferente. Transformar ambos plásmidos a una cepa de Streptococcus salivarius desprovista de genes de salivaricina. Inducir la transcripción de ambos plásmidos, durante 2-4 horas de cultivo continuado. Añadir cada 30 min pmsf (inhibidor de proteasa) 0,2 mM. Realizar ziptipping como en el ejemplo 1y analizar por MALDI-TOFMS (modo lineal).

Resultado

15 Se observa un pico por espectrometría de masas correspondiente a la taquilepsina.

EJEMPLO 9

Producción por Streptococcus salivarius (procariota Gram positivo) de taquilepsina I [S3, S12] (tabla1) con serina-3 y serina-12 deshidratas con salivaricinaB sin formación enzimática posterior de anillo tioéter.

La taquilepsina tiene la siguiente secuencia [S3,S12]: KWSFRVCYRGISYRRCR

25 Materiales y métodos

Clonar una construcción líder -salivaricina (tabla 2) después de una fase de lectura abierta por taquilepsina mutante (tabla 1). Clonar la salivaricinBT en un segundo plásmido con un marcador antibiótico diferente. Transformar este plásmido a una cepa de Streptococcus salivarius desprovista de genes de salivaricina. Inducir la transcripción de ambos plásmidos, durante 2-4 horas de cultivo continuado. Realizar ziptipping como en el ejemplo 1 y analizar por MALDI-TOFMS (modo lineal).

Resultado

35 Se observa un pico por espectroscopia de masas correspondiente a la taquilepsina con serinas deshidratadas.

EJEMPLO 10

Producción por Streptococcus salivarius (procariota Gram positivo) de taquilepsina I [S3, S12] I (tabla1) con S3 y S12 deshidratadas con salivaricinaB sin formación enzimática posterior de anillo tioéter.

La taquilepsina tiene la siguiente secuencia [S3, S12]: KWSFRVCYRGISYRRCR

Materiales y métodos

45 Clonar una construcción líder-salivaricina (tabla 2) después de una fase de lectura abierta por taquilepsina mutante (tabla 1) y después de esto la salivaricinBT. Transformar este plásmido a una cepa de Streptococcus salivarius desprovista de genes de salivaricina. Inducir la transcripción, durante 2-4 horas de cultivo continuado. Realizar ziptipping como en el ejemplo 1 y analizar por MALDI-TOFMS (modo lineal).

Resultado

Se observa un pico por espectroscopia de masas correspondiente a la taquilepsina con serinas deshidratadas.

55 EJEMPLO 11

Producción por Lactococcus lactis (procariota Gram-positivo) mediante lacticinaT de vasonatrina (tabla 1) sin modificaciones.

La lacticina 481-T tiene actividad peptidasa líder y por lo tanto en este ejemplo particular en el sobrenadante del cultivo celular se encontró vasonaprina sin líder. La vasonaprina está, entre otras, implicada en la vasorelajación. Su secuencia es GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCNSFRY.

Materiales y métodos

65 Clonar una construcción lacticina 481-líder (tabla 2) después de una fase de lectura abierta por vasonatrina (tabla 1).

Clonar la lacticina 481-T en un segundo plásmido con un marcador antibiótico diferente. Transformar ambos plásmidos a una cepa de L. lactis desprovista de genes de lacticina 481. Inducir la transcripción de ambos plásmidos cultivando durante una noche en medio mínimo. Realizar ziptipping como en el ejemplo 1 y analizar por MALDI-TOFMS (modo lineal).

5 Resultado

Se observa un pico por espectrometría de masas correspondiente a la vasonatrina.

EJEMPLO 12

Producción por Lactococcus lactis (procariota Gram-positivo) mediante lacticinaT de vasonatrina (tabla 1), con anillos tioéter mediados con lacticina M.

15 La vasonatrina está, entre otras, implicada en la vasorelajación. Tiene una secuencia de aminoácidos, que sin mutaciones, permite la formación de dos anillos de lantionina. Su secuencia es: GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCNSFRY.

Pueden formarse anillos de lantionina a partir de S3-C6 y a partir de S16-C22.

Materiales y métodos

Clonar una construcción de lacticina 481-líder (tabla 2) seguido de vasonatrina (tabla 1) y secuencias codificantes de lacticinaM. Transformar el plásmido a Lactococcus lactis PA1001. Inducir la transcripción del plásmido cultivando

25 durante una noche en medio mínimo. Realizar ziptipping como en el ejemplo 1 y analizar por MALDI-TOFMS (modo reflectron). Analizar muestras peroxidadas (en el caso de un puente tioéter uno o dos oxígenos añadidos; en el caso de cisteínas tres oxígenos añadidos) y no peroxidadas.

Resultado

Se observan picos por espectrometría de masascoherentes con el líder de lacticinaM acoplado a vasonatrina con dos anillos tioéter y dos serinas deshidratadas más.

EJEMPLO 13

35 Transporte mediante NisT del prepéptido de nisina fusionado en el extremo C con una variante de encefalina.

Este ejemplo muestra que NisT puede exportar el prepéptido de nisina no modificado con una ampliación C-terminal. Otros autores han descrito que los lantibióticos maduros pueden exportarse mediante LanBTC / TM con una ampliación C-terminal, pero todavía no se sabe que el prepéptido no modificado con una ampliación C-terminal también puede exportarse solo mediante el transportador LanT. Este ejemplo implica una cepa Lactococcus lactis que carece del grupo génico de nisina cromosómico completo, pero produce simultáneamente NisT codificado por plásmido y una fusión del prepéptido NisA y una variante de encefalina, YTGFC (la encefalina genéticamente fusionada al extremo C del prepéptido de nisina). Puede encontrarse un prepéptido de fusión no modificado en el

45 sobrenadante de cultivo, lo que demuestra que NisT es suficiente para el transporte del prepéptido con ampliación C-terminal al exterior de la célula.

Materiales y métodos.

Lactococcus lactis, PA1001 (véase ejemplo 1), se transformó con pNGnisT, que se construyó como se describe en el ejemplo 1. pNGnisA-enkT y pNGnisA-enkS se construyeron de la siguiente manera. pNGnisA se sometió a PCRed con el par de cebadores 5'-GCACGTGTTGCTTTGATTGATAGC-3' y 5'-CTGGATCCTTAACAAAAACCTGTGTATTTGCT-TACGTGAATACTAC-'3 (sitio BamH1 subrayado), que conduce a la fusión C-terminal de la variante de encefalina YTGFC con nisina A (enkT). El producto de la PCR se ligó y se

55 transformó a Lactococcus lactic PA1001 + pNGnisT. La cepa resultante, PA1001 + pNGnisT + pNZenkT se cultivó en medio MG17 a una DO600 = 0,4, se sedimentó y resuspendió en medio mínimo complementado con sobrenadante filtrado 1/1000 de Lactococcus lactis NZ9700 productora de nisina de tipo silvestre. Después de una incubación durante una noche las células se sedimentaron y el sobrenadante se sometió a ziptipping y a análisis MALDI TOF. Resultado:

Figura 11. Se observan picos casi a 6400,05 (prepéptido de nisina sin metionina 1 con ampliación C-terminal con YTGFC) por maldi TOF. Por tanto, el transportador de nisina puede exportar el prepéptido de nisina genéticamente fusionado con una variante de encefalina. Por lo tanto se puede llegar a la conclusión de que los transportadores de

65 lantibióticos también pueden usarse para el transporte de prepéptidos de lantibióticos no modificados que están ampliados en el extremo C mediante un péptido fusionado.

Tabla 1, (poli)péptidos seleccionados

Tabla 1: (poli)péptidos cuyo ADN codificante está precedido por ADN codificante del líder de lantibiótico en una fase

de lectura abierta.

Posibilidades mutacionales que permiten la formación postraduccional de un anillo (o más) tioéter, proporcionadas,

por ejemplo, por la vasopresina se aplican también a otras secuencias, incluyendo aquellas que ya tienen un anillo,

con otros (poli)péptidos en la Tabla 1, teniendo en cuenta la descripción de la formación de anillo tioéter mencionada

en el texto. 10

Tabla 1: (poli)péptidos cuyo ADN codificante está precedido por ADN codificante del líder de lantibiótico en una fase

de lectura abierta. Posibilidades mutacionales que permiten la formación postraduccional de un anillo (o más) tioéter,

proporcionadas, por ejemplo, por la vasopresina se aplican también a otras secuencias, incluyendo aquellas que ya

tienen un anillo, con otros (poli)péptidos en la Tabla 1, teniendo en cuenta la descripción de la formación de anillo 15 tioéter mencionada en el texto.

Tabla 1A:

Vasopresina: Función: como una hormona antidiurética:

(A1, S2, R8)-secuencia: ASFQNCPRG; anillo de lantionina S2-C6

(A1, S2, C3, R8)-secuencia: ASCQNCPRG; anillo de lantionina S2-C3

(A1, S2, C4, R8)-secuencia: ASFCNCPRG ; anillo de lantionina S2-C4

(A1, S2, C5, R8)-secuencia: ASFQCCPRG (SEC ID Nº:); anillo de lantionina S2-C5

(A1, S2, A6, C7, R8)-secuencia: ASFQNACRG; anillo de lantionina S2-C7

(A1, S2, A6, C8)-secuencia: ASFQNAPCG; anillo de lantionina S2-C8

(A1, S2, A6, R8, C9)-secuencia: ASFQNAPRC; anillo de lantionina S2-C9

(A1, S3, R8)-secuencia: AYSQNCPRG; anillo de lantionina S3-C6

(A1, S3, C4, R8)-secuencia: AYSCNCPRG ; anillo de lantionina S3-C4

(A1, S3, C5, R8)-secuencia: AYSQCCPRG; anillo de lantionina S3-C5

(A1, S3, A6, C7, R8)-secuencia: AYSQNACRG; anillo de lantionina S3-C7

(A1, S3, A6, C8)-secuencia: AYSQNAPCG; anillo de lantionina S3-C8

(A1, S3, A6, R8, C9)-secuencia: AYSQNAPRC; anillo de lantionina S3-C9

(A1, S4, R8)-secuencia: AYFSNCPRG ; anillo de lantionina S4-C6

(A1, S4, C5, R8)-secuencia: AYFSCCPRG ; anillo de lantionina S4-C5

(A1, S4, A6, C7, R8)-secuencia: AYFSNACRG ; anillo de lantionina S4-C7

(A1, S4, A6, C8)-secuencia: AYFSNAPCG ; anillo de lantionina S4-C8

(A1, S4, A6, R8, C9)-secuencia: AYFSNAPRC ; anillo de lantionina S4-C9

(A1, S5, R8)-secuencia: AYFQSCPRG ; anillo de lantionina S5-C6

(A1, S5, A6, C7, R8)-secuencia: AYFQSACRG ; anillo de lantionina S5-C7

(A1, S5, A6, C8)-secuencia: AYFQSAPCG ; anillo de lantionina S5-C8

(A1, S5, A6, R8, C9)-secuencia: AYFQSAPRC ; anillo de lantionina S5-C9

(A1, S6, C7, R8)-secuencia: AYFQNSCRG ; anillo de lantionina S6-C7

(A1, S6, C8)-secuencia: AYFQNSPCG ; anillo de lantionina S6-C8

(A1, S6, R8, C9)-secuencia: AYFQNSPCG ; anillo de lantionina S6-C9

(A1, S7, C8)-secuencia: AYFQNCSCG ; anillo de lantionina S7-C8

(A1, S7, R8, C9)-secuencia: AYFQNCSRC ; anillo de lantionina S7-C9

(A1, S7, C9)-secuencia: AYFQNCPSC ; anillo de lantionina S8-C9.

Terlipresina (hormona antidiurética): 20

S4-secuencia: GGGSYFQNCPKG

Lantionina postraduccional: S4-C9.

Cispresina (hormona antidiurética): 25

S4-secuencia: GGGSYFNCPKG

Anillo de lantionina postraduccional: S4-C8.

El péptido hipotensivo adrenomedulina, puede funcionar como una hormona en el control de la circulación

A13,S16-secuencia: YRQSMNNFQGLRAFGSRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDN VAPRSKISPQGY Lantionina postraduccional: S16-C21.

5 Alatostatina I (inhibidor neuropeptídico de la síntesis de la hormona juvenil)

C6-secuencia: APSGACRLYGFGL Lantionina postraduccional: S3-C6.

10 Angiotensina I

S7, C10-secuencia: DRVYIHSFHC Lantionina postraduccional S7-C10 Función: en respuesta a una presión reducida, la enzima renina escinde la angiotensina I, a partir de

15 angiotensinógeno, después elimina un dipéptido para producir la angiotensina II fisiológicamente activa, la sustancia con actividad presora más fuerte conocida, que ayuda a regular el volumen y el equilibrio mineral de los fluidos corporales.

Antopleurina-A (neuropéptido)

20 A4-secuencia: GVSALCDSDGPSVRGNTLSGTLTLYPSGCPSGWHNCKAHGPTI G WCCKQ Anillos de lantionina postraduccional: S3-C6, S27-C31, S33-C38, T44-C48.

Péptido 1 antiinflamatorio (antiinflamación)

25 S1, C6-secuencia: SQMKKCLDS Lantionina postraduccional: S1-C6

Dermaseptina (péptido antimicrobiano)

30 C10-secuencia: ALWKTMLKKCGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ Lantionina postraduccional: T5-C10.

35 Péptido similar a bombinina (péptido antimicrobiano)

C8-secuencia: GIGASILCAGKSALKGLAKGLAEHFAN Lantionina postraduccional: S5-C8.

40 Histatina-5 (péptido salival antimicrobiano)

S4, C7-secuencia: DSHSKRCHGYKRKFHDKHHSHRGY Lantionina postraduccional: S4-C7.

45 Indolicidina (péptido antimicrobiano)

S2, C5-secuencia: ISPWCWPWWPWRR Lantionina postraduccional: S2-C5.

50 Magainina-1 (péptido antimicrobiano)

C13-secuencia: GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS Lantionina postraduccional: S8-C13.

55 Factor Natriurético Auricular (fuerte sustancia vasoactiva con una función clave en homeostasis cardiovascular y actividad estimuladora del GMPc).

Secuencia: SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY Lantioninas postraduccionales: S1-C7, S19-C23. 60 Bradiquinina (función importante en fisiología renal y conductual).

C9-secuencia: RPPGFSPFC Lantionina postraduccional: S6-C9. 65

Péptido Natriurético Cerebral (actúa como una hormona cardiaca implicada en la natriuresis, diuresis, vasorelajación, inhibición de renina y secreción de aldosterona, mejora la función cardiaca)

S16,C19-secuencia: SPKMVQGSGCFGRKMSRICSSSGLGCKVLRRH 5 Lantionina postraduccional: S8-C10, S16-C19

Péptido Natriuirético de tipo C (presenta actividad natriurética y vasodepresora)

Secuencia: DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK LDRIG SMSGLGC 10 Anillo de lantionina postraduccional: S34-C37, S47-C53.

Péptido de vasonatrina (vasorelajación)

Secuencia: GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCNSFRY 15 Anillo de lantionina postraduccional: S3-C6, S17-C22.

Péptido inductor del sueño delta (inducción del sueño delta)

S2, C6-secuencia: WSGGNCSGE 20 Anillo de lantionina postraduccional: S2-C6.

Alfa-dendrotoxina

S11,S26-secuencia: PRRKLCILHRSPGRCYDKIPAFYYNSKKKQCERFDWSGC GGNSNRFKTIEECRRTCIG 25 Lantionina postraduccional: S11-C15, S26-C31 Función: afecta a los canales de potasio.

Eledoisina

30 C4-secuencia: PSKCAFIGLM Anillo de lantionina postraduccional: S2-C4 Función: excitación neuronal, causante de respuestas conductuales, vasodilatadoras, secretagogas, causante de la contracción de músculos lisos.

35 Equistatina:

Secuencia: ECESGPCCRNCKFLKEGTICKRARGDDMDDYCNGKTCDCPRNPHK GPAT Anillos de lantionina postraduccional: S4-C7, T18-C20, T36-C37 Función: inhibidor de agregación plaquetaria dependiente de fibrinógeno.

40 Alfa-endorfina

S2,C6-secuencia: YSGFMCSEKSQTPLVT Anillo de lantionina postraduccional: S2-C6 45 Función: opioide.

beta-endorfina

S21,C26-secuencia: YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNSILKNCYKKGE 50 Anillo de lantionina postraduccional: S21-C26 Función: opioide.

Defensina I

55 S2,S12-secuencia: ASYCRIPACIAGSRRYGTCTYQGRLWAFCC Anillos de lantionina postraduccional: S2-C4, S13-C19 Función: péptido antimicrobiano

Secretina

60 S23,C26-secuencia: HSDGTFTSELSRLREFARLQRLSQGCV Anillo de lantionina postraduccional:S23-C26 Función: regulación del pH en el estómago.

65 Urocortina

C19-secuencia: DNPSLSIDLTFHLLRTLLCLARTQSQRERAEQNRIIFDSV Anillo de lantionina postraduccional: T16-C19 Función: estimula la secreción de ACTH.

5 Urotensina II

S5-secuencia: AGTASCFWKYCV Anillo de lantionina postraduccional: T3-C6, S5-C11 Función: osmoregulación y factor de liberación de corticotropina.

Péptido A cardioactivo pequeño

S4,C7-secuencia: ARPSYLCFPRM Anillo de lantionina postraduccional: 15 S4-C7 Función: inhibe la liberación de acetilcolina

Péptido B cardioactivo pequeño

S4,C7-secuencia: MNYSAFCRM Lantionina postraduccional: S4-C7 Función: estimula la contracción en el intestino, aumenta la amplitud del latido cardíaco.

Ceratotoxina A

25 C9-secuencia: SIGSALKKCLPVAKKIGKIALPIAKAALP Lantionina postraduccional: S4-C9 Función: antimicrobiana, péptido hemolítico con actividad contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, estable a 100 grados centígrados.

Cerebelina

C7-secuencia: SGSAKVCFSAIRSTNH Lantionina postraduccional: S3-C7 Función: neuromodulación, estimulación de liberación de norepinefrina, potencia indirectamente la secreción

35 adrenocortical

Caribdotoxina

S33-secuencia: FTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKSRCYS (metil)lantionina postraduccional: T3-C7, T8-C13, S15-C17, T23-C28, S33-C35 Función: inhibidor de canales de calcio y potasio activados por voltaje

Colecistoquinina

45 C8-secuencia: KAPSGRMCIVKNQQLDPSHRISDRYMGWMDF Lantionina postraduccional: S4-C8 Función: contracción de la vesícula biliar y liberación de enzimas pancreáticas en el intestino.

Conopresina G

S1-secuencia: SFIRNCPKG Lantionina postraduccional: S1-C6 Función: control conductual.

55 Alfa-conotoxina EI

S2,S5-secuencia: RSHCSYHPTCNMSNPQIC Lantionina postraduccional: S2-C4, S5-C10, S13-C18 Función: bloqueante de receptores nicotínicos de acetilcolina.

Corazonina

C9-secuencia: TFQYSRGWCN Lantionina postraduccional: S5-C9 65 Función: regulación del latido cardíaco.

Leu-encefalina

S2,C3-secuencia: YSCFL Anillo de lantionina postraduccional: S2-C3 5 Función: opioide.

Met-encefalina

S2,C3-secuencia: YSCFM 10 Anillo de lantionina postraduccional: S2-C3 Función: opioide.

Oxitocina

15 (Sl)-secuencia: SYIQNCPLG Anillo de lantionina postraduccional S1-C6 Función: la oxitocina estimula la contracción uterina y la lactancia: aumenta la secreción de Na+; estimula la GTPasa miometrial y fosfolipasa C.

20 Exendina-3

C35-secuncia: HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGCPPPS Anillo de lantionina postraduccional: S32-C35 Función: similar a la secretina.

25 Péptido encefalitogénico alérgico experimental

C5-secuencia: FSWGCEGQR Anillo de lantionina postraduccional: S2-C5 30 Función: estabilización de la membrana de mielina

Péptido complementario de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental

S4,C7-secuencia: VFISGPCRLLG 35 Anillo de lantionina postraduccional: S4-C7 Efecto: tiene una función en la encefalomielitis autoinmunitaria.

Gonadoliberina II

40 (C9)-secuencia: QHWSHGWYCG Anillo de lantionina postraduccional: S4-C9 Función: estimula la secreción de gonadotropinas; estimula la secreción de hormonas estimulantes de folículos y luteinizantes.

45 Ácido tocinoico / ácido presinoico

(S1,I3)-secuencia: SYIQNC Anillo de lantionina postraduccional S1-C6 Función: el ácido tocinoico es un inhibidor de oxitocina, que induce el comportamiento materno.

50 Leuprolida

Secuencias: XHWSYGCRPX Anillo de tioéter postraduccional: S4-C7

55 XHWSYXCRX Anillo de tioéter postraduccional: S4-C7 Función: agonista de LHRH.

Calcitonina

60 Número de acceso: P01258 (Sl)-secuencia: SGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP Anillo de tioéter postraduccional S1-C7 Función: incorporación de CaPi en huesos.

ACTH, hormona adrenocorticotrópica

(Q5,C6)-secuencia: SYSMQCFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF 5 Anillo de lantionina postraduccional S1-C6

Secuencia del fragmento ACTH

SYSMECFRWG Anillo postraduccional: S2-C6 Función: la ACTH estimula la síntesis y secreción de glucocorticoides por la corteza adrenal.

Fragmento del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B

15 C6-secuencia: MGTNLCVPNPLGFFPDHQLDP Modificación postraduccional: anillo de lantionina T3-C6 Función: antígeno de superficie

Péptido inhibidor de conicotropina

S4,C8-secuencia: FRWSKPVCKKRRPVKVYPNGAEDSAEAFPLE Lantionina postraduccional: S4-C8 Función: inhibición de ACTH.

25 Factor liberador de corticotropina

S30,C33-Sec: SEEPPISLDLTFHLLREVLEMARAEQLAQSAHCNRKLMEII Lantionina postraduccional: S30-C33 Función: liberación de corticotropina.

Somatostatina

(S3)-secuencia: AGSKNFFWKTFTSC Anillo de lantionina postraduccional S3-C14 35 Función: factor de inhibición de la liberación de somatotropina, factor de inhibición de la liberación de la hormona del crecimiento.

Polipéptido pancreático humano

(S18, C21)-secuencia: APLEPVYPGDNATPEQMSQYCADLRRUINMLTRPRY, Anillo de lantionina postraduccional S18-C21 Función: agonista en receptores del neuropéptido Y4

Péptido YY

45 (S22,C25,T29,C32)-secuencia: YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY Anillos de (metil)lantionina postraduccional S22-C25, T29-C32 Función: hormona intestinal que inhibe la secreción pancreática estimulada tanto por secretina como por colecistoquinina.

Glucagón

(C5,S24,C29)-secuencia: HSQGCFTSDYSKYLDSRRAQDFVSWLMNC Anillos de lantionina postraduccional S1-C5, S24-C29 55 Función: restablecimiento del nivel de glucosa en sangre cuando es demasiado bajo.

alfa-neuroquinina

(C9)-secuencia: HKTDSFVGCM Anillo de lantionina postraduccional S5-C9 Función: antagonista de taquiquinina.

LHRH1, hormona liberadora de hormona luteinizante

65 Función: regula la secreción de gonadotropinas, hormona luteinizante y esteroides sexuales. (Q1, C7)-secuencia: QHWSYGCRPG Anillo de lantionina postraduccional S4-C7

(S1, C4)-Secuencia: SHWCYGLRPG anillo postraduccional: S1-C4 (S1, A4, C5)-Secuencia: SHWACGLRPG anillo postraduccional: S1-C5 (S1, A4, C6)-Secuencia: SHWAYCLRPG anillo postraduccional: S1-C6 (Q1, S2, A4, C5)-Secuencia: QSWACGLRPG anillo postraduccional: S2-C5 (Q1, S2, A4, C6)-secuencia: QSWAYCLRPG anillo postraduccional: S2-C6 (Q1, S2, A4, C7)-secuencia: QSWAYGCRPG anillo postraduccional: S2-C7 (Q1, S3, A4, C6)-secuencia: QHSAYCLRPG anillo postraduccional: S3-C6 (Q1, S3, A4, C7)-secuencia: QHSAYGCRPG anillo postraduccional: S3-C7 (Q1, S3, A4, C8)-secuencia: QHSAYGLCPG anillo postraduccional: S3-C8 (Q1, C8)-secuencia: QHWSYGLCPG anillo postraduccional: S4-C8 (Q1, C9)-secuencia: QHWSYGLRCG anillo postraduccional: S4-C9 (Q1, A4, S5, C8)-secuencia: QHWASGLCPG anillo postraduccional: S5-C8 (Q1, A4, S5, C9)-secuencia: QHWASGLRCG anillo postraduccional: S5-C9 (Q1, A4, S5, C10)-secuencia: QHWASGLRPC anillo postraduccional: S5-C10 (Q1, A4, S6, C9)-secuencia: QHWAYSLRCG anillo postraduccional: S6-C9 (Q1, A4, S6, C10)-secuencia: QHWAYSLRPC anillo postraduccional: S6-C10 (Q1, A4, S7, C10)-secuencia: QHWAYGSRPC anillo postraduccional: S7-C10.

LHRH2, fragmento de la hormona liberadora de hormona luteinizante 5 Función: regula la secreción de gonadotropinas, hormona luteinizante y esteroides sexuales.

(Q1, C7)-secuencia: QHWSHGCYPG Anillo de lantionina postraduccional S4-C7 10 (S1, C4)-secuencia: SHWCHGWYPG anillo postraduccional: S1-C4 (S1, A4, C5)-secuencia: SHWACGWYPG anillo postraduccional: S1-C5 (S1, A4, C6)-secuencia: SHWAHCWYPG anillo postraduccional: S1-C6 (Q1, S2, A4, C5)-Secuencia: QSWACGWYPG anillo postraduccional: S2-C5 (Q1, S2, A4, C6)-secuencia: QSWAHCWYPG anillo postraduccional: S2-C6 (Q1, S2, A4, C7)-secuencia: QSWAHGCYPG anillo postraduccional: S2-C7 (Q1, S3, A4, C6)-secuencia: QHSAHCWYPG anillo postraduccional: S3-C6 (Q1, S3, A4, C7)-secuencia: QHSAHGCYPG anillo postraduccional: S3-C7 (Q1, S3, A4, C8)-secuencia: QHSAHGWCPG anillo postraduccional: S3-C8 (Q1, C8)-secuencia: QHWSHGWCPG anillo postraduccional: S4-C8 (Q1, C9)-secuencia: QHWSHGWYCG anillo postraduccional: S4-C9 (Q1, A4, S5, C8)-secuencia: QHWASGWCPG anillo postraduccional: S5-C8 (Q1, A4, S5, C9)-secuencia: QHWASGWYCG anillo postraduccional: S5-C9 (Q1, A4, S5, C10)-secuencia: QHWASGWYPC anillo postraduccional: S5-C10 (Q1, A4, S6, C9)-secuencia: QHWAHSWYCG anillo postraduccional: S6-C9 (Q1, A4, S6, C10)-secuencia: QHWAHSWYPC anillo postraduccional: S6-C10 (Q1, A4, S7, C10)-secuencia: QHWAHGSYPC anillo postraduccional: S7-C10.

Factor ácido del crecimiento de fibroblastos derivado de cerebro (102-111)

(S103,C109)-secuencia: HSQKHWFCGL 15 Anillo de lantionina postraduccional S103-C109 Función: factor de crecimiento. Factor básico del crecimiento de fibroblastos derivado de cerebro (1-24)

Secuencia: PALPEDGGSGAFPPCHFKDPKRLY

20 Anillo de lantionina postraduccional S11-C17 Función: factor de crecimiento.

Insulina

Secuencias: Cadena alfa: GIVEQCCASVCSLYQLENYCN (SEC ID Nº:)

5 (S9-C14, T27-C30)-cadena beta: FVNQHLCGSHLVECLYLVCGERGFFYTPKC (SEC ID Nº:) Anillos de (metil)lantionina postraduccional S9-C14, T27-C30 Enlaces disulfuro: alfa 6 -11 alfa 7 -beta 7, alfa 20 -beta 19 Función: tratamiento de la diabetes.

Paratormona:

(S36-C39, T79-C82)-secuencia: SVSEIELMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVSLGCPLAPRDAG SERPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKACSE

15 (SEC ID Nº:) Anillos de (metil) lantionina postraduccional S36-C39, T79-C82 Función: modulación del contenido de calcio en suero que afecta a la fisiología mineral y ósea.

Péptido inhibidor de unión a fibrinógeno

S6,C9-secuencia: HHLGGSKQCGDV Lantionina postraduccional: S6-C9.

Péptido inhibidor del factor de crecimiento de fibroblastos

25 S1,C3-secuencia: SPCGHYKG Anillo de lantionina postraduccional: S1-C3 Efecto: inhibición del factor de crecimiento de fibroblastos.

Galanina

C10-secuencia: GWTLNSAGYCLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS Anillo de lantionina postraduccional: S6-C10 Función: contrae la musculatura lisa del tracto gastrointestinal y genitourinario, regula la liberación de la hormona

35 del crecimiento, modula la liberación de insulina.

Polipéptido inhibidor gástrico

S28,C31-secuencia: YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLSQKCKKNDWKHNITQ Función: fuerte estimulación de secreción de insulina y relativamente mal inhibidor de secreción de ácido gástrico.

Gastrina-I grande

45 S8,C11-secuencia: LGPQGPPSLVCDPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDF Anillo de lantionina postraduccional: S8-C11 Función: estimula la secreción gástrica de HCl, la secreción de enzimas pancreáticas, la contracción del músculo liso y aumenta la circulación sanguínea y la secreción de agua en el estómago e intestino.

Pentagastrina

S1,C4-secuencia: SWMCF Anillo de lantionina postraduccional: S1-C4

55 Péptido liberador de gastrina

S9,C12-secuencia: VPLPAGGGSVLCKMYPRGNHWAVGHLM Anillo de lantionina postraduccional: S9-C12 Función: liberación de gastrina.

Factor alfa de crecimiento transformante

Secuencia: VVSHFNDCPDSHTQFCFHGTCRFLVQEDKPACVCHSGYVGAR CEHA DLLA Anillo de (metil)lantionina postraduccional: S3-C8, T21-C22, S37-C44 65 Función: TGF alfa es un polipéptido mitogénico que puede unirse al receptor de egf y actúa sinérgicamente con TGF beta para promover la proliferación celular independiente de anclaje en agar blando.

Hormona dle crecimiento humano

C7-secuencia: FPTIPLCRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYS Anillo de metillantionina postraduccional: T3-C7 5 Función: hormona del crecimiento, estimula, entre otras, la síntesis de proteínas y captación de aminoácidos.

Factor liberador de la hormona del crecimiento

C22-secuencia: YADAIFTNSYRKVLGQLSARKCLQDIMSRQQGESNQERGARAR L Anillo de lantionina postraduccional: S18-C22 Función: liberación de la hormona del crecimiento.

Guanilina

15 Secuencia: PGTCEICAYAACTGC Anillo de lantionina postraduccional: T3-C4, T13-C15 Función: activador de la guanilato ciclasa.

Helospectina I

S15,C18-secuencia: HSDATFTAEYSKLLSKLCLQKYLESILGSSTSPRPPSS Anillo de lantionina postraduccional: S15-C18

Fragmento del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B

25 C6-Secuencia: MGTNLCVPNPLGFFPDHQLDP Anillo de metillantionina postraduccional: T3-C6 Función: exendina-1: similar a secretina.

Molécula de adhesión intercelular

Secuencia: NAQTSVSPSKVILPRGGSVLVTC Anillo de lantionina postraduccional: S18-C23 Función: anti-hiv.

35 Taquiplesina I

(S3,S12)-secuencia: KWSFRVCYRGISYRRCR Anillos de lantionina postraduccional S3-C7, S12-C16 Función inhibidor de la fusión de células Hiv, péptido antitumoral, péptido antimicrobiano.

Fragmento peptídico antigénico del HIV (gp 120)

(S10,C14)-secuencia: CGKIEPLGVSPTKCKRRVVQREKR 45 Anillo de lantionina postraduccional S10-C14.

Fragmento peptídico antigénico I de lHIV (gp 41)

(S2)-secuencia: GSSGKLICTTAVPWNAS Lantionina postraduccional S2-C8.

Péptido antigénico 5 del HIV (gp41)

55 (S20)-secuencia: RVTAIEKYLQDQARLNSWGSAFRQVCHTTVPWVNDS Anillo de lantionina postraduccional S20-C26.

Inhibidores de proteasa del HIV

Secuencia: TVSFCF Anillo de lantionina postraduccional T1-C5 Función: inhibidor de proteasa del HIV.

Análogo del factor de crecimiento I similar a insulina 65 S1,C4-secuencia: SYACPLKPAKSC

Anillos de lantionina postraduccional: S1-C4, S11-C12. IGF II 69-84: 5 (C7)-secuencia: DVSTPPCVLPDNFPRY (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional S3-C7. Fragmento de interleucina 8: (S6, C10)-secuencia: AVLPRSAKEC (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional S6-C10 Función: atracción de neutrófilos, basófilos y linfocitos T, pero no de monocitos. Está implicado en la activación de neutrófilos y se libera de diversos tipos de células en respuesta a inflamación. 15 Fragmento de interleucina-2 (60-70) (factor de crecimiento de linfocitos T) Secuencia: LTFKFYMSKKC (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional S67-C70. Leucoquinina I (péptido neuroactivo) C8-secuencia: DPAFNSWC (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional: S6-C8. 25 Leucopiroquinina C4-Secuencia: TSFCPRL (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional: T1-C4 Función: media la actividad contráctil muscular visceral Mastoparán S5,C8-secuencia: INLKSLACLAKKIL (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional: S5-C8 35 Función: toxina membrano activa del veneno de avispas. Hormona concentradora de melanina S11-Secuencia: DFDMLRCMLGSVYRPCWQV (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional: S11-C16 Función: posible neurotransmisor, implicado en la regulación del comportamiento dirigido Melitina 45 C14-secuencia: GIGAVLKVLTGLPCLISWIKRKRQQ (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional: T10-C14 Función: péptido membrano activo del veneno de abeja. Motilina C9-secuencia: FVPIFTYGCLQRMQEKERNKGQ (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional: T6-C9 Función: regulación de motilidad gastrointestinal interdigestiva. 55 Neuropéptido Y C26-secuencia: YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRCYINLITRNRY (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional S22-C26 Función: control de alimentación y secreción de hormona liberadora de gonadotropina. Osteocalcina S4,C8-secuencia: YLYSWLGCPVPYPDPDELADHIGFQEAYRRFYGPV (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional: S4-C8 65 Función: constituye el 1-2 % de la proteína ósea total, se une fuertemente a apatito y calcio.

(N-acetil-)beta-endorfina 1-27

(C21)-secuencia: YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNCIIKNAY (SEC ID Nº:) Metillantionina postraduccional T16-C21 5 Funciones: analgesia, cambios conductuales, liberación de hormona del crecimiento.

Péptido relacionado con el oncogén Ras

HU-rasha (S2, C5)-secuencia: GSVGCGKS (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional S2-C5.

Péptido relacionado con el oncogén Ras

15 Hu-rasT24 (S2, C5)-secuencia: GSVGCGKS (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional S2-C5.

Péptido relacionado con el oncogén Ras

Hu-(Hu-rast24)-Lys (S3, C6)-secuencia: YGSVGCGKSK (SEC ID Nº:) Anillo de lantionina postraduccional S3-C6.

25 Tabla 1B:

Albúmina Número de acceso: P02768 Secuencia: DTHKSE IAHRFKDLGE EHFKGLVLIA FSQYLQQCPF DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD ESHAGCEKSL HTLFGDELCK VASLRETYGD MADCCEKQEP ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF KADEKKFWGK YLYEIARRHP YFYAPELLYY ANKYNGVFQE CCQAEDKGAC LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ER-ALKAWSVA RLSQKFPKAE FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE CCDK-PLLEKS HCIAEVEKDA IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL GSFLYEYSRR HPEYAVSVLL RLAKE-YEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ

35 VSTPTLVEVS RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC TESLVNRRPC FSALTPDETY VPKAFDEKLF TFHADICTLP DTEKQIKKQT ALVELLKHKP KATEEQLKTV MENFVAFVDK CCAADDKEAC FAVEGPKLVV STQTALA Enlaces disulfuro: 77-86; 99-115; 114-125; 148-193; 192-201; 224-270; 269-277; 289-303; 302-313; 340-385; 384-393; 416-462; 461-472; 485-501; 500-511; 538-583; 582-591 (los números corresponden a la proteína precursora que contiene 24 aminoácidos más, en el extremo N) Función: regulación de la presión osmótica coloidal del plasma sanguíneo, unión a moléculas de plasma sanguíneo. Alglucerasa Número de acceso: P04062

45 Secuencia: A RPCIPKSFGY SSVVCVCNAT YCDSFDPPTF PALGTFSRYE STRSGRRMEL SMGPIQANHT GT-GLLLTLQP EQKFQKVKGF GGAMTDAAAL NILALSPPAQ NLLLKSYFSE EGIGYNIIRV PMASCDFSIR TYTY-ADTPDD FQLHNFSLPE EDTKLKIPLI HRALQLAQRP VSLLASPWTS PTWLKTNGAV NGKGSLKGQP GDIYHQT-WAR YFVKFLDAYA EHKLQFWAVT AENEPSAGLL SGYPFQCLGF TPEHQRDFIA RDLGPTLANS THHNVRLLML DDQRLLLPHW AKVVLTDPEA AKYVHGIAVH WYLDFLAPAK ATLGETHRLF PNTMLFASEA CVGSKFWEQS VRLGSWDRGM QYSHSIITNL LYHVVGWTDW NLALNPEGGP NWVRNFVDSP IIVDITKDTF YKQPMFYHLG HF-SKFIPEGS QRVGLVASQK NDLDAVALMH PDGSAVVVVL NRSSKDVPLT IKDPAVGFLE TISPGYSIHT YLWHRQ Función: glucosilceramidasa.

55 Alfa-galactosidasa Número de acceso: P06280 Secuencia: LDNGLARTP TMGWLHWERF MCNLDCQEEP DSCISEKLFM EMAELMVSEG WKDAGYEYLC IDD-CWMAPQR DSEGRLQADP QRFPHGIRQL ANYVHSKGLK LGIYADVGNK TCAGFPGSFG YYDIDAQTFA DWGVDLLKFD GCYCDSLENL ADGYKHMSLA LNRTGRSIVY SCEWPLYMWP FQKPNYTEIR QYCNHWRNFA DIDDSWKSIK SILDWTSFNQ ERIVDVAGPG GWNDPDMLVI GNFGLSWNQQ VTQMALWAIM AAPLFMSNDL RHISPQAKAL LQDKDVIAIN QDPLGKQGYQ LRQGDNFEVW ERPLSGLAWA VAMINRQEIG GPRSYTIAVA SLG-KGVACNP ACFITQLLPV KRKLGFYEWT SRLRSHINPT GTVLLQLENT MQMSLKDLL Función: galactosidasa. Alteplasa

65 Número de acceso: P00750 Secuencia: SYQVI CRDEKTQMIY QQHQSWLRPV LRSNRVEYCW CNSGRAQCHS VPVKSCSEPR CFNGGTC

QQA LYFSDFVCQC PEGFAGKCCE IDTRATCYED QGISYRGTWS TAESGAECTN WNSSALAQKP YSGRRP-DAIR LGLGNHNYCR NPDRDSKPWC YVFKAGKYSS EFCSTPACSE GNSDCYFGNG SAYRGTHSLT ESGAS-CLPWN SMILIGKVYT AQNPSAQALG LGKHNYCRNP DGDAKPWCHV LKNRRLTWEY CDVPSCSTCG LR-QYSQPQFR IKGGLFADIA SHPWQAAIFA KHRRSPGERF LCGGILISSC WILSAAHCFQ ERFPPHHLTV IL-GRTYRVVP GEEEQKFEVE KYIVHKEFDD DTYDNDIALL QLKSDSSRCA QESSVVRTVC LPPADLQLPD WTE-CELSGYG KHEALSPFYS ERLKEAHVRL YPSSRCTSQH LLNRTVTDNM LCAGDTRSGG PQANLHDACQ GDS-GGPLVCL NDGRMTLVGI ISWGLGCGQK DVPGVYTKVT NYLDWIRDNM RP

Disulfuro: 41-71; 69-78; 86-97; 91-108;110-119; 127-208; 148 -190;. 179-203; 215-296;236-278; 267-291; 299430; 342-358; 350-419; 444-519; 476-492;509-537 (contado con 35 aa adicionales en el extremo Nl) Función: escinde el plasminógeno para formar plasmina

Antitrombina III Número de acceso: P01008 Secuencia: HGSPVDIC TAKPRDIPMN PMCIYRSPEK KATEDEGSEQ KIPEATNRRV WELSKANSRF ATTFYQH-LAD SKNDNDNIFL SPLSISTWA MTKLGACNDT LQQLMEVFKF DTISEKTSDQ IHFFFAKLNC RLYRKANKSS KLVSANRLFG DKSLTFNETY QDISELVYGA KLQPLDFKEN AEQSRAAINK WVSNKTEGRI TDVIPSEAIN ELTV-LVLVNT IYFKGLWKSK FSPENTRKEL FYKADGESCS ASMMYQEGKF RYRRVAEGTQ VLELPFKGDD ITMV-LILPKP EKSLAKVEKE LTPEVLQEWL DELEEMMLVV HMPRFRIEDG FSLKEQLQDM GLVDLFSPEK SKLPGI-VAEG RDDLYVSDAF HKAFLEVNEE GSEAAASTAV VIAGRSLNPN RVTFKANRPF LVFIREVPLN TIIFMGRVAN PCVK Disulfuro: 40-160;53-127; 279-462 (contado con 32 aa de secuencia señal) Función: inhibición de la coagulación. Aprotinina Número de acceso: P00974 Secuencia: RPDFC LEPPYTGPCK ARIIRYFYNA KAGLCQTFVY GGCRAKRNNF KSAEDCMRTC GGA Disulfuro: 40-90; 49-73; 65-86 (contando con 35 aa en el extremo N) Función: Inhibe tripsina, kalikreína, quimotripsina y plasmina. Asparaginasa Número de acceso: P20933 Secuencia: Cadena alfa: SPLPLV VNTWPFKNAT EAAWRALASG GSALDAVESG CAMCEREQCD GSVGFGGSPD ELGET-TLDAM IMDGTTMDVG AVGDLRRIKN AIGVARKVLE HTTHTLLVGE SATTFAQSMG FINEDLSTSA SQALHSD-WLA RNCQPNYWRN VIPDPSKYCG PYKPPGILKQ DIPIHKETED DRGHD Cadena beta: TIGMV VIHKTGHIAA GTSTNGIKFK IHGRVGDSPI PGAGAYADDT AGAAAATGNG DILMRFLPSY QAVEYMRRGE DPTIACQKVI SRIQKHFPEF FGAVICANVT GSYGAACNKL STFTQFSFMV YNSEKNQPTE EKVDCI Disulfuro: 64-69; 163-179; 286-306; 317-345 (contando con 23 aa extras en el extremo Nl) Función: escisión de glucoproteínas. Becaplermina Número de acceso: P01127 Secuencia: SLGSLTIAE PAMIAECKTR TEVFEISRRL IDRTNANFLV WPPCVEVQRC SGCCNNRNVQ CRP-TQVQLRP VQVRKIEIVR KKPIFKKATV TLEDHLACKC ETVAAARPVT RSPGGSQEQR AKTPQTRVTI RTVRVR-RPPK GKHRKFKHTH DKTALKETLG Disulfuro: 97-141; 130-178; 134-180; 124-124 INTERCADENA; 133-133 INTERCADENA. (contando con 81 aa en el extremo N) Función: factor de crecimiento de plaquetas. Proteína morofogénica ósea 7 Número de acceso: P34819 Secuencia: GKHNSAPMFM LDLYNAMAVE EGGGPAGQGF SYPYKAVFST QGPPLASLQD SHFLTDADMV MS-FVNLVEHD KEFFHPRYHH REFRFDLSKI PEGEAVTAAE FRIYKDYIRE RFDNETFRIS VYQVLQEHLG RES-DLFLLDS RTLWASEEGW LVFDITATSN HWVVNPRHNL GLQLCVETLD GQSINPK Función: induce la formación ósea, implicada en la regulación de Ca Catalasa Número de acceso: P04040 Secuencia: ADSRDPASDQ MQHWKEQRAA QKADVLTTGA GNPVGDKLNV ITVGPRGPLL VQDVVFTDEM AH-FDRERIPE RVVHAKGAGA FGYFEVTHDI TKYSKAKVFE HIGKKTPIAV RFSTVAGESG SADTVRDPRG FAVK-FYTEDG NWDLVGNNTP IFFIRDPILF PSFIHSQKRN PQTHLKDPDM VWDFWSLRPE SLHQVSFLFS DRGIP-DGHRH MNGYGSHTFK LVNANGEAVY CKFHYKTDQG IKNLSVEDAA RLSQEDPDYG IRDLFNAIAT GKYPSWT-FYI QVMTFNQAET FPFNPFDLTK VWPHKDYPLI PVGKLVLNRN PVNYFAEVEQ IAFDPSNMPP GIEASPDKML QGRLFAYPDT HRHRLGPNYL HIPVNCPYRA RVANYQRDGP MCMQDNQGGA PNYYPNSFGA PEQQPSALEH SIQYSGEVRR FNTANDDNVT QVRAFYVNVL NEEQRKRLCE NL4GHLKDAQ IFIQKKAVKN FTEVHPDYGS HIQALLDKYN AEKPKNAIHT FVQSGSHLAA REKANL Función: protección contra H2O2. Cecropina B Número de acceso: P01508

Secuencia: KWKV FKKIEKMGRN IRNGIVKAGP AIAVLGEAKA LG Función: Antibacteriana. Celulasa Número de acceso: P23548 Secuencia: MKKKGLKKTF FVIASLVMGF TLYGYTPVSA DAASVKGYYH TQGNKIVDES GKEAAFNGLN WF-GLETPNYT LHGLWSRSMD DMLDQVKKEG YNLIRLPYSN QLFDSSSRPD SIDYHKNPDL VGLNPIQIMD KLIEK-AGQRG IQIILDRHRP GSGGQSELWY TSQYPESRWI SDWKMLADRY KNNPTVIGAD LHNEPHGQAS WGT-GNASTDW RLAAQRAGNA ILSVNPNWLI LVEGVDHNVQ GNNSQYWWGG NLTGVANYPV VLDVPNRVVY SPH-DYGPGVS SQPWFNDPAF PSNLPAIWDQ TWGYISKQNI APVLVGEFGG RNVDLSCPEG KWQNALVHYI GANNLYFTYW SLNPNSGDTG GLLLDDWTTW NRPKQDMLGR IMKPVVSVAQ QAEAAAE Función: hidrólisis de celulosa. Alfa coriogonadotropina Número de acceso: P01215 Secuencia: APDVQD CPECTLQENP FFSQPGAPIL QCMGCCFSRA YPTPLRSKKT MLVQKNVTSE STCCVAK-SYN RVTVMGGFKV ENHTACHCST CYYHKS Función: un heterodímero de una cadena alfa común y una cadena beta única confiere especificidad biológica a la tirotropina, lutropina, folitropina y gonadotropina. Beta coriogonadotropina Número de acceso: P01233 Secuencia: SKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN TTICAGYCPT MTRVLQGVLP ALPQVVCNYR DVRFE-SIRLP GCPRGVNPVV SYAVALSCQC ALCRRSTTDC GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQ Disulfuro: 29-77; 43-92; 46-130; 54-108; 58-110; 113-120 Función: estimula la producción de esteroides. Quimopapaína Número de acceso: P14080 Secuencia: PQSID WRAKGAVTPV KNQGACGSCW AFSTIATVEG INKIVTGNLL ELSEQELVDC DKHSYGCKGG YQTT-SLQYVA NNGVHTSKVY PYQAKQYKCR ATDKPGPKVK ITGYKRVPSN CETSFLGALA NQPLSVLVEA GGKPFQ-LYKS GVFDGPCGTK LDHAVTAVGY GTSDGKNYII IKNSWGPNWG EKGYMRLKRQ SGNSQGTCGV YKSSYYP-FKG FA Disulfuro: 156-197; 190-229; 287-338 (contando con 134 aa en el extremo N) Función: tiol proteasa. Quimotripsina Número de acceso: P54414 Secuencia: MTTSAARKGL RTRGSACPRA TRSASSISSR AQVIVAGPIT DKLAQRTVAH LLALAEDSDE PINMLISSPG GH-VESGDMIH DVIKFIRPTV RTIGLAWVAS AGALIFVGAD KENRYCLPNT RFLIHQPSVG IGGTSTDMMI QAEQVRLMRD RLNQIFAEAT GQPVERIEKD TQRDFWLNTQ EALDYGLLGK VIRSVDELK Función: serina proteasa. Endotelina grande Secuencia: CSCSSLMDKECVYFCHLDIIWVNTPEHVVPYGLGSPRS Función: las endotelinas son péptidos vasoconstrictores derivados de endotelio. Toxina de Clostridium botulinum de tipo A Número de acceso: Q45894 Secuencia de cadena ligera A: PFVNKQFNYK DPVNGVDIAY IKIPNAGQMQ PVKAFKIHNK IWVIPERDTF TNPEEGDL-NP PPEAKQVPVS YYDSTYLSTD NEKDNYLKGV TKLFERIYST DLGRMLLTSI VRGIPFWGGS TIDTELKVID TNC-INVIQPD GSYRSEELNL VIIGPSADII QFECKSFGHD VLNLTRNGYG STQYIRFSPD FTFGFEESLE VDTNPLL-GAG KFATDPAVTL AHELIHAEHR LYGIAINPNR VFKVNTNAYY EMSGLEVSFE ELRTFGGHDA KFIDSLQENE FRLYYYNKFK DVASTLNKAK SIIGTTASLQ YMKNVFKEKY LLSEDTSGKF SVDKLKFDKL YKMLTEI YTE DN-FVNFFKVI NRKTYLNFDK AVFRINIVPD ENYTIKDGFN LKGANLSTNF NGQNTEINSR NFTRLKNFTG LFEFYKLL-CV RGIIPFKTKS LDEGYNK Secuencia de cadena pesada A: ALN DLCIKVNNWD LFFSPSEDNF TNDLDKVEEI TADTNIEAAE ENISLDLIQQ YYLT-FDFDNE PENISIENLS SDIIGQLEPM PNIERFPNGK KYELDKYTMF HYLRAQEFEH GDSRIILTNS AEEALLKPNV AYTFFSSKYV KKINKAVEAF MFLNWAEELV YDFTDETNEV TTMDKIADIT IIVPYIGPAL NIGNMLSKGE FVEAI-IFTGV VAMLEFIPEY ALPVFGTFAI VSYIANKVLT VQTINNALSK RNEKWDEVYK YTVTNWLAKV NTQIDLIREK MKKALENQAE ATKAIINYQY NQYTEEEKNN INFNIDDLSS KLNESINSAM ININKFLDQC SVSYLMNSMI PYAVKRLKDF DASVRDVLLK YIYDNRGTLV LQVDRLKDEV NNTLSADIPF QLSKYVDNKK LLSTFTEYIK NIVNT-SILSI VYKKDDLLDL SRYGAKINIG DRVYYDSIDK NQIKLINLES STIEVILKNA IVYNSMYENF STSFWIKIPK YF-SKINLNNE YTIINCIENN SGWKVSLNYG EIIWTLQDNK QNIQRVVFKY SQMVNISDYI NRWIFVTITN NRLTKSKlYI NGRLIDQKPI SNLGNIHASN KIMFKLDGCR DPRRYIMIKY FNLFDKELNE KEIKDLYDSQ SNSGILKDFW GNYLQYDKPY YMLNLFDPNK YVDVNNIGIR GYMYLKGPRG SVVTTNIYLN STLYEGTKFI IKKYASGNED NIVRNNDRVY INVVVKNKEY RLATNASQAG VEKILSALEI PDVGNLSQVV VMKSKDDQGI RNKCKMNLQD NNG-NDIGFIG FHLYDNIAKL VASNWYNRQV GKASRTFGCS WEFIPVDDGW GESSL Disulfuro: 429-453 INTERCADENA (POR SIMIMLITUD); 1234-1279 Función: bloqueante de la liberación de neurotransmisores por hidrólisis de snap25. Toxina de Clostridium botulinum de tipo B

Número de acceso: P10844 Secuencia: PVTINNFNYN DPIDNNNIIM MEPPFARGTG RYYKAFKITD RIWIIPERYT FGYKPEDFNK SSGIFNRD-VC EYYDPDYLNT NDKKNIFLQT MIKLFNRIKS KPLGEKLLEM IINGIPYLGD RRVPLEEFNT NIASVTVNKL ISNP-GEVERK KGIFANLIIF GPGPVLNENE TEDIGIQNHF ASREGFGGIM QMKFCPEYVS VFNNVQENKG ASIF-NRRGYF SDPALILMHE LIHVLHGLYG IKVDDLPIVP NEKKFFMQST DAIQAEELYT FGGQDPSIIT PSTDKSIYDK VLQNFRGIVD RLNKVLVCIS DPNININIYK NKFKDKYKFV EDSEGKYSID VESFDKLYKS LMFGFTETNI AENYKIK-TRA SYFSDSLPPV KIKNLLDNEI YTIEEGFNIS DKDMEKEYRG QNKAINKQAY EEISKEHLAV YKIQMCKSVK APGICIDVDN EDLFFIADKN SFSDDLSKNE RIEYNTQSNY IENDFPINEL ILDTDLISKI ELPSENTESL TDFN-VDVPVY EKQPAIKKIF TDENTIFQYL YSQTFPLDIR DISLTSSFDD ALLFSNKVYS FFSMDYIKTA NKVVEAGLFA GWVKQIVNDF VIEANKSNTM DKIADISLIV PYIGLALNVG NETAKGNFEN AFEIAGASIL LEFIPELLIP VVGAFLLE-SY IDNKNKIIKT IDNALTKRNE KWSDMYGLIV AQWLSTVNTQ FYTIKEGMYK ALNYQAQALE EIIKYRYNIY SEKEKSNINI DFNDINSKLN EGINQAIDNI NNFINGCSVS YLMKKMIPLA VEKLLDFDNT LKKNLLNYID ENKLYLIG-SA EYEKSKVNKY LKTIMPFDLS IYTNDTILIE MFNKYNSEIL NNIILNLRYK DNNLIDLSGY GAKVEVYDGV ELND-KNQFKL TSSANSKIRV TQNQNIIFNS VFLDFSVSFW IRIPKYKNDG IQNYIHNEYT IINCMKNNSG WKISIRGNRI IWTLIDINGK TKSVFFEYNI REDISEYINR WFFVTITNNL NNAKIYINGK LESNTDIKDI REVIANGEII FKLDGDIDRT QFIWMKYFSI FNTELSQSNI EERYKIQSYS EYLKDFWGNP LMYNKEYYMF NAGNKNSYIK LKKDSPVGEI LTRSKYNQNS KYINYRDLYI GEKFIIRRKS NSQSINDDIV RKEDYIYLDF FNLNQEWRVY TYKYFKKEEE KLFLA-PISDS DEFYNTIQIK EYDEQPTYSC QLLFKKDEES TDEIGLIGIH RFYESGIVFE EYKDYFCISK WYLKEVKRKP YNLKLGCNWQ FIPKDEGWTE Disulfuro: 436-445 INTERCADENA (PROBABLE). Función: endopeptidasa que escinde la sinaptobrevina-2 y por tanto bloquea la neurotransmisión. Colágeno Número de acceso: P30754 Secuencia: YRAGPRYIQA QVGPIGPRGP PGPPGSPGQQ GYQGLRGEPG DSGPMGPIGK RGPPGPAGIA GKS-GDDGRDG EPGPRGGIGP MGPRGAGGMP GMPGPXGHRG FRGLSGSXGE QGKSGNQGPD GGPGPAGPSG PIGPRGQTGE RGRDGKSGLP GLRGVDGLAG PPGPPGPIGS TGSPGFPGTP GSKGDRGQSG LXGAQGLQGP VGLSGQPGVA GENGHPGMPG MDGANGEPGA SGESGLPGPS GFPGPRGMPG TAGSPGQAGA XGDGGPT-GEQ GRPGAPGVXG SSGPPGDVGA PGHAGEAGKR GSPGSPGPAG SPGPQGDRGL PGSRGLPGMT GAS-GAMGIPG EKGPSGEPGA KGPTGDTGRQ GNQGTPGIAG LPGNPGSDGR PGKDGRPGIR GKDGKQGEQG PQGPQGLAGL QGRAGPPGAR GEPGKNGAPG EPGAHGEQGD AGKDGETGAA GPPGAAGPTG ARGPPG-PRGQ QGFQGLAGAQ GTPGEAGKTG ERGAVGATGP SGPAGPGGER GAPGDRGNVG PRGMPGERGA TGPAGPTGSP GVAGAKGQGG PPGPAGLVGL PGERGPKGVG GSXGSRGDIG PRGKAGERGK DGERGER-GEN GLPGPSGLAA SXGERGDMGS PGERGSPGPA GERGPAGSQG IQGQPGPPGD AGPAGTXGDI GF-PGERGTRG ATGKQGARGP RGLAGKRGLR GAGGSRGETG AQGEIGLPGS PGQPGLPGPS GQPGPSGPAG TAGKQGVXGA RGSPGLVGKQ GDRGSDGEPG RDGTXGERGE DGPPGVSGPT GAPGQQGERG MPGM-VGLRGE TGPMGGQGMX GDGGPPGPSG DRGERGNAGP QGPTGPSGQA GAPGQEGAPG KDGLPGLAGR PGERGEPGVA GRAGSQGLAG LMGQRGLPGA AGPPGDRGER GEPGGQGVQG PVGAPGSQGP AGIMGMX-GEA GGKGAXGDKG WTGLPGLQGL QGTPGHSGES GPPGAPGPRG ARGEAGGRGS QGPPGKDGQP GPS-GRVGPRG PSGDDGRSGP PGPPGPPGPP GNSDYGA Función: formación de fibrilla Colagenasa Número de acceso: P08897 Secuencia: IINGYEAYTG LFPYQAGLDI TLQDQRRVWC GGSLIDNKWI LTAAHCVHDA VSVVVYLGSA VQYEGEAVVN SERIISHSMF NPDTYLNDVA LIKIPHVEYT DNIQPIRLPS GEELNNKFEN IWATVSGWGQ SNT-DTVILQY TYNLVIDNDR CAQEYPPGII VESTICGDTC DGKSPCFGDS GGPFVLSDKN LLIGVVSFVS GAGCES-GKPV GFSRVTSYMD WIQQNTGIIF Disulfuro: 60-76; 181-196; 206-234 Función: Serina proteasa. Corticotropina, ACTH Número de acceso: P01189 Secuencia: WCLE SSQCQDLTTE SNLLECIRAC KPDLSAETPM FPGNGDEQPL TENPRKYVMG HFRWDRFGRR NSSSSGSSGAGQKREDVSAG EDCGPLPEGG PEPRSDGAKP GPREGKRSYS MEHFRWGKPV GKKRRPVKVY PNGAEDESAE AFPLEFKREL TGQRLREGDG PDGPADDGAG AQADLEHSLL VAAEKKDEGP YRMEHFRWGS PPKDKRYGGF MTSEKSQTPL VTLFKNAIIK NAYKKGE Disulfuro: 28-50 (contando con una señal de 26 aa) Función: estimulación de melanocitos. Domasa alfa Número de acceso: P24855 LKIAAFNI QTFGETKMSN ATLVSYIVQI LSRYDIALVQ EVRDSHLTAV GKLLDNLNQD APDTYHYVVS EPLGRN-SYKE RYLFVYRPDQ VSAVDSYYYD DGCEPCGNDT FNREPAIVRF FSRFTEVREF AIVPLHAAPG DAVAEIDALY DVYLDVQEKW GLEDVMLMGD FNAGCSYVRP SQWSSIRLWT SPTFQWLIPD SADTTATPTH CAYDRIVVAG MLLRGAVVPD SALPFNFQAA YGLSDQLAQA ISDHYPVEVM LK Disulfuro: 123-126; 195-231 (contando con 21 aa extra en el extremo N) Función: endonucleolítica, se une a G-actina.

Eptacog alfa (factor VII) Número de acceso: P08709 Secuencia: NAFLEELRP GSLERECKEE QCSFEEAREI FKDAERTKLF WISYSDGDQC ASSPCQNGGS CK-DQLQSYIC FCLPAFEGRN CETHKDDQLI CVNENGGCEQ YCSDHTGTKR SCRCHEGYSL LADGVSCTPT VEYPCGKIPI LEKRNASKPQ GRIVGGKVCP KGECPWQVLL LVNGAQLCGG TLINTIWVVS AAHCFDKIKN WRN-LIAVLGE HDLSEHDGDE QSRRVAQVII PSTYVPGTTN HDIALLRLHQ PVVLTDHVVP LCLPERTFSE RTLAFVRF-SL VSGWGQLLDR GATALELMVL NVPRLMTQDC LQQSRKVGDS PNITEYMFCA GYSDGSKDSC KGDSGG-PHAT HYRGTWYLTG IVSWGQGCAT VGHFGVYTRV SQYIEWLQKL MRSEPRPGVL LRAPFP Disulfuro: 77-82; 110-121; 115-130; 132-141; 151-162; 158-172; 174-187; 195-322; 219-224; 238-254; 370-389; 400-428 (contando con 61 aa en el extremo N) Función: coagulación. Etanercept Número de acceso: P20333 Secuencia: LPAQVAFT PYAPEPGSTC RLREYYDQTA QMCCSKCSPG QHAKVFCTKT SDTVCDSCED STYTQL-WNWV PECLSCGSRC SSDQVETQAC TREQNRICTC RPGWYCALSK QEGCRLCAPL RKCRPGFGVA RPGTET-SDVV CKPCAPGTFS NTTSSTDICR PHQICNVVAI PGNASRDAVC TSTSPTRSMA PGAVHLPQPV STR-SQHTQPT PEPSTAPSTS FLLPMGPSPP AEGSTGDFAL PVGLIVGVTA LGLLIIGVVN CVIMTQVKKK PLCLQREAKV PHLPADKARG TQGPEQQHLL ITAPSSSSSS LESSASALDR RAPTRNQPQA PGVEASGAGE AR-ASTGSSDS SPGGHGTQVN VTCIVNVCSS SDHSSQCSSQ ASSTMGDTDS SPSESPKDEQ VPFSKEECAF RSQLETPETL LGSTEEKPLP LGVPDAGMKP S Disulfuro: 40-53; 54-67; 57-75; 78-93; 96-110; 100-118; 120-126; 134-143; 137-161; 164 179 (contando con 22 aa extras en el extremo N) Función: receptor del TNF-alfa. Eritropoyetina Número de acceso: P01588 Secuencia: APP RLICDSRVLE RYLLEAKEAE NITTGCAEHC SLNENITVPD TKVNFYAWKR MEVGQQAVEV WQGLALLSEA VLRGQALLVN SSQPWEPLQL HVDKAVSGLR SLTTLLRALG AQKEAISPPD AASAAPLRTI TADT-FRKLFR VYSNFLRGKL KLYTGEACRT GDR Disulfuro: 34-188; Disulfuro: 56-60 (contado con 27 aa en el extremo N) Fragmento de eritropoyetina: Secuencia: YASHFGPLGWVCK Anillo de lantionina postraduccional: S3-C12 Fragmento 2 de eritropoyetina: Secuencia: YASHFGPLTWVCK Anillo de lantionina postraduccional: S3-C12 Función: eritropoyesis. Exendina-4 Número de acceso: P26349 Secuencia: MPVESGL SSEDSASSES FASKIKRHGE GTFTSDLSKQ MEEEAVRLFI EWLKNGGPSS GAPPPSG 86 AMIDACIÓN (G-87 PROPORCIONA EL GRUPO AMIDA). (contando con 23 aa de señal en el extremo Nl) Función: similar a secretina Factor VIII Número de acceso: P00451 Secuencia: A TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AK-PRPPWMGL LGPTIQAEVY DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG GSH-TYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEG-KSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHT-FLVRNH RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE EPQLRMKNNE EAEDYD-DDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRI-GR KYKKVRFMAY TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGN-QIMSDKR NVILFSVFDE NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL HEVAY-WYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTAL-LKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL SKNNAIEPRS FSQNSRHPST RQKQFNATTI PENDIEKTDP WFAHRTPMPK IQNVSSSDLL MLLRQSPTPH GLSLSDLQEA KYETFSDDPS PGAIDSNNSL SEMTHFRPQL HHSGDMVFTP ESGLQLRLNE KLGTTAATEL KKLDFKVSST SNNLISTIPS DNLAAGTDNT SSLGPPSMPV HYD-SQLDTTL FGKKSSPLTE SGGPLSLSEE NNDSKLLESG LMNSQESSWG KNVSSTESGR LFKGKRAHGP ALL-TKDNALF KVSISLLKTN KTSNNSATNR KTHIDGPSLL IENSPSVWQN ILESDTEFKK VTPLIHDRML MDKNATAL-RL NHMSNKTTSS KNMEMVQQKK EGPIPPDAQN PDMSFFKMLF LPESARWIQR THGKNSLNSG QGPSP-KQLVS LGPEKSVEGQ NFLSEKNKVV VGKGEFTKDV GLKEMVFPSS RNLFLTNLDN LHENNTHNQE KKIQEE-IEKK ETLIQENVVL PQIHTVTGTK NFMKNLFLLS TRQNVEGSYD GAYAPVLQDF RSLNDSTNRT KKHTAHFSKK GEEENLEGLG NQTKQIVEKY ACTTRISPNT SQQNFVTQRS KRALKQFRLP LEETELEKRI IVDDTSTQWS KNM-KHLTPST LTQIDYNEKE KGAITQSPLS DCLTRSHSIP QANRSPLPIA KVSSFPSIRP IYLTRVLFQD NSSHLPAASY RKKDSGVQES SHFLQGAKKN NLSLAILTLE MTGDQREVGS

LGTSATNSVT YKKVENTVLP KPDLPKTSGK VELLPKVHIY QKDLFPTETS NGSPGHLDLV EGSLLQGTEG AIKWNEANRP GKVPFLRVAT ESSAKTPSKL LD-PLAWDNHY GTQIPKEEWK SQEKSPEKTA FKKKDTILSL NACESNHAIA AINEGQNKPE IEVTWAKQGR TERLC-SQNPP VLKRHQREIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERL-WDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRN-QASR PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD CKAWAYFSDV DLEKD-VHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRF-HAI NGYIMDTLPG LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD SS-GIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSP-SKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL Y Disulfuro: 172-198; 547-573; 1851-1877; 2040-2188; 2193-2345 (contando con 19 aa extras en el extremo N) Función: coagulación. Factor IX Número de acceso: P00740 Secuencia: Cadena ligera: NSG KLEEFVQGNL ERECMEEKCS FEEAREVFEN TERTTEFWKQ YVDGDQCESN PCLNGGSCKD DINSYECWCP FGFEGKNCEL DVTCNIKNGR CEQFCKNSAD NKVVCSCTEG YRLAENQKSC EPAVPFPCGR VSVSQTSKLT R Cadena pesada: AEAVFPDVD YVNSTEAETI LDNITQSTQS FNDFTRVVGG EDAKPGQFPW QVVLNGKVDA FCGGSIVNEK WIVTAAHCVE TGVKITVVAG EHNIEETEHT EQKRNVIRII PHHNYNAAIN KYNHDIALLE LDEPLV-LNSY VTPICIADKE YTNIFLKFGS GYVSGWGRVF HKGRSALVLQ YLRVPLVDRA TCLRSTKFTI YNNMFCAGFH EGGRDSCQGD SGGPHVTEVE GTSFLTGIIS WGEECAMKGK YGIYTKVSRY VNWIKEKTKL T Disulfuro: 64-69; 97-108; 102-117; 119-128; 134-145; 141-155; 157-170 (contado en el precursor) Función: coagulación.

Factor X Número de acceso: P00742 Secuencia: Cadena ligera: ANSFLEEMKK GHLERECMEE TCSYEEAREV FEDSDKTNEF WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK CK-DGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSVVCS CARGYTLADN GKACIPTGPY PCG-KQTLER Cadena pesada: R KRSVAQATSS SGEAPDSITW KPYDAADLDP TENPFDLLDF NQTQPERGDN NLTRIVGGQE CK-DGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEVVIK HN-RFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPY-VDRNSC KLSSSFIITQ NMFCAGYDTK QEDACQGDSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK Disulfuro: 90-101; 95-110; 112-121; 129-140; 136-149; 151-164; 172-342; 241-246; 261 277; 390-404; 415-443 (contado con 40 aa de secuencia señal) Función: coagulación, el factor Xa (parte de la cadena pesada del factor X) es una glucoproteína dependiente de vitamina K que convierte la protrombina en trombina en presencia de, entre otros, fosfolípido aniónico. Factor XIII Número de acceso: P00488 Secuencia: VN LQEFLNVTSV HLFKERWDTN KVDHHTDKYE NNKLIVRRGQ SFYVQIDFSR PYDPRRDLFR VE-YVIGRYPQ ENKGTYIPVP IVSELQSGKW GAKIVMREDR SVRLSIQSSP KCIVGKFRMY VAVWTPYGVL RTSRN-PETDT YILFNPWCED DAVYLDNEKE REEYVLNDIG VIFYGEVNDI KTRSWSYGQF EDGILDTCLY VMDRAQM-DLS GRGNPIKVSR VGSAMVNAKD DEGVLVGSWD NIYAYGVPPS AWTGSVDILL EYRSSENPVR YGQCWVF-AGV FNTFLRCLGI PARIVTNYFS AHDNDANLQM DIFLEEDGNV NSKLTKDSVW NYHCWNEAWM TRP-DLPVGFG GWQAVDSTPQ ENSDGMYRCG PASVQAIKHG HVCFQFDAPF VFAEVNSDLI YITAKKDGTH VVEN-VDATHI GKLIVTKQIG GDGMMDITDT YKFQEGQEEE RLALETALMY GAKKPLNTEG VMKSRSNVDM DFEVE-NAVLG KDFKLSITFR NNSHNRYTIT AYLSANITFY TGVPKAEFKK ETFDVTLEPL SFKKEAVLIQ AGEYMGQLLE QASLHFFVTA RINETRDVLA KQKSTVLTIP EIIIKVRGTQ VVGSDMTVTV QFTNPLKETL RNVWVHLDGP GVTRP-MKKMF REIRPNSTVQ WEEVCRPWVS GHRKLIASMS SDSLRHVYGE LDVQIQRRPS M Función: coagulación, estabiliza indirectamente cadenas de fibrina. Fibronectina Número de acceso: P02751 Secuencia: QAQQMVQPQ SPVAVSQSKP GCYDNGKHYQ INQQWERTYL GNALVCTCYG GSRGFNCESK PE-AEETCFDK YTGNTYRVGD TYERPKDSMI WDCTCIGAGR GRISCTIANR CHEGGQSYKI GDTWRRPHET GGYM-LECVCL GNGKGEWTCK PIAEKCFDHA AGTSYVVGET WEKPYQGWMM VDCTCLGEGS GRITCTSRNR CNDQDTRTSY RIGDTWSKKD NRGNLLQCIC TGNGRGEWKC ERHTSVQTTS SGSGPFTDVR AAVYQPQPHP QPPPYGHCVT DSGVVYSVGM QWLKTQGNKQ MLCTCLGNGV SCQETAVTQT YGGNSNGEPC VLPFTYNGRT FYSCTTEGRQ DGHLWCSTTS NYEQDQKYSF CTDHTVLVQT QGGNSNGALC HFPFLYNNHN YTDCTSEGRR DNMKWCGTTQ NYDADQKFGF CPMAAHEEIC TTNEGVMYRI GDQWDKQHDM GHMMRCTCVG NGRGEWT-CIA YSQLRDQCIV DDITYNVNDT FHKRHEEGHM

LNCTCFGQGR GRWKCDPVDQ CQDSETGTFY QIGD-SWEKYV HGVRYQCYCY GRGIGEWHCQ PLQTYPSSSG PVEVFITETP SQPNSHPIQW NAPQPSHISK YILR-WRPKNS VGRWKEATIP GHLNSYTIKG LKPGVVYEGQ LISIQQYGHQ EVTRFDFTTT STSTPVTSNT VTGET-TPFSP LVATSESVTE ITASSFVVSW VSASDTVSGF RVEYELSEEG DEPQYLDLPS TATSVNIPDL LPGRKYIVNV YQISEDGEQS LILSTSQTTA PDAPPDPTVD QVDDTSIVVR WSRPQAPITG YRIVYSPSVE GSSTELNLPE TANS-VTLSDL QPGVQYNITI YAVEENQEST PVVIQQETTG TPRSDTVPSP RDLQFVEVTD VKVTIMWTPP ESAVT-GYRVD VIPVNLPGEH GQRLPISRNT FAEVTGLSPG VTYYFKVFAV SHGRESKPLT AQQTTKLDAP TN-LQFVNETD STVLVRWTPP RAQITGYRLT VGLTRRGQPR QYNVGPSVSK YPLRNLQPAS EYTVSLVAIK GN-QESPKATG VFTTLQPGSS IPPYNTEVTE TTIVITWTPA PRIGFKLGVR PSQGGEAPRE VTSDSGSIVV SGLT-PGVEYV YTIQVLRDGQ ERDAPIVNKV VTPLSPPTNL HLEANPDTGV LTVSWERSTT PDITGYRITT TPTNGQQGNS LEEVVHADQS SCTFDNLSPG LEYNVSVYTV KDDKESVPIS DTIIPAVPPP TDLRFTNIGP DTM-RVTWAPP PSIDLTNFLV RYSPVKNEED VAELSISPSD NAVVLTNLLP GTEYVVSVSS VYEQHESTPL RGRQKT-GLDS PTGIDFSDIT ANSFTVHWIA PRATITGYRI RHHPEHFSGR PREDRVPHSR NSITLTNLTP GTEYVVSIVA LNGREESPLL IGQQSTVSDV PRDLEVVAAT PTSLLISWDA PAVTVRYYRI TYGETGGNSP VQEFTVPGSK STA-TISGLKP GVDYTITVYA VTGRGDSPAS SKPISINYRT EIDKPSQMQV TDVQDNSISV KWLPSSSPVT GYRVTT-TPKN GPGPTKTKTA GPDQTEMTIE GLQPTVEYVV SVYAQNPSGE SQPLVQTAVT NIDRPKGLAF TDVDVDSIKI AWESPQGQVS RYRVTYSSPE DGIHELFPAP DGEEDTAELQ GLRPGSEYTV SVVALHDDME SQPLIGTQST AI-PAPTDLKF TQVTPTSLSA QWTPPNVQLT GYRVRVTPKE KTGPMKEINL APDSSSVVVS GLMVATKYEV SVY-ALKDTLT SRPAQGVVTT LENVSPPRRA RVTDATETTI TISWRTKTET ITGFQVDAVP ANGQTPIQRTIKPDVRSY-TI TGLQPGTDYK IYLYTLNDNA RSSPVVIDAS TAIDAPSNLR FLATTPNSLL VSWQPPRARI TGYIIKYEKP GSP-PREVVPR PRPGVTEATI TGLEPGTEYT IYVIALKNNQ KSEPLIGRKK TDELPQLVTL PHPNLHGPEI LDVP-STVQKT PFVTHPGYDT GNGIQLPGTS GQQPSVGQQM IFEEHGFRRT TPPTTATPIR HRPRPYPPNV GEEI-QIGHIP REDVDYHLYP HGPGLNPNAS TGQEALSQTT ISWAPFQDTS EYIISCHPVG TDEEPLQFRV PGTSTS-ATLT GLTRGATYNI IVEALKDQQR HKVREEVVTV GNSVNEGLNQ PTDDSCFDPY TVSHYAVGDE WERMSES-GFK LLCQCLGFGS GHFRCDSSRW CHDNGVNYKI GEKWDRQGEN GQMMSCTCLG NGKGEFKCDP HEATCY-DDGK TYHVGEQWQK EYLGAICSCT CFGGQRGWRC DNCRRPGGEP SPEGTTGQSY NQYSQRYHQR TNTNVNCPIE CFMPLDVQAD REDSRE Disulfuro: 52-78; 76-87; 97-125; 123-135; 141-169; 167-179; 186-215; 213-225; 231-260; 258-270; 308-335; 333342; 360-386; 374-401; 420-446; 434-461; 470-498; 496-508; 518 545; 543-555; 561-589; 587-599; 2206-2235; 2233-2245; 2251-2278; 2276-2288; 2295-2319; 2317-2333; 2367-2367; 2371-2371 INTERCADENA (CON 2367 DE OTRA CADENA). (contado con 31 aa extras en el extremo N) Función: cicatrización de heridas, forma celular. Fibrinógeno Número de acceso: P02671 Secuencia: GPRVV ERHQSACKDS DWPFCSDEDW NYKCPSGCRM KGLIDEVNQD FTNRINKLKN SLFEYQKNNK DSHSLTTNIM EILRGDFSSA NNRDNTYNRV SEDLRSRIEV LKRKVIEKVQ HIQLLQKNVR AQLVDMKRLE VDIDIKIRSC RGSCSRALAR EVDLKDYEDQ QKQLEQVIAK DLLPSRDRQH LPLIKMKPVP DLVPGNFKSQ LQKVPPEWKA LTDMPQMRME LERPGGNEIT RGGSTSYGTG SETESPRNPS SAGSWNSGSS GPGSTGNRNP GSSGTGGTAT WKPGSSGPGS TGSWNSGSSG TGSTGNQNPG SPRPGSTGTW NPGSSERG-SA GHWTSESSVS GSTGQWHSES GSFRPDSPGS GNARPNNPDW GTFEEVSGNV SPGTRREYHT EKLVT-SKGDK ELRTGKEKVTSGSTTTTRRS CSKTVTKTVI GPDGHKEVTK EVVTSEDGSD CPEAMDLGTL SGIGTLDG-FR HRHPDEAAFF DTASTGKTFP GFFSPMLGEF VSETESRGSE SGIFTNTKES SSHHPGIAEF PSRGKSSSYS KQFTSSTSYN RGDSTFESKS YKMADEAGSE ADHEGTHSTK RGHAKSRPVR DCDDVLQTHP SGTQSGIFNI KLPGSSKIFS VYCDQETSLG GWLLIQQRMD GSLNFNRTWQ DYKRGFGSLN DEGEGEFWLG NDYLHLLTQR GSVLRVELED WAGNEAYAEY HFRVGSEAEG YALQVSSYEG TAGDALIEGS VEEGAEYTSH NNMQFSTFDR DADQWEENCA EVYGGGWWYN NCQAANLNGI YYPGGSYDPR NNSPYEIENG VVWVSFRGAD YSLRAVRMKI RPLVTQ Disulfuro: 47-47 INTERCADENA (CON C-47'); 55-55 INTERCADENA (CON C-95 EN BETA); 64 -64 INTERCADENA (CON C-49 EN GAMMA); 68-68 INTERCADENA (CON C-106 EN BETA); 180 -180 INTERCADENA (CON C-165 EN GAMMA); 184-184 INTERCADENA (CON C-223 EN BETA); 461-491 Función: información de fibrina, agregación plaquetaria. Filgrastim Número de acceso: P09919 Secuencia: TPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLVSECA TYKLCHPEEL VLLGHSLGIP WAPLSS-CPSQ ALQLAGCLSQ LHSGLFLYQG LLQALEGISP ELGPTLDTLQ LDVADFATTI WQQMEELGMA PALQPTQ-GAM PAFASAFQRR AGGVLVASHL QSFLEVSYRV LRHLAQP Disulfuro: 69-75; 97-107 (contado con 30 aa en el extremo N) Función: estimulación de granulocitos. Alfa folitropina Número de acceso: P37036 Secuencia: FPBGZFTMZG CPZCKLKZBK YFSKLGAPIY ZCMGCCFSRA YPTPARSKKT MLVPKNITSZ ATCC-VAKAFT KATVMGBARV ZNHTZCHCST CYYHKS Disulfuro: 11-35; 14-64; 32-86; 36-88; 63-91 Función: estimulación de folículos. Beta folitropina Número de acceso: P01225

Secuencia: S CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAH-HADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST DCTVRGLGPS YCSFGEMKE Disulfuro: 21-69; 35-84; 38-122; 46-100; 50-102; 105-112 (contado con 18 aaen el extremo N) Función: estimulación de folículos. Hormona liberadora de la hormona de crecimiento Número de acceso: P48144 Secuencia: HADGLLDR ALRDILVQLS ARKYLHSLTA VRVGEEEEDE EDSEPLS Función: liberación de la hormona de crecimiento. Polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria Número de acceso: P48144 Secuencia: H SDGIFTDSYS RYRKQMAVKK YLAAVLGRRY RQRFRN (amidación del último resto) Función: véase el nombre. Hialuronidasa Número de acceso: P38567 Secuencia: LNFRA PPVIPNVPFL WAWNAPSEFC LGKFDEPLDM SLFSFIGSPR INATGQGVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL QDHLDKAKKD ITFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLS LTEATEKAKQ EFEKAGKDFL VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVREAIRVSK IPDAKSPLPV FAYTRIVFTD QVLK-FLSQDE LVYTFGETVALGASGIVIWG TLSIMRSMKS CLLLDNYMETILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK NWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK PTLEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADVK DTDAVDVCIADGV-CIDAFLK PPMETEEPQI FYNASPSTLS ATMFIVSILF LIISSVASL Función: glucosil hidrolasa. Hirudina II Número de acceso: P28504 Secuencia: ITYTDCTESG QDLCLCEGSN VCGKGNKCIL GSNGEENQCV TGEGTPKPQS HNDGDFEEIP EEYLQ Disulfuro: 6-14; 16-28; 22-39 Función: inhibidor de trombina. Imiglucerasa Número de acceso: P04062 Secuencia: A RPCIPKSFGY SSVVCVCNAT YCDSFDPPTF PALGTFSRYE STRSGRRMEL SMGPIQANHT GT-GLLLTLQP EQKFQKVKGF GGAMTDAAAL NILALSPPAQ NLLLKSYFSE EGIGYNIIRV PMASCDFSIR TYTY-ADTPDD FQLHNFSLPE EDTKLKIPLI HRALQLAQRP VSLLASPWTS PTWLKTNGAV NGKGSLKGQP GDIYHQT-WAR YFVKFLDAYAEHKLQFWAVT AENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLML DDQRLLLPHW AKVVLTDPEA AKYVHGIAVH WYLDFLAPAK ATLGETHRLF PNTMLFASEA CVGSKFWEQS VRLGSWDRGM QYSHSIITNL LYHVVGWTDW NLALNPEGGP NWVRNFVDSP IIVDITKDTF YKQPMFYHLG HF-SKFIPEGS QRVGLVASQK NDLDAVALMH PDGSAVVVVL NRSSKDVPLT IKDPAVGFLE TISPGYSIHT YLWHRQ Función: Glucoihidrolasa. Interleuquina 2 Número de acceso: P01585 Secuencia: APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELK-PLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT Disulfuro: 78-125 (contado con 20 aa de señal en el extremo N) Función: factor de crecimiento. Interferón alfa-4 Número de acceso: P01562 Secuencia: CDLPETH SLDNRRTLML LAQMSRISPS SCLMDRHDFG FPQEEFDGNQ FQKAPAISVL HELIQQIFNL FTTKDSSAAW DEDLLDKFCT ELYQQLNDLE ACVMQEERVG ETPLMNADSI LAVKKYFRRI TLYLTEKKYS PCAWEVVRAE IMRSLSLSTN LQERLRRKE Disulfuro: 24-122; 52-162 (contado con 23 aa en el extremo N) Función: Antiviral, el interferón estimula la producción de dos enzimas, una proteína quinasa y una oligoadenilato sintetasa. Interferón-beta Número de acceso: P01575 Secuencia: INYKQLQLQ ERTNIRKCQE LLEQLNGKIN LTYRADFKIP MEMTEKMQKS YTAFAIQEML QNVFLV-FRNN FSSTGWNETI VVRLLDELHQ QTVFLKTVLE EKQEERLTWE MSSTALHLKS YYWRVQRYLK LMKYN-SYAWM VVRAEIFRNF LIIRRLTRNF QN Función: antiviral, antibacteriana y anticancerosa. Factor intrínseco Número de acceso: P27352 Secuencia: ST QTQSSCSVPS AQEPLVNGIQ VLMENSVTSS AYPNPSILIA MNLAGAYNLK AQKLLTYQLM SSDN-NDLTIG HLGLTIMALT SSCRDPGDKV SILQRQMENW APSSPNAEAS AFYGPSLAIL ALCQKNSEAT LPIAVR-FAKT LLANSSPFNV DTGAMATLAL TCMYNKIPVG SEEGYRSLFG QVLKDIVEKI SMKIKDNGII GDIYSTGLAM QALSVTPEPS KKEWNCKKTT DMILNEIKQG KFHNPMSIAQ ILPSLKGKTY LDVPQVTCSP DHEVQPTLPS NPG-PGPTSAS NITVIYTINN QLRGVELLFN ETINVSVKSG SVLLVVLEEA QRKNPMFKFE

TTMTSWGLVV SSINNI-AENV NHKTYWQFLS GVTPLNEGVA DYIPFNHEHI TANFTQY Disulfuro: 26-246; 103-288; 143-182 (contado con 18 aa extras en el extremo N) Función: endocitosis de cobalamina

Invertasa Número de acceso: Q60115 Secuencia: MFNFNASRWT RAQAMKVNKF DLTTSMPEIG TDFPINIRDDL WLWDTWPLRD INGNPVSFKG WNV-IFSLVAD RNIPWNDRHS HARIGYFYSK DGKSWVYGGH LLQESANTRT AEWSGGTIMA PGSRNQVETF FT-STLFDKNG VREAVAAVTK GRIYADSEGV WFKGFDQSTD LFQADGLFYQ NYAENNLWNF RDPHVFINPE DG-ETYALFEA NVATVRGEDD IGEDEIGPVP ANTVVPKDAN LCSASIGIAR CLSPDRTEWE LLPPLLTAFG VNDQMERPHV IFQNGLTYLF TISHDSTYAD GLTGSDGLYG FVSENGIFGP YEPLNGSGLV LGGPASQPTE AYAHYIMNNG LVESFINEII DPKSGKVIAG GSLAPTVRVE LQGHETFATE VFDYGYIPAS YAWPVWPFPD RRK Función: sacarasa. Lepirudina Número de acceso: P01050 Secuencia: VVYTDCTESG QNLCLCEGSN VCGQGNKCIL GSDGEKNQCV TGEGTPKPQS HNDGDFEEIP EEYLQ Disulfuros: 6-14; 16-28 Función: inhibidor de trombina. Beta lutropina Número de acceso: P01229 Secuencia: SREPLRPWCH PINAILAVEK EGCPVCITVN TTICAGYCPT MMRVLQAVLP PLPQVVCTYR DVRFE-SIRLP GCPRGVDPVV SFPVALSCRC GPCRRSTSDC GGPKDHPLTC DHPQLSGLLF L Disulfuro: 29-77; 43-92; 46-130; 54-108; 58-110; 113-120 Función: estimula la síntesis de esteroides. Lisozima Número de acceso: P21270 Secuencia: MDPRLREEVV RLIIALTSDN GASLSKRLQS RVSALEKTSQ IHSDTILRIT QGLDDANKRI IALEQSRD-DL VASVSDAQLA ISRLESSIGA LQTVVNGLDS SVTQLGARVG QLETGLADVR VDHDNLVARV DTAERNIGSL TTELSTLTLR VTSIQADFES RISTLERTAV TSAGAPLSIR NNRITMGLND GLTLSGNNLA IRLPGNTGLN IQNG-GLQFRF NTDQFQIVNN NLTLKTTVFD SINSRIGATE QSYVASAVTP LRLNSSTKVL DMLIDMSTLE INSSGQLTVR STSPNLRYPI ADVSGGIGMS PNYRFR Función: hidrólisis de peptidoglucano. Inhibidor de metaloproteinasa Número de acceso: P16035 Secuencia: CSCS PVHPQQAFCN ADVVIRAKAV SEKEVDSGND IYGNPIKRIQ YEIKQIKMFK GPEKDIEFIY TAPSSAVCGV SLDVGGKKEY LIAGKAEGDG KMHITLCDFI VPWDTLSTTQ KKSLNHRYQM GCECKITRCP MI-PCYISSPD ECLWMDWVTE KNINGHQAKF FACIKRSDGS CAWYRGAAPP KQEFLDIEDP Disulfuros: 27-98; 29-127; 39-152; 154-201; 159-164; 172-193 (contado con 26 aa en el extremo N) Función: inactivación de proteasa. Neurofisina Número de acceso: P01185 Secuencia: AMSDLELRQ CLPCGPGGKG RCFGPSICCA DELGCFVGTA EALRCQEENY LPSPCQSGQK ACGS-GGRCAA FGVCCNDESC VTEPECREGF HRRA Disulfuro: 41-85; 44-58; 52-75; 59-65; 92-104; 98-116; 105-110 Función: la neurofisina se une a la vasopresina.

Papaína Número de acceso: P00784 Secuencia: VY MGLSFGDFSI VGYSQNDLTS TERLIQLFES WMLKHNKIYK NIDEKIYRFE IFKDNLKYID ETNKKNNSYW LGLNVFADMS NDEFKEKYTG SIAGNYTTTE LSYEEVLNDG DVNIPEYVDW RQKGAVTPVK NQGSCGSCWA FSAVVTIEGI IKIRTGNLNE YSEQELLDCD RRSYGCNGGY PWSALQLVAQ YGIHYRNTYP YEGVQRYCRS REKGPYAAKT DGVRQVQPYN EGALLYSIAN QPVSVVLEAA GKDFQLYRGG IFVGPCGNKV DHAVAAVGYG PNYILIKNSW GTGWGENGYI RIKRGTGNSY GVCGLYTSSF YPVKN Disulfuro: 155-196; 189-228; 286-333 (contado con 18 aa N-terminal) Función: Proteinasa. Pepsina Número de acceso: P00790 Secuencia: VDEQPLEN YLDMEYFGTI GIGTPAQDFT VVFDTGSSNL WVPSVYCSSL ACTNHNRFNP EDSSTYQSTS ETVSITYGTG SMTGILGYDT VQVGGISDTN QIFGLSETEP GSFLYYAPFD GILGLAYPSI SSS-GATPVFD NIWNQGLVSQ DLFSVYLSAD DQSGSVVIFG GIDSSYYTGS LNWVPVTVEG YWQITVDSIT MNGEAI-ACAE GCQAIVDTGT SLLTGPTSPI ANIQSDIGAS ENSDGDMVVS CSAISSLPDI VFTINGVQYP VPPSAYILQS EGSCISGFQG MNLPTESGEL WILGDVFIRQ YFTVFDRANN QVGLAPVA Disulfuro: 107-112; 268-272; 311-344 (contado con 62 aa en el extremo N) Función: Peptidasa.

Plasminógeno Número de acceso: P00747 Secuencia: E PLDDYVNTQG ASLFSVTKKQ LGAGSIEECA AKCEEDEEFT CRAFQYHSKE QQCVIMAENR KSSI-IIRMRD VVLFEKKVYL SECKTGNGKN YRGTMSKTKN GITCQKWSST SPHRPRFSPA THPSEGLEEN YCRNP-DNDPQ GPWCYTTDPE KRYDYCDILE CEEECMHCSG ENYDGKISKT MSGLECQAWD SQSPHAHGYI PSKF-PNKNLK KNYCRNPDRE LRPWCFTTDP NKRWELCDIP RCTTPPPSSG PTYQCLKGTG ENYRGNVAVT VSGHT-CQHWS AQTPHTHNRT PENFPCKNLD ENYCRNPDGK RAPWCHTTNS QVRWEYCKIP SCDSSPVSTE QLAPTAPPEL TPVVQDCYHG DGQSYRGTSS TTTTGKKCQS WSSMTPHRHQ KTPENYPNAG LTMNYCRNPD ADKGPWCFTT DPSVRWEYCN LKKCSGTEAS VVAPPPVVLL PDVETPSEED CMFGNGKGYR GKRATTVTGT PCQDWAAQEP HRHSIFTPET NPRAGLEKNY CRNPDGDVGG PWCYTTNPRK LYDYCDVPQC AAPSFDCGKP QVEPKKCPGR VVGGCVAHPH SWPWQVSLRT RFGMHFCGGT LISPEWVLTA AHCLEKSPRP SSYKVILGAH QEVNLEPHVQ EIEVSRLFLE PTRKDIALLK LSSPAVITDK VIPACLPSPN YVVADRTECF ITGWGETQGT FGAGLLKEAQ LPVIENKVCN RYEFLNGRVQ STELCAGHLA GGTDSCQGDS GGPLVCFEKD KYILQGVTSW GLGCARPNKP GVYVRVSRFV TWIEGVMRNN Disulfuro: 49-73; 53-61; 103-181; 124-164; 152-176; 185-262; 188-316; 206-245; 234-257; 275-352; 296-335; 324-347; 377-454; 398-437; 426-449; 481-560; 502-543; 531-555; 567-685; 577-585; 607-623; 699-766; 729745; 756-784 Función: proteasa. Protamina Número de acceso: P04554 Secuencia: MVRYRVRSLS ERSHEVYRQQ LHGQEQGHHG QEEQGLSPEH VEVYERTHGQ SHYRRRHCSR RRLHRIHRRQ HRSCRRRKRR SCRHRRRHRR GCRTRKRTCR RH Función: sustitución de histona. Protrombina Número de acceso: P12259 Secuencia: AQ LRQFYVAAQG ISWSYRPEPT NSSLNLSVTS FKKIVYREYE PYFKKEKPQS TISGLLGPTL YAE-VGDIIKV HFKNKADKPL SIHPQGIRYS KLSEGASYLD HTFPAEKMDD AVAPGREYTY EWSISEDSGP THDDPP-CLTH IYYSHENLIE DFNSGLIGPL LICKKGTLTE GGTQKTFDKQ IVLLFAVFDE SKSWSQSSSL MYTVNGYVNG TMPDITVCAH DHISWHLLGM SSGPELFSIH FNGQVLEQNH HKVSAITLVS ATSTTANMTV GPEGKWIISS LTP-KHLQAGM QAYIDIKNCP KKTRNLKKIT REQRRHMKRW EYFIAAEEVI WDYAPVIPAN MDKKYRSQHL DNFSN-QIGKH YKKVMYTQYE DESFTKHTVN PNMKEDGILG PIIRAQVRDT LKIVFKNMAS RPYSIYPHGV TFSPYEDEVN SSFTSGRNNT MIRAVQPGET YTYKWNILEF DEPTENDAQC LTRPYYSDVD IMRDIASGLI GLLLICKSRS LDR-RGIQRAA DIEQQAVFAV FDENKSWYLE DNINKFCENP DEVKRDDPKF YESNINISTIN GYVPESITTL GFCFD-DTVQW HFCSVGTQNE ILTIHFTGHS FIYGKRHEDT LTLFPMRGES VTVTMDNVGT WMLTSMNSSP RSKKLR-LKFR DVKCIPDDDE DSYEIFEPPE STVMATRKMH DRLEPEDEES DADYDYQNRL AAALGIRSFR NS-SLNQEEEE FNLTALALEN GTEFVSSNTD IIVGSNYSSP SNISKFTVNN LAEPQKAPSH QQATTAGSPL RHLIG-KNSVL NSSTAEHSSP YSEDPIEDPL QPDVTGIRLL SLGAGEFKSQ EHAKHKGPKV ERDQAAKHRF SWMKL-LAHKV GRHLSQDTGS PSGMRPWEDL PSQDTGSPSR MRPWKDPPSD LLLLKQSNSS KILVGRWHLA SEKG-SYEIIQ DTDEDTAVNN WLISPQNASR AWGESTPLAN KPGKQSGHPK FPRVRHKSLQ VRQDGGKSRL KKSQF-LIKTR KKKKEKHTHH APLSPRTFHP LRSEAYNTFS ERRLKHSLVL HKSNETSLPT DLNQTLPSMD FGWIASLP-DH NQNSSNDTGQ ASCPPGLYQT VPPEEHYQTF PIQDPDQMHS TSDPSHRSSS PELSEMLEYD RSHKSFPTDI SQMSPSSEHE VWQTVISPDL SQVTLSPELS QTNLSPDLSH TTLSPELIQR NLSPALGQMP ISPDLSHTTL SP-DLSHTTLS LDLSQTNLSP ELSQTNLSPA LGQMPLSPDL SHTTLSLDFS QTNLSPELSH MTLSPELSQT NLSPALGQMP ISPDLSHTTL SLDFSQTNLS PELSQTNLSP ALGQMPLSPD PSHTTLSLDL SQTNLSPELS QTNLSPDLSE MPLFADLSQI PLTPDLDQMT LSPDLGETDL SPNFGQMSLS PDLSQVTLSP DISDTTLLPD LSQISPPPDL DQI-FYPSESS QSLLLQEFNE SFPYPDLGQM PSPSSPTLND TFLSKEFNPL VIVGLSKDGT DYIEIIPKEE VQSSED-DYAE IDYVPYDDPY KTDVRTNINS SRDPDNIAAW YLRSNNGNRR NYYIAAEEIS WDYSEFVQRE TDIEDSDDIP EDTTYKKVVF RKYLDSTFTK RDPRGEYEEH LGILGPIIRA EVDDVIQVRF KNLASRPYSL HAHGLSYEKS SEG-KTYEDDS PEWFKEDNAV QPNSSYTYVW HATERSGPES PGSACRAWAY YSAVNPEKDI HSGLIGPLLI CQKGIL-HKDS NMPVDMREFV LLFMTFDEKK SWYYEKKSRS SWRLTSSEMK KSHEFHAING MIYSLPGLKM YEQEWVRLHL LNIGGSQDIH VVHFHGQTLL ENGNKQHQLG VWPLLPGSFK TLEMKASKPG WWLLNTEVGE NQRAGMQTPF LIMDRDCRMP MGLSTGIISD SQIKASEFLG YWEPRLARLN NGGSYNAWSV EKLAAEFASK PWIQVDMQKE VIITGIQTQG AKHYLKSCYT TEFYVAYSSN QINWQIFKGN STRNVMYFNG NSDASTIKEN QFDP-PIVARY IRISPTRAYN RPTLRLELQG CEVNGCSTPL GMENGKIENK QITASSFKKS WWGDYWEPFR ARLNAQ-GRVN AWQAKANNNK QWLEIDLLKI KKITAIITQG CKSLSSEMYV KSYTIHYSEQ GVEWKPYRLK SSMVDKIFEG NTNTKGHVKN FFNPPIISRF IRVIPKTWNQ SITLRLELFG CDIY Disulfuro: 167-193; 500-526; 1725-1751; 1907-2061; 2066-2221 (contado con 28 aa en el extremo N) Función: coagulación. Protirelina Número de acceso: P20396 Secuencia: QPEAAQ QEAVTAAEHP GLDDFLRQVE RLLFLRENIQ RLQGDQGEHS ASQIFQSDWL SKRQHPG-KRE EEEEEGVEEE EEEEGGAVGP HKRQHPGRRE DEASWSVDVT QHKRQHPGRR SPWLAYAVPK RQHP-GRRLAD PKAQRSWEEE EEEEEREEDL MPEKRQHPGK RALGGPCGPQ GAYGQAGLLL GLLDDLSRSQ GAEEKRQHPG RRAAWVREPL EE Función: liberación de tirotropina.

SC3 Número de acceso: P16933 Secuencia: GGHPGT TTPPVTTTVT VTTPPSTTTI AAGGTCTTGS LSCCNQVQSA SSSPVTALLG LLGIVLSDLN VLVGISCS-PL TVIGVGGSGC SAQTVCCENT QFNGLINIGC TPINIL Función: hidrofobina. Sermorelina Número de acceso: P01286 Secuencia: YADAIFTNS YRKVLGQLSA RKLLQDIMSR QQGESNQERG ARARL Función: liberación de la hormona de crecimiento. Estreptodornasa Número de acceso: P26295 IPPYHH NTVLAKTVSV NQTYGEYKDY YTVIGESNID QSAFPKIYKT TERVYKGQGT SEKRVTVSDV VYN-PLDGYKR STGAYGVVTK DMIDMSKGYR EKWETNPEPS GWFRFYNRAD NEEISEKEYD SRRTKSYKVT NNVPVVLTTL KGKKYNSHLF VASHLFADSL GGKSIRKNAI TGTQMQNVGT RKGGMQYIEK KVLSHITKNP DVY-VFYSAIP EYQGAELLAR SVLVSALSSD GVINETVRVF NTADGFNINY EKGGLLTESP VSEIDNIEDS TTDEIENS-VD DSEEIVYNDT TTEEEEN Función: DNAsa. Estreptoquinasa Número de acceso: P00779 Secuencia: IAGP EWLLDRPSVN NSQLVVSVAG TVEGTNQDIS LKFFEIDLTS RPAHGGKTEQ GLSPKSKPFA TDSGAMSHKL EKADLLKAIQ EQLIANVHSN DDYFEVIDFA SDATITDRNG KVYFADKDGS VTLPTQPVQE FLLSGHVRVR PYKEKPIQNQ AKSVDVEYTV QFTPLNPDDD FRPGLKDTKL LKTLAIGDTI TSQELLAQAQ SILNKNHPGY TIYERDSSIV THDNDIFRTI LPMDQEFTYR VKNREQAYRI NKKSGLNEEI NNTDLISEKY YV-LKKGEKPY DPFDRSHLKL FTIKYVDVDT NELLKSEQLL TASERNLDFR DLYDPRDKAK LLYNNLDAFG IM-DYTLTGKV EDNHDDTNRI ITVYMGKRPE GENASYHLAY DKDRYTEEER EVYSYLRYTG TPIPDNPND Función: activación de plasminógeno. Tiroglobulina Número de acceso: P01266 Secuencia: N IFEYQVDAQP LRPCELQRET AFLKQADYVP QCAEDGSFQT VQCQNDGRSC WCVGANGSEV LG-SRQPGRPV ACLSFCQLQK QQILLSGYIN STDTSYLPQC QDSGDYAPVQ CDVQQVQCWC VDAEGMEVYG TRQLGRPKRC PRSCEIRNRR LLHGVGDKSP PQCSAEGEFM PVQCKFVNTT DMMIFDLVHS YNRFPDAFVT FSSFQRRFPE VSGYCHCADS QGRELAETGL ELLLDEIYDT IFAGLDLPST FTETTLYRIL QRRFLAVQSV IS-GRFRCPTK CEVERFTATS FGHPYVPSCR RNGDYQAVQC QTEGPCWCVD AQGKEMHGTR QQGEPPSCAE GQSCASERQQ ALSRLYFGTS GYFSQHDLFS SPEKRWASPR VARFATSCPP TIKELFVDSG LLRPMVEGQS QQFSVSENLL KEAIRAIFPS RGLARLALQF TTNPKRLQQN LFGGKFLVNV GQFNLSGALG TRGTFNFSQF FQQLGLASFL NGGRQEDLAK PLSVGLDSNS STGTPEAAKK DGTMNKPTVG SFGFEINLQE NQNALKFLAS LLELPEFLLF LQHAISVPED VARDLGDVME TVLSSQTCEQ TPERLFVPSC TTEGSYEDVQ CFSGECWCVN SWGKELPGSR VRGGQPRCPT DCEKQRARMQ SLMGSQPAGS TLFVPACTSE GHFLPVQCFN SECYCVDAEG QAIPGTRSAI GKPKKCPTPC QLQSEQAFLR TVQALLSNSS MLPTLSDTYI PQCSTDGQWR QVQCNGPPEQ VFELYQRWEA QNKGQDLTPA KLLVKIMSYR EAASGNFSLF IQSLYEAGQQ DVFPVLSQYP SLQDVPLAAL EG-KRPQPREN ILLEPYLFWQ ILNGQLSQYP GSYSDFSTPL AHFDLRNCWC VDEAGQELEG MRSEPSKLPT CPG-SCEEAKL RVLQFIRETE EIVSASNSSR FPLGESFLVA KGIRLRNEDL GLPPLFPPRE AFAEQFLRGS DYAIR-LAAQS TLSFYQRRRF SPDDSAGASA LLRSGPYMPQ CDAFGSWEPV QCHAGTGHCW CVDEKGGFIP GSLTARSLQI PQCPTTCEKS RTSGLLSSWK QARSQENPSP KDLFVPACLE TGEYARLQAS GAGTWCVDPA SGEELRPGSS SSAQCPSLCN VLKSGVLSRR VSPGYVPACR AEDGGFSPVQ CDQAQGSCWC VMDSGEEVPG TRVTGGQPAC ESPRCPLPFN ASEVVGGTIL CETISGPTGS AMQQCQLLCR QGSWSVFPPG PLICSLESGR WESQLPQPRA CQRPQLWQTI QTQGHFQLQL PPGKMCSADY AGLLQTFQVF ILDELTARGF CQIQVKTFGT LVSIPVCNNS SVQVGCLTRE RLGVNVTWKS RLEDIPVASL PDLHDIERAL VGKDLLGRFT DLIQSGSFQL HLD-SKTFPAE TIRFLQGDHF GTSPRTWFGC SEGFYQVLTS EASQDGLGCV KCPEGSYSQD EECIPCPVGF YQEQAGSLAC VPCPVGRTTI SAGAFSQTHC VTDCQRNEAG LQCDQNGQYR ASQKDRGSGK AFCVDGEGRR LPWWETEAPL EDSQCLMMQK FEKVPESKVI FDANAPVAVR SKVPDSEFPV MQCLTDCTED EACSFFTVST TE-PEISCDFY AWTSDNVACM TSDQKRDALG NSKATSFGSL RCQVKVRSHG QDSPAVYLKK GQGSTTTLQK RFEPTGFQNM LSGLYNPIVF SASGANLTDA HLFCLLACDR DLCCDGFVLT QVQGGAIICG LLSSPSVLLC NVK-DWMDPSE AWANATCPGV TYDQESHQVI LRLGDQEFIK SLTPLEGTQD TFTNFQQVYL WKDSDMGSRP ESM-GCRKDTV PRPASPTEAG LTTELFSPVD LNQVIVNGNQ SLSSQKHWLF KHLFSAQQAN LWCLSRCVQE HSFC-QLAEIT ESASLYFTCT LYPEAQVCDD IMESNAQGCR LILPQMPKAL FRKKVILEDK VKNFYTRLPF QKLMGISIRN KVPMSEKSIS NGFFECERRC DADPCCTGFG FLNVSQLKGG EVTCLTLNSL GIQMCSEENG GAWRILDCGS PDIEVHTYPF GWYQKPIAQN NAPSFCPLVV LPSLTEKVSL DSWQSLALSS VVVDPSIRHF DVAHVSTAAT SNF-SAVRDLC LSECSQHEAC LITTLQTQPG AVRCMFYADT QSCTHSLQGQ NCRLLLREEA THIYRKPGIS LLS-YEASVPS VPISTHGRLL GRSQAIQVGT SWKQVDQFLG VPYAAPPLAE RRFQAPEPLN WTGSWDASKP RAS-CWQPGTR TSTSPGVSED CLYLNVFIPQ NVAPNASVLV FFHNTMDREE SEGWPAIDGS FLAAVGNLIV VTASYR-VGVF GFLSSGSGEV SGNWGLLDQV AALTWVQTHI RGFGGDPRRV SLAADRGGAD VASIHLLTAR ATNSQL-FRRA VLMGGSALSP AAVISHERAQ QQAIALAKEV SCPMSSSQEV VSCLRQKPAN VLNDAQTKLL AVSGPFHY-WG PVIDGHFLRE PPARALKRSL WVEVDLLIGS SQDDGLINRA KAVKQFEESR GRTSSKTAFY QALQNSLGGE DSDARVEAAA TWYYSLEHST DDYASFSRAL ENATRDYFII CPIIDMASAW AKRARGNVFM YHAPENYGHG SLELLADVQF ALGLPFYPAY

EGQFSLEEKS LSLKIMQYFS HFIRSGNPNY PYEFSRKVPT FATPWPDFVP RAG-GENYKEF SELLPNRQGL KKADCSFWSK YISSLKTSAD GAKGGQSAES EEEELTAGSG LREDLLSLQE PGSK-TYSK Función: precursor de la hormona tiroidea. Uroquinasa.

5 Número de acceso: P00749 Secuencia: MRALLARLLLCVLVVSDSKGSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYF FT SNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKT-CYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLFWNS ATVLQQTYFTHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCY-VQVGLKPLVQ ECMVHDCADGKKPSSPPEEFTLKFQCGQKTLRPRFKIIGGEFTTIENQPWFAAI

10 YRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISAFTTHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSN TQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIFTRSKEGRCAQPSRTIQTIC LPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLIFTSHRECQQPHY YGSEVTTKMLCAADPQWKTD-SCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRG FT CALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLAL Función: activación de plasminógeno.

15 Tabla 2, péptidos líder

Epicidina-280 MENKKDLFDLEIKKDNMENNNELEAQ Pep-5 MKNNKNLFDLEIKKETSQNTDELEPQ Epilancina-K7 MNNSLFDLNLNKGVETQKSDLSPQ Nisina-A/Z MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR Subtilina MSKFDDFDLDVVKVSKQDSKITPQ Epidermina

MEAVKEKNDLFNLDVKVNAKESNDSGAEPR Galidermina MEAVKEKNELFDLDVKVNAKESNDSGAEPR Mutacina-1140/III MSNTQLLEVLGTETFDVQEDLFAFD

TTDTTIVASNDDPD TR Lacticina-481 MKEQNSFNLLQEVTESELDLILGA Variacina MTNAFQALDEVTDAELDAILGG Mutacina-II MNKLNSNAVVSLNEVSDSELDTILGG Estreptococina-A-FF22 MEKNNEVINSIQEVSLEELDQIIGA Salivaricina-A MNAMKNSKDILNNAIEEVSEKELMEVAGG Sublancina MEKLFKEVKLEELENQKGS Lactocina-S

MKTEKKVLDELSLHASAKMGARDVESSMNAD Ruminococina A MRNDVLTLTNPMEEKELEQILGG ButIrivibriocina OR79A MNKELNALTNPIDEKELEQILGG Estreptococina A-M49 MTKEHEIINSIQEVSLEELDQIIGA Bacteriocina J46 MKEQNSFNLLQEVTESELDLILGA Salivaricina A1

MKNSKDILTNATEEVSEKELMEVAGG Estreptina MNNTIKDFDLDLKTNKKTATPY Plantaricina-W alfa MKISKIEAQARKDFFKKIDTNSNLLNVNGA Lacticina-3147A1

MNKNEIETQPVTWLEEVSDQNFDEDVFGA Estafilococina-C55 alfa MKSSFLEKDIEEQVTWFEEVSEQEFDDDIFGA Plantaricina-W beta MTKTSRRKNAIANYLEPVDEKSINESFGAGDPEAR Lacticina-3147A2 MKEKNMKKNDTIELQLGKYLEDDMIELAEGDESHGG Estafilococina-C55 beta MKNELGKFLEENELELGKFSESDMLEITDDEVYAA Citolisina-LL

MENLSVVPSFEELSVEEMEAIQGSGDVQAE

Citolisina-LS

MLNKENQENYYSNKLELVGPSFEE

LSLEEMEAIQGSGDV QAE

Cinnamicina

MTASILQQSVVDADFRAALLENPAAFGASAAALPTPVEAQD

QASLDFWTKD IAATEAFA

Mersacidina

MSQEAIIRSWKDPFSRENSTQNPAGNPFSELIKEAQMDKLVGAG

DNEAA

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para producir, en una célula hospedadora, un polipéptido que contiene un puente tioéter, cuyo origen no es una bacteria Gram-positiva, comprendiendo el procedimiento;

   5 a) seleccionar una célula hospedadora que tenga una molécula de ácido nucleico que comprenda un primer y un segundo fragmento de ácido nucleico que estén en la misma fase de lectura abierta, en la que

   -

   el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico, y en el que este péptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal manera que pueda producirse la formación de un puente tioéter; -el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia a modificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias constituido por Ser

   15 Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es un cualquier aminoácido y donde n es 1-13, y donde el polipéptido no tiene como origen una célula bacteriana Gram-positiva;

   b) seleccionar la célula hospedadora para detectar la presencia de la proteína transportadora LanT; c) traducir la molécula de ácido nucleico, produciendo de este modo un péptido de fusión del péptido líder de lantibiótico y el polipéptido que comprende la secuencia seleccionada del grupo de secuencias constituido por Ser-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; y d) recoger el polipéptido que contiene el puente tioéter de un medio de la célula hospedadora.
2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que adicionalmente comprende recoger dicho polipéptido deseado 25 después de detectar la presencia de dicho péptido líder en el medio de cultivo de dicha célula.

3. 3.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 donde dicho polipéptido deseado es de origen esencialmente eucariota o viral.

4. 4.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 donde dicho polipéptido se selecciona del grupo constituido por polipéptidos con SEC ID Nº: 1 a 249 como se indica en la tabla 1A.

5. 5.

   Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde dicho péptido líder se selecciona

   del grupo constituido por péptidos líder con SEC ID Nº: 250 a 280 como se indica en la tabla 1B. 35

6. 6.

   Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde dicha célula hospedadora es una célula procariota Gram-negativa o eucariota.

7. 7.

   Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde dicho (poli)péptido que no ha sufrido modificación postraduccional intracelular comprende la deshidratación de una serina o una treonina y/o formación de un puente tioéter.

8. 8.

   Un método que permite la modificación de un polipéptido deseado producido por una célula hospedadora recombinante, comprendiendo dicho método las etapas a, b, c y d de la reivindicación 1 y comprendiendo

   45 adicionalmente seleccionar dicha célula hospedadora para detectar la presencia de una enzima capaz de proporcionar modificación postraduccional.

9. 9.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 8 que permite la modificación extracelular de dicho (poli)péptido deseado comprendiendo adicionalmente dicho método seleccionar dicha célula hospedadora para detectar la presencia de una enzima esencialmente extracelular capaz de proporcionar modificación postraduccional.

10. 10.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 donde dicha enzima es capaz de deshidratar una serina o una treonina.

    55 11. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 donde dicha enzima es capaz de proporcionar la formación de un puente tioéter.

11. 12.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 donde dicho (poli)péptido deseado es de origen esencialmente eucariota o viral.

12. 13.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 donde dicho polipéptido se selecciona del grupo constituido por polipéptidos con SEC ID Nº: 1 a 249.

13. 14.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 donde dicho péptido líder se selecciona 65 del grupo constituido por péptidos líder con SEC ID Nº: 250 a 280.

14. 15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 donde dicha modificación comprende la deshidratación de una serina o una treonina y/o la formación de un puente tioéter.

15. 16.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 donde dicha célula hospedadora es 5 una célula procariota Gram-negativa o una célula eucariota.

16. 17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16 donde dicho polipéptido que no ha sufrido modificación postraduccional intracelular comprende la deshidratación de una serina o una treonina y/o la formación de un puente tioéter.
17. 18. Un método para la producción de un polipéptido de origen no lantibiótico que comprende deshidroalaninas y/o restos de ácido deshidrobutírico que comprende:

    a) seleccionar una célula hospedadora que tenga una molécula de ácido nucleico que comprenda un primer y un 15 segundo fragmento de ácido nucleico que estén en la misma fase de lectura abierta, donde

    -

    el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico y donde este péptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal manera que

    20 pueda producirse la formación de un puente tioéter; -el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia a modificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias que consiste en Ser-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; y donde el polipéptido no tiene como origen una célula bacteriana Gram-positiva;

    25 -y una molécula de ácido nucleico que codifica LanB o la parte N-terminal de LanM y opcionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica LanT;

    b) permitir la traducción de dichas moléculas de ácido nucleico; y c) opcionalmente someter a lisis dichas células hospedadoras; y 30 d) recoger dicho polipéptido deseado.
18. 19. Una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un primer y un segundo fragmento de ácido nucleico que están en la misma fase de lectura abierta, donde

    35 -el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico y donde este péptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal manera que puede producirse la formación de un puente tioéter; -el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia a

    40 modificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias que consiste en Ser-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido donde n es 1-13; y donde el polipéptido no tiene como origen una célula bacteriana Gram-positiva;
19. 20. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 19 donde dicho polipéptido deseado es de origen 45 esencialmente eucariota o viral.
20. 21. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 20 donde dicho (poli)péptido se selecciona del grupo que consiste en polipéptidos con SEC ID Nº: 1 a 249.

    50 22. Una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 donde dicho péptido líder se selecciona del grupo que consiste en péptidos líder con SEC ID Nº: 250 a 280.
21. 23. Una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, siendo dicha célula

    hospedadora una célula procariota Gram-negativa o una célula eucariota. 55
22. 24. Una célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 provista de una proteína LanT y no provista de una proteína LanB.

23. 25.

    Una célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 provista de una proteína 60 LanT y no provista de una proteína LanC.

24. 26. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 25 provista con una LanB.

25. 27.

    Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 23 provista con una proteína LanT, LanB, LanC y/o 65 LanM.

26. 28. Una molécula de ácido nucleico que comprende un primer y un segundo fragmento de ácido nucleico que están en la misma fase de lectura abierta, donde

    -

    el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmente equivalente

    5 a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico y donde este péptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal manera que puede producirse la formación de un puente tioéter; -el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia a modificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias que consiste en Ser-Xaan

    10 Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; -en el que dicho polipéptido es de origen eucariota o viral.
27. 29. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28 donde dicho (poli)péptido se selecciona del grupo que

    consiste en polipéptidos con SEC ID Nº: 1 a 249. 15
28. 30. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28 o 29, donde dicho péptido líder se selecciona del grupo que consiste en péptidos líder con SEC ID Nº: 250 a 280.