JPS6341920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、式（）： を有する高純度のＬ−α−グリセリルホスホリル
コリン（）の新規な製法に関する。 式（）を有するＬ−α−グリセリルホスホリ
ルコリンを筋肉内投与または経口投与することに
より、過脂肪タンパク質性
（hyperlipoproteinaceous）の食餌を摂取するこ
とにより惹起されるかまたは四塩化炭素中毒を原
因とする脂肪の浸透から肝臓組識を保護しうるこ
とが観察されている。さらにＬ−α−グリセリル
ホスホリルコリンを投与することにより、胆汁分
泌停止に対する保護効果を有することも見出され
ている。 観察された重要な事実は、グリセリルホスホリ
ルコリンが脂肪タンパク質の組識中へ入り込むと
いうことである。薬理速度（pharmokinetics）
の研究により、グリセリルホスホリルコリンは腸
または腸管に迅速に吸収され、また筋肉中に接種
されたばあいはその場所で迅速に吸収されること
が証明されている。吸収されたグリセリルホスホ
リルコリンは血液中を循環し、とくに肝臓、腎臓
および悩などの臓器へ送り込まれる。それらの中
でも肝臓においては、グリセリルホホスホリルコ
リンは脂肪タンパク質と合体して再度循環系中に
戻る。その働きによつて、グリセリルホスホリル
コリンは抗脂肪血症作用を有する。 Ｌ−α−グリセリルホスホリルコリン（）は
レシチン、とくに卵からえられたレシチンの加水
分解によつてえられる。Ｌ−α−グリセリルホス
ホリルコリン（）の製造において遭遇する主な
問題はＬ−α−グリセリルホスホリルコリンの精
製である。加水分解によつてＬ−α−グリセリル
ホスホリルコリン（）と共にえられる複数の副
生成物は、共にＬ−α−グリセリルホスホリルコ
リン（）の治療学的価値を減ぜしめ、しばしば
望ましくない副作用を惹起する。したがつてとく
に純粋な形のＬ−α−グリセリルホスホリルコリ
ン（）をえようとするいくつかの比較的有効な
試みがなされてきた。 米国特許第2864、848号明細書に、レシチンの
加水分解を、それにより生成する副生成物を水銀
塩の形で沈殿させるための塩化第二水銀を存在さ
せて行なう方法が開示されている。しかしその方
法では、グリセリルホスホリルコリンから過剰に
存在する明らかに有毒な水銀イオンを取除くこと
が必要となり、その除去はH₂SおよびBaCO₃を
用いて複雑な処理を施すことにより行なわれる。
それでもなおそのような処理ではすべての水銀イ
オンを充分に除去することができず、さらに引続
いて精製処理することが必要であると前記明細書
に指摘されている。とくに最終目的物は塩化カド
ミウムで錯体を形成させて精製されなければなら
ない。全体を通じて操作は非常に複雑であり、ま
た最終目的物は重金属類から解放されることもな
い。 叙上の方法と類以の方法が「ビオケミカル・ブ
リバレーシヨン（Biochemical Preparation）」
第６巻、第16〜19頁に記載されている。その方法
によるとカドミウムの最終的な除去は、反応物質
をイオン交換樹脂の混合物中を通すことによつて
行なわれる。この処理をまた方法を複雑にし、さ
らに目的物質の収率を低下せしめる。 加水分解のほかに、ブロツカーホフ
（Brockerhoff）はリン脂質（Phosphatide）１モ
ルあたりナトリウムメトキシド３モルを用いて行
なうレシチンの希釈溶液（約21ｇ／）のメチル
アルコール分解について述べている〔「ジヤーナ
ル・リビト・リサーチ（Journal Lipid
Research）第４巻（1963年）、第96頁〕。しかし
叙上の条件下で行なうメチルアルコール分解は、
所望のアシルー酸素結合の切断と同時に有害な副
生成物の形成を伴なうｐ−ｏ結合の切断を惹起す
る。 オクイとその共同研究者らは、アルカリ土類金
属類の水酸化物を用いて卵からえられたレシチン
を加水分解することにより、Ｌ−α−グリセリル
ホスホリルコリン（）を製造する方法を「薬学
雑誌」第84巻（第12号）（1964年）、第1206〜９頁
に示している。しかしこの方法では、副成分を有
するために非常に低い純度のものしかえられな
い。 ブロツカーホフおよびユルコウスキー
（Yurkowski）は、第四アンモニウム塩基（水酸
化テトラブチルアンモニウム）を用いてレシチン
の加水分解を行なうＬ−α−グリセリルホスホリ
ルコリンの製法について「キヤナデイアン・ジヤ
ーナル・オブ・ビオケミストリー（Canadian
Journal of Biochemistry）」第43巻（1965年）、
第1777頁に若干述べている。加水分解はチヤドハ
（Chadha）がChem.Phys.Lipids、第４巻（1970
年）、第104〜108頁に示したと同様に充分に進行
する。しかし全体にわたる加水分解をその塩基で
行なうことは経済的に見合わず、さらに水酸化テ
トラブチルアンモニウムを含有しないグリセリル
ホスホリルコリンをうることさえもできない。し
たがつて水酸化テトラブチルアンモニウムをＬ−
α−グリセリルホスホリルコリン（）から結晶
化させることによつて分離しなけばならない。さ
らにこの方法は大規模な操作にはむかない。また
クベロ・ロブレス（Cubero Robles）およびロエ
ルス（Roels）は、細かく砕かれた卵黄からえら
れる脂肪質抽出物のメチルアルコール分解により
Ｌ−α−グリセリルホスホリルコリンの製法につ
いてChem.Phys.Lipids、第６巻（1971年）、第31
〜38頁で述べている。その方法は、卵黄粉末をク
ロロホルム−メタノールで抽出する操作、えられ
た混合液の溶煤を蒸発させる操作、えられた残渣
をエーテルに溶解させる操作およびえられたエー
テル溶液をリチウムメトキシドで処理する操作を
含んでいる。 最後の操作に用いられる試薬の量は、リン脂質
１モルあたり１モルである。その試薬で処理する
ことにより、グリセリルホスホリルコリン（以
下、GPCともいう）とグリセリルホスホリルエ
タノールアミン（以下、GPEともいう）との混
合物がえられる。この混合物をHClで中和したの
ち、シリカ上でクロマトグラフイーによりGPC
とGPEとを分離する。実際には、クロマトグラ
フイーによりえられるGPCはコロイド状の珪酸
によつて（溶出剤として水を用いるときに予想さ
れるように）汚染されている。この珪酸汚染物は
目的物を繰り返し結晶化することによつてのみ除
去することができる。そのような結晶化操作は非
常に困難である。 これまで述べてきた満足しうる純度を有する
GPCをうる方法は、一般的に実施するには困難
を伴ない、経済的にも見合わない。 しかるに本発明者らは種々研究を重ねた結果、
精製されたレシチンのアルコール分解を、用いる
レシチンに対して触煤量のアルカリ金属アルコキ
シドの存在下で行なうという経済的にみて困難を
伴なわずに実施できる比較的簡単な操作により純
粋なGPCを高収率でうる方法を見出した。 すなわち本発明は、精製されたレシチンを、該
レシチン１モルに対しアルコール分解に用いるア
ルコールのアルカリ金属アルコキシドを0.01〜
0.1モル用いてその触煤作用によりアルコール分
解せしめることからなる、式（）： を有する高純度のＬ−α−グリセリルホスホリル
コリンの新規な製法に関する。反応系に存在させ
るアルカリ金属アルコキシドの濃度は極めて低濃
度でよく、実施例１〜４に示すように35〜40ミリ
モル濃度である。 本発明の方法でえられる充分に純粋な目的物質
は、前述したようなきわめて困難な再結晶を行な
うことやCdCl₂で錯体をつくる必要がない。それ
ら再結晶およびCdCl₂でによる錯体形成は工業ベ
ースで行なうには適当でないものである。 本発明におけるアルコール分解にはメタノール
を用いることが好ましく、アルコキシド触煤には
ナトリウムアルコキシドが好ましい。したがつて
アルコール分解に用いる系としては、メタノー
ル／ナトリウムメトキシド系が好ましい。 本発明におけるアルコール分解は、好ましくは
レシチン39重量％および触煤量のアルコキシドを
含有する精製されたレシチンのメタノール性溶液
を室温で約60分間放置することによつて行なわれ
るのが好ましい。用いるアルコキシドの量は、前
記のごとくレシチン１モルあたり0.01〜0.1モル
であり、好ましくは0.05モルである。レシチン１
モルに対してアルコキシドの量が0.1よりも多く
なると副生成物が増大し、生成物の精製がきわめ
て困難になる。また0.01モルよりも少なくなると
反応が著しく緩慢になり、反応時間が長くなりす
ぎる。反応の終りに反応中に分離した脂肪酸エス
テルを除去し、残留部分であるアルコール性溶液
からアルカリ金属イオンを除去するために該メタ
ノール溶液をアルコキシド１当量あたり約８当量
の弱酸性カチオン交換樹脂〔たとえばローム・ア
ンド・ハース社製アンバーライトIR−C50（H⁺）〕
で処理する。 樹脂からの溶離物および洗浄ずみ液を減圧下
（たとえば12mmHg）で蒸発して濃縮し体積を小さ
くし、ついで水で希釈したのち脂肪酸エステルの
残り、脱アセチル化されていないかまたは部分的
に脱アセチル化されているレシチンおよび卵から
えられるレシチン中に通常存在するスフインゴマ
イエリン（sphingomyelin）を取除くためにクロ
ロホルムで抽出する。水相部分を減圧下で蒸発乾
固せしめ、もし必要ならば活性炭（たとえばカー
ボンSL50）で脱色する。 えられる生成物は、加水分解による不純物、無
機塩および脂肪酸エステルを含まず、またCdCl₂
で錯体を形成させ、連続して結晶化し、イオン交
換樹脂を通して分解し、ついで結晶化してえられ
るサンプル用のＬ−α−グリセリルホスホリルコ
リンと明らかな相違はない。 本発明の方法によつてえられるＬ−α−グリセ
リルホスホリルコリンは通常約15重量％の水分を
含有している。 もし必要ならば、高真空下でP₂O₅により乾燥
したのちエタノール−ジエチルエーテルまたはエ
タノール−酢酸エチルから繰り返し結晶化せしめ
ることにより水分を除去することができる。その
結果無色の吸湿性の固体がえられ、その融点は
130〜131℃であり、実験式はC₈H₂₀NO₆Pである。 叙上の水分の除去は、Ｌ−α−グリセリルホス
ホリルコリンを水溶液で用いるばあいまたは他の
主要な有効成分と共に注射用の親水性の薬として
用いるばあい（通常そのような形で用いられるこ
とが多いが）には、不要である。脱アセチル化さ
れたリン脂質はあらゆる点からみて充分な純度を
有しているので、繰り返して結晶化せずに無定形
のままの生成物を使用することが可能である。 次に実施例をあげて本発明の方法を説明する。 実施例 １ (a) レシチンの精製 卵からえられたレシチン〔アルカリに不安定
な燐（alkali labile Ｐ）：2.7〜2.85％、グリセ
リルホスホリルコリンの燐：2.24〜2.52％〕を
原料として用いた。塩化メレチン１中に粗製
レシチン0.5Kgを加えてえられた溶液を６の
アセトン中へ注ぎ込み、５℃で撹拌しつづけ
た。60分後、液体部分をデカンテーシヨンによ
り排除し、残留部分を塩化メチレン１中に溶
解せしめ、えられた溶液をアセトン６中に注
ぎこむことにより精製を行なつた。形成した沈
殿物を過し、室温で減圧（12mmHg）乾燥し
てレシチン320ｇをえた。 クロロホルム−メタノール（容量比、１：
１）650ml中にレシチン320ｇを加えてえられた
溶液をAl₂O₃（1.4Kg）上でクロマトグラフイー
に付し、クロロホルム−メタノール（容量比
１：１）3.5で溶出せしめた。溶出液を40℃
で減圧（12mmHg）乾燥し、ついで塩化メチレ
ン350ml中に再度溶解させ、遠心分離して５℃
で撹権拌下にアセトン2.4中に注ぎ込んだ。 ５℃で60分間放置したのち、生成した沈殿物
を過し室温で減圧（12mmHg）乾燥して純粋
なレシチン210ｇをえた（アルカリに不安定な
燐：3.70〜3.80％、グリセリルホスホリルコリ
ンの燐：3.70〜3.80％）。 (b) Ｌ−α−グリセリルホスホリルコリンの製
造。 ナトリウムメトキシドを0.039モル含む無水
メタノール１中に（ａ）でえられた精製ずみ
のレシチン約500ｇ（0.7モル）を加えてえられ
た溶液を室温で60分間放置した。生成した油状
層を分離して除去し、ついで溶液をイオン交換
樹脂（アンバーライトIR−C50（H⁺））80ｇか
らなるベツド（高さ50cm）を通し、吸着した物
質をつづいてメタノールで溶出した。メタノー
ルの使用量は毎回１であつた。溶出液を40℃
で減圧（12mmHg）下に濃縮して体積を約１
とし、ついで水550mlで希釈し、クロロホルム
400mlで４回抽出した。 えられた水相を40℃で減圧（12mmHg）下に
濃縮乾固し、残留物を水410mlに溶解せしめ、
ついで脱色用の炭素12ｇを加えてえられた水相
を室温で15分間撹拌せしめた、該水相をミリボ
ア（millipore）で過し、溶煤を40℃で減圧
（12mmHg）下に除去して無定形の純粋なＬ−α
−グリセリルホスホリルコリン165ｇをえた。 H₂O＝15％ 全体の燐＝84.1％ クロマトグラフイーによる分離後の燐：83.94
％ ビシナルグリコール：84.59％ コリン：85％ ブロツカーホフ（J.Lipids Research、第４
巻（1963年）、第96頁）またはドースン
（Dawson）（J.Biochem.、第75巻（1960年）、
第45頁）にしたがつてサンブルの分析を行な
い、Ｐ−Ｏ結合の切断が生じていなかつたこと
を確認した。真空（0.05mmHg）下にP₂O₅を通
して乾燥したサンプルを99％エタノール、つい
でエチルエーテルから結晶化して、融点が130
〜131℃の白色の吸湿性の結晶をえた。 比施光度（10％、水中）：〔α〕_D＝−2.84 元素分析値：C₈H₂₀NO₉P（分子量257）として 実測値：C37.50、H7.70、N5.38、P12.06 計算値：C37.35、H7.84、N5.45、P12.04 コリンエステル 実測値：46.92 計算値：42.12 ビシナルグリコール＝99.8％ 実施例 ２ 大豆のレシチン（アルカリに不安定な燐：２
％、GPCの最小限度の燐：0.5％）を原料として
用いた。メタノール600ml中に該レシチン600ｇを
懸濁させてえられた懸濁液を室温で60分間撹拌し
た。これを５℃で60分間放置し、ついで溶煤をデ
カンテーシヨンにより除去し、残留物をメタノー
ル300mlで洗浄した。えられたメタノール性抽出
物を５℃で18時間放置し、ついで過して40℃で
減圧（12mmHg）下に濃縮して乾燥し、70ｇの残
渣をえた（アルカリに不安定な燐：3.0〜3.1％、
グリセリルホスホリルコリンの燐：2.0〜2.1％）。
該残渣を再度牲製して純粋なレシチン20ｇをえ
た。 えられたレシチンに卵のレシチンを用いた実施
例１と同様な処理をして、実施例１と同様な純度
を有するGPCを実質的に同様な収率でえた。 実施例３〜４および比較例１〜３ 実施例１（ａ）でえた精製ずみのレシチン約500
ｇ（0.7モル）を第１表に示す量のナトリウムメ
トキシドを含む無水メタノール１中に加え、イ
オン交換樹脂の量および溶出用のメタノールの１
回分の使用量を第１表に示すように変えたほかは
実施例１（ｂ）と同様にして無定形の純粋なＬ−
α−グリセリルホスホリルコリンをえた。各実施
例および比較例におけるＬ−α−グリセリルホス
ホリルコリンの収量を第１表に示す。

【表】 第１表から明らかなごとく、ナトリウムメトキ
シドの量がレシチン１モルに対して0.01〜0.1モ
ルの範囲内にあるときは、その範囲外にあるとき
に比して大幅に収率が高くなつている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 精製されたレシチンを、該レシチン１モルに
   対しアルコール分解に用いるアルコールのアルカ
   リ金属アルコキシドを0.01〜0.1モル用いかつ35
   〜40ミルモル濃度で存在させ、その触媒作用によ
   りアルコール分解せしめることからなる、式
   （）： を有する高純度のＬ−α−グリセリルホスホリル
   コリンの製法。 ２ レシチン１モルあたりアルコキシド0.05モル
   を用いる特許請求の範囲第１項記載の製法。 ３ アルコールがメタノールである特許請求の範
   囲第１項または第２項記載の製法。 ４ アルコキシドがナトリウムアルコキシドであ
   る特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記
   載の製法。 ５ ナトリウムメトキシドの触媒作用によりメチ
   ルアルコール分解する特許請求の範囲第２項記載
   の製法。 ６ 室温で行なう特許請求の範囲第１項、第２
   項、第３項、第４項または第５項記載の製法。 ７ 約60分間にわたつて行なう特許請求の範囲第
   ６項記載の製法。 ８ 精製された卵のレシチンを用いる特許請求の
   範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、
   第６項または第７項記載の製法。 ９ 精製された大豆のレシチンを用いる特許請求
   の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載
   の製法。