DK156402B - Fremgangsmaade til fremstilling af lmw-heparin - Google Patents

Description

1 DK 156402 B

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangsmâde til fremstilling af lavmolekylær heparin (LMW-heparin) ved enzymatisk depolymerisering af heparin.

Konventionel heparin er en heterogen blanding af muco-5 polysaccharider, der dækker et molekylvægtomrâde fra 5000 - 50.000 dalton med en antalsmiddelmolekylvægt pâ ca. 10 - 14.000 dalton.

Heparin indvirker direkte eller indirekte pâ funktionen af adskillige proteiner, især enzymer fra koagulationskaskaden.

10 Adskillige faktorer, sâsom fordelingen af funktionelle grupper i molekylet og molekylvægten, har indflydelse pâ effekten af heparin. Det er sâledes velkendt, at molekylvægten spiller en vigtig rolle med hensyn til heparinaktivitet, især inaktivering af thrombin og faktor Xa medieret af antithrombin III.

15 Antithrombinaktivitet kræver en mindsteheparinmole- kylvægt svarende til ca. 18 monosaccharider, d.v.s. ca. 5400 dalton, hvorimod antifaktor Xa aktivitet kan udtrykkes med hepa-rinmolekyler sâ smâ som 5-6 saccharidenheder, 1500 - 1800 dalton.

20 En række andre effekter af heparin, f.eks. antithrombo- tisk effekt (heparinoligosaccharider indeholdende 18 monosaccha-rider eller mindre synes at hâve lav antithrombotisk aktivitet), indflydelse pâ ADP-induceret thrombocytaggregering, biotilgænge-lighed efter subcutan indgift, inhibering med PF^ (blodpladefak-25 tor 4) og HRG (histidinrig glycoprotein) (Thrombosis and

Haemostasis 58 (1987), 190) sâvel som aktiviteten over for koagu-leringsenzymer fra det interne System, som er ansvarlig for dan-nelse af faktor Xa, pâvirkes stærkt af heparins molekylvægt.

I de senere âr har interessen samlet sig om heparin-30 fragmenter eller -fraktioner med et hpjt forhold mellem antifaktor Xa aktivitet og antithrombinaktivitet med molekylvægt fra 4000 dalton til op imod 6000, da sâdanne stoffer har vist sig at hâve god antithrombotisk effekt og pâ samme tid ingen eller ringe tendens til at forârsage blodningskomplikationer. De udviser ogsâ 35 foroget biotilgængelighed, især efter subkutan indgift.

2 DK 156402 B

*

Eftersom selektiviteten af heparinvirkning er korrele-ret med molekylvægten, er det sandsynligt, at der er et relativt snævert molekylvægtomrâde, indenfor hvilket heparinaktiviteten er optimal.

5 En fremgangsmâde til fremstilling af LMW-heparin med en specifik, tilstræbt molekylvægt og en snæver molekylvægtforde-ling, d.v.s. lav polydispersitet ville derfor være fordelagtig.

Fremgangsmâden if0lge den foreliggende opfindelse muligg0r opnâelse af et vilkârligt 0nsket molekylvægtomrâde af et 10 depolymeriseringsprodukt af heparin.

LMW-heparin kan fremstilles i lavt udbytte fra konven-tionel heparin ved fraktionering (DE offentligg0relsesskrift nr. 2.944.792 og nr. 2.945.595). St0rstedelen af LMW-heparin fremstilles imidlertid ved depolymerisering af heparin enten ved 15 kemiske eller enzymatiske fremgangsmâder eventuelt efterfulgt af fraktionering (jfr. A. A. Horner: Heparin, Chemistry and Clinical Usage, V.V. Kakkar og D.P. Thomas (eds.) Academie Press (1976), side 37-48 og Perlin et al., Carbohydrate Research 18^, (1971), 185-194.

20 Kemisk depolymerisering af heparin er beskrevet i offentliggjorte EP-patentans0gninger nr. 0037.319, 0076.279 og 0014.184, US patentskrift nr. 4.351.938 og GB patentskrift nr. 2.002.406.

Enzymatisk depolymerisering er beskrevet i US patent-25 skrift nr. 3.766.167, GB patentskrift nr. 2.002.406, offentlig-gjort EP patentans0gning nr. 0014.184 og US patentskrift nr. 4.396.762.

Et væsentligt problem forbundet med aile de kendte batchdepolymeriseringsprocesser er at standse depolymeriserings-30 reaktionen ved den korrekte middelmolekylvægt. Ydermere resul-terer depolymeriseringsreaktionen i heparinfragmenter med mindre eller st0rre st0rrelse end den 0nskede molekylvægt, selv i mangel af sidereaktioner.

I de kendte depolymeriseringsprocesser til depolymeri-35 sering af heparin, som anvender uorganiske depolymeriseringsrea-genser (salpetersyre, hydrogenperoxid etc.) er der ingen præfe-rence med hensyn til st0rrelsen af det angrebne molekyle eller

3 DK 156402 B

med hensyn til positionen indenfor molekylet af det bând, der skal brydes. Ifolge R.J. Linhardt et al., Biochem.Biophys.Acta 702 (1982) 197-203 skelner sâledes ikke engang enzymet heparin-ase, idet heparinasens virkemâde er endolytisk tilfældig.

5 Det betyder, at polydispersiteten af en vilkârlig hepa- rindepolymeriseringsblanding udvikles pâ en statistisk forud-sigelig mâde som en funktion af graden af depolymerisering. Især pâ det tidspunkt, hvor middelmolekylvægten er lige over den 0n-skede værdi, har en stor del af fragmenterne den Onskede molekyl-10 vægt; men pâ grund af depolymeriseringens endolytisk tilfældige natur har de ogsâ en forholdsvis stor chance for at blive yder-ligere depolymeriseret til dannelse af fragmenter af suboptimal storrelse. En batchdepolymerisering bor derfor stoppes pâ dette tidspunkt.

15 Der er imidlertid hidtil ikke udviklet tilfredsstillen- de metoder til kontrol af depolymeriseringen af heparin til op-nâelse af ho je udbytter af et forudbes teint LMW-heparinprodukt.

Det er et formâl med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en metode til kontrol af en enzymatisk depolymeri-20 sering af heparin med heparinase i vandigt medium.

Det er yderligere et formâl med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en metode til fremstilling af LMW-heparin med en Onsket middelmolekylvægt.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en frem- 25 gangsmâde til fremstilling af LMW-heparin, ved hvilken heparin delvist depolymeriseres med heparinase i vandigt medium, og denne fremgangsmâde er ejendommelig ved, at man mâler forogelsen i lysabsorptionen under forlobet af en sâdan depolymerisering, hvilken forogelse er forârsaget af dannelsen af stigende mængder 30 af umættede heparinnedbrydningsprodukter, efterhânden som den enzymatiske depolymerisering skrider frem, og at den enzymatiske depolymerisering standses, nâr stigningen i absorption har nâet en værdi svarende til den onskede antalsmiddelmolekylvægt Mn og den tilsvarende onskede vægtmiddelmolekylvægt M , hvorpâ LMW- w 35 heparinproduktet udvindes fra reaktionsblandingen.

4 DK 156402 B

Middelmolekylvægten af en heparindepolymeriseringsreak-tion kan bestemmes pâ en række mâder baseret pâ f.eks. GPC-HPLC, viskositetsmâling, lysspredning eller kemisk eller fysisk-kemisk bestemmelse af funktionelle grupper opstaet under depolymerise-5 ringsprocessen.

De fleste nævnte fremgangsmâder sâsom GPC-HPLC er tid-r0vende og vanskeligt anvendelige i produktion i stor mâlestok, og storsteparten af de kendte metoder, der anvendes ved produktion af LMW-heparin er faktisk baseret pâ empiriske metoder, der 10 bygger pâ omhyggelig kontrol af udgangsmaterialet og reaktions-betingelserne for at opnâ den onskede molekylvægt ved afslutnin-gen af depolymeriseringsreaktionen. Imidlertid kan slutproduktets molekylvægt variere fra batch til batch pâ grund af uundgâelige variationer under depolymeriseringsreaktionen, f.eks. variationer 15 i enzymaktivitet, og det kan være vanskeligt at opnâ et ensartet produkt.

Hvis et produkt med den korrekte gennemsnitsmolekylvægt skal fremstilles fra hver produktionsbatch, skal depolymeriseringsreaktionen standses straks, nâr den onskede middelmolekyl-20 vægt er nâet i depolymeriseringsblandingen. Dette kræver, at ændringen i middelmolekylvægten overvâges ved at anvende metoder til molekylvægtbestemmelse med ringe eller ingen forsinkelse.

Hidtil har der ikke eksisteret en hurtig, praktisk metode til bestemmelse af molekylvægten af en depolymeriserings-25 reaktionsblanding indeholdende LMW-heparin. Ifolge et aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en sâdan metode.

Middelmolekylvægten af heparin eller en LMW-heparin kan angives som antalsmiddelmolekylvægten (Mn), d.v.s. vægt/antal molekyler, eller som vægtmiddelmolekylvægt (M ) eller peak mole- w 30 kylvægt (Μ , ). M eller M , anvendes normalt til karakte-

pSciJÇ W pSclK

risering af heparin eller LMW-heparinprodukter.

Det er nu blevet bekræftet eksperimentelt, at polydis-persiteten (D), d.v.s. Mw/Mn' af en ÇTiven heparindepolymerise-ringsblanding ændres pâ en regelbunden mâde under den enzymatiske 35 depolymeriseringsreaktion af heparin som vist i fig. 1.

5 DK 156402 B

Den foreliggende opfindelse bygger pâ det forhold, at der er udviklet en hurtig og pâlidelig metode til bestemmelse af under depolymeriseringen af heparin med heparinase som forkla-ret i det folgende.

5 Da fig. 1 angiver korrelationen mellem M og M , kan w n depolymeriseringen af heparin til LMW-heparin med en given, 0n-sket opnâs ved depolymerisering til den tilsvarende antals-middelmolekylvægt Mn.

Den enzymatiske depolymeriseringsproces med hepa-10 rinase egner sig til en spektrophotometrisk antalsmiddelmole-kylvægtsbestemmelse (Mn) eftersom den enzymatiske procès er eli-minativ og danner en reducerende endegruppe og en endegruppe bestâende af et /\4,5 umættet-iduronsyrederivat med en distinkt UV-absorption ved 230-235 nm. Den molære absorptionskoefficient 15 for et antal LMW-heparinfragmenter af di-, tetra-, hexa- og oligosaccharider blev offentliggjort af Linker og Hovingh (Biochem. 11 (1972), 563 - 568). Gennemsnitsværdien af den publicerede molære absorptionskoefficient er 5500.

En ligning som 1_ = 1__ + AA235 (1) 20 Μ M c · Ç n n,u t der giver sammenhængen mellem antalsmiddelmolekylvægt (Mn), og stigningen i absorption ved 235 nm kan nemt udledes.

I formel (1) er Μβ antalsmiddelmolekylvægten af det depolymeriserede produkt, Mn u er antalsmiddelmolekylvægten af 25 heparinsubstratet, c er substratkoncentrationen (g/1), ΔΑ235 er stigningen i absorptionen ved 235 nm og £ er den molære absorptionskoefficient .

Beregning af Mn er mulig, nâr Mn af heparinsubstratet (M ), substratkoncentration (c, g/1) og absorptionskoefficien-n, u 30 ten (£) af de umættede depolymeriseringsprodukter er kendt, og Δα235 mâles.

I en række fors0g blev heparin depolymeriseret med heparinase delvist renset med hydroxylapatit'kromatografi ifolge Linker og Hovingh (Methods in Enzymology 28^ (1972), 902 - 911).

6 DK 156402 B

Antalsmiddelmolekylvægten Mn blev beregnet ved at an-vende ligningen (1) og anvende den publicerede værdi for £ = 5500 og blev sammenlignet med Mn bestemt ved GPC-HPLC.

Det blev imidlertid gentagne gange konstateret, at den 5 beregnede værdi af Mn (Mn(^A)) varierede fra den værdi for Mn, der blev fundet med HPLC (Mn(HPLC)), med op til 20%.

Omarbejdning af (1) til ΛΑ235 = c-£ (^_ " ^_) (2) Μ M n n,u 10 muliggor beregning af en absorptionsstigning ΔΑ235 svaren<^e til en onsket antalsmiddelmolekylvægt Mn· Men forsog viste igen, at hvis depolymeriseringen blev standset ved den beregnede værdi af var den faktiske M bestemt ved HPLC betydeligt hojere end den onskede Mn, hvis værdien af c = 5500 fundet af Hovingh og 15 Linker blev anvendt.

Det blev derfor konkluderet, at den dârlige overens-stemmelse mellem Mn(/\A) og Mn(HPLC) skyldtes anvendelsen af værdien 55 00 for£ .

Omarbejdning af ligning (1) til 20 £ = ΔΑ235 Mn Mn,u (3) c (M - M ) n,u n' viser, at £ kan beregnes ved at anvende kendte værdier for c og ^ og samtidigt mâlte værdier for ΔΑ235 og Mn(HPLC).

Pâ denne mâde fandtes en værdi for £ = 7600, som gav 25 tæt korrelation mellem beregnet M^(AA) og observeret Mn(HPLC) i en række forsog.

Muligheden for at beregne en korrekt værdi af Mn base-ret pâ den letmâlelige ΔΑ235 er grundlaget for udovelsen af den foreliggende opfindelse, ifolge hvilken en batchenzymatisk

7 DK 156402 B

depolymerisering af heparin fâr lov til at forl0be, indtil den beregnede værdi af ΔΑ235 er nâet, hvorpâ heparindepolymerise-ringsreaktionen standses, og reaktionsblandingen oparbejdes.

Heparinase anvendt if0lge den foreliggende opfin-5 delse fremstilles pâ en i og for sig kendt mâde som beskrevet af Hovingh og Linker (Methods in Enzymology 2_8 (1972), 902 - 911 og J.Biol.Chem. 245 (1970), 6170 - 6175) ved dyrkning af Flavobacterium heparium pâ et heparinholdigt substrat, host af celler og sprængning af celler ved sonikering og rensning blandt andet 10 ved kromatografi pâ hydroxyapatit. Nedbrydningen af heparin med heparinase udfpres i vandigt medium som beskrevet af f.eks.

Hovingh og Linker (J.Biol.Chem. 240 (1965), 3724-3728). Nâr den pnskede Mn værdi af depolymeriseringsblandingen er nâet, inakti-veres heparinase pâ kendt mâde, f.eks. ved sænkning af pH eller 15 kort varmebehandling.

LMW-heparinproduktet udfældes derpâ pâ kendt mâde, f.eks. ved udfældning med alkohol, og oprenses pâ kendt mâde, f.eks. blegning, sterilfiltrering og alkoholudfældning.

Beregning af stigningen i absorption ved 20 230 - 235 nm ΔΑ233 svarende til den 0nskede af produktet foretages som folger: a) aflæsning pâ fig. 1 af Mn svarende til den onskede M og w y b) beregning af AA__r svarende til M fra a) ved 23b n 25 hjælp af den ovenfor nævnte formel (2) ved anvendelse af værdien 7600 for £.

ΔΑ235 mâles med et spectrophotometer efter syrning af proven, fortrinsvis til pH mindre end 2,5. Det er indlysende for en fagmand, at stigningen i UV-absorption forârsaget af dannelsen 30 af umættede nedbrydningsprodukter ved heparinasepâvirkning af heparin kan mâles ved andre b0lgelængder end her angivet. Absorp-tionskoefficienten mâles imidlertid fortrinsvis ved 235 nm, da den har sit maksimum ved denne b0lgelængde.

Depolymeriseringen standses, nâr ΛΑ235 har nâet den 35 beregnede værdi, hvorpâ LMW-heparinproduktet udfældes ved tilsæt-ning af alkohol (fortrinsvis 0,6 - 10 vol/vol)..

8 DK 156402 B

Heparindepolymeriseringsreaktion udf0res fortrinsvis ved en temperatur pâ 25 - 40°C og ved en pH-værdi pâ 6-8.

Sk0nt den foreliggende opfindelse illustreres ved en procès, hvor heparinase anvendes i fri form, kan immobiliseret 5 heparinase ogsâ anvendes.

Eksempel 1 illustrerer overensstemmelsen mellem malt ved A og mâlinger i forhold til HPLC-mâlinger (M^( /\A) i forhold til Mn(HPLC)) af pr0ver gennem hele forl0bet af en batch-depolymerisering af heparin.

10 Eksempel 1 2,5 g heparinnatrium, USP, M = 17.300, M = 12.400 w n dalton blev opl0st i 25 ml 0,1 M natriumacetat, 0,01 M calcium-acetat pH 7,0.

Heparinase, 0,8 ml, 1500 enheder/ml, specifik aktivitet 15 1050 enheder/mg blev opl0st i 25 ml 0,1 M natriumacetat.

En heparinaseenhed defineres if0lge Hovingh og Linker, Methods in Enzymol., 2j3 (19 72), 902 - 911.

Heparinsubstratet og enzymopl0sningen blev blandet og inkuberet ved let omr0ring i et vandbad holdt pâ 30°C.

20 En pr0ve udtaget umiddelbart efter blanding blev for- tyndet med 1,7 M perchlorsyre, pH mindre end 2,5, og filtreret, og absorptionen blev mâlt ved 235 nm.

Absorptionsmâlingen blev gentaget et antal gange som vist i tabellen herunder, og samtidigt udtagne pr0ver blev kort 25 opvarmet over et kogende vandbad for at 0delægge enzymaktivite-ten, afk0let, fortyndet 5 gange med 0,5 M natriumsulfat og filtreret, og molekylvasgten blev analyser et - ved GPC-HPLC.

GPC-HPLC analysen blev udfdrt under anvendelse af Waters 1-125 og 1-60 s0jler i serier med 0,5 M natriumsulfat som 30 eluent, 0,5 ml/min., monitoreret ved brydningsindeksbestemmelse, og molekylvægten blev beregnet ud fra retentionstiden, ved anvendelse af en ikke-lineær standardkurve baseret pâ dextran- og hep ar inf r agment s t an dar der.

Antalsmiddelmolekylvægten, Mn, blev beregnet if0lge 35 ligning (1) under anvendelse af absorptionsstigningen ved 235 nm, £ = 7600, c = 50 og M = 12.400.

n / il

9 DK 156402 B

Resultaterne er anf0rt i tabellen herunder, og som det fremgâr, opnâedes der tæt overensstemmelse mellem den beregnede og den iagttagne antalsmiddelmolekylvægt.

Tabel 5 Tid A235 ΔΑ235 Μη(ΔΑ) Mn(HPLC) (AA)/Mn(HPLC) ( timer ) _(dalton) (dalton)_% __ 0 4,5 4,5 1.0 28,83 24,33 6912 6750 102,4 2.0 47,67 43,17 5148 4661 110,4 10 3,0 63,43 58,93 4242 4261 99,6 3.5 70,03 65,53 3951 3863 102,3 4.0 77,5 73,00 3666 3830 95,7 4.5 83,2 78,7 3475 3565 97,5 5.5 94,4 89,9 3153 3145 100,3 15 22 242,5 238 1415 1405 100,7 101,1 ± 4,4 (S.D.)

Eksempel 2

Formâlet med eksperimenterne beskrevet nedenfor var at 20 producere LMW-heparin med en middelmolekylvægt (M ) pâ 6500 ± 500 w dalton.

Fra fig. 1 blev antalsmiddelmolekylvægten (Mn) svarende til M = 6500 dalton fundet til at være ca. 3500 dalton.

w

Fem forskellige hepariner (se tabellen nedenfor) blev 25 valgt til enzymatisk depolymerisering. Ændringen i optisk densi-tet ved 235 nm (ΔΑ233 beregnet) ) svarende til en Mn værdi i reaktionsblandingen pâ 3500 dalton (i et eksperiment 3400 dalton)

10 DK 156402 B

blev beregnet for.hver heparin fra ligning 2 under anvendelse af c = 50 mg/ml, £ = 7600 og M -værdien af de aktuelle heparin-prover (se tabel).

Den enzymatiske nedbrydning af heparinerne blev udfort 5 som folger:

Heparin blev oplost i en koncentrâtion pâ 50 mg/ml i 0,1 M natriumacetatpuffer, pH 7,0 indeholdende spor af calcium (0,0005 - 0,01 M). Oplosningen blev opvarmet til 30°C, og hepa-rinase blev tilsat i en mængde nodvendig for at depolymerisere 10 heparin til den onskede Mn_værdi pâ ca. 48 timer.

Ændringen i optisk densitet ved 235 nm (ΔΑ235^ blev malt lobende i prover af reaktionsblandingerne efter fortynding med 1,7 M perchlorsyre, pH under 2,5. Nâr ΔΑ235 var me<^ ΔΑ235 (beregnet), blev den enzymatiske depolymerisering stand-15 set.

Nâr ΔΑ235 ^avc^e n^et den beregnede værdi, blev LMW-heparinproduktet udfældet ved tilsætning af alkohol, og det de-polymeriserede produkt blev oprenset pâ kendt mâde, f.eks. ved blegning, sterilfiltrering og alkoholudfældning. Egenskaber af 20 produkterne fra 5 uafhængige forsog er vist i den folgende tabel.

Tabel II

Forsog Batch- M af 0nsket Mængde anvendt

Π/U J

nr. storrelse heparin Mr i (bereg- heparinase (g) (dalton) produkt net) (NOVO enheder/g 25 __(dalton) _heparin)_ 1 1000 10100 3500 70,94 53 2 1000 12400 3500 77,93 65 3 1200 13900 3400 84,43 73 4 1000 11600 3500 75,81 60 30 5 1000 11200 3500 74,64 62

11 DK 156402 B

Forseg Slut Udbytte Mi Mi Biologisk II w nr. ΔΑ235 1 af Pro~ produkt produkt aktivitet af reaktions- dukt (dalton) (dalton) produkt _% (w/w)__IU/mg_ 5 1 71,76 87,8 3690 6150 2 77,40 93,9 3840 6510 76 3 83,97 90,6 3710 6630 77 4 75,07 90,5 3660 6180 82 5 74,80 93,0 3610 6610 82 10 Biologisk aktivitet i et amidolytisk antifaktor Xa assay modificeret for udforelse med automatisk analyseapperatur, men ellers som beskrevet af A.N. Teien et al., Thrombosis Research (1976), 413. Der anvendtes renfremstillet antithrombin III (AT III) og faktor Xa og den 1. internationale LMW-heparin-15 standard (National Institute for Biological Standards and Controls, London) som referencestandard.

Det fremgâr af ovennævnte, at aile slut-LMW-heparinpro-dukterne har en vægtmiddelmolekylvægt (M^) inden for det onskede omrâde.

Claims (3)

12 DK 156402 B 5 10

1. Fremgangsmâde til fremstilling af LMW-heparin ved hvilken heparin depolymeriseres delvist med heparinase i et van-digt medium, kendetegnet ved, at stigningen i lysab-sorptionen forârsaget af dannelsen af umættede nedbrydnings-LMW-produkter ved indvirkning af heparinase pâ heparin mâles under 20 depolymeriseringsreaktionen, reaktionen standses, nâr stigningen i absorptionen har nâet en værdi svarende til den 0nskede antals-middelmolekylvægt Mn og den tilsvarende vægtmiddelmolekylvægt M^, og at LMW-heparin udvindes fra reaktionsblandingen.

2. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at stigningen i absorptionskoefficienten mâles ved 230 - 235 nm.

3. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet 30 ved, at heparinasen anvendes i fri form.