JPS62283103A - Ｌｍｗ−ヘパリンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明はヘパリンの酵素膜重合による低分子量ヘパリン
（ＬＭＷ−ヘパリン）の製法に関する。

〔従来技術および発明が解決しようとする間厘点〕通常
のヘパリンは数平均分子量約１０〜１４０００ドルトン
を有する分子量範囲５０００〜５００００ドルトンのム
コ多糖の不均質混合物である。

ヘパリンは多くのタンパク質特に凝固段階の酵素のｖ１
能に直接または間接に作用する。

ヘパリンの効果は多数の要因たとえば分子における官能
基の分布および分子量により影響される。

すなわち、後者がヘパリンの活性、特に）・ロンビンお
よびアンチトロンビン■により伝達されるＸ０因子の不
活化に重要な役割を果すということは確実に立証されて
いる。

アンチトロンビン活性は約１８藺の単糖に相当する最小
ヘパリン分子量、すなわち約５４００ドルトンが必要で
あり、一方抗Ｘ。因子活性は５〜６個のｉ！ｍ位１５０
０〜１８００ドルトンはど小さいヘパリン分子により表
現されることができる。

一連の他のヘパリン効果、たとえば抗血栓症効果（１８
個以下の単糖を含むヘパリンオリゴ糖は低い抗血栓症活
性を有するように見える）はＡＤＰ−誘因血小板凝集に
影響し、皮下投与後の生物有効性、ＰＦ４およびＨＲＧ
による阻害ならびにＸ０因子を生ずる固有の経路の凝集
酵素に対する活性はヘパリンの分子量に強く影響される
。

近年、分子量４０００ドルトンから６０００ドルトンま
でを有する高いＸ、Ｉ／アンチトロンビン活性を有する
ヘパリン断片または一分画に興味が集まっている。とい
うのは、このような物質が良好な抗血栓症効果を有しそ
れと同時に出血合併症を起こす傾向が全くないかまたは
あったとしてもわずかであることが報告されているから
である。これらはまた、特に皮下投与後に強化された生
物有効性を示す。

ヘパリン作用の１択性は分子量に関連するため、比較的
狭い分子量範囲がヘパリン活性が最適であるところに存
在するようである。

したがって特定の所望の分子量および狭い分子量分布、
すなわち多分散度の低いＬＭＷ−へバリンを製造する方
法が有利であろう。

本発明方法はヘパリンからの脱重合生成物の所望の分子
量範囲の達成を容易にするものである９ＬＭＷ−ヘパリ
ンは分別法により通常のヘパリンから低収率でｙ４製さ
れうる（ドイツ国特許出願公開第２，９４４，７９２号
公報および同第２，９４５，５９５号公報）。しかしな
がら、はとんどのＬＭＷ−ヘパリンは化学的または酵素
的方法のいずれかによりヘパリンを脱型合し続いて必要
ならば分別することにより調製される（ニー、オーナー
　八・Ｈｏｒｎｅｒ　。

ヘパリン、Ｋａｋｋａｒ、編、Ｔｈｏｍａｓ、　１９７
６　　およびベルリンらＰｅｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、ｃ
ａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、１−８，１８５（１
９７１））。

ヘパリンの化学内股重合はヨーロッパ特許公報第００３
７，３１９号、同第００７６．２７９号および同第００
１４．１８４号明細書、米国特許第４，３５１，９３８
号ならびに英国特許第２，００２，４０６号に記載され
ている。

酵素内股重合は米国特許第３，７６６．１６７号、英国
特許第２，００２，４０６号、ヨーロッパ特許公報第０
０１４．１８４号明ａｔ書および米国特許第４，３９６
，７６２号に記載されている。

公知のバッチ成膜重合方法のすべてに特有の主な問題点
は、適切な平均分子量で脱重合、反応を停止することで
ある。さらに、脱重合反応の結果、副反応がない場合で
さえ、所望分子量より小さいかまたは大きいサイズのヘ
パリン断片が得られる。

無機脱重合試薬（亜硝酸、過酸ｆヒ水素等）を用いるヘ
パリン脱重合、のための公知脱重合方法において、攻撃
される分子のサイズまたは破壊されるべき結合手の分子
内での位置に関して何らの採択性も存在しない、アール
、ジェイ、ラインハルトＲ，Ｊ、Ｌｉｎｈａｒｄｔら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　７０２（
１９８２）　１９７〜２０３によればヘパリナーゼ酵素
でさえこのような区別を行なわない。ヘパリン活性の作
用形態は１壬意の内部分解である。

このことはヘパリン脱重合温き物の多分散度が脱重合の
程度の関数として統計的に予想できうる方法に発展する
ことを意味する。特に平均分子量が所望の価３ちょうど
越える時点で大部分の断片は所望の分子量を有するが、
しかし脱重合が任意に内部分解する性買のためこれらは
またさらに脱重合されてあまり適切でないサイズの断片
となる機会らまた比較的大きい。バッチ成膜重合はほぼ
この時点で停止されるべきである。

しかしながら、これまでのところヘパリンの脱重合を制
御して予測されたＬＭＷ−ヘパリン生成物を高収率で得
るための満足すべき方法は開発されていない。

本発明の目的は水性媒体反応混合物においてヘパリン活
性によりヘパリンの酵素膜重合を制御する方法を提供す
るものである。本発明のさらに別の目的は所望の平均分
子量を有するＬＭＷ−ヘパリンの製法を提供するもので
ある。

〔問題点を解決するための手段、発明の１ヤ用および効
果〕 本発明は、水性媒体中ヘパリン活性によりヘパリンを部
分的に脱重合することによるＬＭＷ−ヘパリンの製法で
あって、この脱重合経過の間に光吸収の増加を測定し、
この増加は醇素脱重合が進むにしたがって不飽和ヘパリ
ン分解生成物の割合が増加することにより引き起こされ
、そして吸収増加が所望の数平均分子量Ｍｎに相当する
値および相当する所望の重量平均分子量ＭＷに達した時
酵素脱重合を停止し、その後ＬＭＷ−ヘパリン生成物を
反応混合物から回収することからなるＬＭＷ−ヘパリン
の製法を提供するものである。

ヘパリン脱重合反応混合物の平均分子量は、たとえばＧ
ｒ’Ｃ−１１ＰＬｃ、粘度測定、光散乱または脱型合方
法で作られた官能基の化学的または物理的測定等に基づ
く幾つかの方法で評価される。

ＧＰＣ−１１ＰＬｃのような言及された方法のほとんど
は時間がかかり、大規模製造に容易には適さない。

実際、ＬＭＷ−ヘパリンの製造に使用される公知方法の
大部分は、脱重合反応の最後に所望の分子量を得るため
に出発組成物および反応条件を注意深く制御することを
あてにした経験的方法に基づくものである。しかしなが
ら、脱重合反応の間の不可避的変動たとえば酵素活性の
変動のために、最終生成物の分子量は一回のバッチから
池のバッチへ変化し、これが均一な生成物を高収率で得
ることと困難にしている。

適切な平均分子量を有する生成物が各々の製造バッチに
より製造されるべきであるならば、脱重合反応混合物に
おいて所望の平均分子量が達成された時に直ちに脱重合
反応を停止させねばならない。このことにより、平均分
子量が変化したすぐ後でまたは多少遅れて分子量決定の
ための測定を続けて行なうことが必要となる。

これまでは脱型合反応混３物（ＬＭＷ−ヘパリン含有）
の分子量測定のための迅速な実際的方法は存在していな
かった。

本発明の一つの見地はこのような方法を提供することで
ある。

ヘパリンまたはＬＭＷ−ヘパリンの平均分子量は数平均
分子量＜Ｍｗ、）、すなわちモルの重量／数として、ま
たは重量平均分子量（ＭＷ）またはピーク分子量（Ｍピ
ーク）として表わされる。ＭＷまたはＭビークは通常は
ヘパリンまたはＬＭＷ−ヘパリン生成物を特徴づけるた
めに用いられる。

ここにおいて、与えられたヘパリン脱重合反応混合物の
多分散度（Ｄ）、すなわちＭｗ／Ｍｏは、第１図に示す
ようにヘパリンの酵素膜重合反応の間に規則的に変化す
ることが実験的に確認された。

本発明はヘバリナーゼな用いたヘパリンの脱重合の間に
Ｍｎを測定するための迅速で確実な方法が開発されたと
いう事実に基づく。第１図でＭｎとＭｎの間の関連性を
示しているように、ヘパリンの与えられた所望のＭｗへ
の脱重合が相当する数平均分子量Ｍｎへ脱重合すること
により達成されうる。

ヘパリナーゼを用いた酵素脱型合方法は分光光度数平均
分子量（Ｍｎ）定量に適している。というのは酵素法は
１個の還元末端基と２３０−２３５ｎｍに独特のＵ■吸
収を有するΔ４，５−不飽和一イズロン酸誘導体からな
る１個の末端基を脱離して作り出すからである。ジー、
テトラ−、ヘキサ−およびオリゴ糖の幾つかのＬＭＷ−
ヘパリン断片のモル吸収係数はリンカ−（Ｌｉｎｋｅｒ
）とホビン（ＩＩｏｖｉＢＩ＋）により公表されている
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１（１９７２）　、５６３−５６
８）。公表されたモル吸収係数の平均値は５５００であ
る。

数平均分子１（Ｍｗ）と２３５ｎｍでの吸収増大の間が
容易に誘導される。

式（１）において、Ｍｎは脱重合生成物の数平均分子量
であり、Ｍｎ、。はヘパリン基質の数平均分子量であり
、Ｃは基質濃度（ｇ／ｌ）、ΔΔ２，５は２３５ｎｍに
おける吸収増大およびεはモル吸収係数である。Ｍｏの
計算は、ヘパリン基質のＭｎ（Ｍｗ。

。）、基贋濃度（ｃ、ｇ、り、および不飽和脱重合生成
物の吸収係数（ε）が公知であり、そしてΔ＾２，５を
測定した場合に可能である。

多数の実験において、リンセーおよびホビン（ＭｅＬｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｇｙｍｏｌｏｇｙ　２８　（１９７
２）、９０２−９１１）によるヒドロキシルアパタイト
クロマトグラフィ用いて部分的に精製されたヘパリナー
ゼによりヘパリン３脱重合する。

数平均分子量Ｍｎは、式（１）を用いそして公表された
値ε＝　５５００を用いて計算し、そしてＧＰＣ−１１
ＰＬＣにより測定したＭｎと比較した。

しかしながら計算値Ｍｎ　（Ｍｏ（ΔＡ＞）はＩ（ＰＬ
Ｃを用いて実測されたＭｎの値（Ｍｗ　（ＨＰＬＣ））
とは２０％の程度までで異なることが一様に見られた。

式（１）を再配列して得られる式（２）：により、所望
の数平均分子ｆｆ１Ｍｎに相当する吸収増大Δ＾２３５
の計算ができる。しかしながら、ここでも、実験により
脱重合を計算値Δ＾２，５で止めるならば、ボビンとリ
ンカ−により見出されたε＝５５００の値を用いる場合
Ｉｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃで測定した実際のＭｗ、ｌが所望のＭ
ｎよりかなり高いことがわがっな。

Ｍｏ（ΔＡ）とＭ　。（ＩＩＰＬＣ）との低い対応関係
はε＝５５００　を用いることにより起きるということ
が結論づけられた。

式（１）を再配列して得られる式： Δ＾Ｂ５　　Ｍｗ１−Ｍｗ１　、　ｕ ・　（Ｍｗ１．。−Ｍｏ）（３） によれば、ＣおよびＭｎ、。の公知の値を用い、同時に
Δへ２１．とＭｎ（ＩＩＰＬＣ）の測定値を用いてεが
計算される。

このようにしてε＝　７６００が見出され、これは多数
の実験において計算値Ｍｗ（ΔＡ）と実測されたＭｗ（
ＨＰＬＣ）の間に密接な相関関係を与える。

容易に測定されたΔ＾２１．に基づくＭｎの適切な値を
計算する可能性は本発明方法の実際に基づき、これにし
たがってヘパリンのバッチ式酵素脱重合をΔ＾２１．の
計算値が達成するまで進めさせ、その後ヘパリン脱重合
反応を停止し、反応混合物を仕上げる。

本発明で使用するヘパリナーゼは、ホビンとリンカ−（
Ｉｌｏｖｉｎｇｈ　ａｎｄ　Ｌｉｎｋｅｒ）（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ　２Ｅｊ　（１
９７２）、９０２〜９１１およびＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
＋ｎ。

２’４５　（１９７０）、６１７０〜６１７５）に記載
されているそれ自体公知の方法により由られる。この方
法は、ヘパリン含有基質中のフラボバクテリウムへバリ
ウム（ＦＩａｖｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｕ
ｍ）を培養し、細胞採取しそして超音波処理により細胞
を破壊し、そしてとりわけヒドロキシアバタイ１〜中で
クロマトグラフィすることにより精製することからなる
。ヘパリンのヘパリナーゼによる分解は、たとえばホビ
ンとリンカ−（Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、２！！立（
１９６５）　、３７２４〜３７２８　）に記載されてい
るように水性媒体中で行なわれる。脱重合混合物の所望
のＭｎ値が達成されるとヘパリナーゼを公知方法、たと
えばｐＨを低めたりまたは短期間加熱処理することによ
り不活化する。

次いでＬＭＷ−ヘパリン生成物を公知方法、たとえばア
ルコールを用いた沈澱により沈澱させ、そして当該技術
でよく知られた方法たとえば漂白、減菌ｒ過およびアル
コール沈澱により精製する。

生成物の所望のＭｗに相当する２３０〜２３５ｎｍでの
吸収増加Δ＾２，５の計算を次のようにして行なう：ａ
）所望のＭｗに相当するＭｎを第１図で読み、ｂ）　ε
について７６００の値を用い上記式（２）を使ってａ）
からＭｎに相当するΔ＾２０．を計算する。

Δ＾２３．はサンプルを好ましくはａｌｌ＜２．５まで
酸性化した後分光光度計を用いて測定される。当業者に
とってはヘパリンにおけるヘパリナーゼの作用により不
飽和分解生成物を形成することにより起こされるＵＶ−
吸収の増加はここで示される以外の波長で測定されうる
ということは明らがである。しかしながら、吸収係数は
これが２３５ｎ＋ｎで最大であるのでこの波長で測定さ
れるのが好ましい。

脱重合はΔ＾２ｏが計算値に達する時に停止され、その
後アルコール（好ましくは０．６〜１０容量／容Ｘ、＞
を添加することによりＬＭＷ−ヘパリン生成物を沈澱さ
せる。

ヘパリン脱重合反応は温度２５〜４０℃、ｐＨ６〜８で
行なうのが好ましい。本発明はヘパリナーゼを遊雛形で
用いる方法により説明するが固定化ヘパリナーゼを用い
てもよい。

例１はヘパリンのバッチ成膜重合の経過を通してサンプ
ルのＡおよびΔＡ測測定より決定されるＭｎ　とＨＰＬ
Ｃ測定によるＭｎ（Ｍｗ（ΔＡ）対Ｍｎ（ＩＩＰＬｃ）
）の一致を説明する。

以下余白 〔実施例〕 例１ ヘパリンナトリウム２．５ｇ　、　ＵＳＰ、　Ｍｗ　＝
１７３００、Ｍｎ＝１２４００ドルトンを０．１　Ｍ＃
酸ナナトリウム２５社０．０１Ｍ酢酸カルシウムｐＨ７
，０に溶がした。

ヘパリナーゼ、０．８ｍｌ、１５００ｕ／ｍＮ、特異的
活性１０５０ｕ／ｍｇを０．１Ｍ酢酸ナトリウム２５ｍ
１中に溶がした。

ヘバリナーゼ一単位はホビンとリンカ−１Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、２８（１９７２）、９０
２〜９１１にしたがって定義される。

ヘパリン基質と酵素溶液を混合し、３０’Ｃのサーモス
タットを備えた水浴中で緩やかに撹拌しながらインキュ
ベ−１・する。

混合後ただちに採取したサンプルを１．７Ｍ過塩素酸で
希釈してｐＨ２，５未満とし、濾過し、そして吸収を２
３５ｎｍで測定する。吸収測定を下記表に示すように何
回か幾つ返し、同時に採取したサンプルを沸騰水浴中で
短時間加熱して酵素活性を破壊する。次いで冷却し、０
．５Ｍ硫酸ナトリウムで５倍に希釈し、沢過し、そして
分子量をＧＰＣ−ＨＰＬＣで分析した。

０．５Ｍ硫酸ナトリウムを溶出液（０，５社／分）とし
て用い連続してウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）　　Ｉ　
−１２５およびｌ−６０カラムを用いてＧＰＣ−ＨＰＬ
Ｃ分析を行ない、屈折率検出により走査し、そして分子
量をデキストランおよびヘパリン断片標準物に基づく非
直線状標準曲線を用いて、保持時間にしたがって計算す
る。

数平均分子量Ｍｎは２３５ｎｍでの吸収増加、ε＝７６
００、ｃ＝５０およびＭｎ、ｕ＝１２４００を用いて式
（１）から計算される。

結果を下記表に示す。表から明らかなように、計算され
た数平均分子量および測定されたものとの間はぴったり
一致する。

以下余白 第土衣 時間＾２，５　　Δ＾２）Ｓ　　Ｍｎ（ΔＡ）　　Ｍｏ
（ＨＰＬＣ）　　Ｍｗ＋（ΔＡ）／Ｍｗ　（ＨＰＬＣ）
（ｈ）　　　　　　　　　（ドルトン）（ドルトン）　
　　　　　％０４．５０−−　　　　　　　　　− １．０　２８．８３　２４．３３　　　６９１２　　　
６７５０　　　　　　　１０２．４２．０　４７．６７
　４３．１７　　　５１４８　　　４６６１　　　　　
　　１１０．４３．０　６３．４３　５８．９３　　　
４２４２　　　４２６１　　　　　　　　９９．６３．
５　７０．０３　６５．５３　　　３９５１　　　３８
６３　　　　　　　１０２．３４．０７７．５　７３．
００　　　３６６６　　　３８３０　　　　　　　　９
５．７４．５　８３．２　７８．７　　　　３４７５　
　　３５６５　　　　　　　　９７．５５．５　９４．
４　８９．９　　　　３１５３　　　３１４５　　　　
　　　１００．３２２　２４２．５　２３８　　　　　
１４１５　　　１４０５　　　　　　　１００．７±４
．４（Ｓ、Ｄ、） 例２ 以下に概略した実験の目的は重量平均分子量（Ｍｗ）６
５００±５００　ドルトンのＬＭＷ−ヘパリンを製造す
ることである。

第１図からＭｗ＝６５００ドルＩ・ンに相当する数平均
分子１（Ｍｗ）が約３５００ドルトンであることがわか
る。

５つの異なったヘパリン（下記表参照）を酵素脱重合１
ヒのために選択する。反応混合物のＭｎ３５００ドルト
ンに相当する２３５ｎｍでの光学密度の変１ヒ（Δ＾２
，５（計算値））を、それぞれのヘパリンについて、ｃ
＝５０ｍｇ／ｍ１、ε＝７６００および実際のヘパリン
ロットのＭｎ１．（下記表参照）を用いて式く２）から
計算する。

ヘパリンの酵素分解は次のように行なわれる：ヘパリン
を微量のカルシウム（０，０００５〜０．ＯＩＭ）を含
有する０、１Ｍ酢酸すｌ−リウムｔｄＥ液中に濃度５０
ｍｇ／ｍ＆で溶解する。溶液を３０℃まで加熱し、ヘパ
リナーゼを必要量添加しヘパリンを約４８時間で所望の
Ｍｎまで脱重合する。

２３５ｎｍにおける光学密度の変化（Δへ２−１）を、
１．７Ｍ過塩素酸でｐＨ２，５未満まで希釈後、反応混
合物のサンプルについて繰り返し測定する。

Δ＾２，５がΔ＾２，５（計算値）と等しくなったとき
に酵素膜重合を止める。

ΔＡ２，５が計算値に達したとき、アルコールを添加し
てＬＭＷ−ヘパリン生成物を沈でんさせ、脱重合生成物
を当該技術で良く知られた方法、たとえば漂白、減菌濾
過およびアルコール沈でんにより精製する。５つの独立
した実験からの生成物特性を次表に示す。

以下余白 茅、１［１モ ２　　　　１０００　　　　１２４００　　　　　３５
００　　　　７７．９３　　　　　６５３　　　　１２
００　　　　　１３９００　　　　　３４００　　　　
８４．４３　　　　　７３４　　　　１０００　　　　
　１１６００　　　　　３５００　　　　７５．８１　
　　　　６０１　　　　７１．７６　　　　８７．８　
　　　３８９０　　　　６１５０２　　　　　ｎ、４０
　　　　９３．９　　　　３８４０　　　　８５１０　
　　　　７６３　　　　８３．９７　　　　９０．６　
　　　３７１０　　　　　市３０７７４　　　　７５．
０７　　　　９０．５　　　　３６６０　　　　６＋８
０　　　　　８２５　　　　７４．８０　　　　９３．
０　　　　３６１０　　　　０６１０　　　　　８２＊
　１を用いたアミド分解アンチファクターＸａ分析によ
る生物学的活性、参考標準物としては国際ＬＭＷ−ヘパ
リン標バ艦物（ナショナルインスティヂュート　〕オア
　バイオロジカル　スタンダーズ　アンド　コントロー
ルズＮｎＬｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ＬｉＬｕｔｅ　ｆｏｒ　
［ｌｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔｕ＋ｄａｒｄｓ　ａｎｄ　
ＣｏｎＬｒｏｌｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）以上のことから、最
終ＬＭＷ−ヘパリン生成物のすべては所望の値内に重量
平均分子ｆｆｉ（Ｍｗ）ｆ！：有することが明らかであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬ　Ｍ　Ｗ−ヘパリンにおける数平均分子量（
Ｍｏ）と重量平均分子量（Ｍｗ）との関係を示すグラフ
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヘパリンにおけるヘパリナーゼの作用により不飽和
   分解ＬＭＷ−生成物を作ることにより起きる光吸収の増
   加を脱重合反応の間に測定し、該反応を吸収増加が所望
   の数平均分子量Ｍｎに相当する値および相当する重量平
   均分子量Ｍｗに達する時に停止し、そしてＬＭＷ−ヘパ
   リンを反応混合物から回収することからなる、ヘパリン
   を水性媒体仲でヘパリナーゼを用いて部分的に脱重合す
   ることによるＬＭＷ−ヘパリンの製法。 ２、吸収係数の増加を２３０〜２３５ｎｍで測定する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、ヘパリナーゼを遊離形で使用する特許請求の範囲第
   １項記載の方法。