JPS624116B2

JPS624116B2 -

Info

Publication number: JPS624116B2
Application number: JP55093126A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Arai; Tatsuo Haishi; Akio Torigata; Yasuhiro Ito
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1980-07-08
Filing date: 1980-07-08
Publication date: 1987-01-28
Also published as: JPS5718634A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新抗生物質キヤンデイプラネシン
（Candiplanecin）に関するものである。本発明者
らは島根県能義郡で採取した土壤から分離したア
ンプラリエラ属に属するNo.43871株がカビ、酵母
に対し抗菌力を有する新抗生物質キヤンデイプラ
ネシンを生産することを見い出した。従つてキヤ
ンデイプラネシンはこれらカビ、酵母に起因する
ヒト、動物または植物の疾病の予防あるいは治療
に用いられる薬剤として有用である。キヤンデイプラネシンを生産するNo.43871株の
菌学的性状は次の通りである。 (1) 形態学的特徴 ISP〔インターナシヨナル・ストレプトマイ
セス・プロジエクト（International St―
reptomyces Project）〕規定の培地およびワツ
クスマン（S.A.Waksman）らの勧告〔ゼ・ア
クチノミセテス（The Actinomycetes）２
巻〕の培地上、28℃14日間培養後、顕微鏡下観
察によるNo.43871株の形態学的特徴は胞子嚢を
有し、その直径は3.5〜6.2×7.0〜11.5μであつ
て柱状を示す。胞子は0.7〜2.0×1.1〜2.5μで
あつて鞭毛を有し胞子嚢を滅菌水に入れた場
合、胞子は約30分で遊走性を帯びる。 (2) 各種培養基上の諸性質各種培養基上で28℃14日間培養した時の性状
は第１表に示す通りである。色調の表示は日本
色彩研究所版“標準色票”のカラーチツプナン
バーを表わす。またNo.43871株の生理学的性質を第２表に、
炭素源の同化性を第３表に示す。

【表】

【表】＊〓強く同化、＋〓同化、−〓同化せず
(3) 菌体内成分についてビー・ベツカー（B.Becker）らおよびエ
ム・ピー・レシエバリヤー（M.P.
Lechevalier）らの方法〔エツチ・プラウザー
（H.Prauser）著、ゼ・アクチノミセタレス
（The.Actinomyceta―Ies）311頁、1970年、ア
プライド・マイクロバイオロジー（Applied
Microbiology）12巻、421頁、1964年、同13
巻、236頁、1965年〕に従い、菌体の酸加水分
解物のペーパークロマトグラフイーによる分析
を行つた結果、メソ・２，６―ジアミノピメリ
ン酸およびグリシンが認められ、細胞壁のタイ
プは型であることが確認された。上記の如きNo.43871株の諸性状のうちで特に、
柱状の胞子嚢を形成し、胞子が遊走性を有し、細
胞壁タイプが型であることなどから、本菌株が
放線菌の中でもアクチノプラナセアエ科
（Actinoplanaceae）のアンプラリエラ（Ampulla
―riella）属に属する菌株であることが明らかと
なり、アンプラリエラ・エスピー（Ampullarie
―lla sp.）No.43871と命名した。本菌株は通産省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されておりその微生物受託番号は第5646
号である。以上キヤンデイプラネシンの生産菌について説
明したが、放線菌の諸性質は一定したものではな
く、自然的、人工的に容易に変化することは周知
の通りであり、本発明で使用しうる菌株はアンプ
ラリエラ属に属するキヤンデイプラネシンを生産
するすべての菌株を包含するものである。本発明の方法における培養は、一般放線菌にお
ける培養方法に準じて行われ、液体培地中での振
盪培養あるいは通気撹拌培養によるのが好まし
い。培地成分としては放線菌の栄養源として公知
のものが使用され、たとえば炭素源としてブドウ
糖、シユクロース、グリセリン、マルトース、デ
キストリン、澱粉、大豆油、綿実油などが、窒素
源としては、大豆粉、落花生粉、綿実粉、フアー
マミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプト
ン、肉エキス、イースト、イーストエキス、硝酸
ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、
種々のアミノ酸等が、又無機塩として、食塩、燐
酸塩、炭酸カルシウム、微量金属塩などが必要に
応じて適宜添加される。液体培養に際しては、シ
リコン油、植物油、界面活性剤等が消泡剤として
適宜使用される。培地のPHは中性付近、培養温度
は24℃から30℃、特に28℃前後が好ましい。培養の経過に伴つて培養液中に生産されるキヤ
ンデイプラネシンの力価の経時的変化は、被検菌
としてキヤンデイダ・アルビカンス
（Candidaalbicans）YU1200の一夜培養液をサブ
ロー寒天培地（栄研化学株式会社製）に加えて調
整した寒天平板でペーパーデイスク検定法により
測定される。通常72〜150時間の培養でキヤンデ
イプラネシンの生産量は最高値に達する。主とし
て培養液中の液体部分に存在するキヤンデイプラ
ネシンは培養終了後菌体その他の固型部分を珪藻
土等を過助剤とする過操作あるいは遠心分離
によつて除去し、その液あるいは上清中から抽
出精製される。キヤンデイプラネシンはその物理化学的性状を
利用することにより、たとえば吸着剤を用いて採
取することができる。吸着剤としては、たとえば
活性炭、あるいは吸着用樹脂であるアンバライト
XAD―２、XAD―４、XAD―７等（ロームアン
ドハース社製）やダイヤイオンHP10、HP20、
HP50等（三菱化成社製）が使用され、キヤンデ
イプラネシンを含む液から、上記の如き、吸着剤
を通過させて、含まれる不純物を吸着させて取り
除くか、キヤンデイプラネシンを吸着させた後、
メタノール水、ｎ―ブタノール水、アセトン水な
どを用いて溶出する。又、キヤンデイプラネシン
は水と混合しない有機溶媒たとえば、酢酸エチ
ル、ｎ―ブタノール、メチルイソブチルケトンな
どの単独またはそれらの組み合せにより培養液
または水溶液から中性ないし酸性で抽出精製する
ことも可能である。更に、キヤンデイプラネシン
を精製するためには、セフアデツクスLH―20
（フアルマシア社製）などを用いた分配カラムク
ロマトグラフイー、プレパツク500／C₁₈（米国ウ
オーターズ社製）などを用いた逆層分配クロマト
グラフイー、シリカゲル、フロリジルのような担
体を用いた吸着カラムクロマトグラフイー、キヤ
ンデイプラネシンと混在する不純物との溶媒に対
する分配率の差を利用した抽出法あるいは向流分
配法などが有効な方法といえる。以上の精製手段
を単独あるいは適宜組み合せ、反復用いることに
よりキヤンデイプラネシンを精製することが出来
る。キヤンデイプラネシンは又一般の脂溶性抗生
物質と同じく培養条件によつては培養液中の菌体
部分に存在し、アルコール類、アセトン等の親水
性有機溶媒によつて抽出後溶媒を除去し、水溶液
とした後、培養液からと同様の方法で抽出精製
することが出来る。このようにして得られたキヤ
ンデイプラネシンは次の理化学的性状を有する。１物質の性状：酸性の淡黄色油状物質２元素分析値（％）：Ｃ、59.29、Ｈ、7.37 ３分子量：マススペクトル法で測定出来なかつ
た。４比旋光度：〔α〕^２０ _Ｄ＝＋26.3゜（C0.85、
CHCI³）５紫外線吸収スペクトル（第１図）：メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペ
クトルは第１図に示した通り270nm（Ｅ^１％_１cm＝
296）に極大吸収を示す。６赤外線吸収スペクトル（第２図）：クロロホルム溶液で測定した赤外線吸収スペ
クトルは第２図に示す通りである。７核磁気共鳴吸収スペクトル（第３図）：重クロロホルム中内部基準にTMS（テトラ
メチルシラン）を使用して測定した核磁気共鳴
吸収スペクトル（60MHz）は第３図に示す通り
である。８溶解性：ベンゼン．クロロホルム、酢酸エチル、アセ
トン、メタノールに可溶。水に難溶。９呈色反応：ヨード、過マンガン酸カリ．硫酸に陽性、ニ
ンヒドリンに陰性。 10 薄層クロマトグラフイー：Ｒ_f値0.4 吸着剤；メルク社製シリカゲルプレートNo.5715 展開溶媒；クロロホルム：メタノール（４：
１） 11 高圧紙電気泳動： 0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）中で東洋
紙No.51Aを用いた高圧紙電気泳動（55volt／
cm、0.8mA／cm）では陽極に向つて移動し、標
準物質として用いたB.P.B（ブロムフエノール
ブルー）の易動度を1.0とした時、キヤンデイ
プラネシンのそれは0.46である。 12 抗菌スペクトル：カビ、酵母類に対する最小阻止濃度（MIC）
はサブロー寒天培地又はポテトデキストロース
寒天培地を用いた寒天稀釈法によつて測定し
た。その結果は第４表に示す通りである。

【表】上記の如きキヤンデイプラネシンの特性を既知
抗生物質の諸性状と比較した結果、一致するもの
はなく新抗生物質と判定された。実施例１アンプラリエラ・エスピーNo.43871株を培地組
成―１で示される培地80mlを含む500ml容三角フ
ラスコに一白金耳接種し、220rpmの回転振盪培
養機により28℃にて120時間培養した。この培養
液１mlを、培地組成―２で示される培地80mlを含
む500ml容三角フラスコに接種し、220rpmの回転
振盪培養機により28℃で培養した。培養液を3000rpm10分遠心し、その上清液につ
いてペーパーデイスクを用い、キヤンデイダ・ア
ルビカンスYU1200に対する抗菌力を測定しなが
ら培養の経過を追うと120時間でその生産量は４
μｇ／mlに達した。

【表】

【表】実施例２アンプラリエラ・エスピーNo.43871株を培地組
成―１の培地を80ml含む500ml容三角フラスコに
一白金耳接種し、220rpmの回転振盪培養機によ
り28℃にて120時間培養した。この培養液を35ml
ずつ培地組成―３の培地700mlを含む２容三角
フラスコに接種し、220rpmの回転振盪培養機に
より28℃にて72時間培養した。次にこの培養液
2.5を培地組成―３の培地50を含む100容タ
ンクに接種し、通気量1v.v.m、回転数390rpm、
内圧1.0Kg／cm²で28℃にて48時間培養した。得ら
れた培養液は種培養液として、培地組成―３の培
地300を含む600容タンクに15接種し、本培
養を行なつた。本培養の条件は、通気量300／min.，内圧1.0
Kg／cm²、回転数240rpmで28℃にて93時間培養し
た。培養終了後セライトを助剤に用いて、フイル
タープレスにて過し、280の培養液を得
た。

【表】この液280を塩酸水でPH３に調整後、セラ
イトを助剤に用いてフイルタープレスで過し
液270を得た。この液をダイヤイオンHP20
27のカラムに吸着せしめカラムを水洗後、PH
12、80％含水メタノールにて溶出し、活性分画
140を得た。この活性分画をPH７に調整後減圧
下濃縮し、40の濃縮液を得、再度PH2.5に調整
後、40の酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を
合併後、減圧下濃縮し、酢酸エチルで十分膨潤平
衡化させたセフアデツクスLH―20カラム（６×
66cm）に注加した。同溶媒で展開し、活性分画
1105mlを得た。減圧下濃縮し、キヤンデイプラネ
シン284mgを含む茶かつ色油状物17ｇを得た。
液からの回収率は51％であつた。得られた油状物
を200mlのクロロホルムに溶解せしめ、クロロホ
ルムで調整したフロリジルカラム（岩井化学薬品
社製40ｇ）に吸着させた後、はじめ800mlのクロ
ロホルムで、次いでクロロホルム―メタノール
（９：1v／ｖ）で溶出し、溶出液は100mlずつ分
画した。フラクシヨン９から19までを集めて減圧
下濃縮することにより234mgのキヤンデイプラネ
シンを含む茶黄色油状物３ｇを得た。この油状物
は更に分取用高速液体クロマトグラフイー・シス
テム500（米国ウオーターズ社製）を用いて精製
した。即ちこの油状物３ｇをメタノール13mlに溶
解したのち、60％含水メタノールで十分平衡化し
たプレパツク500／C18（米国ウオーターズ社
製）１本に注加し、はじめ３の60％メタノール
で、次いで85％含水メタノールで順次溶出し、溶
出液は300mlずつ分画した。フラクシヨン11〜14
を集めて減圧下280mlまで濃縮後、稀塩酸でPH2.5
に調整し、250mlの酢酸エチルで２回抽出した。
抽出液を合併後減圧下５mlまで濃縮、クロロホル
ム―酢酸エチル（１：1v／ｖ）で十分膨潤平衡
化させたセフアデツクスLH―20カラム（4.5×56
cm）に注加し、同溶媒系で展開し、溶出液は10ml
ずつ分画した。フラクシヨン55〜67を集めて減圧
下濃縮乾燥し、キヤンデイプラネシン165mgを淡
黄色油状物として得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はキヤンデイプラネシンの紫外線吸収ス
ペクトル、第２図は同物質の赤外線吸収スペクト
ル、第３図は同物質の核磁気共鳴吸収スペクトル
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性状を有する抗生物質キヤン
デイプラネシン（Candiplanecin）１物質の性状：酸性の淡黄色油状物質２元素分析値（％）：Ｃ、59.29、Ｈ、7.37 ３分子量：マススペクトル法で測定出来なかつ
た。４比旋光度：〔α〕^２０ _Ｄ＝＋26.3゜（C0.85、
CHCI₃）５紫外線吸収スペクトル（第１図）：メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペ
クトルは第１図に示した通り270nm（Ｅ^１％_１cm＝
296）に極大吸収を示す６赤外線吸収スペクトル（第２図）：クロロホルム溶液で測定した赤外線吸収スペ
クトルは第２図に示す通りである。７核磁気共鳴吸収スペクトル（第３図）：重クロロホルム中内部基準にTMS（テトラ
メチルシラン）を使用して測定した核磁気共鳴
吸収スペクトル（60MHz）は第３図に示す通り
である。８溶解性：ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、アセ
トン、メタノールに可溶。水に難溶。９呈色反応：ヨード、過マンガン酸カリ、硫酸に陽性、ニ
ンヒドリンに陰性。 10 薄層クロマトグラフイー：Ｒ_f値0.4 吸着剤；メルク社製シリカゲルプレートNo.5715 展開溶媒；クロロホルム：メタノール（４：
１） 11 高圧紙電気泳動： 0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）中で東洋
紙No.51Aを用いた高圧紙電気泳動（55volt／
cm、0.8mA／cm）では陽極に向つて移動し、標
準物質として用いたB.P.B（ブロムフエノール
ブルー）の易動度を1.0とした時、キヤンデイ
プラネシンのそれは0.46である。 12 抗菌力：キヤンデイダ・アルビカンス、サツカロマイ
セス・セレビシエ、アスペルギルス・オリゼ、
トリコフイトン・メンタグロフイテス、ペリキ
ユラリア・フイラメントーサおよびピリキユラ
リア・オリゼなどを含むカビ、酵母類に抗菌力
を示した。２アンプラリエラ属に属するキヤンデイプラネ
シン生産菌を培養して、キヤンデイプラネシンを
単離することよりなる、キヤンデイプラネシンの
製造法。ここではキヤンデイプラネシンは次の理
化学的性状を有する。１物質の性状：酸性の淡黄色油状物質２元素分析値（％）：C.59.29、H.7.37 ３分子量：マススペクトル法で測定出来なかつ
た。４比旋光度：〔α〕^２０ _Ｄ＝＋26.3゜（C0.85、
CHCI₃）５紫外線吸収スペクトル（第１図）：メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペ
クトルは第１図に示した通り270nm（Ｅ^１％_１cm＝
296）に極大吸収を示す。６赤外線吸収スペクトル（第２図）：クロロホルム溶液で測定した赤外線吸収スペ
クトルは第２図に示す通りである。７核磁気共鳴吸収スペクトル（第３図）：重クロロホルム中内部基準にTMS（テトラ
メチルシラン）を使用して測定した核磁気共鳴
吸収スペクトル（60MHz）は第３図に示す通り
である。８溶解性：ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、アセ
トン、メタノールに可溶。水に難溶。９呈色反応：ヨード、過マンガン酸カリ、硫酸に陽性、ニ
ンヒドリンは陰性。 10 薄層クロマトグラフイー：Ｒ_f値0.4 吸着剤；メルク社製シリカゲルプレートNo.5715 展開溶媒；クロロホルム：メタノール（４：
１） 11 高圧紙電気泳動： 0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）中で東洋
紙No.51Aを用いた高圧紙電気泳動（55volt／
cm、0.8mA／cm）では陽極に向つて移動し、標
準物質として用いたB.P.B（ブロムフエノール
ブルー）の易動度を1.0とした時、キヤンデイ
プラネシンのそれは0.46である。 12 抗菌力：キヤンデイダ・アルビカンス、サツカロマイ
セス・セレビシエ、アスペルギルス・オリゼ、
トリコフイトン・メンタグロフイテス、ペリキ
ユラリア・フイラメントーサおよびピリキユラ
リア・オリゼなどを含むカビ、酵母類に抗菌力
を示した。３アンプラリエラ属に属するキヤンデイプラネ
シン生産菌がアンプラリエラ・エスピーNo.43871
（Ampullariella sp.No.43871、微工研菌寄第5646
号）である特許請求の範囲第２項記載の製造法。