JPS6246262A - 妊娠診断用乾燥試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は妊娠診断用乾燥試薬、更に詳しくは、ヒト絨毛
性ゴナドトロピン（以下、ｈＣＧと略称する）に対する
特異性が高く、高感度で、かつ試薬の安定性の高い妊娠
診断用乾燥試薬に関するものである、 〔従来の技術〕 ｈＣＧは妊娠と同時に絨毛細胞より分泌される糖蛋白ホ
ルモンの一種であり、グロゲステロンの分泌を促進する
。又、絨毛性環、非絨毛性癌、胞状奇胎のときに見出さ
れる６ したがって、ｈＣＧの検出は妊娠の早期診断とｈＣＧ分
泌性の癌の診断に有用であることは、よく知られている
。

体液、殊に尿中のｈＣＧの測定に関しては、従来の生物
学的検出法に代り、近年でＨｈＣＧに対する抗体全利用
した免疫学的方法が主流である。

この免疫学的方法に於てはｈｃＧＫ対する特異性が高く
、高感度で、かつ正確性、迅速性、簡易性が要求される
。

現在、ｈＣＧの免疫学的測定法としては、抗ｈＣＧ抗体
をラテックス担体に感作した試液と尿等の検液と全ガラ
ス、合成樹脂、紙等のスライド状あるいけプレート状等
の基体表面上に滴下し反応させ、その凝集状態を観察す
る凝集反応による検出法が繁用されている。

これら従来の詳薬は、自然凝集を避ける為、抗体感作ラ
テックス懸濁液（以下、単にラテックス乳液という）と
緩衝液の２試液に別れており、ラテックス乳液は使用時
毎に、振とり混和して液を均一にしてから、基体上に緩
衝液と共に滴下するという、繁雑な操作が必要であった
、又、滴下することによる試液量の誤差、あるいはガラ
ス、合成樹脂製の基体全線り返し使用する場合には、そ
のつど洗浄する必要があるが、その際の残留洗剤による
基体表面の汚染あるいはキズ等の影響により正確性にお
いて問題？生ずる等、迅速性、正確性、試薬の安定性て
於て満足のいくものではなかった。

したがって、ラテックス乳液と緩衝液のように複数の試
薬液を準備することなく、かつ不正確な滴下操作を必要
としない、迅速性、正確性、品質の安定性に於て満足の
いく特異的な免疫学的ｈＣＧ検出用試薬の出現が望まね
ている。

一方、被検液中に存在するカルシウムイオンが、ｈＣＧ
の濃度とは無関係に感作赤血球の自発的凝集を起こすこ
とが知られており、この問題全解決するためこのカルシ
ウムイオンと結合させ非特異凝集？抑える為のキレート
剤全使用する方法が用いられている（特公昭４０−１７
６７２号）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

担体にラテックスを用いた場合に於ても、カルシウムイ
オンによる非特異凝集が起こるので、キレート剤全使用
することにより測定精度全向上させるのが好ましいが、
ラテックス乳液にキレート剤を添加するとラテックス乳
液は経時的に自然凝集奮起こすので、緩衝液に添加する
こととなり、必然的に試薬は２試液とならざる全農ない
。

それ故、従来被検液中のカルシウムイオンの影響を除き
、かつ測定時に試薬液の滴下操作？必要としない特異的
な免疫学的ｈＣＧ検出用試薬は知られていなかっ７ｔ、
。

本発明は上記従来技術における問題点を解決するための
ものであり、その目的は、ラテックス乳液と緩衝液とキ
レート剤とを混合して単一試薬として、担体表面上に塗
布し乾燥してなるディスポタイプの測定試薬とすること
によって、被検液例えば被検尿との非特異反応１除き、
かつ試薬の安定性、測定操作の簡易性、迅速性、並びに
反応の正確性の全て全溝足し得る試薬を提供することに
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

すなわち本発明の妊娠診断用乾燥試薬は、ヒト絨毛性ゴ
ナドトロピン（ｈＣＧ）に対するモノクローナル抗体を
感作したラテックス担体と、キレート剤とを含有する抗
体感作ラテックス懸濁液を、凝集反応用基体の表面上に
塗布し乾燥してなることを特徴とする。

本出願人は先にｈＣＧのα鎖サブユニット、及びβ鎖サ
ブユニットに対するモノクローナル抗体を用い７２：％
異性、並びに感度の高いｈＣＧの直接凝集反応による測
定試薬について特許出願上した（特願昭６Ｏ−２６５９
７）　６上記の先願により、前述の従来の測定法におけ
る欠点の内、特異性並びに感度については、はぼ満足の
いく測定試薬全組たが、本発明者は、更に正確性、迅速
性、試薬の安定性の改良全図るべく、鋭意研究の結果、
本発明全完成した。

すなわち、従来の試薬が液体であり１混合して放置する
と自然凝集するという非特異反応を避ける為、ラテック
ス乳液と緩衝液との２試液と成らざる全農なかったこと
による従来の試薬の前述の種々の欠点全解消するために
、本発明においては試薬を基体上で乾燥することにより
単一試薬とした。

又、被検体である尿中に存在するカルシウムイオンによ
る非特異凝集１避けるため、キレート剤全使用した。こ
のキレート剤の使用は、ラテックスを担体とした妊娠診
断用乾燥試薬においては従来知られていなかった。

上記の二つの条件を合せ持つことにより本発明による試
薬、すなわちキレート剤全添加したｈＣＧに対するモノ
クローナル抗体全感作したラテックス乳液と緩衝液との
２試液混合液？担体表面上に塗布し乾燥した妊娠診断用
乾燥試薬は、特異性が高く、高感度で、かつ正確性、迅
速性、簡易性、試薬の安定性の全て全満足させるもので
ある。

本発明の妊娠診断用乾燥試薬に用いるモノクローナル抗
体の調裂け、ケラ−とミルスタインの方法に準じて行な
われる。

すなわち、ｈＣＧで免疫した動物の抗体産生細胞と、骨
髄腫細胞のように、人工培養基で増殖のよい細胞と全融
合させる。

得られた融合細胞のうち、目的とする抗体全産生するも
の全クローニングし、培養液又は動物の腹腔内に接種し
て増殖させた後、塩析、クロマトグラフィーなどＫより
、濃縮、精製してモノクローナル抗体を得る、 ラテックスにモノクローナル抗体全感作する方法は、物
理的な吸着を利用した方法で目的を達することができる
が、アミノ基、カルボキシル基など？付したラテックス
に化学的に結合させる方法や、更に感度を増し特異性を
上げるためスペーサー全挿入する方法も選べる、凝集用
基体としては、紙、樹脂フィルムあるラミネート材等が
用いられる。

特に、基体表面全コロナ放電処理、オゾン処理、火焔処
理又は、クロム酸処理等？施し、表面全酸化して水に濡
れ易くしたものが好ましい。

基体表面の反応の場としては、例えば、表面上に周囲を
凸部で囲むか又は疎水性塗料上用いて設けた、円もしく
は楕円状の閉鎖線で囲まれた領域とし、背景は凝集の観
察が容易なように着色したものが好ましい、 又、基体表面に円、楕円、矩形状等の適する大きさの凹
部全役け、この中に乾燥試薬全形成して反応の場として
もよい７ ラテックス乳液全安定化するための緩衝液としては、公
知のもの全周いることができるが、特ＶＣＢ　Ｓ　Ａ　
（Ｂｏｖｉｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ　；牛血清
アルブミン）、ショ糖、マンニトール等ｙ、　１　種以
上添加したものが好ましい。

キレート剤としては、エチレンジアミンａ６酸等のポリ
アミノカルボン酸類、クエン酸等のオキシカルボン酸類
、あるいは縮合リン酸Ｊｔ、４を用いることができるが
、特にＥＤＴＡのアルカリ金属塩、（以下、ＥＤＴＡ２
Ｎａと略称する）が好ましい。

試薬の乾燥は、担体の反応の場の、はぼ中央に５〜５０
μｌ程度全塗布し、室温〜７０℃桿度で行なう。

〔実　施　例〕

以下の実施例、比較例並びに比較試験例において本発明
を更に詳細に説明する６なお本発明は下記実施例に限定
されるものではない。以下、チは重量％全表わす。

モノクローナル抗体の調製： ｈｃＧ２０μｇｋ生理食塩水０．２　ｍｌに溶解し、等
量のフロイントの完全アジュバントヲ加え、混合した後
、その［１２ｍｌ　ｋ　Ｂａ１ｂ　／　Ｃマウス指掌部
の皮下及び背部に接種した。

接種後四週目に抗体価の上昇′ｆｒ：確認し、さらにｈ
　ＣＧ　２０μＩ全生理食塩水１２ｍ１に溶解したもの
？腹腔内に接種した。

３日後に、免疫マウスの膵臓全摘出した６ｈＣＧ免疫Ｂ
ａ１ｂ／Ｃマウスの稗細胞と対数増殖期にあるマウス骨
髄牌細胞ｐ３−Ｘ６３Ｊ１ｇ８−６５５を４：１の側合
で混合し、５０チポリエチレングリコール４０００液存
在下に２分間性いて細胞融合全行なった。

融合後、細胞？洗浄し、ＨＡＴ培地に浮遊させ９６穴（
ウェル）のマイクロカルチャープレートに分注し培養し
た。

培養の観察音読け、ハイブリッドの増殖が認められたウ
ェルは、４５個であった。

これらハイブリッドは、更に培養金続は細胞塊が大きく
なった後、上清全採取した、採取した培養上清１ＥＩＡ
法により検査し、目的とする抗体？産生じている細胞１
辺びだした。

選びだした細胞は、再度クローニング２繰り返しクロー
ンとして確立させた。

その結果、ｈＣＧβ鎖特異抗体を産生ずるクローンと、
α釦特異抗体全産生するクローン全農た。

上記５種のハイブリドーマ各々、５×１０ｂ個全７日前
に２．６．１０．１４テトラメチルペンタデ力ンα５ｍ
ｌ’に腹腔内に注射しｆｃ８週令雌マウス（ＢａＡ：ｂ
／Ｃ）に腹腔内投与した。

２〜４週後、腹腔が肥大したマウスよジ腹水全採取し、
室温、１２００回転、１０分間遠心し、最上部の有機溶
媒全除去し、中間の腹水層を集めた。

得られた腹水を、更に硫安塩析法によりｆｌｋｍ、精製
し抗体とし７ｔ０ 抗体感作ラテックス液の調製： 粒径ａ５μのポリスチレンラテックスの、２チ懸濁液１
　ｍｌに、１％抗体Ｃ１，０２ｍＪの割合で、抗β鎖抗
体？加え、よく攪拌した後、５６°Ｃで３０加温し感作
しｆｃ。

混合試薬の調製： 上記で作成した感作ラテックスを、遠心洗浄後、２チ懸
濁液となるように、［１２ＭＥＤＴＡス液とした。抗α
鎖抗体についても、同様の操作で抗体感作ラテックス液
全調製した。

この２種の感作ラテックス液全当量混合しｆｃ。

乾燥試薬の作成： （１）上記で調製した混合試薬上、第１図に示す熱可塑
性樹脂フィルム１全コーティングしたスライド２上に約
１５μ１滴下し、６０℃で５０分間乾燥して乾燥試薬５
全得念。

（２）同様の混合試薬上、第２図に示す凹所全役けた熱
可塑性樹脂シート４の凹所内に約１５μ１滴下し、６０
℃で５０分間乾燥して乾燥試薬３を得た５なお、５は乾
燥試薬５の汚染全防ぐための粘着剤全塗布しｔプラスチ
ックフィルム等の剥離シートである。剥離シート５の代
りに袋内に熱可塑性樹脂シート４全収納してもよい。

比較例１： キレート剤を添加しないこと以外は実施例と同様にして
比較例の乾燥試薬を調製した、比較試験１： 実施例にて作成した乾燥試薬並びにキレート剤無添加に
て同様に作成した比較例の乾燥試薬について、非妊婦尿
１００例を被検体として測定し、その的中率を比較した
結果を第１表に示−ｔ。

測定方法は、作成した乾燥試薬上に、被検体尿［Ｌ１７
１１ｉ滴下し、攪拌棒で良く混和し、６分間スライド全
回転振とうした後、明るい照明の下で、凝集の有無全観
察した。

判定結果は、凝集しなかったもの會−１凝集が観察され
たものケ＋、弱い凝集が観察さｈたもの全土で表わした
、 第１表　キレート剤の添加効果 第１表より、キレート剤の添加により的中率が大きく向
上しているの７５：判る。

比較例２： 実施例で調製した抗体感作ラテックス液全用いて、これ
にキレート剤を添加した試液苓・作成した。

比較試験２： 上記の試液と実施例で調製した本発明の乾燥試薬とを、
各々３７℃及び４℃で、１週間及び２週間保存したもの
について、ｈｃＧｉＯ〜１、　ＯＩＵ／ｍｌの範囲で、
６段階のｐ度で含有した標準液全検体として測定した。

結果を第２表に示す。

測定方法は、抗体感作ラテックス試液については、スラ
イド上に１０１５ｍ１滴下した上に、標準液ｆ　１１　
ｍ１滴下し、攪拌棒で良く混和し、５分間スライド金回
転振とうした後、明るい照明の下で、凝集の有無を観察
した。

本発明の乾燥試薬については、比較試験１゜と同様の操
作にて行なった、 判定結果は、凝集しなかったものに一１凝集が観察され
たもの全＋、弱い凝集が観察されたもの全土で表わした
。

＼　）、 第２表より明らかなように、本発明の乾燥試薬は保存温
度や保存日数の影響ケ受けず安定であるが、液状試薬は
上記保存条件の影’Ｊｆｆｉ受けており、試薬全乾燥し
た効果がよく判る。

比較試験３： 実施例にて作成した本発明の乾燥試薬と、対照としてキ
レート剤全添加しない乾燥試薬、並びに従来の抗ｈＣＧ
ウサギ抗体感作ラテックス液について、妊婦尿（−１−
）１００例、非妊婦尿（−）１００例及び更年期婦人尿
（−）　５０例ｋＭ検体として測定した。結果に第３表
に示す。

表中の数値は、妊婦尿で凝集（斗）、弁杆へ１）尿並び
に更年期婦人尿で非凝集（−）を示した件数全表わす。

＝、ｘ ・　／−／− 一、−、ｘ＝−、Ｈ ＝、／　　５．、、、、’、／； 一／ ／、２／ 第５表　各種試薬における判定数 本発明の乾燥試薬は凝集及び非凝集の又方シておいて特
異反応性が優れており、キレート剤無添加の乾燥試薬及
び従来のｈＣＧ抗体感作ラテックス液と比べてキレート
剤全添加し、かつ乾燥したことによる判定率の向上効果
が明確に現われている。

〔発明の効果〕

上述のように本発明の妊娠診断用乾燥試薬は、ヒト絨毛
性ゴナドトロピンに対するモノクローナル抗体全感作し
たラテックス担体とキレート剤とを含有する懸濁液を基
体表面上に塗布し乾燥してなるものであるため、被検液
中に存在する金属イオン特にカルシウムの影響？防ぐこ
とができ判定率が向上した。

又、試薬全乾燥させたことにより、従来の同種目的に使
用する試薬だ比べて安定性が増加し、使い捨てできるた
め試薬の保管や管理が容易となジ、更に測定操作も簡単
で個人差がでないため、妊娠の診断を正確かつ簡便迅速
に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の妊娠診断用乾燥試薬の一実施例の斜視
図。 図中、 １・・・熱可塑性樹脂フィルム　　　２・・・スライド
５・・・乾燥試薬　　　　４・・・熱可塑性樹脂シート
５・・・剥離シート 才１図 １　・・・熱１Ｌで性村寸脂フィルム ２・・・・スライド ３＝°゛少之丙炉龜式東 才２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に対するモノ
   クローナル抗体を感作したラテックス担体と、キレート
   剤とを含有する抗体感作ラテックス懸濁液を、凝集反応
   用基体の表面上に塗布し乾燥してなることを特徴とする
   妊娠診断用乾燥試薬。 ２）モノクローナル抗体がｈＣＧのα鎖サブユニット、
   及びβ鎖サブユニットに対するモノクローナル抗体であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の妊娠診
   断用乾燥試薬。