JPS6250782B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は血清中のビリルビンの定量方法及び改
良試験具及び該試験具の製造方法を供する。特
に、担体に組み入れて装置を形成した場合、該試
験具上に均一に発色させる組成物を供する。 ヘムの破壊の際、胆汁色素、主にビリルビン、
は血清中で作られ続いて肝臓により除去される。
一日に形成される胆汁色素の量は、破壊されるヘ
モグロビン量及び肝臓機能に非常に関係してい
る。ヘモグロビン１ｇがビリルビン35mgを生ずる
と推定されている。人間の血漿又は血清100ml中
に通常、0.1〜1.5mgのビリルビンが存在する。 肝臓機能低下の様な臨床研究に於いて血清ビリ
ルビン量の推定は非常に重要であると認識されて
きている。血清中のビリルビン含有量の定量的分
析方法は、尿中のビリルビンに関するエールリツ
ヒ（Ehrlich）試験法を応用したバン・デン・ベ
ルク（Van den Bergh）により最初発明され
た。該エールリツヒ反応はジアゾ化スルフアニル
酸（エールリツヒジアゾ試薬）及びビリルビンを
カツプリングさせ赤紫色のアゾ化合物を生ずる事
を基本としている。エールリツヒの記載通りの最
初の方法では、ビリルビン及びジアゾ試薬の両方
が溶ける溶液としてアルコールを用いた。人間の
胆汁中の胆汁色素の分析の際、該アルコールを除
去することにより色素の普通の発色が“直接的
に”即ちアルコールの添加なくして、起こる事を
バン・デン・ベルクは発見した。アルコールの添
加なくして反応するビリルビンのこの形態を、従
つて、“直接反応”と称した。しかしながら、普
通の血清中のビリルビンを検出する為には、まだ
アルコールの添加を必要とした。アルコールの添
加後のみビリルビンを測定しうる形態については
“間接反応”という言葉を用いた。 該間接形ビリルビンは、該ビリルビンがヘムポ
ルフイリンの破壊により生ずる網内皮組織から肝
臓に向う途中の“遊離”（非結合の）ビリルビン
である。該ビリルビンは水溶性でない為、ジアゾ
試薬とカツプリングを開始するにはアルコールの
添加を必要とするのである。肝臓中で、該遊離ビ
リルビンはグルクロン酸と結合する。結合ビリル
ビンは水溶性であり、該ジアゾ試薬と直接反応し
うる。従つて、バン・デン・ベルクの該“直接形
ビリルビン”は事実上ビリルビン結合物（ビリル
ビングルクロナイド）である。 スルフアニル酸以外のスルホン酸も、記載した
該ジアゾカツプリング反応に使用できるものとし
て提案されてきた。その中には、ｐ−トルエンス
ルホン酸、スルホサリチル酸、スルホン酸及びヘ
キサミン酸がある。例えば、米国特許第3585001
号を参照の事。 アルコール以外に同一の結果を示す他の物質、
即ち“遊離”ビリルビンのジアゾカツプリング反
応を高めるものであり、間接形、従つて総ビリル
ビン量の測定を可能にするものも又知られてい
る。これらの物質は“促進剤”と称せられ、カフ
エイン、ダイフイリン、酢酸ナトリウム、安息香
酸ナトリウム、アラビアゴム等が挙げられる。ヘ
ンリー、R.J.著、臨床化学、原理と技術、第２版
ハーパー・アンド・ロー社（Henry，R.J.，
Clinical Chemistry，Principles and
Technics，Second Edition，Harper and
Row）1047頁（1974年）；ウイズ、T.K.著、胆
汁色素、アカデミツク・プレス社（With，T.K.
，Bile Pigments，Academic Press）324〜327
頁（1968年）；及び米国特許第4038031号（日本
国特開昭52−43493号）を参照の事。 ジアゾカツプリング反応を利用する、例えば細
片状のビリルビン検出試験具が開示されてきてい
る。例えば、上記特許に加えて、米国特許第
3853476号、第3880588号、第3912457号、第
4069016号及び第4069017号を参照の事。 これらの試験具は、臨床診断に役立つてきた。 しかしながら、これら先行技術の試験具は、均
一に血清試料を吸収しないという欠点があるとい
う事が認識されてきた。サンプルに適用した場
合、該点で形成される色は非常に強烈であるが、
一方該点の周辺上には、もしあるにしても非常に
薄い色が発色するだけである。定量的試験に要す
る精度に達する為には均一な発色が必要である
為、この不均一性は特に望ましくない特徴であ
る。 先行技術の試験具のこの問題は本発明により認
識され、下記のように完全に克服された。 血清中のビリルビン検出用試験具であつて、担
体及びその担体に包含されたジアゾニウム塩、ｐ
−トルエンスルホン酸及びダイフイリンから成る
組成物、から成る血清中のビリルビンの検出用試
験具は、試験サンプルと反応した場合、発色の不
均一性という望ましくない特徴から解放されると
いう事がわかつた。血清試料中に存在するビリル
ビンは、試験すべき試料を本発明による試験具に
接触させ、生じた比色応答を観察する事から成る
方法で検出できる。担体に上述の組成物を包含さ
せる事から成る方法、例えば含浸溶液で飽和する
方法、で該試験具は供せられる。 今回解決された不均一性という問題点は先行技
術の試験具において血清蛋白の沈澱が生ずる結果
であると信じられている。しかしながら、本発明
は必ずしもこの考え方に基づいているものではな
い。 ｐ−トルエンスルホン酸はジアゾニウム化合物
を安定化するのに十分に低いPHを生ずるにも拘ら
ず、本発明による試験具を用いれば血清ビリルビ
ン量に応答した均一の発色を得られる事が可能に
なつた。結果として、ビリルビン濃度に相当した
非常に定量的な機器による反射率を、該試験具に
血清試料を適用した場所に関係なく得る事が可能
である。 下記の記載で使用している特定の語句は、特許
請求の範囲で規定する本発明を明らかにする為に
選択した個々の実施態様だけに関するものであ
る。 血清ビリルビン検出用試験具は、もつぱら即ち
ほとんど全部、電子吸引基を有するいかなる芳香
族ジアゾニウム塩も使用できる。従つて、例えば
ベンゼン系列に於いては、該置換基はニトロ基、
ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸残
基、ニトリル基又は、四級アンモニウム基であり
える。電子供与基、例えばアルコキシ基もまたあ
る限定量まで存在しえる。更に、ジアゾ化ナフチ
ルアミン及びベンジジン誘導体も又使用可能であ
る。例えば、アルコキシ基、アルキル基、又はア
リールアミノ基の様な電子供与基をもつぱら含有
するベンゼン−ジアゾニウム塩はビリルビンと比
較的ゆつくり反応する為、余り適していない。 該ジアゾニウム塩は、実施例で示してある様
に、アニリン系列の物質と亜硝酸塩の反応によ
り、その場で形成できるし、又直接添加する事も
可能である。該ジアゾニウム塩を塩自体として直
接添加するにしても、該塩をその場で形成するに
しても、置換及び非置換ハロベンゼン、特に２，
４−ジクロベンゼンのジアゾニウム塩が好まし
い。又、ｐ−ニトロベンゼンジアゾニウムテトラ
フルオロボレートの様なニトロ−置換ベンゼンの
ジアゾニウム塩も都合が良い。 該含浸溶液中に存在する該ジアゾニウム塩は約
0.02ｇ／dlから約2.0ｇ／dlの濃度であり、好ま
しくは約0.05ｇ／dlから約0.5ｇ／dlである。該
含浸溶液中に用いられるｐ−トルエンスルホン酸
は約0.5ｇ／dlから約10.0ｇ／dlの濃度であり、
好ましくは約1.0ｇ／dlから約6.0ｇ／dlである。
該含浸溶液中に用いるダイフイリンは約6.0ｇ／
dlから約14.0ｇ／dlの濃度であり、好ましくは約
8.0ｇ／dlから約12.0ｇ／dlである。該含浸溶液
を調製するのに使用される溶媒は水、生理学的溶
液、適当な有機溶媒又はその混合物でありえる。
種々の補助的成分を任意に添加できる。その様な
成分にガントレツツ（Gantrez）AN−139
〔GAF・コーポレーシヨン、化学製品部門（GAF
Corp.，Chemical Products，）N.Y.，N.Y.から市
販されている無水マレイン酸とメチルビニルエー
テルの共重合体〕がある。該反応は好ましくは、
比較的酸性（例えば、約PH１から約PH５）で行な
われる。 本発明の試験具は、吸収性のマトリツクスの様
な担体に該試験組成物を包含させる事から成る方
法で作られる。前に記載した様に、該組成物の含
浸溶液で飽和して組成物を包含させ、該含浸担体
を続いて乾燥する。含浸法の他に、本発明の試験
具は基質又はマトリツクス上に該組成物をスプレ
ーするか又は印刷する方法の様な他の適切な技術
により作る事も可能である。 担体という語句は、水又は生理学的液体に接触
した場合、構造上の全体性を維持し且つその中に
溶けない吸収性及び非吸収性のマトリツクスを表
わす。使用可能な適切な吸収性マトリツクスに
は、紙、セルロース、木材、合成樹脂フリース、
ガラス繊維、織布及び非織布等がある。非吸収性
マトリツクスには、ポリプロピレン等の様な有機
プラスチツク材料がある。吸収性マトリツクスを
用いる場合は、該マトリツクスを有機プラスチツ
ク細片（例えば、ポリスチレン）の様な不溶性支
持体に使用が容易な様に、両面接着テープの様な
適当な手段で都合良く固定する。 試験試料を該試験具に少量滴下したり、又は他
の方法で担体マトリツクスに試験試料を導入する
事により該試験具を都合良く使用し、それにより
ビリルビンが存在する場合には、検出可能な色の
変化が生じるのである。血漿試料又は血清試料の
いずれを試験する場合も、全く同一の方法で該試
験具の使用は可能である。 反応後の試験具は視覚的に読む事ができるが、
しかし検知されたビリルビン濃度をより正確に定
量する為に、反射分光光度計を用いて反応後の試
験具の比色の読みを行なう。反射率はベツクマン
DK−２分光光度計、ベツクマン・インストルメ
ント・インコーポレーシヨン、フラートン、カリ
フオルニア（Beckman Instruments，Inc.，
Fullerton，California）92634又は分光比色計
SCF−１イスラエル・エレクトロ−オプテイカ
ル・インダストリー・リミテツド〔Israel
Electro―Optical Industry Ltd.（米国ではブル
ーマー・リサーチ・コーボレーシヨン、プレイン
ウエル、ロングアイランド（Broomer Research
Corporation，Plainwell Long Island），N.
Y.11803より発売）〕の様な市販の分光光度計で
得られる。 下記に例示した実施例から、特許請求の範囲内
と見込まれる種々の補足及び改質が当該技術分野
の技術者には考えられるであろう。 実施例 １ この実施例では、本発明によつて調製した試験
具及び他の組合せの試薬を包含した試験具を、発
色の均一性及びかくして得られたビリルビン濃度
のデータの信頼性を比較した。 ６種の異なつた含浸溶液を、蒸留水45.0ml及び
ガントレツツAN−139の10ｇ／dl溶液5.0mlの溶
媒中に表１に記載する配合により通常の実験室の
条件下で調製した。 ｐ−トルエンスルホン酸及びスルホサリチル酸
は、イーストマン・オーガニツク・ケミカルス、
ロチエスター（Eastman Organic Chemicals，
Rochester）N.Y.14650から購入した。ヘキサミ
ン酸は、アボツト・ラボラトリーズ、ノースシカ
ゴ、イリノイ州（Abbott Laboratories，North
Chicago，Illinois）から購入した。１，５−ナフ
タレンジスルホン酸ジナトリウム；２，４−ジク
ロロアニリン；及び亜硝酸ナトリウムは標準品質
の試薬である。ダイフイリン及びカフエインはア
リドリツチ・ケミカル・カンパニー・インコーポ
レーテツド、ミルオーキー、ウイスコンシン州
（Aldrich Chemical Co.，Inc.，Milwaukee
Wisconsin）53233から購入した。

【表】 該試薬は２，４−ジクロロアニリン及び亜硝酸
ナトリウムであり、これらは含浸溶液中でその場
で反応し、２，４−ジクロロベンゼンジアゾニウ
ム塩、この場合は２，４−ジクロロベンゼンジア
ゾニウム−１，５−ナフタレンジスルホネートが
形成される。 配合Ａを有する溶液は、本発明による試験具を
作る為に使用した。配合ＢからＦまでの溶液は、
比較用に他の試験具を作る為に使用した。カフエ
インをｐ−トルエンスルホン酸及びヘキサミン酸
と組合わせた配合Ｃ及びＥはいずれも溶液になら
ず、それ故使用するペーパーマトリツクスに適切
に含浸さえ出来ない事がすぐに観察された。 上述した残りの含浸溶液の１つに、１枚ずつ、
別々にイートン−ダイクマン205番紙〔イート
ン−ダイクマン、マウント・ホーリイ・スプリン
グス、ペンシルバニア（Eaton―Dikeman，
Mount Holly Springs，Pa）17065〕を含浸させ
飽和させた。この様に含浸したシートを、乾燥す
るまで、60℃の実験室用標準オーブン中に置い
た。種々の含浸溶液の乾燥残留分を含有するこれ
らのペーパーシートを、続いて0.5cm×1.0cmの長
方形に切断し、試験具を作成した。次に、該試験
具に両面接着テープを貼り、それによりプラスチ
ツク支持体に固定した。配合Ａ，Ｂ，Ｄ及びＦを
有する組成物を組み入れて作成した試験具を各々
試験具Ａ，Ｂ，Ｄ及びＦとする。 次に、ビリルビン１mg／dlを含む様に前もつて
試験した血清試料を約30μの量で、作成した
個々の試験具上の異なる場所（中央部及び周辺
部）に適用した。発色応答の読みは反射分光光度
計で行なつた。反射率パーセント（％Ｒ）を、試
料適用後、90秒560ナノメーター（nm）の波長で
読んだ。この実験の実施で得た結果を、表２に％
Ｒ値で記載する。

【表】 試験具Ｆの560nmでの％Ｒは余りに小さく読む
事が不可能であつた。しかしながら、反射率が最
小である450nmでは読む事が可能であるが、この
波長での読みは血清自体の色にまで種々応答する
ので信頼性がない。 記載した結果は配合Ａの組成物を含む試験具
で、試料を中央部及び周辺部に適用した場合の％
Ｒの相違は0.3である事を示している。配合Ｂの
組成物を含む試験具で、試料を中央部及び周辺部
に適用した場合の％Ｒの相違は9.5である。試験
具Ａの読みの均一性に対する試験具Ｂの読みの不
均一性間の相違は、この比較で、１：31.7の比で
ある。配合Ｄの組成物を有する試験具で、試料を
中央部及び周辺部に適用した場合の％Ｒの相違は
11.4である。試験具Ａの読みの均一性に対する試
験具Ｄの読みの不均一性間の相違は１：38の比で
ある。上述した様に、含浸溶液さえできなかつた
為、配合Ｃ及びＥの組成物を有する試験具につい
ては結果が得られなかつた。 種々の試験具に関する表２の％Ｒの読みは、数
学的に外挿して、ビリルビン濃度をミリグラム／
デシリツトル（mg／dl）として表わした。試験具
Ａについて記載した％Ｒ値は、非常に似ていて、
正確に前もつて試験した値1.0mg／dlの濃度であ
り、ビリルビン量を共に、本質的に再現してい
る。試験具Ｂについて記載した％Ｒ値は、各々
47.0及び56.5で、1.0mg／dl（試験具Ｂの配合に関
しては正確な値）及び誤つた零の値（０mg／dl）
を表わしている。試験具Ｄについて記載した％Ｒ
値は、各各1.0mg／dl及び０mg／dlのビリルビン
量を表わしている。試験具Ｂにおける様に、測定
されるビリルビン濃度の実質的な違いは、血清を
試験具上のどこに適用するかに依存している事が
観察できる。 記載した実験結果及び上述の分析した結果は、
本発明による試験具を用いて測定した場合、発色
が非常に均一になり、従つて臨床データーが非常
に正確になる事を示している。 本発明はある程度特徴的に記載されているが、
本発明の範囲から逸脱せずに種々の改質がなされ
うる事は理解されるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血清試料中のビリルビンの検出用試験具であ
   つて、担体及びその担体に包含された、ジアゾニ
   ウム塩、ｐ−トルエンスルホン酸及びダイフイリ
   ンから成る組成物、から成ることを特徴とするビ
   リルビン検出用試験具。 ２ 該ジアゾニウム塩がハロベンゼンジアゾニウ
   ム塩である特許請求の範囲第１項記載の試験具。 ３ 該ジアゾニウム塩が２，４−ジクロロベンゼ
   ンジアゾニウム−１，５−ナフタレンジスルホネ
   ートである特許請求の範囲第２項記載の試験具。 ４ 該ジアゾニウム塩がｐ−ニトロベンゼンジア
   ゾニウム塩である特許請求の範囲第１項記載の試
   験具。 ５ 該ｐ−ニトロベンゼンジアゾニウム塩がｐ−
   ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレ
   ートである特許請求の範囲第４項記載の試験具。 ６ 血清試料中のビリルビンの検出用試験具であ
   つて、担体及びその担体に包含された、ｐ−トル
   エンスルホン酸；ダイフイリン；１，５−ナフタ
   レンジスルホン酸ジナトリウム；２，４−ジクロ
   ロアニリン；及び亜硝酸ナトリウムから成る組成
   物、から成る事を特徴とするビリルビン検出用試
   験具。 ７ 担体に、ジアゾニウム塩、ｐ−トルエンスル
   ホン酸及びダイフイリンから成る組成物を接触さ
   せる事を特徴とする血清試料中のビリルビン検出
   用試験具の製造方法。 ８ 担体に、ｐ−トルエンスルホン酸；ダイフイ
   リン；１，５−ナフタレンジスルホン酸ジナトリ
   ウム；２，４−ジクロロアニリン；及び亜硝酸ナ
   トリウムから成る組成物を接触させる事を特徴と
   する血清試料中のビリルビン検出用試験具の製造
   方法。 ９ 血清試料中のビリルビンの検出方法であつ
   て、前記試料を、担体及びその担体に包含された
   ジアゾニウム塩、ｐ−トルエンスルホン酸及びダ
   イフイリンから成る組成物、から成る試験具と接
   触させ、生じた比色応答を観察することから成る
   事を特徴とする検出方法。 １０ 血清試料中のビリルビンの検出方法であつ
   て、前記試料を、担体及びその担体に包含された
   ｐ−トルエンスルホン酸；ダイフイリン；１，５
   −ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム；２，４
   −ジクロロアニリン；及び亜硝酸ナトリウムから
   成る組成物、から成る試験具を接触させ生じた比
   色応答を観察する事から成ることを特徴とする検
   出方法。